一种检测阪崎克罗诺杆菌的方法及引物、探针和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测技术，特别涉及阪崎克罗诺杆菌核苷酸的引物和探针以及检 测阪崎克罗诺杆菌的方法。
【背景技术】
[0002] 阪崎克罗诺杆菌（Cronobactersakazakii)原名阪崎肠杆菌 (Enterobactersakazakii)是一种有周生鞭毛、能运动、兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆 菌。其流行病学调查显示，其感染病例大多数为婴幼儿，主要引起菌血症、脑膜炎、坏死性小 肠结膜炎等，并伴随有严重的神经系统后遗症。作为一种条件致病菌，其对特殊人群具有高 达40%~80%的致死率。克罗诺杆菌广泛分布在婴幼儿奶粉、奶酪、腌肉、水、蔬菜、大米、 面包、茶叶、草药、调味品及豆腐等多种食品及食品原料中。随着一系列与该菌相关的婴幼 儿奶粉召回和重大感染事件的爆发，婴幼儿配方奶粉中阪崎克罗诺杆菌的污染问题受到全 世界的关注。
[0003] 目前包括阪崎克罗诺杆菌在内的苏黎世克罗诺杆菌（C.turicensis)，丙二酸 盐克罗诺杆菌（C.malonaticus)，尤尼沃斯克罗诺杆菌（C.universails)，穆汀斯克罗 诺杆菌（C. muytjensii)，都柏林克罗诺杆菌（C. dublinensis)6个种的克罗诺杆菌证实 对人体具有致病性，而康帝蒙克罗诺杆菌（C. condiment)，以及2014年最新归类的三种 C. zurichensis，C. helveticus和C. pulveris等4种还未见能引起人体疾病的报道。克罗 诺杆菌属的各个种菌株对化学物质的敏感性以及温度和抗生素方面存在较大的差异，而且 各个菌的致病因子在特定情况下的表达也各不相同，从而导致的致病力也不尽相同。研宄 表明，阪崎克罗诺杆菌与丙二酸盐克罗诺杆菌是引起人类致病的主要菌株，具有更高的致 病性。阪崎克罗诺杆菌对外界有害因子抵抗力强，分布广，是污染克罗诺杆菌的奶粉中分离 出的主要菌株。因此在物种水平上对阪崎克罗诺杆菌进行快速和可靠的识别及检测在食品 污染检测和溯源以及临床和流行病学上具有十分重要的作用。目前对克罗诺杆菌的快速检 测主要存在以下三个方面问题：
[0004] 1)现有检测方法落后于克罗诺杆菌属在分类学上的发展。
[0005] 由于克罗诺杆菌属在分类上的不断发展，许多现有的检测方法，无法在菌种水平 上对克罗诺杆菌属进行区分，例如将实际为穆汀斯克罗诺杆菌ATCC 51329当做阪崎克罗 诺杆菌进行鉴定。这给食品污染检测和溯源以及临床和流行病学上的快速定型提出了难 题。
[0006] 2)现有的分子学方法无法适应DNA同源性极高各个种的克罗诺杆菌的特异检测。
[0007] 现有的阪崎克罗诺杆菌检测方法的主要难点在于阪崎克罗诺杆菌同其他克罗诺 杆菌以及肠杆菌科的其他细菌特别是阴沟肠杆菌在形态特征，生理生化特征方面具有高度 相似性，并有极高的DNA同源性。因此无论是FDA推荐对该菌的检测方法还是目前的各类 基于核苷酸片段的检出方法均存在选择性差的缺点，易出现假阳性或假阴性结果。目前已 被用于克罗诺杆菌属检测的基因有gluA、gyrB、dnaG、ompA、ropB以及zpx等。二鸟苷酸环 化酶广泛存在于各种食源性致病菌中，相关的某些基因片段在许多细菌中都具有高度的保 守性，如霍乱弧菌，沙门氏菌和大肠杆菌。而克罗诺杆菌属中参与编码二鸟苷酸环化酶的 cgcA基因不仅具有属内的保守性，且具有种间的等位基因的特异性差异，另外还能与肠杆 菌科其他细菌进行很好的区分。2012年cgcA基因首次被用于克罗诺杆菌属的快速分型研 宄中，但基于cgcA基因的克罗诺杆菌的核酸检测方法未见报道。
[0008] 3)现有的检测方法无法适应快速、特异和高通量的要求。
[0009] 现有的检测方法主要有基于生理生化实验的传统生化检测法和试剂盒法，基于分 子生物学的PCR法、基因芯片、HRM等方法。分子生物学方法比传统的生理生化方法具有快 速、高通量和快速的优点。其中基于荧光探针标记的荧光定量PCR方法，比普通PCR方法具 有更高的检出限和低污染，比HRM法具有更高的特异性，比基因芯片技术具有更低廉的成 本和可操作性。
[0010] 本发明在分析已报道阪崎克罗诺杆菌及其他克罗诺杆菌基因组序列的基础上，基 于CgcA基因分别设计引物及荧光探针实现阪崎克罗诺杆菌的特异性、快速检测。采用的荧 光PCR技术是在普通PCR的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物的同时再加入 一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术。
【发明内容】
[0011] 本发明所要解决的技术问题是提供一种用于阪崎克罗诺杆菌实时荧光定量PCR 检测的引物、探针序列，使得能够快速简单地判断样品是否有阪崎克罗诺杆菌，可用于各种 乳制品中致病菌的检测。为了降低对阪崎克罗诺杆菌的检测时间，提高阪崎克罗诺杆菌的 阳性检出率，本研宄运用基于TaqMam探针的荧光定量PCR技术，建立快速检测的方法。
[0012] 本发明针对阪崎克罗诺杆菌基因组的保守序列设计了用于荧光定量PCR检测的 引物及探针，建立了阪崎克罗诺杆菌荧光定量PCR检测技术，反应结束即可根据扩增曲线 判定是否有阪崎克罗诺杆菌。
[0013] 其中，上述反应条件可以是：95°C变性Imin ;以95°C 5s，60°C 40s扩增40个循环 (收集荧光）。为了解决上述技术问题，本发明在分析已报道阪崎克罗诺杆菌及其他克罗诺 杆菌基因组序列的基础上，基于cgcA基因分别设计引物及荧光探针，所述的引物由正向引 物和反向引物组成，其核苷酸序列如下：
[0014] 上游引物 CSPF753 序列为 5 'GCAGGTGCTGCTGCGAG3'（SEQ ID NO:2)
[0015] 下游引物 CSPR890 序列为 5'GCAGATTGTCTTTGTCATACCCG3'（SEQ ID NO:3)
[0016] 或者上述引物对的上游引物向5'端方向延伸10个碱基，向3'端方向延伸10个 碱基，下游引物向3'端方向延伸10个碱基，向5'端方向延伸10个碱基区域范围内得到的 引物序列。
[0017] 本发明设计的探针的核苷酸序列如下：
[0018] CSPB803:5 'TTGATCAGGTCGTCAGAATCTACGGGT3' （SEQ ID N0:4)
[0019] 或者上述探针序列向3'端方向延伸10个碱基和向5'端方向延伸10个碱基区域 范围内得到的探针序列。
[0020] 一种检测阪崎克罗诺杆菌的方法，包括如下步骤：
[0021] (1)将上述探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有猝灭荧光染料，得到标记 有荧光素的探针；
[0022] (2)以待测样品的DNA为模板，利用权利要求1所述的上、下游引物以及上述标记 有荧光素的探针进行实时荧光定量PCR反应，每个循环结束后采集数据；
[0023] (3)反应结束后根据扩增曲线判断是否有阪崎克罗诺杆菌。
[0024] 所述报告焚光染料采用下列焚光基团中的任意一种：Fam、Hex、Tet、Joe、Vic、 FITC、Cy3和Cy5 ;所述淬灭荧光染料采用下列荧光基团中的任意一种：Tamra、R〇X、Dabcyl、 BHQl 和 BHQ2。
[0025] 以25 μ 1的反应体系计，所述实时荧光定量PCR反应的条件为：
[0026]
[0027] 所述实时荧光定量PCR反应条件是：95°C变性Imin ;以95°C 5s，60°C 40s扩增40 个循环。
[0028] 一种检测阪崎克罗诺杆菌的试剂盒，包括上述上、下游引物以及探针。
[0029] 所述试剂盒还包括10XPCR Buffer、dNTPs和Taq酶。
[0030] 以25 μ 1的反应体系计，试剂盒的各组分如下：
[0031] IOXPCR Buffer 1 ~3μ1 dNTPs，各 1~3mM 1~3μ1 上、下游引物，各5~15 μ M 各1~2μ1 探针，5~15 μ M 0.2~0.8 μ 1 Taq 酶，2~IOU/μ 1 0·2~0.8μ1 RNase Free dH20 全少 8· 4 μ 1。
[0032] 以25 μ 1的反应体系计，试剂盒的各组分如下：
[0033] IOXPCR Buffer 2. 5 μ I dNTPs，各 2. 5mM 2μ I 上、下游引物，各IOuM 各1.5μ 1 探针，10 μ M 0. 5μ 1 Taq 酶，5U/μ I 0. 5 μ I RNase Free ClH2O 11. 5 μ 1〇
[0034] 本发明根据TaqMan技术，在常规PCR的基础上添加了一条标记有两个荧光染料基 团的核苷酸探针，例如将报告荧光染料标记的探针的5'端，淬灭荧光染料标记在探针的3' 端，两者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，当二者 距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增强。在扩增反应过程中，探针同模板上的 目的扩增片段杂交，由于Taq酶具有5'端到3'端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切 断，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，在扩增延伸阶段将探针切断， 淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，从而实现对阪崎克罗诺杆菌的检 测。
[0035] 当然，可以根据本发明给出的引物对或者其扩增产物序列设计其它类型的探针， 以适用不同方法的荧光PCR检测。
[0036] 本发明采用的荧光PCR技术是在普通PCR的基础上，在扩增反应体系中加入一对 特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测 靶核苷酸序列的技术。除了具有普通PCR的优点外，它还具有以下优点：（1)特异性更强，灵 敏度更高：由于多使用了 一条可与模板互补配对的荧光探针，从而提高了特异性，并且由自 动化仪器收集荧光信号，避免了人工判断的主观性，又可进一步提高灵敏度；（2)定量更准 确可靠：全封闭反应，在线式实时监测荧光，无须PCR的对数期，摈弃普通PCR方法的受多因 素干扰的终点分析法；（3)适用范围更广：理论上可检测任何阪崎克罗诺杆菌的核酸；(4) 可实现单管双检或多检，还可设计针对性内标，监控抽提效率及排除抑制剂干扰；（ 5)不接 触有毒试剂，操作安全。但是，荧光定量PCR对引物的要求相对于普通PCR而言，更为苛刻。
[0037] 本发明根据阪崎克罗诺杆菌基因组序列设计的引物特异性好，用于荧光PCR检测 的灵敏度高。本发明检测方法准确性强，灵敏度高，其能够快速简单地判断样品是否有阪崎 克罗诺杆菌，为各种乳制品中阪崎克罗诺杆菌的鉴别诊断提供了科学依据。
【附图说明】
[0038] 图1是实时荧光定量PCR技术阪崎克罗诺杆菌核酸检测的特异性实验的检测结果 图；
[0039] 图2是发明检测方法的灵敏度实验的检测结果图；
[0040]图3是婴幼儿配方奶粉中阪崎克罗诺杆菌增菌检测结果图。
【具体实施方式】
[0041] 为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但是本 发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
[0042] 实施例1
[0043] 一种检测阪崎克罗诺杆菌的方法，按照以下步骤进行：