专利名称：一株生物转化l-苯丙氨酸生成2-苯乙醇的酿酒酵母的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说涉及一株新分离的酿酒酵母及其用于生物转 化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的方法。
背景技术：
2-苯乙醇，又名β-苯乙醇，英文名为2-phenylethanol，分子式为C8H100，常温下 是无色透明的液体，天然存在于一些花和植物比如玫瑰、茉莉等的精油中。2-苯乙醇具有的 玫瑰香味深受人们欢迎，是所有玫瑰香型香气的基本组分，其在食品、化妆品、日用品、烟草 和药品中有广泛的应用。2-苯乙醇的生产方法可分为生物合成法、直接从植物中提取法和化学合成法三 种。研究发现酵母菌可以从头开始合成，也可以通过氨基酸分解途径转化L-苯丙氨 酸生成2-苯乙醇。马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)禾口酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)禾口 异常汉逊酵母(Hansenula anomala)等在生长过程中从头合成一定量的2_苯乙醇。1907年Ehrlich发现在一些酵母 细胞中，L-苯丙氨酸通过转氨作用生成苯丙酮酸、再脱羧形成苯乙醛，苯乙醛经氧化脱氢酶 作用生成2-苯乙醇，这条途径后来以Ehrlich的名字命名。利用这条途径通过生物转化 L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇是目前生物合成法制备2-苯乙醇的主要方法。Albertazzi 等人用异常汉逊酵母(Hansenula anomala CBS 110)在含 2 克 / 升 L-苯丙氨酸而不含其他氮源的培养基中培养24小时得到1.7克/升2-苯乙醇，相同条件下 使用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae NCYC 739)得到 1. 5 克 / 升 2_ 苯乙醇(1994)。 Huang等人用发酵毕赤酵母(Pichia fermentans L-5)转化L-苯丙氨酸16天后可得到453 毫克/升的2-苯乙醇(2000)。Stark等人采用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Giv 2009)为出发菌株，在含有6克/升L-苯丙氨酸的培养集中转化48小时候得到2. 35克/ 升2-苯乙醇。鉴于2-苯乙醇对酵母细胞的毒害作用，使2-苯乙醇的产量停留在一个较低 的水平，研究人员采用了原位产物分离技术来提高2-苯乙醇的产率。Stark等人以油醇作 为萃取剂，采用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Giv 2009)进行两相补料分批转化， 最终2-苯乙醇浓度可达到12. 6克/升。采用这种方法虽然2-苯乙醇产量得到了较大提 高，但同时给产物的分离提取带来了很多困难，也增加了生产成本。从植物中提取2-苯乙醇的方法因原料来源有限，且原料中比如玫瑰中2-苯乙醇 的含量很低，提取成本太高，以此方法得到的产品目前仅应用于高档香料中；化学合成法 普遍存在较严 峻的环保问题，反应条件一般较剧烈，对设备要求较高，且产品不是天然的； 生物合成法具有产品绿色天然、成本低、反应条件温和、环境污染小等等突出优点，是将来 2-苯乙醇制备研究的方向，有极好的发展前景。但从自然界中筛选2-苯乙醇生产菌株是一 项十分艰巨的工作，筛选到的野生菌株产量和产率往往非常低，对产物2-苯乙醇的耐受性 低，所以国际上用生物合成法生产2-苯乙醇的技术尚未成熟，目前还没有产业化生产的报道。
发明内容
本发明的目的是针对目前市场对天然绿色产品的需要，以及生物法生产2-苯乙 醇产物浓度低、没有好的生产菌株等问题，提供一株新分离的生产2-苯乙醇的酿酒酵母， 并提供用此菌株生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的方法。本发明涉及的酿酒酵母名为Saccharomyces cerevisiae P-3，已于2009年3月1 日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 209035。
上述Saccharomycescerevisiae P_3 CCTCC M 209035菌株的生理生化特征如表 1所示。表1 菌株 Saccharomyces cerevisiae P_3 CCTCC M 209035 的生理生化特征 上述Saccharomyces cerevisiae P_3 CCTCC M 209035 菌株的 18S rDNA 序列与 其它多株酿酒酵母的18S rDNA序列有99%的相似性。上述Saccharomyces cerevisiae P_3 CCTCC M 209035 菌株，用于生物转化 L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的方法以MPK培养基生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇，所用的 MPK培养基配方为糖蜜20 50克/升，L-苯丙氨酸5 12克/升，磷酸二氢钾0. 5克/ 升，调节PH至7.0。115°C灭菌20分钟。转化温度为35°C，在500毫升的锥形瓶中装75毫 升MPK培养基，置于摇床上以180转/分钟的转速培养40小时，可得到成熟的2-苯乙醇转 化液。本发明提供的Saccharomycescerevisiae P_3 CCTCC M 209035菌株可以用于微 生物转化法生产2-苯乙醇。微生物转化法生产2-苯乙醇具有反应条件温和、产品绿色天 然、成本较低、环境友好等优点。
具体实施方式
实施例一步骤1 =Saccharomyces cerevisiae P_3 CCTCC M 209035 菌株的筛选取花园和氨基酸厂周围的土壤，称取5克溶于100毫升生理盐水，充分混勻后取10 毫升加入50毫升MPK培养基中，在35°C条件下，180转/分钟振荡培养48小时后，以6% 的接种量(体积/体积)转接新鲜的MPK培养基培养24小时，重复这一过程3 5次。将 培养的菌液稀释1，000, 000倍涂布于营养琼脂培养基上，在35°C条件下静置培养20小时。 营养琼脂培养基配方为蛋白胨10克/升，牛肉膏3克/升，氯化钠5克/升，琼脂18克/ 升。培养基的初始PH值为7.2，115°C灭菌20分钟。选取长出的单菌落接种50毫升的MPK 培养基中，35°C条件下振荡培养24小时筛选能够转化L-苯丙氨酸生成2-苯乙醇的菌株 并测定2-苯乙醇含量，最终获得一株转化能力较好、能积累较高浓度2-苯乙醇的菌株，即 Saccharomyces cerevisiaeP_30由生理生化鉴定实验表明，通过上述实验得到的菌株形态为椭圆形或卵圆形，直 径5 10微米，菌落颜色为浅黄色，可利用葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露糖，不能利用 乳糖和纤维二糖，可分解脂肪和明胶，不能利用柠檬酸盐、硝酸盐、重氮基蓝B和尿素，可在 不含维生素和含质量百分比为10%的NaCl培养基上生长，其18S rDNA序列与其它多株酿 酒酵母的18S rDNA序列有99%的相似性。该菌株命名为Saccharomyces cerevisiae P-3，已于2009年3月1日保藏于中国 典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 209035。步骤2 制备上述 Saccharomyces cerevisiae P_3 CCTCC M 209035 菌株的细胞 液体培养物挑取用营养琼脂培养基斜面培养的Saccharomyces cerevisiae P_3 CCTCC M209035菌株一环，接种在装有已灭菌的50毫升营养肉汤培养基的500毫升锥形瓶中，于 35°C、180 转 / 分钟在摇床上培养 24 小时，即制得 Saccharomyces cerevisiae P-3CCTCC M 209035菌株的细胞液体培养物。上述营养肉汤培养基与营养琼脂培养基的制备方法相同，只是不加入琼脂。步骤3 利用上述 Saccharomyces cerevisiae P-3 CCTCC M 2O9O35 菌株，以含 2O 克/升糖蜜的MPK培养基中培养获得成熟的2-苯乙醇转化液将通过上述步骤1、2 的方法获得的 Saccharomyces cerevisiae P_3 CCTCC M209035菌株的细胞液体培养物，以体积百分比为6%的接种量接种到装有已灭菌的75毫升MPK培养基的500毫升锥形瓶中，于35°C、180转/分钟在摇床上培养。在第40小时2-苯 乙醇的浓度达到2. 7克/升，即得成熟的2-苯乙醇转化液。上述含20克/升糖蜜的MPK培养基配方为糖蜜20克/升，L-苯丙氨酸7克/ 升，磷酸二氢钾0. 5克/升，调节pH至7. 0。115°C灭菌20分钟。实施例二利用上述Saccharomycescerevisiae P_3 CCTCC M 209035菌株，以含 30克/升糖蜜的MPK培养基中培养获得成熟的2-苯乙醇转化液与上述实施例一的步骤相同，所不同的只是MPK培养基的配方中糖蜜浓度为30克 /升。在第40小时得到成熟的转化液，其中2-苯乙醇的浓度达到3. 4克/升。实施例三利用上述Saccharomycescerevisiae P-3 CCTCC M 2O9O35菌株，以含 40克/升糖蜜的MPK培养基中培养获得成熟的2-苯乙醇转化液与上述实施例一的步骤相同，所不同的只是MPK培养基的配方中糖蜜浓度为40克 /升。在第40小时得到成熟的转化液，其中2-苯乙醇的浓度达到3. 8克/升。实施例四利用上述Saccharomycescerevisiae P_3 CCTCC M 209035菌株，以含 50克/升糖蜜的MPK培养基中培养获得成熟的2-苯乙醇转化液与上述实施例一的步骤相同，所不同的只是MPK培养基的配方中糖蜜浓度为50克 /升。在第40小时得到成熟的转化液，其中2-苯乙醇的浓度达到4. 1克/升。实施例五利用上述Saccharomycescerevisiae P_3 CCTCC M 209035菌株，以含 30克/升糖蜜和5克/升L-苯丙氨酸的MPK培养基中培养获得成熟的2-苯乙醇转化液与上述实施例一的步骤相同，所不同的只是MPK培养基的配方中L-苯丙氨酸浓度 为5克/升，糖蜜浓度为30克/升。在第40小时得到成熟的转化液，其中2-苯乙醇的浓 度达到3.3克/升。实施例六利用上述Saccharomycescerevisiae P-3 CCTCC M 2O9O35菌株，以含 30克/升糖蜜和12克/升L-苯丙氨酸的MPK培养基中培养获得成熟的2-苯乙醇转化液与上述实施例一的步骤相 同，所不同的只是MPK培养基的配方中L-苯丙氨酸浓度 为12克/升，糖蜜浓度为30克/升。在第40小时得到成熟的转化液，其中2-苯乙醇的浓 度达到3.6克/升。
权利要求
一株酿酒酵母，其特征在于该酿酒酵母的菌株名为Saccharomyces cerevisiae P-3，已于2009年3月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M209035，该Saccharomyces cerevisiae P-3 CCTCC M 209035菌株的特征是形状为椭圆形或卵圆形，直径5～10微米，菌落颜色为浅黄色，可利用葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露糖，可分解脂肪和明胶，在不含维生素和含质量百分比为10％的NaCl培养基上生长，所述Saccharomyces cerevisiae P-3 CCTCC M 209035菌株的18S rDNA序列与其它多株酿酒酵母的18S rDNA序列有99％的相似性。
2.如权利要求1所述的酿酒酵母用于生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的方法，其 特征在于所述Saccharomyces cerevisiae P_3 CCTCC M 209035菌株以MPK培养基生物 转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇。
3.如权利要求2所述的酿酒酵母用于生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的方法，其 特征在于所述MPK培养基配方为糖蜜20 50克/升，L-苯丙氨酸5 12克/升，磷酸 二氢钾0. 5克/升。
4.如权利要求2或3所述的酿酒酵母用于生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的方 法,其特征在于用所述 Saccharomyces cerevisiae P_3 CCTCC M 209035 菌株以 MPK 培养 基生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇，转化温度为35°C，在500毫升的锥形瓶中装75毫 升MPK培养基，以180转/分钟的转速培养40小时，可得到成熟的2-苯乙醇转化液。
全文摘要
本发明公开了一株生物转化L-苯丙氨酸制备2-苯乙醇的酿酒酵母，名为Saccharomyces cerevisiae P-3，已于2009年3月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC M 209035；该菌株是从土壤中分离获得的，菌株形态为椭圆形或卵圆形，直径5～10微米，菌落颜色为浅黄色；该菌株具有典型的酿酒酵母生理生化特征；该菌株的18S rDNA序列与其它多株酿酒酵母的18S rDNA序列有99％的相似性。可以利用该菌株进行生物转化L-苯丙氨酸生产天然2-苯乙醇。微生物转化法生产2-苯乙醇具有反应条件温和、产品绿色天然、成本较低、环境友好等优点。
文档编号C12P7/22GK101857844SQ200910049170
公开日2010年10月13日 申请日期2009年4月10日 优先权日2009年4月10日
发明者华栋梁, 张兆斌, 杜毅, 甘霖, 许平, 魏中浩 申请人:上海凯信生物科技有限公司