少 RT-PCR阵列间的样品变异，基于其相对表达（相对于各个阵列上的总体miRNA表达，使用中 值标准化分析）比较血浆微泡和PBMC之间的miRNA (PMID :16854228)。通过控制供体的性 别和年龄，线性混合模型用于评估血浆微泡和PBMC之间的特定miRNA的差异。基于评估的 均值差异计算倍数变化。
[0124] 用通过针对各个组织的过滤标准的miRNA产生热图并且基于miRNA的相对平均表 达，对miRNA层次聚类。还基于血浆微泡和PBMC的miRNA的原始CT得分，对miRNA表达进 行排列。进行另外的统计分析（例如AN0VA)以确定在两个处理组之间显著表达的miRNA。
[0125] 途径分析和预测。用 miRanda(microrna. sanger. ac. uk/targets/v5/)确定预测 的miRNA革E。基于miRanda算法，产生各个祀的得分，仅大于17的得分进一步用Ingenuity Pathway Analysis 软件（Ingenuity Systems，Redwood City, CA)分析。使用该软件，基于 miRNA的革El确定经典途径。检查数据集以基于miRNA的革El的基因本体（ontology)确定相关 的途径。
[0126] 结果
[0127] 外周血微泡亚群
[0128] 最初，我们检查正常健康个体的外周血内的微泡的细胞来源。使用流式细胞术，我 们发现大多数外周血微泡源于血小板（图4)，如之前报道的（PMID :10648405)。
[0129] 我们还观察到第二大的微泡群体，其来源于单核细胞吞噬细胞谱系。用检测单核 吞噬细胞上的表面抗原的抗体对该群体免疫染色。特别地，仅小百分比的外周血微泡来源 于T-细胞和嗜中性粒细胞。我们未能检测到来源于B细胞的微泡（数据未显示）。有趣的 是，我们检测到表达来自内皮细胞的表面抗原的小的微泡亚群。
[0130] 血浆微泡和PBMC中的miRNA表达
[0131] 为了检测外周血内的微泡区室中是否包含miRNA以使得能够在体内的不同组织 之间进行联系和影响遗传变化，我们对来自血浆的纯化的微泡进行miRNA特征谱分析。我 们分析来自51个不吸烟的健康个体（包括27个男性和24个女性）的微泡的所有亚群。为 了确定微泡和PBMC之间的miRNA表达是否存在差异，我们还从各个供体纯化了 PBMC。进行 实时PCR分析以检查420种miRNA的表达。对过滤的数据进行层次聚类分析，比较PBMC和 血浆样品之间的miRNA表达特征谱（图5A)。
[0132] 除了三种以外的所有PBMC样品与微泡样品分别聚类，表明两组之间的miRNA表达 特征谱显著不同。基于减少背景噪声的过滤标准，我们发现微泡和PBMC样品中分别表达 104 种和 75 种 miRNA (图 5B 和 5C)。
[0133] 在这些miRNA中，71种是各个样品组共有的（图OT)。特别地，仅两种miRNA， miR-031 和 29c 仅在 PBMC 样品中表达，而四种 miRNA(miR-127、-134、-485-5p 和-432)仅在 血浆级分中表达。显示了通常在血浆中表达的所有104种miRNA(表1I，在图7中显示）。
[0134] 年龄和性别的影响
[0135] 我们在任一样品组的miRNA表达中没有观察到年龄和/或性别的影响。特别地，女 性和男性供体的中值年龄都是29岁。最年长的个体是58岁，而最年轻的是21岁。因此， 我们进一步对数据分层以检查差异。年龄匹配的样品之间的检查没有显示对PBMC和微泡 样品之间的miRNA表达的任何显著的影响。当控制性别时，我们还将上四分位年龄与下四 分位年龄相比，各个组的平均年龄分别为48. 9±6. 2和21. 9±1. 2。然而，我们未能检测到 基于年龄的样品组之间的miRNA表达的显著差异（数据未显示）。
[0136] 微泡和PBMC中的miRNA表达的比较
[0137] 表1II，图8中显示的是来自所有个体的血浆微泡和PBMC中表达前十的miRNA。 对于血浆来说，表达前十的miRNA以递减的顺序为miR-223、-484、-191、-146a、-016、-02 6a、-222、-024、-126 和-32。而 PBMC 中高表达的是 miR-223、-150、-146b、-016、-484、-146 a、-191、-026a、-019b和-020a。微泡中表达前十的miRNA在100%的个体中被检测到。然 而，在PBMC样品中，在100%的个体中观察到除miR-150 (98%的供体）和miR-484 (89%的 供体）外的所有表达前十的miRNA。
[0138] 我们还发现PBMC和微泡的表达前十的miR中共有六种miR(miR-223、miR-484、 miR-191、miR-146a、miR-26a和miR-16)。特别地，在两个区室中最显著表达的miR都是 miR-223。基于各个单独供体的排序分析，确定特定miRNA出现在表达前十的miRNA中的频 率，miR-223在PBMC和微泡中的频率为100%。尽管miR-486的表达是血浆微泡中表达前 十的miRNA，但发现该miRNA仅在20%的个体特征谱中是表达前十。有趣地，在血浆微泡中 高表达的miRNA未被鉴定为组织特异性miR。
[0139] 我们进一步检查微泡和PBMC中分别具有大于>66 %和>88%的任意值的排序评分 (数据集的天然截断值）的miR的集体功能（collective function)。基于该标准，我们进 一步检查来自微泡和PBMC样品的排在前9的miR。因此，我们分析血浆中发现的miR-223、 -484、-191、-146&、-016、-026&、-222、-024、和-126的组合的功能。对于？81?：，我们检查下 列 miRNA 的组合的功能，miR-223、-150、-146b、-016、-484、-146a、-191、-026a 和-019b。 使用Sanger miRBase Target版本5,我们发现血衆微泡的组合的miR的1578个预测的革巴 (数据未显示）。计算机分析这些组合的靶以确定它们集体调控的途径。使用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)软件，我们发现参与代谢和获得性免疫系统的调控的经典途径受 这些显示的miRNA的表达高度调控（表1V，示于图9中，上部）。
[0140] 在检查的来自PBMC级分的9种miRNA中，我们发现了 1857个预测的mRNA靶（数 据未显示）。最后，由这些miRNA调控的前五的经典途径特别地是多种氨基酸和脂质代谢途 径（表1V，示于图9中，上部）。我们还从Sanger miRBase和TargetScan中发现了共有的 预测的靶并且确定了它们的功能（表1V，示于图9中，下部）。
[0141] 然后我们检查了在微泡和PBMC之间差异表达的miRNA。我们发现20种miRNA在 PBMC级分中与微泡样品相比具有三倍以上的表达增加（表V，示于图10)。相比之下，与 PBMC相比，15种miRNA在血浆微泡中显著表达。
[0142] 图11 :表VI显示在PBMC和血浆中表达的所有miRNA(检测器名称）的平均的标 准化的数据及各自的标准差。
[0143] 讨论
[0144] 在这些实施例中，发明人现表明miR在正常稳态条件下在外周血的微泡中循环。 此处，我们显示了 104种在血浆微泡中表达的miR并且miR表达显著不同于PBMC。到目前 为止，大量的研宄显示了 miR调节许多细胞功能的能力。然而，这些研宄大多暗含，miR处 于其宿主细胞内以引起作用（PMID :17923084)。我们的数据表明，微泡中包含的miRNA可 能是至远端细胞的联系信号以调节细胞稳态。
[0145] 微泡中的这些miRNA可循环至不同的组织靶。血浆微泡中表达最高的miRNA的进 一步检查证实很多这些功能调控造血和细胞分化程序（表1II，示于图8)。例如，miR-223 的表达调控骨髓、粒细胞和破骨细胞的分化（PMID :18278031，PMID :17471500, PMID : 16325577)。其还显示在造血干细胞增殖中起作用（PMID :18278031)。有趣地，miR-223在 急性髓性白血病（AML)中丧失（PMID :18056805)。相反，miR-126的下调在巨核细胞分化 期间发生（PMID :16549775)。特别地，miR-24的表达受TGF-β (其为造血的有效的正和 负调节子）调控（PMID :16123808, PMID :18353861)。在微泡中表达的 miR-24 和 miR-16 都调控红细胞产生（PMID :17906079, PMID :17976518)，而miR-16还调节淋巴发育（PMID : 16616063)。miR-16表达的丧失已在慢性淋巴细胞性白血病（CLL)中得到广泛验证（PMID : 17327404, PMID :17351108)。
[0146] 血浆微泡中表达的许多miR还调控细胞周期蛋白的进程（PMID:18365017， PMID :17914108)。MiR-222 靶向 p27Kipl (PMID :17914108)而 miR-24 抑制 pl6(INK4a) (PMID :18365017)。miR-16的增加的表达导致细胞在细胞周期的G0/G1期积累（PMID : 16123808)。相反，乳腺癌细胞中miR-126的表达增加细胞增殖和肿瘤生长但抑制转移 (PMID :18185580)。这通过血管细胞粘附分子-I (VCAMl)的调控发生（PMID :18227515)。
[0147] 与在血衆微泡中高表达的其他miR不同，miR_146a显示在不同的水平上发挥作 用。虽然已表明miR-146a作为肿瘤抑制因子起作用并且该miR的丧失与前列腺癌的发展 相关（PMID :18174313)，miR-146a 还调节免疫功能（PMID: 16885212, PMID: 18057241)。可 能该miR在血浆微泡中的表达定义免疫调节功能（表1V，示于图9)。
[0148] 基于检查靶的基因本体的IPA分析，预测受miR_146a表达影响的最相关网络是细 胞增殖，免疫和淋巴系统发育和功能。另外，预测该miR调控先天免疫应答。根据上述分析， 我们发现LPS/IL-1和toll样受体信号传导是预测受mir-146a调控的前五的经典途径之 〇
[0149] 到目前为止，还不清楚miR-484或miR-486的功能。与miR_146a相似，miR-484 和miR-486似乎作为免疫应答性的调节子起作用。特别地，基于相对表达，miR-484是微泡 级分中第二高表达的miR。预测模型表明该miR具有多种功能。与微泡中表达的很多其他 miR-样，预测miR-484调控造血作用。特别地，预测NK细胞信号传导和IL-4信号传导途 径是miR-484的靶，而miR-486调控抗原呈递。此外，miR-486显示调控细胞分化、增殖和 生长。
[0150] 虽然我们在血浆微泡中检测到104种miR，但存在许多在总miR特征谱中检测不 到的miR。血浆微泡中检测不到的miR也可用作疾病的生物标志物。最近，Lawrie等报道， 在患有B细胞淋巴瘤的患者的血浆中检测到miR(PMID :18318758)。该研宄表明miR-155、 miR-210和miR-21在来自这些患者的血浆中升高并且miR-21与复发有关。基于该研宄，我 们在正常个体中检测到miR-155和miR-21，但没有发现miR-210。有趣地，我们发现75%的 个体在血浆中表达miR-155而60%表达miR-21 (数据未显示）。
[0151] 因此，对于待用作疾病的预测标志物的这些miR，每个个体在疾病检测前将需要基 线。因此，miR-210的表达可用作B细胞淋巴瘤的较好的标志物。可以存在另外的关系。例 如，miR-203在血浆微泡中检测不到。该miR的升高的表达与膀胱癌和结肠腺癌有关并因 此可以用作生物标志物（PMID : 18230780, PMID :17826655)。
[0152] 对于在正常情况下表达而在疾病情况下丧失的血浆miR来说，可存在相反的关 系。例如，在急性淋巴细胞性白血病（ALL)中，miR-223下调（PMID :18056805)。因为 miR-223是血浆微泡中表达的最显著的miR，其减少的表达可用作ALL的诊断标志物。此外， miR-15a/16在慢性淋巴细胞性白血病（CLL)中丧失