广藿香多倍体的诱导方法
【专利摘要】本发明公开了一种广藿香多倍体的诱导方法，本发明首次以广藿香愈伤组织再生的丛生芽为诱导材料，利用秋水仙素浸剂法将丛生芽的茎尖进行多倍体诱导，再将诱导后的茎尖去分化和再分化得多倍体植株。本发明的诱导材料结合所采用的诱导培养方法，显著提高了广藿香多倍体的诱导率，高达63.3%，成活率100%，以及降低了嵌合体的发生率，仅为10%。本发明获得的广藿香多倍体成稳定性好，经过无性扦插繁殖2代后，其性状仍与诱导当代相似。本发明获得的广藿香四倍体叶面积、茎等都较二倍体大许多，分枝数也更多，有利于提高广藿香油的产量，促进广藿香油品质的改善，实现广藿香优质高产的目的，满足人们对广藿香药材及其相关产品品质的需求。
【专利说明】广藿香多倍体的诱导方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及离体培养和秋水仙素处理结合选育多倍体的方法，具体涉及广藿香多倍体的诱导方法，属于多倍体育种【技术领域】。
【背景技术】
[0002]广藿香iPogostemon cab I in ( Blanco) Benth)为唇形科刺蕊草属多年生草本植物，被历代医家视为暑湿时令之要药，临床应用广泛，疗效较佳，是著名的道地南药。此外，从广藿香中提取的广藿香油还是医药工业和轻化工业的重要原料，可用于配制各种剂型、化妆护肤品、定香剂和杀虫剂等。广藿香引种到我国南亚热带地区种植后，由于气候等生态条件不同，引进我国栽培后罕见开花结籽，有时开了花，但花药败育，所以多采用扦插的繁殖方式。由于长期采用扦插繁殖，引起品种退化、植株生长缓慢、参差不齐，病虫害发生率高、抗逆性弱，导致产量及品质下降，迫切需要进行新品种选育。
[0003]植物多倍体具有器官巨大性、抗逆性增强的特点，器官的增大不仅能提高相应部位入药的药材的产量，而且增加药材的品质，其有效成分含量相应增加，抗逆性也增强。广藿香入药部位是植株地上部分，其总挥发油含量主要分布在植株的叶片、茎中，对其进行多倍体育种是改进其品质的重要途径。
[0004]多倍体主要来源于自然突变和人工诱变，其中人工诱变方法包括物理和化学方法。化学诱变中秋水仙素是最为常用的药剂之一，已成功在众多农作物、园艺植物和一些药用植物中诱导出多倍体并推广使用。常见的化学诱变剂有秋水仙碱和除草剂，如氨氟乐灵、氨磺乐灵、甲酰胺草磷、氧乐灵等，其中秋水仙碱是至今发现的加倍效果最好，使用最广泛的染色体加倍剂。应用组织培养技术培育多倍体是组织培养技术发展的一个新的领域，它是组织培养技术与秋水仙碱化学诱导技术的有机结合。化学诱变与组织培养的结合，使得多倍体诱导中融入了组织培养的优点，试验条件易于控制，且可以缩短育种时间，由于组织培养能实现快速繁殖，多倍·体诱导时可一次处理大量的植物材料，大大的加快了育种进程，可获得更多的多倍体材料，另外由于所选材料大多幼嫩，且处在分生状态的组织细胞，容易受秋水仙碱的影响，诱导成功率较高，且多倍体纯度高。常用的诱导方式有浸溃法、点滴法和混培法，以上三种方法各有利弊，对于不同植物材料的诱导也产生了不同的加倍效果。秋水仙碱是一种有毒试剂，处理不当会对植物造成伤害，秋水仙碱处理的浓度和时间因诱导的方法和材料的不同有所差异，其有效浓度为0.01%~1%，一般0.2%~0.4%应用最广。
[0005]多倍体诱导方法早期研究主要采用原位诱导法，即把供试植物的种子、正在生长的幼苗、茎尖等在非离体条件下用不同浓度的诱变剂处理，从而诱导染色体加倍。处理的方法有浸泡法、注射法、涂抹法及包埋法等。尽管这些方法都能获得多倍体，但往往存在嵌合体几率高的现象。近年来随着生物技术的发展，离体培养加倍法开始盛行，从已有报道来看，该方法的主要途径有两条:一是在组织培养过程中，用秋水仙素水溶液直接处理培养材料；二是用含有秋水仙素的固体培养基将材料培养一段时间，再转入分化培养基，再由变异细胞分化出完整植株。离体加倍培养法由于试验条件易于控制，变异植株受环境影响造成的回复突变现象减少，试验结果重复性强。然而，多倍体诱导的关键问题之一是出现嵌合体，尽管嵌合体是诱导多倍体中一种较常见的现象，材料选取不当往往造成多倍体细胞比例少，很快被二倍体取代。
【发明内容】
[0006]为了解决上述问题，本发明通过选取特定的诱导材料、改进诱导和培养方法，建立了一种诱导率高、嵌合体发生率低的广藿香多倍体的诱导方法。
[0007]本发明的目的在于提供一种广藿香多倍体的诱导方法。
[0008]本发明所采取的技术方案是:
一种广藿香多倍体的诱导方法，其特征在于:包括以下步骤:
1)愈伤组织的诱导:取广藿香的叶片，消毒，洗净，在无菌条件下，剪成1~2cm2的小片，接种至愈伤组织培养基中，进行愈伤组织培养12~14天，获得愈伤组织；
2)丛生芽的诱导:在无菌条件下，将愈伤组织转接到丛生芽培养基中培养26~30天，获得丛生芽；
3)秋水仙素处理:在无菌条件下，剪取0.5~1cm长的丛生芽茎尖浸泡于0.3~
0.5g.L-1的秋水仙素溶液中，黑暗条件下振荡24~72h ；
4)恢复培养:在无菌条件下，将秋水仙素处理后的丛生芽茎尖用无菌水洗干净，接种于愈伤组织培养基中培养12~14天后，再接种于丛生芽培养基中培养26~30天，获得多倍体丛生芽；
5)增殖培养:将多倍体丛生芽接种到新的丛生芽培养基中进行增殖培养20~25天；
6)多倍体鉴定:取增殖培养后丛生芽的茎尖进行染色体数目观察，在一个根尖上同时观察到5个以上分裂相染色体数目加倍，即可确证该变异株系为多倍体；
7)生根培养:在无菌条件下，将鉴定为多倍体的株系从基部切下，转接到生根培养基中培养8~15天，获得生根苗；
8)炼苗:取出生根苗，转接到装有蛭石和砂子的盆中，在室内炼苗培养28~40天；
9)移苗:炼苗后，将盆苗移到室外，或者将苗从盆中移栽到田间，遮上有70~85%遮阳率的阴棚，培养8~12天后，移去阴棚，进行田间栽培管理，即可。
[0009]进一步的，上述所有的愈伤组织培养基包含MS基本培养基、0.1~0.3mg.L-16_ΒΑ、0.4 ~0.6 mg.L 1 NAA>30 ~32g.L 1 鹿糖和 6.0 ~7.0 g.L 1 琼脂。
[0010]进一步的，上述所有的丛生芽培养基包含MS基础培养基、0.1~0.3mg -L-1 6-BA、30~32g.L-1鹿糖和6.0~7.0 g.L-1琼脂。
[0011]进一步的，上述所有的生根培养基包含1/2MS基础培养基、0.1~0.3 mg -L-1 IBA、30~32g.L-1鹿糖和6.0~7.0 g.L-1琼脂。
[0012]进一步的，上述所有的愈伤组织培养的条件为:温度28~30°C、光照强度为1000~1200Lx、光照周期8~12h光照/12~16h黑暗。
[0013]进一步的，上述所有的丛生芽培养条件、生根培养条件、炼苗培养条件独立为:温度25°C~28°C、光照强度为1000~1200Lx、光照周期8~12h光照/12~16h黑暗。
[0014]进一步的，步骤8)所述的蛭石和砂子的体积比为1: (1~1.5)。
[0015]本发明的有益效果是:本发明首次以广藿香愈伤组织再生的丛生芽为诱导材料，利用秋水仙素浸泡法将丛生芽的茎尖进行多倍体诱导，再将诱导后的茎尖去分化和再分化，获得多倍体植株，诱导结果显示，本发明选取的诱导材料结合本发明采用的诱导和培养方法，显著提高了广藿香多倍体的诱导率(高达63.33% )、及降低了嵌合体的发生率(仅为10%)。
[0016]本发明获得的广藿香多倍体成活率100%，且稳定性好，经过无性扦插繁殖2代后，其性状仍与诱导当代相似。
[0017]本发明获得的广藿香植株较二倍体巨大，其叶面积、茎较二倍体大许多，且分枝数也更多，其有效成分广藿香油含量也显著高于二倍体，有助于提高对广藿香油提取的产量，促进广藿香油品质的改善，实现广藿香优质高产的目的，满足人们对广藿香药材及其相关产品品质的需求。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为广藿香二倍体与四倍体盆栽植株；
图2广藿香田间栽培植株，A为田间栽培的广藿香二倍体植株，B为田间栽培的广藿香四倍体植株；
图3广藿香染色体观察图，A为广藿香二倍体的染色体，2η = 2X14= 28，Β为广藿香四倍体的染色体，4η = 4X14=56。
【具体实施方式】
[0019]以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0020]实施例1:
O愈伤组织的诱导:以健康植株的成熟叶片为材料，在70%酒精中洗涤15s后，再用
0.1%升萊消毒8~IOmin,无菌水洗漆4次,将处理的叶片剪成I~2cm2的小片,接种至愈伤组织培养基(含MS基础培养基、0.2mg.1 6-ΒΑ、0.5 mg.1 ΝΑΑ、30~32g.1蔗糖和6.0~7.0 g.L—1琼脂)中，在28~30°C，光照强度为1000~1200Lx，光照周期IOh光照/24h黑暗的条件下培养12~14天，获得愈伤组织；
2)丛生芽诱导:将愈伤组织转接到丛生芽培养基(含MS基础培养基、0.1 mg-L^-BA,30~32g 蔗糖和6.0~7.0 g-1琼脂)培养4周左右，获得大量丛生芽，培养条件为温度25°C~28°C，光照强度1000~1200Lx、光照周期8~12h光照/12~16h ；
3)秋水仙素处理:在无菌条件下，剪取0.5~Icm长的丛生芽茎尖浸泡在0.4 g.1浓度的秋水仙素中，室温黑暗条件下振荡培养24~72h ；
4)恢复培养:在无菌条件下，将处理后丛生芽茎尖用无菌水冲洗干净，接种于愈伤组织培养基，培养2周左右获得愈伤组织，培养条件同步骤I);再将愈伤组织转接至丛生芽培养基，培养4周左右，获得大量丛生芽，培养条件同步骤2)；
5)增殖培养:恢复培养后，将处理组与对照组的丛生芽比较，筛选株高度、茎粗度、节间距、叶面积、叶片厚度、气孔密度、气孔大小等特征变异较大的丛生芽接种到新的丛生芽培养基中进行增殖培养20~25天，培养条件同步骤2)；
6 )多倍体鉴定:增殖培养后，选择外观表形稳定的变异株系，将其茎尖压片，观察染色体数目，在一个茎尖上同时观察到5个以上分裂相染色体数目加倍(如图3所示)，即可确定该变异株系为多倍体，以步骤3)中处理的茎尖数为基数，统计多倍体的诱导率为63.33% ；
7)生根培养:将鉴定为多倍体的株系，从基部切下，转接到生根培养基(含1/2MS基础培养基、0.2 mg.L—1 IBA,30~32g.L—1蔗糖和6.0~7.0 g.L—1琼脂)诱导生根，培养8~15天，获得生根苗，培养条件同步骤2)；
8)炼苗:取出生根苗，洗去培养基，转接到含有体积比为1:(1~1.5)的蛭石和砂子的盆中进行炼苗，炼苗培养30天左右，培养条件同步骤2)；
9)移苗:炼苗后，将盆苗移至室外，或者将苗从盆中移栽至田间，盖上有70~80%遮阳率的阴棚，培养10天左右，移去阴棚，进行正常的田间栽培管理，幼苗生长健壮(如图1和图2所示)，所有诱导成功的多倍体都存活，存活率达100%。
[0021]将实施例中诱导方法的效果与其他常用诱导方法的效果进行比较。
[0022]在本发明过程中，还选取了幼苗茎尖、成熟植株茎尖、愈伤组织作为诱导材料进行广藿香多倍体诱导，其多倍体诱导效果与实施例1的进行比较，比较结果如表1所示。
[0023]表1不同广藿香诱导材料的多倍体诱导效果比较
【权利要求】
1.一种广藿香多倍体的诱导方法，其特征在于:包括以下步骤: O愈伤组织的诱导:取广藿香的叶片，消毒，洗净，在无菌条件下，剪成I~2cm2的小片，接种至愈伤组织培养基中培养12~14天，获得愈伤组织； 2)丛生芽的诱导:在无菌条件下，将愈伤组织转接到丛生芽培养基中培养26~30天，获得丛生芽； 3)秋水仙素处理:在无菌条件下，剪取0.5~Icm长的丛生芽茎尖浸泡于0.3~0.5gL-1的秋水仙素溶液中，黑暗条件下振荡24~72h ； 4)恢复培养:在无菌条件下，将秋水仙素处理后的丛生芽茎尖用无菌水洗干净，接种于愈伤组织培养基中培养 12~14天后，再接种于丛生芽培养基中培养26~30天，获得多倍体丛生芽； 5)增殖培养:将多倍体丛生芽接种到新的丛生芽培养基中进行增殖培养20~25天； 6)多倍体鉴定:取增殖培养后丛生芽的茎尖进行染色体数目观察，在一个根尖上同时观察到5个以上分裂相染色体数目加倍，即可确证该变异株系为多倍体； 7)生根培养:在无菌条件下，将鉴定为多倍体的株系从基部切下，转接到生根培养基中培养8~15天，获得生根苗； 8)炼苗:取出生根苗，转接到装有蛭石和砂子的盆中，在室内炼苗培养28~40天； 9)移苗:炼苗后，将盆苗移到室外，或者将苗从盆中移栽到田间，遮上有70~85%遮阳率的阴棚，培养8~12天后，移去阴棚，进行田间栽培管理，即可。
2.根据权利要求1所述一种广藿香多倍体的诱导方法，其特征在于:所述的愈伤组织培养基包含 MS 基本培养基、0.1 ~0.3mg.I/1 6_ΒΑ、0.4 ~0.6 mg.L-1 ΝΑΑ、30 ~32g.L-1蔗糖和6.0~7.0 g.L—1琼脂。
3.根据权利要求1所述一种广藿香多倍体的诱导方法，其特征在于:所述的丛生芽培养基包含MS基础培养基、0.1~0.3mg.L-1 6-BA、30~32g.L-1蔗糖和6.0~7.0 g.L-1琼脂。
4.根据权利要求1所述一种广藿香多倍体的诱导方法，其特征在于:所述的生根培养基包含1/2MS基础培养基、0.1~0.3 mg.L—1 IBA,30~32g.L—1蔗糖和6.0~7.0 g.L—1琼脂。
5.根据权利要求1所述一种广藿香多倍体的诱导方法，其特征在于:所述的愈伤组织培养的条件为:温度28~30°C、光照强度为1000~1200Lx、光照周期8~12h光照/12~16h黑暗。
6.根据权利要求1所述一种广藿香多倍体的诱导方法，其特征在于:丛生芽培养条件、生根培养条件、炼苗培养条件独立为:温度25V~28°C、光照强度为1000~1200Lx、光照周期8~12h光照/12~16h黑暗。
7.根据根据权利要求1所述一种广藿香多倍体的诱导方法，其特征在于:步骤8)所述的輕石和砂子的体积比为1:(1~1.5)。
【文档编号】A01H4/00GK103704132SQ201310657063
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月5日 优先权日:2013年12月5日
【发明者】李明, 梁生旺, 杨全, 伍彧 申请人:广东药学院