专利名称：利用pts基因和RNA干扰ads基因提高青蒿广藿香醇含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术领域的提高青蒿广藿香醇含量的方法，具体是一种利用 (patchoulol synthase,广藿香醇合成酶)基因和RNA干扰aofe(Amorpha-4, ll-diene synthase,紫穗槐二烯合成酶)基因提高青蒿广藿香醇含量的方法。
技术背景青蒿(Artemisia annua L )是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素是从青蒿地上 部分分离出的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前世界上公认的治疗疟疾 最有效的药物，尤其对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有更好的效果。ads是青蒿素合成途 径中的一个关键酶，是青蒿素代谢工程的重要耙点。采用基因工程手段，用反义RNA的 方法抑制a血基因，将使得植株不产青蒿素或少产青蒿素，并且将代谢流分流到其他萜 类等次生代谢产物的合成上，从而得到产生其他次生代谢产物的青蒿植株。广藿香醇，英文名Patchouli Alcohol;俗称百秋李醇；分子量222;分子式C15H260;熔点55°C-59°C;溶解度不溶于水，易溶于乙醇、丙酮、石油醚等有机溶剂。广藿香醇是从广藿香中提取出来的一种具有特殊芳香气味的天然单体化合物，用于香精 或香水行业，是法国标准化委员会确定的香精香料中的标志性成分，可用于治疗真菌性 皮肤病，还可用于其它化合物合成的基础原料，提高广藿香醇具有重大的商业价值和广阔的市场前景。Pts是广藿香中广藿香醇合成途径中的一个关键酶，是广藿香醇代谢工程的重要靶点。采用基因工程手段，用关键酶基因p&质体定位地转化青蒿，将打破广 藿香醇生物合成的限速瓶颈，获得广藿香醇高产的青蒿植株，为规模化生产广藿香醇提 供一条新途径。Joe Chappell等在《Nature Biotechnology》(自然生物技术)2006年24期1441-1447 页发表了题为"Redirection of cytosolic or plastidic isoprenoid precursors elevates terpene production in plants"(在植物中通过异戊二烯前体的质体或胞质 分流提高萜类化合物的产量)的论文，文中评述，通过在转基因烟草中过量表达广藿香 醇合成酶可以使原来不产生广藿香醇的烟草产生广藿香醇，每克湿重物质中广藿香醇含 量达到0. 5微克，可见通过代谢调控广藿香醇合成途径关键步骤可以使原来不产生广藿3香醇的植物合成广藿香醇。经对现有技术的文献检索发现，目前尚未发现与利用p"基因和RNA干扰的a血基 因提高广藿香醇含量有关的报道。发明内容本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种利用p"基因和RNA干扰a血 基因提高青蒿广藿香醇含量的方法。本发明建立了一种稳定提高青蒿中广藿香醇含量 的方法，为利用转基因青蒿大规模生产广藿香醇以及除青蒿素外的其他萜类等次生代 谢物奠定坚实的基础。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括步骤如下步骤一，获得青蒿素生物合成途径关键酶基因a&部分序列，广藿香醇生物合成途径关键酶基因P"全部阅读框序列和拟南芥中质体定位信号肽的^片段；步骤二，将获得的基因部分序列构建成发夹结构，然后将发夹结构和质体定位 的p"基因分别连于表达调控序列上，得到含a&i和质体定位的p"基因的植物表达 载体；步骤三，用含a血i和质体定位的p"基因的植物表达载体转化根癌农杆菌； 步骤四，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿外植体，PCR检测，获得转基因青 蒿植株；步骤五，对获得的转基因青蒿中广藿香醇含量进行测定。步骤二中，所述质体定位的p"基因由/^5"5"或cyp;7aW基因启动子启动。步骤四中，所述PCR检测具体为，分别设计合成检测a血i和检测质体定位的p"基因的引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带为阳性的植株即为转基因青蒿植株。步骤五中，所述测定具体为HPLC-ELSD法检测，色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相 为甲醇与水，柱温3(TC，流速1.0mL/min，进样量10 ^L，蒸发光散射检测器漂移管温 度4(TC，放大系数为7，载气压力5bar。所述流动相中甲醇与水的体积比为70:30。本发明从广藿香中克隆广藿香醇合成酶基因的完整阅读框P"序列，构建质体定位 的P"基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导；从青蒿中克隆紫穗槐二烯合成酶基因 a血部分序列，构建含so^'结构的植物表达载体，发夹结构的RNA干扰,简称为"WW 或"/^>/ J'/7 a血"；将质体定位的p"和s血i基因同时导入植物并再生出植株；PCR检测外源目的基因质体定位的P"和ao^'的整合情况，利用HPLC-ELSD法测定植物中 广藿香醇含量。本发明具有如下的有益效果本发明将青蒿素合成途径的关键酶ao^'基因和质体 定位的广藿香醇合成途径关键酶基因p"导入青蒿植株中，获得了广藿香醇含量显著提 高的转基因青蒿植株。转基因青蒿植株中广藿香醇的含量达到湿重的1.02%，是非转化 普通青蒿的1020倍，本发明对于广藿香醇的规模化生产以及利用转基因青蒿大规模生 产除青蒿素外的其他萜类等次生代谢产物具有重要意义。本发明涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄； 根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008， 28(3): 38-43》 文献中公开。根癌农杆菌EHA105可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚 CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambarl。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解为这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册见New York Cold Spring Harbor Laboratory出版社1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1步骤一，青蒿a血i基因、p"基因、^基因的克隆① 青蒿基因组总RNA的提取取少量青蒿幼嫩叶片，用液氮速冻后，迅速用研钵研碎，加入盛有1 mL由美国GIBCO BRL公司生产的TRIzol Reagents于1. 5 mL Eppendorf管中，充分振荡后，于室温下放 置5min，加200叱氯仿，用力振荡15sec，室温放置2min-3 min后，于4。C、 12， 000g 离心15 min;将约600叱上清液吸入干净的1. 5 mL Eppendorf管中，加入等体积的异 丙醇，颠倒混匀，室温下放置10 miri后，于4°C、 12，000g离心10 min;弃上清，加 lmL75%(v/v)乙醇清洗，振荡后，于4。C、 7， 500g离心5 min;室温千燥15min-20 min 后溶于30叱-50 PL RNAase-free水中；用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分 光光度计上测定RNA含量。② 广藿香基因组总RNA的提取取少量广藿香幼嫩叶片，用液氮速冻后，迅速用研钵研碎，加入盛有lmL由美国 GIBCO BRL公司生产的TRIzol Reagents于1. 5mL Eppendorf管中，充分振荡后，于室用力振荡15 sec，室温放置2min-3 min后，于4。C、 12， OOOg离心15 min;将约600叱上清液吸入干净的1. 5mL E卯endorf管中，加入等 体积的异丙醇，颠倒混匀，室温下放置10min后，于4'C、 12, OOOg离心10 miri;弃上 清，加1 mL75%(v/v)乙醇清洗，振荡后，于4°C、 7, 500g离心5 min;室温干燥15min-20 min后溶于3(HiL -50叱RNAase-free水中；用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后 在分光光度计上测定RNA含量。③ 拟南芥基因组总RNA的提取取少量拟南芥幼嫩叶片，用液氮速冻后，迅速用研钵研碎，加入盛有lmL由美国 GIBCO BRL公司生产的TRIzol Reagents于1. 5mL Eppendorf管中，充分振荡后，于室 温下放置5min，加200叱氯仿，用力振荡15 sec，室温放置2min-3 min后，于4。C、 12， OOOg离心15 min;将约600叱上清液吸入干净的1. 5mL Eppendorf管中，加入等 体积的异丙醇，颠倒混匀，室温下放置lOmin后，于4。C、 12， 000g离心10 min;弃上 清，加lmL 75%(v/v)乙醇清洗，振荡后，于4°C、 7， 500g离心5 min;室温干燥15min-20 min后溶于30叱-50叱RNAase-free水中；用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在 分光光度计上测定RNA含量。④ 青蒿ads基因的克隆将所获的青蒿基因组总RNA通过反转录酶XL (細V)反转录获得第一链cDNA，根据 青蒿ads基因的编码序列(SEQIDN0. 1)，设计扩增出含有部分ads编码序列(SEQID NO. 1中1054bp到1427bp)的上下游引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内 切酶位点Xbal / Xhol以及KpnI/HindIII，以便构建表达载体。以第一链cDNA为模板， 经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海英骏生物技术服务有限公司采用3730自动 测序仪完成。测序结果表明，所克隆的部分序列与GenBank中所报道的青蒿ads基因的 编码序列(SEQ ID NO. 1中1054bp到1427bp) 一致。⑤ 广藿香p"基因的克隆将广藿香基因组总RNA通过反转录酶XL (AMV)反转录获得第一链cDNA，根据广藿 香pts基因的编码序列(SEQ ID NO. 2)，设计扩增出完整编码框的上下游引物，并在 上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点NcoI和SacI，以便构建表达载体。以第 一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海英骏生物技术服务有限 公司采用3730自动测序仪完成。测序结果表明，所克隆的序列与GenBank中所报道的 广藿香pts基因的编码序列(SEQ ID NO. 2) —致。⑥拟南芥^基因的克隆将拟南芥基因组总RNA通过反转录酶XL (AMV)反转录获得第一链cDNA，根据所述 拟南芥tp基因的编码序列(SEQ ID NO. 3)，设计扩增出完整功能的上下游引物，并在 上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点SacI和BaraHI，以便构建表达载体。以第 一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海英骏生物技术服务有限 公司采用3730自动测序仪完成。测序结果表明，所克隆的序列与GenBank中所报道的 拟南芥tp基因的编码序列(SEQ ID NO. 3) —致。步骤二，含质体定位的p"和s血/基因的植物双元表达载体的构建① 中间载体pHANNBAL:: p35S-hairpin ads-nos的构建选用pHA丽BAL为基本元件，构建具有发夹结构的中间载体pHANNBAL:: p35S-hairpin ads-no。具体地，Xhol/Hindlll以及Kpnl/Xbal分别进行双酶切pGEM T-easy+ads和pCAMBIA2300: :p35S_pdk_nos，其中pdk是pyruvate orthophosphate dikinase的简称，是一种内含子，回收ads部分片段和pHA丽BAL大片段，连接转化， 挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。② 中间载体pCAMBIA2300: :p35S-gus-nos的构建选用pBI121和pC腦BIA2300为基本元件，构建双元植物表达载体 pCAMBIA2300: :p35S-gus-nos。利用HindIII和EcoRI双酶切pBI121和pCAMBIA2300质 粒；回收pBI121的GUS表达盒和pCAMBIA2300大片段；连接回收产物，转化筛选，抽 质粒酶切验证。③ 植物表达载体pCAMBIA2300: :p35S-hairpin ads-nos的构建以pCAMBIA2300: :p35S-gus-nos为表达载体，用hairpin ads基因替换其上gus基 因。利用BamHI/SacI双酶切pGEM T-easy+hairpin ads和pCAMBIA2300: :p35S_gus-nos， 回收hairpin ads和pCAMBIA2300::p35S-gus-nos大片段，连接转化，挑取单克隆，提 取质粒做PCR检测和酶切验证。 植物表达载体pCAMBIA2300: :p35S-tp-pts-nos的构建以pCAMBIA2300: :p35S-gus-nos为表达载体，用tp-pts基因替换其上gus基因。 利用BamHI/SacI双酶切pGEM T-easy+tp-pts和pCAMBIA2300: :p35S-gus-nos，回收 tp-pts和pC細BIA2300::p35S-gus-nos大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做 PCR检测和酶切验证。步骤三，将含s血i和质体定位的； "基因的植物表达载体转化根癌农杆菌将步骤二中含3fl^'和质体定位的基因的植物双元表达载体转入根癌农杆菌， 如EHA105。取lug左右的质粒DNA加入到200mlEHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴 30min， -70。C放置10min 。再在37。C水浴5min或42。C水浴lmin，接着冰浴2min，加 入800ml LB液体培养基28°C ， 175rptn摇培3hr后涂在含50 u g/ml Kanaraycin的LB平 板上。28'C培养到形成单菌落。步骤四，根癌农杆菌介导a血i和尸J55"启动子启动的质体定位p"基因转化青蒿① 外植体的预培养青蒿种子用75% (v/v)乙醇浸泡lmin;再用20% (v/v) NaClO浸泡20 min;无菌 水冲洗3-4次；用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基中，MS由 Murashige和Skoog在1962年发明，可以通过公开的商业渠道取得；25'C、 16小时白 天和8小时的黑夜培养，培养3天即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5 cm时，剪取无菌苗 叶片外植体用于转化。② 农杆菌与外植体的共培养将所述的叶片外植体，转到1/2 MS和IOO Pmol/L AS组成的共培养培养基中，滴 加含活化好的所述含a血和p"基因植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌 的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28'C暗培养3d，以滴加在不带有目的基因的 根癌农杆菌的1/2 MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。③ 抗性再生植株的筛选将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到MS 、 0. 5 mg/L 6-BA 、 0. 05 mg/L NM、 50 mg/L Kan和500mg/L Cb组成的发芽筛选培养基上于25°C 、 16h/8h光照培养，每两 周继代培养一次，经过2次-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛 生芽剪下转入1/2MS0和125mg/LCb组成生根培养基上培养至生根，从而获得Kan抗性 再生青蒿植株。④ 转基因青蒿植株的PCR检测根据目的基因所在表达盒p35s-adsi-nos序列A fe和a血i分别设计正向引物设计 和反向引物对目的基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出 958bp的特异DNA片段。而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。根据目的基因所在表达盒p35s-tp-pts-nos序列p35s和tp-pts分别设计正向引物 设计和反向引物对目的基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增 出2966bp的特异DNA片段。而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。步骤五，对获得的转基因青蒿中广藿香醇含量进行HPLC-ELSD测定① HPLC-ELSD条件及系统适用性以及标准溶液的配制HPLC:采用water alliance 2695系统，色谱柱为C-18反相硅胶柱，此硅胶柱是 由Waters公司生产SymraetryShieldTMC18，具体规格为膜厚5pm，长度x内径250mm x 4.6mm;流动相为甲醇与水，其中甲醇与水的体积比为70:30，此比例下广藿香醇的 保留时间为5. 1 min，峰型良好；柱温30。C;流速1. OmL/min;进样量10 ^L;灵敏度 AUFS=1. 0;理论塔板数按广藿香醇峰计算不低于2000。ELSD:采用water alliance 2420系统，蒸发光散射检测器漂移管温度40°C,放大 系数为7，载气压力5 bar;称取2. 0 mg Sigma公司生产的广藿香醇标准品用lmL甲醇完全溶解，得到2 mg/mL 广藿香醇标准品溶液，保存于-2(TC备用。② 标准曲线的制作将对照品溶液在相应色谱条件下分别进样2(Ld、 4pl、 6(lJ、 8pl、 10^1，记录图谱 及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品含量(X， pg)进行回归分析。结果标明，广藿香 醇在4pg-20ng范围内呈现良好的log-log线性关系，广藿香醇对照品的log-log线性 回归方程为Y=1.28e+000X+4. 71e+000， R=0. 979546。③ 样品的制备和广藿香醇含量的测定广藿香醇的提取过程基于((Journal of Chromatography A》(色谱杂志A) 2006年 6月23日第1118巻第2期180-187页由Van Nieuwerburgh等人报道的方法取 lg-2g鲜重的青蒿叶片，于50ml试管中将其浸没在10ml氯仿中摇荡1分钟，将浸出液 倒入新的试管中使氯仿挥发完全，取3 ml无水乙醇充分溶解提取物，用于HPLC检测。采用HPLC-ELSD测定广藿香醇含量，样品进样体积为2(^1,根据峰面积代入线形回 归方程计算出样品中的广藿香醇含量(mg)，再除以样品的青蒿叶湿重(g)，从而计算出 青蒿植株中广藿香醇的含量。结果表明，本实施例青蒿中广藿香醇的含量达到湿重的1%， 是非转化普通青蒿的1000倍。实施例2本实施例中步骤一、步骤三及步骤五均同实施例l，本实施例与实施例1所不同之 处在于步骤二中①、②和③均同实施例1，不同之处在于，④ 中间载体pCAMBIA2300: :cyp71avl promoter-gus-nos的构建-gus-nos，回收cyp71avl promoter和pCAMBIA2300: :p35S -gus-nos大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。⑤植物表达载体pCAMBIA2300:: cyp71avl promoter -tp-pts-nos的构建以pCAMBIA2300:: cyp71avl promoter -gus-nos为表达载体，用tp-pts基因替换 其上gus基因。利用BamHI/SacI双酶切pGEM T-easy+tp-pts和pCAMBIA2300:: cyp71avl promoter -gus-nos， 回收tp-pts禾口 pCAMBIA2300:: cyp71avl promoter -gus-nos大 片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。步骤四中①、②和③均同实施例1，不同之处在于，④转基因青蒿植株的PCR检测根据目的基因所在表达盒cyp71avl promoter- hairpin ads -nos序歹!j c/p77sW promoter和力w'r贝'77aA分别设计正向引物设计和反向引物对目的基因进行检测。结果 表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出990bp的特异DNA片段，而以非转化青蒿 基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。根据目的基因所在表达盒cyp71avl promoter-tp-pts-nos序歹ij cyp71avl promoter 和tp-pts分别设计正向引物设计和反向引物对目的基因进行检测。结果表明，利用所 设计的PCR特异引物，能扩增出2998 bp的特异DNA片段，而以非转化青蒿基因组DNA 为模板时，没有扩增出任何片段。结果表明，本实施例青蒿中广藿香醇的含量达到湿重的1.02%，是非转化普通青蒿 的1020倍。<110〉上海交通大学<120>利用p"基因和RNA干扰a&基因提高青蒿广藿香醇含量的方法<160> 3<170> Patentln version 3. 1<210> 1<211> 1641<212> ■〈213〉 青蒿(Artemisia annua L )〈400〉 1atgtcacttaacctattcgccccattgccaactttcctcc犯gcatttgg60gg卿tcagtttctcatctagt卿gc犯ggggtgg犯C3gateigtg犯t120gatttaaaaa犯g卿tgcggcaactactatggatattcctatga犯cat180gCC犯ttt3ttgaagctgattgatga犯tccaacgccttgg冊t3CCgt3tcactttgaa240cggg卿ttgatcatgcattgcaatgtattctgg犯tggt300gaccgctcttccttatggttccgtcttatgcggLaagcaaggatattatgttacatgtgat360gttttcaataca犯犯tggagcgttcaagc犯tcgttsgct犯tgatgtt420g卿gUtgcttgagttgtacg33gcaacttc城gagggt3CCtgggg3ga/ttatatta480g犯gatgctcttggttttacacgatctcgtcttagcsttatgctttttct540ac犯3ccccgctctttttaccga犯tax:a^cgggcactaaagcaacccct600ttgCC33g犯t卿ggcggcgC3gt3C3ttcctttctatcttctcataac660ttaaacttgct犯gtt3gagttcaatttgcttcagtcattgcacaaggaa720gagctcagccatgtgtgc犯3tggtgg犯3gctttcgatacgcaccttgt780g犯ttgttgaatgctacttttgggg3Ct3ggttC3ggCt3tgagccacag840tattcccgggctagagttttcttcacaa犯gctgttgctgttataactcttatagatgac900acttatgatgcgtatggtaccttaagatctttactgaagctgttgaa鄉960tggtcaattacatgcttagacacacttccacaaattattc翻atggataca/tgg33ga^tttcttgcaaagg3ggg犯g犯Ca^gatctattt1080aactgcggcfi38g犯tttgtga犯gagtttgttagaaacctg3tggttg3agcaaaatgg1140gC3冊tg3gggacacataccgagcatgatccagttgtaatcattactggc1200ggtgctaacctgcttacaacaacttgtta/tcttggcatgagtgatatatt1260tctgtcgaatgggctgtctctgcacctcctctttttagatactcaggtatacttggtcga1320cgcctaaatgatctcstgacccac朋ggccttcatcgagc1380cttgaaagttatatgaagga8Ltat犯tgtCatgcccaaaccttgatttac1440^gg卿tog卿atgtgtgtaaaaacat t1500ccaaggccgttattgatggctgtgatctatttgtgccagtttcttgaagttcaatatgca1560acttC3cacgtatggg,cgtctctactc1620gtttatcctatgagteit^tga 1641〈110〉上海交通大学<120>利用p"基因和RNA干扰^fe基因提高青蒿广藿香醇含量的方法<160〉 3<170〉 Patentln version 3. 1〈210〉 2<211> 1689<212〉 DNA<213> 广藿香(Pogostemon cablin)<400> 2ggggg8柳tctagctgcatg卿gagctcatggagttgtatgcccaaagtgttggsgtg60ggtgctgcttctcgtcctcttgcgaattttcatccatgtgtgtgggg卿caaattcatt120gtctac肌cccac肌tcatgcc鄉ctggag卿gag鄉鄉ctgaggagctga卿tg180g卿gctg犯ggaagcatcagac肌ctacatgcggcaactgaaaatggtg240ggLtgcaatac3gLCg3tt3ggcattgeictatctttttgtgg犯g3tgttgstga^gctttg300aagaatctgtttg肌atgtttgatgctttctgc犯g肌tagcacgccact360gctctcagctttcgccttctcagacaacatgg咖c卿gtttcatgtga8gtttttg犯420aagttt犯gg3tggca犯gagttccaaatg郷atggsgcggttgcagtc480cttgaattcttcgaagccacgcatctC3gagtccstggag犯gacgtccttgat冊tgct540tttgacttcactaggaactacttggaatcagtctatgc犯ctttgaacgatcc犯ccgcg600aaacaagtcc3caacgcattg犯tgagttctcttttcgaagaggattgccacgcgtgg犯660gcaaggaagtacatatcaatctacgagc肌tacgcatctccttgctcaaa720cttgctaagctgg3tttC犯cttggtacaagCtttgC3C3g犯ggg鄉tgagtg卿at780tctaggtggtggaagactttac犯gtgcccac犯eigctatcattcgttag3g3tCg3ttg840gtggagtcctacttctgggcttcgggatcttstttcga3Ccgaatta/ttcggt3gCt3gg900atgattttagcaaaagggctggctg城tatctcttatggatgatgtgtatgatgcatat960ggt3Cttttg犯tgttcacagatgc犯tcg犯鄉tggg3tgcttcatgt1020ttagat犯acttccag3ttacatgaaaatagt3t3C33ggcccttttggatgtgtttgag1080g卿Ugacg鄉3gttgatcaagctaggcgcaccatatcgagcctactaitggaaaagaa1140gccatg犯atacgccgcgagagcttacatggaeigaggccc犯tggaggga1200aaacccacaacc肌ggsgtatatgaagctggcaaccaagacatgtggctacataactcta1260ataatattatcatgtcttgg敏gg犯gagggC3ttgtgaCC犯3g肌gCcttcgattgg1320gtgttctcccgacctcctttcatcgaggctacattaatcattgccaggctcgtcaatga/t1380attacaggacscgagtttgagagcacgttcgcactgcagtagaa/tgctac1440atggaagagc8C犯3gtgggg卿c卿aggtggtgtctgcca犯tggag1500tcagcatggatgaggggttcttgaatttccaatccctcta1560ctttatcttattctcaattc3gtCCg33C3Cttg3ggtt3ttt3ca犯g3gggcgattcg1620tatacacacgtgggtcctgcagttgtaccttcaxxctgtt1680ccatattaa 1689 <110>上海交通大学〈120>利用pts基因和RNA千扰a&基因提高青蒿广藿香醇含量的方法 <160> 3〈170> Patentln version 3.1 <210> 3 <211〉 177 <212> DNA<213〉 拟南芥(Aribdopsis) <400> 3atggcttcct ctatgctctc ctccgccgct gtggttacat ccccggctca ggccaccatg 60 gtcgctccat tcaccggctt gaagtcatcc gctgcattcc cggtcacccg caagaccaac 120 aaggacatc3 cttccatcgc aagc肌cggg ggaag3tcta gctgcatgaa gg8gctc 17权利要求
1、一种利用pts基因和RNA干扰ads基因提高青蒿广藿香醇含量的方法，其特征在于，包括步骤为步骤一，获得青蒿素生物合成途径关键酶基因ads部分序列，广藿香醇生物合成途径关键酶基因pts全部阅读框序列和拟南芥中质体定位信号肽的tp片段；步骤二，将获得的ads基因部分序列构建成发夹结构，然后将发夹结构和质体定位的pts基因分别连于表达调控序列上，得到含adsi和质体定位的pts基因的植物表达载体；步骤三，用含adsi和质体定位的pts基因的植物表达载体转化根癌农杆菌；步骤四，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿外植体，PCR检测，获得转基因青蒿植株；步骤五，对获得的转基因青蒿中广藿香醇含量进行测定。
2、 根据权利要求1所述的利用p"基因和RNA干扰a血基因提高青蒿广藿香醇含 量的方法，其特征是，步骤二中，所述质体定位的p"基因由/^55或cj^77aW基 启 动子启动。
3、 根据权利要求1所述的利用pts基因和RNA干扰s血基因提高青蒿广藿香醇含 量的方法，其特征是，步骤四中，所述PCR检测具体为，分别设计合成检测a血 和检 测质体定位的p"基因的引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带为阳性的植株 即为转基因青蒿植株。
4、 根据权利要求1所述的利用p"基因和RNA干扰a血基因提高青蒿广藿香醇含 量的方法，其特征是，步骤五中，所述测定具体为HPLC-ELSD法检测，色谱柱C-18 反相硅胶柱，流动相为甲醇与水，柱温30。C，流速1.0mL/min，进样量10 ^L，蒸发光 散射检测器漂移管温度4(TC，放大系数为7，载气压力5bar。
5、 根据权利要求4所述的利用p"基因和RNA干扰a血基因提高青蒿广藿香醇含 量的方法，其特征是，所述的流动相中甲醇与水的体积比为70:30。
全文摘要
一种生物技术领域的利用pts基因和RNA干扰ads基因提高青蒿广藿香醇含量的方法，具体步骤为获得基因ads部分序列和基因pts全部阅读框序列以及拟南芥中质体定位信号肽的tp片段；将构建成发夹结构的ads基因部分序列和质体定位的pts基因分别连于表达调控序列上，形成含adsi和质体定位的pts基因的植物表达载体；利用构建的植物表达载体转化根癌农杆菌；利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿外植体；HPLC-ELSD测定转基因青蒿中广藿香醇的含量。本发明建立了一种提高广藿香醇含量的方法，为利用转基因青蒿大规模生产广藿香醇以及除青蒿素外的其他萜类等次生代谢物奠定坚实的基础。
文档编号C12N15/82GK101597620SQ20091005078
公开日2009年12月9日 申请日期2009年5月7日 优先权日2009年5月7日
发明者唐克轩, 唐岳立, 王玥月 申请人:上海交通大学