专利名称：一种纤维堆囊菌生产埃坡霉素b的发酵方法及发酵培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种纤维堆囊菌生产埃坡霉素B的发酵方法及发酵培养基。
背景技术：
埃坡霉素B作为粘细菌纤维堆囊菌的次级代谢产物，是一种微管超稳定的新型抗 肿瘤活性物质。埃坡霉素B的作用机制与紫杉醇相同，但其在抗肿瘤谱、抗肿瘤活性、安全 性、水溶性及合成方法等方面均优于紫杉醇，是一类前景广阔的新型抗肿瘤药物。为了进行埃坡霉素的大规模生产，生物发酵是理想的途径。埃坡霉素B —般由粘 细菌纤维堆囊菌Sorangium cellulosum 90发酵生产。专利W093/10121中报道，在含碳 源、氮源和无机盐的介质中培养纤维堆囊菌的菌株，并在培养过程中加入吸附性树脂，可生 产得到低产量的埃坡霉素B。文献《纤维堆囊菌的代谢产物及其生物学活性分析》(李越 中，微生物学报，2001，41 (6))，文献《粘细菌纤维堆囊菌降解纤维素多酶复合体的确证和性 质分析》(侯配斌，博士毕业论文，山东大学)，以及文献《Mutation and ahigh-throughput screening method for improving the production of Epothilonesof Sorangium》 (Guo-li Gong, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2007,34 :615_623)均报道，使用 M26 培养基 发酵粘细菌纤维堆囊菌，也可获得低产量的埃坡霉素B。尽管使用M26培养基发酵粘细菌纤维堆囊菌可以生产埃坡霉素B，但产量较低；若 采用诱变筛选，又由于粘细菌纤维堆囊菌难以培养，诱变筛选难度又很大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供了一种纤维堆囊菌发酵培养基，其用于发酵培 养纤维堆囊菌制备埃坡霉素B时，菌株性能稳定，生长快速，产品埃坡霉素B的产量明显提 高。本发明还提供了一种纤维堆囊菌生产埃坡霉素B的发酵方法。本发明提供了一种纤维堆囊菌发酵培养基，其包括碳源、氮源、无机盐、大孔吸附 树脂和水，还包括氨基酸。其中，所述的氨基酸较佳的选自赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸。其中，所述的氨基酸的含量较佳的为0. l_500mg/L，更佳的为1-lOmg/L。其中，所述的纤维堆囊菌发酵培养基的pH值较佳的为3-9，更佳的为5-8。其中，所述的纤维堆囊菌较佳的为Sorangium cellulosum 90。其中，所述的碳源为本领域常规使用的碳源，较佳的为0. 2_2衬％的土豆淀粉或玉 米淀粉或麦芽糊精或土豆糊精，以及0.的葡萄糖。其中，所述的氮源为本领域常规使用的氮源，较佳的为0. 05-0. 5wt %的大豆蛋白 胨或胰胨，以及0.的酵母膏。其中，所述的无机盐为本领域常规使用的无机盐，较佳的为0. 05-0. 5wt %的 MgS04 '7H20,0. 05-0.CaCl2 *2H20,以及0. 5_5ml/L的微量元素液。所述的微量元素 液为本领域常规使用的微量元素液，较佳的参考Reichenbach H. , Dworkin M.等人的《TheMyxobacteria. The Prokaryote》(2nded. 1992. 3418-3487)中相关内容配制，标准微量元 素液(1L 体系):MnCl2 4H20 lOOmg, CoCl2 20mg, CuS04 lOmg, Na2Mo04 2H20 lOmg, ZnCl2 20mg, LiCl 5mg, SnCl2 2H20 5mg, H3B03 lOmg, KBr 20mg, KI 20mg, EDTANa_Fe3+8g0其中，所述的大孔吸附树脂较佳的为非极性大孔吸附树脂，鉴于其用于发酵，为使 之不易破碎，考虑其机械强度，更佳的选择使用XAD-16大孔吸附树脂。其中，所述的大孔吸附树脂的用量较佳的为体积百分比2%。其中，所述的水较佳的为去离子水；所述水的用量较佳的为补足质量百分比 100%。其中，更佳地，碳源、氮源、无机盐和大孔吸附树脂的优选组合为M26培养基，即指 0. 8wt%土豆淀粉、0. 2wt%大豆蛋白胨、0. 2界卞％葡萄糖、0. 2界1%酵母膏、0. lwt%MgS04 *7H20、 0. lwt% CaCl2 2H20、lml/L微量元素液和2% (V V)的XAD-16大孔吸附树脂。本发明的纤维堆囊菌发酵培养基由下述方法制得将上述成分简单均勻混合，用 水补足含量至质量百分比100%，按照本领域常规方式杀菌消毒，即可。本发明的发酵培养基特别适合纤维堆囊菌的发酵培养，本发明还提供了一种纤维 堆囊菌生产埃坡霉素B的发酵方法，其步骤包括在本发明的纤维堆囊菌发酵培养基中接 种纤维堆囊菌，培养，生产埃坡霉素B。其中，所述的纤维堆囊菌较佳的为Sorangium cellulosum 90。其中，所述的纤维堆囊菌的接种量为本领域常规使用接种量，较佳的为 5% -50%，更佳的为10% -30%，百分比为质量百分比。其中，所述的培养的温度较佳的为20_40°C，更佳的为25-30°C。其中，所述的培养的pH值较佳的为3-9，更佳的为5-8。其中，所述的接种使用的种子为经过二级培养的本领域常规使用的粘细菌纤维 堆囊菌种子。其中，所述的二级培养为本领域常规方法培养，包括斜面菌种培养和种子培 养。所述的斜面菌种培养为现有技术常规方法培养，即使用VY/2斜面培养基在30°C条件 下，培养箱培养3-7天。所述的种子培养为现有技术常规方法培养，即使用M7种子培养基， 30°C、200rpm 培养 2-5 天。所述的 VY/2 培养基含有鲜酵母 0. 5wt% ；CaCl2 2H20 0. lwt% ； VB120. 00005wt%;琼脂1. 5wt%;ffi 3mol/L的K0H调pH至7. 2。所述的M7种子培养基含有 蛋白胨 0. 3wt% ；胰胨 0. 3wt% ；淀粉 0. 5wt% ；葡萄糖 0. 2wt% ；酵母膏 0. lwt% ;MgS04 7H20 0. lwt% ；CaCl2 2H20 0. lwt% ；VB120. 00001wt% ；用 3mol/L 的 K0H 调 pH 至 7. 2。本发明所用试剂和原料均市售可得。本发明中，上述的各技术特征的优选条件可以任意组合，得到较佳的技术方案用
于生产高产量的发酵埃坡霉素B。本发明的积极进步效果在于本发明提供了一种纤维堆囊菌发酵培养基及其生产 埃坡霉素B的发酵方法。使用本发明纤维堆囊菌发酵培养基培养菌株时，菌株性能稳定，生 长快速，制备埃坡霉素B相较于使用常规发酵培养基M26，在制备埃坡霉素B时的产量明显 提高50-100%，效果显著。
具体实施例方式下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。实施例中的百分比，如无特殊说明，均为质量百分比。实施例1-4表1给出了本发明的发酵培养基实施例1 4的配方，按表1中所列组分及其含 量(百分比均为质量百分比)简单混合均勻，用去离子水补足含量至质量百分比100%，杀 菌消毒，即制得各发酵培养基。其中，微量元素液配制(1L体系):MnCl2 4H20 lOOmg, CoCl220mg, CuS0410mg, Na2Mo04 2H20 lOmg, ZnCl220mg, LiCl 5mg, SnCl2 2H205mg, H3B03 lOmg, KBr 20mg, KI 20mg, EDTA Na-Fe3+8g。
实施例5粘细菌纤维堆囊菌种子美国菌种保藏中心ATCC购买，保存号为ATCC15384，种子 的保存状态为甘油管保存或冻干管保存均可。微量元素液配制(1L体系):MnCl2 4H20 lOOmg, CoCl220mg, CuS0410mg, Na2Mo04 2H20 lOmg, ZnCl2 20mg, LiCl 5mg, SnCl2 2H20 5mg, H3B03 lOmg, KBr 20mg, KI 20mg, EDTANa-Fe3+8g。
1、孢子培养将粘细菌纤维堆囊菌接到VY/2固体斜面培养基培养上培养5-7天， 待形成成片扩散状菌落，作为种子使用。VY/2培养基组成成分为0. 5衬％鲜酵母、0. lwt% CaCl2 2H20、0. 5mg/L VB12、1. 5wt%琼月旨，用 KOH 调 pH 至 7. 2，121°C灭菌 20min。2、种子培养i、用接种针在长好的粘细菌纤维堆囊菌VY/2斜面上刮取少许菌落接到M7液体 种子培养基中，装瓶量为20ml/250ml，30°C、200rpm摇床培养5-7天。M7培养基组成成分 为0. 3衬％蛋白胨、0. 3wt%胰胨、0. 5wt%淀粉、0. 2 丨％葡萄糖、0.母膏、0. lwt% MgS04 7H20、0. lwt% CaCl2 H20、0. 00001wt% VB12，用 KOH 调 pH 至 7. 2，121°C 灭菌 20min。ii、按20wt%的接种量取培养好的M7种子重新接到新的M7种子培养基中，装瓶 量为80ml/500ml，3(TC、200rpm摇床培养2-4天。M7培养基组成成分为0. 3 丨％蛋白胨、 0. 胨、0. 5wt%淀粉、0. 2界卞％葡萄糖、0.母膏、0. lwt% MgS04 7H20、0. lwt% CaC12 .2H20、0. 00001wt% VB12，用 KOH 调 pH 至 7. 2，加入 10-15 颗玻璃珠，121°C灭菌 20min。3、发酵培养按20wt%的接种量取培养好的M7种子接到本发明的发酵培养基中， 装瓶量为20ml/250ml，30°C、200rpm摇床培养7天。发酵培养基的组成成分为0. 8wt%土豆 淀粉、0. 2wt%大豆蛋白胨、0. 2界卞％葡萄糖、0. 2界1%酵母膏、0. lwt% MgS04 7H20、0. lwt% CaCl2 d^OUml/L微量元素液、2% (V V)的 XAD-16 树脂、2-lOmg/L赖氨酸；pH值为 7. 0。结果分析培养7天后，收集发酵液中的树脂，用甲醇浸泡2小时，取浸泡液进行 HPLC分析埃坡霉素B的产量，如下表所示。其中HPLC条件为柱型Hypersil BDS C18 5um 4. 6mmXI50mm、流动相为乙腈水=50 50、流速为lml/min、检测波长250nm、柱温30°C。 实施例6除使用的发酵培养基以外，孢子培养、种子培养、以及结果分析的操作步骤和条件 同实施例5。其中，发酵培养基的组成成分为0. 8wt%土豆淀粉、0. 2wt%大豆蛋白胨、0. 2wt% 葡萄糖、0. 2界1%酵母膏、0. lwt% MgS04 7H20、0. lwt% CaCl2 2H20、lml/L 微量元素液、2% (V V)的XAD-16树脂和2-10mg/L苏氨酸；pH值为7. 0。结果分析埃坡霉素B的产量如下表所示 实施例7除使用的发酵培养基以外，孢子培养、种子培养、以及结果分析的操作步骤和条件 同实施例5。其中，发酵培养基的组成成分为0. 8wt%土豆淀粉、0. 2wt%大豆蛋白胨、0. 2wt% 葡萄糖、0. 2界1%酵母膏、0. lwt% MgS04 7H20、0. lwt% CaCl2 2H20、lml/L 微量元素液、2% (V V)的XAD-16树脂、2-10mg/L甲硫氨酸；pH值为7. 0。结果分析埃坡霉素B的产量如下表所示 实施例8除使用的埃坡霉素B发酵培养的温度条件为25-30°C以外，孢子培养、种子培养、 以及结果分析的操作步骤和条件同实施例5，其中发酵培养基中的氨基酸含量为赖氨酸 8mg/L。结果分析埃坡霉素B的产量如下表所示 实施例9除使用的埃坡霉素B发酵培养的pH条件为3-9以外，孢子培养、种子培养、以及结 果分析的操作步骤和条件同实施例5，其中发酵培养基中的氨基酸含量为赖氨酸8mg/L。结果分析埃坡霉素B的产量如下表所示 实施例10 孢子培养和种子培养的操作步骤和条件同实施例1。按20%的接种量取培养好 的M7种子接到本发明的发酵培养基中，装瓶量为20ml/250ml，30°C、200rpm摇床培养7天。 发酵培养基的组成成分为0. 2wt%玉米淀粉、0. 05wt%胰胨、1衬％葡萄糖、1衬％酵母膏、0. 05wt% MgS04 7H20、0. 05wt% CaCl2 2H20、5ml/L 微量元素液、2% (V V)的 XAD-16 树 脂、10mg/L赖氨酸。培养7天后，收集发酵液中的树脂，用甲醇浸泡2小时，提取埃坡霉素 B，即可。实施例11孢子培养和种子培养的操作步骤和条件同实施例1。按20%的接种量取培养好 的M7种子接到本发明的发酵培养基中，装瓶量为20ml/250ml，30°C、200rpm摇床培养7天。 发酵培养基的组成成分为2wt%麦芽糊精、0. 5wt%大豆蛋白胨、0. 1衬％葡萄糖、0. lwt% 酵母膏、0. 5wt% MgS04 7H20、0. 5wt% CaCl2 2H20、0. 5ml/L 微量元素液、2% (V V)的 XAD-16树脂、10mg/L赖氨酸。培养7天后，收集发酵液中的树脂，用甲醇浸泡2小时，提取 埃坡霉素B，即可。由上述实施例的分析结果表明当发酵培养基中含有氨基酸时，发酵所得的菌体 量和埃坡霉素B显著增多，其产量至少比不含有氨基酸时提高50 %，效果显著。
权利要求
一种纤维堆囊菌发酵培养基，其包括碳源、氮源、无机盐、大孔吸附树脂和水，其特征在于其还包括氨基酸。
2.如权利要求1所述的纤维堆囊菌发酵培养基，其特征在于所述的氨基酸选自赖氨 酸、苏氨酸和甲硫氨酸。
3.如权利要求1所述的纤维堆囊菌发酵培养基，其特征在于所述的氨基酸的含量为 0. l-500mg/L。
4.如权利要求3所述的纤维堆囊菌发酵培养基，其特征在于所述的氨基酸的含量 l-10mg/L。
5.如权利要求1所述的纤维堆囊菌发酵培养基，其特征在于所述的纤维堆囊菌为 Sorangium cellulosum 90。
6.如权利要求1所述的纤维堆囊菌发酵培养基，其特征在于所述的纤维堆囊菌发酵 培养基的PH值为3-9。
7.如权利要求1-6任一项所述的纤维堆囊菌发酵培养基，其特征在于所述的碳 源为0. 2-2衬％的选自土豆淀粉、玉米淀粉、麦芽糊精和土豆糊精中的一种或多种，以及 0. I-Iwt%的葡萄糖；所述的氮源为0. 05-0. 5wt%的大豆蛋白胨或胰胨，以及0. I-Iwt %的 酵母膏；所述的无机盐为 0. 05-0. 5wt%^ MgSO4 · 7Η20，0· 05-0. 5wt%^ CaCl2 · 2H20,以及 0. 5-5ml/L的微量元素液；所述的大孔吸附树脂为体积百分比为2%的XAD-16大孔吸附树 脂；所述的水的含量为补足质量百分比100%。
8.如权利要求7所述的纤维堆囊菌发酵培养基，其特征在于所述的标准微量元素液， 其 IL 体系含有:MnCl2 · 4H20 IOOmg, CoCl2 20mg, CuSO4IOmg, Na2MoO4 · 2H20 IOmg, ZnCl2 20mg, LiCl 5mg, SnCl2 · 2H20 5mg, H3BO3 IOmg, KBr 20mg, KI 20mg,以及 EDTA Na_Fe3+8g0
9.一种纤维堆囊菌发酵生产埃坡霉素B的发酵方法，其步骤包括在如权利要求1所 述的纤维堆囊菌发酵培养基中接种纤维堆囊菌，培养，生产埃坡霉素B。
10.如权利要求9所述的发酵方法，其特征在于所述的纤维堆囊菌的接种量为 5-50%，百分比为质量百分比；所述的培养的温度为20-40°C ；所述的培养的pH值为3_9。
全文摘要
本发明公开了一种纤维堆囊菌发酵培养基，其包括碳源、氮源、无机盐、大孔吸附树脂和水，其还含有氨基酸。其用于发酵培养纤维堆囊菌制备埃坡霉素B时，菌株性能稳定，生长快速，产品埃坡霉素B的产量明显提高。本发明还提供了使用本发明的纤维堆囊菌发酵培养基发酵培养纤维堆囊菌生产埃坡霉素B的发酵方法。
文档编号C12R1/01GK101851591SQ200910048789
公开日2010年10月6日 申请日期2009年4月3日 优先权日2009年4月3日
发明者田刚, 陈少欣 申请人:上海医药工业研究院