专利名称：一种高效诱导植物组织分化再生的培养方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养方法。
背景技术：
组织培养技术指在无菌条件下利用人工培养基对植物组织的培养。组织培养技术既可为遗传工程提供理想的受体材料，又可为常规植物改良程序提供新的手段，更多、更快、更好地的创造出新品种，在农业中具有广泛的用途；是转基因技术不可或缺的组成部分；可对重要和名贵植物品种进行快速繁殖；在作物脱毒中有着重要的实用意义等。
常规的组织培养是在包含植物生长所必须的营养成分的基本培养基基础上添加各种激素，利用植物细胞的全能性诱导其脱分化形成愈伤组织，然后分化出不定芽，最后诱导不定芽生根，形成完整植株。在整个培养过程的不同时期，通过调整激素的种类、浓度和配比来促进植物再生进程和优化植物生长状态。
在常规的组织培养过程中，可以采用调节作为植物激素的细胞激动素与生长素之间的浓度比例来产生分化的作用，即使产生的分化作用，其分化作用的频率也较低，需要建立更加有效的方法来增强诱导分化能力。
虽然目前利用组织培养技术已经在许多植物物种中成功的建立了离体再生体系，但是由于物种差异和培养条件的限制，很多植物的分化再生率不高、再生速度慢，还不能满足实际生产和研究的需要，因此，改良目前的组织培养技术，在更多植物中尤其是针对木本植物的诱导、分化，使其达到更高的分化再生率和再生速度，是非常关键的。
发明内容
本发明人在实际操作过程中研究出了一种比通常所用方法更为有效提高植物叶片的分化再生率的方法。即，本发明是在培养基中添加甜菜碱前体——甜菜碱醛(分子式见图1)，可以增加细胞的存活力，缩短了愈伤组织出芽时间，增强了愈伤组织的芽分化率，从而提高其分化再生率。已知的甜菜碱生理功能有渗透调节、保护抗氧化酶和光合作用相关酶、稳定细胞质膜结构、消除胁迫时产生的NH3毒害以及作为生物合成中的甲基供应剂等1，2，3，而且植物可以通过根吸收外源甜菜碱或者通过基因工程导入甜菜碱合成途径而增强抗盐、低温的能力4，5，6，7，然而大多数植物叶片不能直接吸收甜菜碱，但可以直接吸收甜菜碱前体——甜菜碱醛，因此，含有甜菜碱代谢途径的植物的叶片可以在组织培养过程中直接吸收培养基中的甜菜碱醛，并将其转化为甜菜碱，在胞内起到相应的生理作用，从而表现为分化再生能力的增强。
本发明的特征是在植物组织分化培养基中添加甜菜碱醛，将植物组织置于培养基表面，进行分化，出芽后转入MS基本培养基进行生根，得到再生植株。本发明能使植物组织在20～25天内分化出芽，使分化再生率由19.4％提高到51.6％，且30天内平均芽高大于1cm，比对照增加一倍以上。在分化速度上来讲，添加甜菜碱醛可以比对照提前5天出芽；从愈伤组织诱导和分化培养至再生芽转入生根培养基前，可缩短组织培养时间10-15天。
具体地，本发明一个方面提供了一种诱导植物组织分化再生的培养方法，其特征在于，在组织细胞中引入甜菜碱醛。
另一方面，按照本发明的方法，其中使用的甜菜碱醛的浓度为4～10mM，优选5mM。
另一方面，按照本发明的方法，其中引入该化学试剂的方法可以是，但不限于在培养基中直接加入，或采用其它方法如微注射等技术。
另一方面，按照本发明的方法，其中用于组织培养的培养基包括，但不限于常规已知的用于组织培养的培养基，如Murashige和Skoog培养基、Linsmaicr和Skoog培养基、White培养基、Gamborg B-5培养基、Nitsch培养基、Heller培养基、ER培养基、N6培养基等，其可以是液体培养基或含有凝胶剂的固体培养基，所述凝胶剂为0.1％-1％的琼脂、Gelrite或琼脂糖，或1％-8％卡拉胶。
另一方面，按照本发明的方法，所采用的植物培养组织包括通过切割的子叶、下胚轴、苗尖、茎、叶、根或其它组织制备的组织片。这些组织片通常可以用次氯酸钠、升汞或酒精灭菌之后使用。如果采用无菌培养的植物，上述灭菌程序可以忽略。此外，包括采用已知的方法对组织片进行组织培养所获得的愈伤组织在内的、未分化的无定形细胞。
另一方面，按照本发明的方法，其中用于植物细胞组织培养的培养方式可以是悬浮培养方式或常规的固体培养方式。
另一方面，本发明的方法适用的植物选自由莴苣、水稻、小麦、玉米、棉花、大豆、油菜、杨树、大麦、高梁、菠菜、甜菜、山菠菜等能代谢甜菜碱醛的所有植物所组成的组。
再一方面，本发明涉及使用本发明的方法获得的愈伤组织或丛生芽，以及由愈伤组织或丛生芽所分化出的植株。
另一方面，本发明还涉及本发明方法在植物组织培养中的应用。
在本发明中，术语“分化率”指由愈伤分化出芽点或芽的外植体数目占接种外植体数的百分比；“出芽率”指由愈伤分化出芽的外植体数目占接种外植体数的百分比。统计时间皆为接种外植体后23天。
在本发明中，MS基本培养基为Murashige和Skoog培养基(MurashigeT，Skoog F，1962，A revised medium for rapid growth and bioassay withtobacco tissue culture.Physiol.Plant.15473-497)的大量元素、微量元素、铁盐、有机成分，固体培养基为添加7％的卡拉胶(购自北京欣经科生物试剂公司)的培养基。
图1.甜菜碱醛的化学分子结构式。
图2.汉城散叶莴苣在添加甜菜碱醛(5mM)时的愈伤出芽情况。
a.接种外植体后23天；b.接种外植体后30天。
图3.汉城散叶莴苣生根的再生苗。
图4.汉城散叶莴苣在不添加甜菜碱醛时的愈伤出芽情况。
a.接种外植体后23天；b.接种外植体后30天。
图5.对照例和实施例1中汉城散叶莴苣的愈伤出芽率和分化率。
图6汉城散叶莴苣在添加甜菜碱醛(10mM)时的愈伤出芽情况。
a.接种外植体后23天；b.接种外植体后30天。
具体实施例方式
下面通过参考附图及实施例详细描述本发明。本领域的普通技术人员能够理解的是，本发明的实施例仅是为举例说明的目的，其不应以任何方式解释为对本发明的限制。
实施例1.汉城散叶莴苣的叶片再生植株的组织培养1.将汉城散叶莴苣种子(购自北京锦绣大地公司)用升汞浸5分钟，接到MS固体培养基上，24℃，光照12h/d培养，发芽后在MS固体培养基上继代培养。
2.取幼嫩莴苣真叶，叶径2-3cm，切成1cm×1cm的方块(外植体)，背面向上置于甜菜碱醛(购自美国DNA Polymerase Technology公司)浓度为5mM的愈伤诱导与分化固体培养基(愈伤诱导与分化培养基MS基本培养基+IAA(Sigma公司)1.0mg/L+6-BA(Sigma公司)0.2mg/L，pH为5.8)。
3.24℃，光照12h/d培养。
4.11天后外植体周边开始长出愈伤，20天左右开始分化出芽点或出芽，30天左右芽高达到1cm左右(见图2)。
5.待外植体出芽且芽高大于1.5cm后转入MS固体基本培养基上进行生根培养。
6.24℃，光照12h/d培养10天左右后，再生苗长出根部(见图3)。
对照例1。作为对照例的汉城散叶莴苣的叶片再生植株的组织培养除了在愈伤诱导与分化培养基中不加甜菜碱醛以外，以与实施例1相同的方式进行汉城散叶莴苣的叶片再生植株的组织培养。其中取外植体时将来自不同叶片的叶块混匀，使对照例和实施例中的外植体减少个体差异。参见图4。
在实施例1中，培养11天开始产生愈伤组织，培养23天后添加5mM甜菜碱醛培养基中出芽率达到51.6％，分化率达到83.9％。培养30天平均芽高大于等于1cm，转入生根培养基即可生根；而对照例同期愈伤生长的数量显著少于实施例1，同期出芽率19.4％，分化率41.9％，培养30天平均芽高不足1cm，尚不能进行生根(见图5)。
实施例2.不同浓度甜菜碱醛对诱导植物组织分化再生的影响在愈伤诱导与分化培养基中添加的甜菜碱醛浓度为4、6、10mM，以与实施例1和对照例1相同的方式进行汉城散叶莴苣的叶片再生植株的组织培养，皆能不同程度的促进莴苣的分化再生，分化率和再生率均高于对照例，但低于实施例1(见图6，以10mM为例，其余类似)，因此，5mM为甜菜碱醛促进莴苣叶片分化再生的最适浓度。
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7.张士功、高吉寅等，甜菜碱对NaCl胁迫下小麦细胞保护酶活性的影响。植物学通报，1999，16(4)429～432.
权利要求
1.一种诱导植物组织分化再生的培养方法，所述方法包含在所述植物组织的细胞中引入甜菜碱醛，其浓度为4-10mM；培养所述植物组织。
2.依照权利要求1的方法，其特征在于所述甜菜碱醛的浓度为5mM。
3.依照权利要求1的方法，其特征在于所述引入甜菜碱醛是通过在培养基中添加或微注射的方式进行的。
4.依照权利要求3的方法，其中所述培养基选自Murashige和Skoog培养基，Linsmaicr和Skoog培养基，White培养基，Gamborg B-5培养基，Nitsch培养基，Heller培养基，ER培养基或N6培养基，并且所述培养基是液体培养基或含有凝胶剂的固体培养基。
5.依照权利要求4的方法，其中所述凝胶剂为0.1％-1％的琼脂、Gelrite或琼脂糖，或1％-8％卡拉胶。
6.依照权利要求1的方法，其中所述植物组织是通过切割的子叶、下胚轴、苗尖、茎、叶、根或其它组织制备的组织片。
7.依照权利要求1的方法，其中所述植物组织细胞为培养通过切割的子叶、下胚轴、苗尖、茎、叶、根或其它组织制备的组织片而获得的愈伤组织在内的、未分化的无定形细胞。
8.依照权利要求1的方法，其中用于植物组织培养的培养方式是悬浮培养方式或固体培养方式。
9.依照权利要求1的方法，其中所述植物为代谢甜菜碱醛的植物。
10.依照权利要求9的方法，其中所述植物选自莴苣、水稻、小麦、玉米、棉花、大豆、油菜、杨树、大麦、高梁、菠菜、甜菜或山菠菜。
11.一种利用权利要求1的方法获得的愈伤组织或丛生芽，以及由所述愈伤组织或丛生芽所分化出的植株。
12.权利要求1的方法在植物组织培养中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种高效诱导植物组织再生的组织培养方法，其特征在于在植物愈伤组织诱导和分化过程中，向培养基中添加甜菜碱醛，可有效提高愈伤组织芽分化再生率、缩短再生芽获得时间和提高再生芽生长速度。利用这种方法可提高植物愈伤组织芽再生率一倍以上。与对照相比可提前5天出芽；从接种外植体至转入生根培养基前，可缩短时间10－15天。本发明还涉及利用此方法获得的愈伤组织或丛生芽，以及由愈伤组织或丛生芽所分化出的植株。
文档编号A01H4/00GK1836499SQ20051005918
公开日2006年9月27日 申请日期2005年3月24日 优先权日2005年3月24日
发明者胡赞民, 李朔, 胡军, 陈宇红, 尹维波 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所