专利名称：Mg132在制备协同诱导分化治疗白血病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属化合物的药物应用，涉及化合物MG132与维甲酸类药物在制备 联合治疗白血病药物中的应用，尤其是涉及化合物MG132在制备协同促进维 甲酸类药物诱导分化治疗白血病的药物中的应用。
背景技术：
自二十世纪七十年代Sachs首先提出分化治疗(differentiation therapy)概 念以来，细胞分化异常在恶性肿瘤的发病学和治疗学上的意义日益引起人们的 广泛兴趣，并成为当今肿瘤学研究的热点之一。肿瘤细胞不论在形态、功能、 代谢、行为诸方面都类似未分化的胚胎细胞，因此利用化学药物诱导肿瘤细胞 分化并逆转其增殖、浸润、转移等恶性表型，使其成为正常或接近正常的细胞， 从而达到治疗肿瘤的目的成为新的治疗手段。
维甲酸类化合物是被研究和临床应用最为广泛的分化诱导剂，其中全反式 维甲酸(all-trans retinoid acid, ATRA)是第一个成功应用于白血病治疗的诱导 分化药物，能够特异性诱导急性早幼粒细胞性白血病(APL)细胞分化成熟。 1988年，上海瑞金医院率先应用ATRA治疗24例APL， 23例取得完全缓解 (CR)。随后进行的一系列大样本随机对照临床研究进一步验证了 ATRA治疗 APL的有效性，明显降低了化疗引发的出血相关死亡率，提高了 APL的CR 率。维甲酸对APL细胞的诱导分化作用，使大多数患者临床上得到缓解，但 随着病人生存期的延长，维甲酸使用过程中仍有一些问题尚待研究解决，如治 疗中维甲酸毒副作用，特别是高白细胞综合征及维甲酸综合征；缓解后单用维 甲酸往往数月内复发；治疗过程中细胞内维甲酸结合蛋白(CRABP)高表达及 细胞色素P450酶促分解代谢使维甲酸治疗失效等。因此，寻找高效、低毒的 新型化合物，有效促进维甲酸的诱导分化作用，降低维甲酸起效浓度，改善白 血病患者的预后及解决相关耐药问题是一个亟待解决的问题。
化合物MG132,是一种有效、可逆的醛基肽类特异性蛋白酶体抑制剂， 分子式为C26H4,N305，能进入细胞中可逆性地抑制蛋白酶体的活性，从而抑制 泛素-蛋白酶体通路所介导的蛋白质的降解，进而影响细胞周期进程和诱导细
胞凋亡。目前，许多文献报道MG132能够诱导多种肿瘤细胞发生凋亡，是一种 潜在的抗肿瘤药物，但关于MG132能否促进维甲酸类药物对白血病细胞的诱 导分化作用，从而改善白血病患者的预后及解决相关耐药问题等尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供化合物MG132在制备协同促进维甲酸类药物诱导分 化治疗白血病的药物中的应用，所述化合物MG132的分子式为C26H4晶05， 化合物MG132的浓度为lxl(T8-lxl(r6M，维甲酸的浓度为lxl(T9-lxl(T5M。
化合物MG132最优选的浓度为0.2x10—6M，维甲酸最优选的浓度为1x10—6。
所述化合物MG132制备的药物与维甲酸类药物一起应用。
化合物MG132单独作用不能诱导白血病细胞分化，但它可以促进维甲酸 类药物对白血病细胞的诱导分化作用，表现为促进维甲酸类药物对白血病细胞 的增殖抑制作用，细胞周期阻滞作用及促进白血病细胞表面分化特异性抗原 CDllb的表达及增加分叶核的细胞数目。
化合物MG132在制备协同促进维甲酸在诱导分化治疗白血病的药物中的 应用机制在于化合物MG132通过抑制蛋白酶体活性，使维甲酸作用过程中 被泛素-蛋白酶体系统降解的维甲酸受体RARa降解减少，从而提高白血病细胞 对维甲酸的敏感性。
本发明通过化合物MG132与维甲酸联合应用达到制备协同促进维甲酸诱 导分化治疗白血病的药物的目的。化合物MG132单独使用对白血病细胞无诱 导分化作用，但可明显促进维甲酸诱导的细胞分化，而且可明显减少维甲酸的 用量和作用时间，进而縮短获得CR时间。化合物MG132能够明显促进维甲 酸对白血病细胞增殖抑制作用，周期阻滞作用，促进白血病细胞分化表面特异 性抗原CDllb表达，细胞核质比减小，分叶型核较维甲酸单用组明显增多。 化合物MG132促进维甲酸诱导白血病细胞分化的作用具有明显的浓度和时间 依赖性。上述作用均有助于减轻维甲酸的毒副作用及降低维甲酸使用过程中耐 药问题的发生。总之，化合物MG132对维甲酸诱导白血病细胞分化能力的增 强作用为该药物开辟了新的应用领域，同时为进一步提高白血病患者的疗效， 改善耐药及相关预后情况提供了可能性。
图1是HL60细胞在不同浓度的MG132与维甲酸处理下的生长曲线。
图2是MG132分别与不同浓度的维甲酸合用对HL60细胞的生长抑制情图3是MG132与维甲酸合用对HL60细胞周期的影响。
图4是MG132与维甲酸合用对HL60细胞表面分化抗原CDllb表达的影响。
图5是MG132与维甲酸合用对HL60细胞内维甲酸受体RARa蛋白表达 的影响。
具体实施例方式
本发明结合附图和具体实施例作进一步的说明。
实施例1:
用不同浓度的MG132 (1x10—8-lxl0—6M)分别与维甲酸(Ixl0—6M)合用处 理HL60细胞株，分别在处理后24、 48、 72、 96、 120小时通过胎盼蓝拒染法 计数活细胞数并绘制HL60细胞的生长曲线，发现低浓度的MG132 (lxl(T8-l><10-7M)单用对HL60细胞生长无明显抑制作用，但能明显促进维 甲酸对HL60细胞的生长抑制作用，并呈时间-剂量依赖性，结果参见图l。
实施例2:
将MG132 (lxlO-7 M)分别与维甲酸(lxlO-9-lxlO-5 M)合用处理HL60 细胞株，120小时后通过胎盼蓝拒染法计数活细胞数，发现MG132能促进不 同浓度维甲酸(lxlO力-lxlO-SM)对HL60细胞的生长抑制作用，结果参见图2。
实施例3:
采用不同浓度的MG132 (lxl(r8-lxl(T6M)分别与维甲酸(1x10—6 M)合 用处理HL60细胞株，在处理后72小时收集细胞，检测细胞周期变化。细胞 用冰预冷的70 %乙醇固定过夜，上机前离心弃去固定液，用PBS重悬细胞， 加入碘化丙啶(PI)染液500 pl(含50^ig/mlPI， 100吗/mlRNaseA)，室温避光染 色30min。用流式细胞仪测定DNA含量，用ModFIT软件计算细胞周期百分 比。结果发现，MG132可明显促进维甲酸诱导的细胞G0/G1期阻滞，且具有 明显的剂量依赖性，而MG132对细胞周期没有明显影响。结果参见图3。
实施例4:
用不同浓度的MG132 (lxl(T8-lxlO'6M)分别与维甲酸(lxl(T6M)合用
处理HL60细胞株，在处理后72小时收集细胞，检测细胞表面分化特异性抗 原CDllb的表达。细胞用冰PBS漂洗2次后用3%BSA在室温下封闭45 min， 然后用CDllb-PE标记的单克隆抗体避光孵育30 min，经PBS洗涤后用流式细 胞仪进行检测，并用CellQuestPro软件分析。结果发现，化合物MG132可明 显促进维甲酸诱导的分化表面特异性抗原CDllb表达增加，分化的细胞随 MG132浓度的增大、处理时间的延长而增多，而MG132单用无明显的诱导分 化作用。结果参见图4。
实施例5:
用不同浓度的化合物MG132 (lxl(T8-lxl(r6M)分别与维甲酸(lxl(T6M) 合用处理HL60细胞株，分别在处理后120小时收集细胞，用瑞氏-吉木萨染色 法观察细胞核形态变化。维甲酸作用后，细胞核质比明显减小，并出现明显的 分叶型核，而化合物MG132与维甲酸合用组具有分叶型核的细胞数目明显增 多。
实施例6:
将MG132 (lxl(T7M)与维甲酸(bio—6 M)合用处理HL60细胞株，在 处理后72小时收集细胞，并用细胞裂解液裂解细胞抽取蛋白质，然后用RARa 抗体(购自美国Santa Cruz公司)进行Western blot免疫印迹。结果发现，MG132 能部分抑制维甲酸诱导的维甲酸受体RARot降解，从而增加HL60细胞对维甲 酸的敏感性。结果参见见图5。
权利要求
1.化合物MG132在制备促进维甲酸诱导分化治疗白血病的药物中的应用，所述化合物MG132的分子式为C26H41N3O5，所述应用中化合物MG132的浓度为1×10-8-1×10-6M，维甲酸的浓度为1×10-9-1×10-5M。
2. 根据权利要求l所述的应用，其特征是所述应用中化合物MG132的 浓度为0.2xl(y6M，维甲酸的浓度为lxl(T6M。
3. 根据权利要求l所述的应用，其特征是所述化合物MG132制备的药 物与维甲酸类药物一起应用。
全文摘要
本发明提供化合物MG132在制备协同促进维甲酸类药物诱导分化治疗白血病的药物中的应用，所述化合物MG132的分子式为C<sub>26</sub>H<sub>41</sub>N<sub>3</sub>O<sub>5</sub>，化合物MG132的浓度为1×10<sup>-8</sup>-1×10<sup>-6</sup>M，维甲酸的浓度为1×10<sup>-9</sup>-1×10<sup>-5</sup>M。化合物MG132单独作用不能诱导白血病细胞分化，但它可以促进维甲酸类药物对白血病细胞的诱导分化作用，表现为促进维甲酸类药物对白血病细胞的增殖抑制作用，细胞周期阻滞作用及促进白血病细胞表面分化特异性抗原CD11b的表达及增加分叶核的细胞数目。本发明为化合物MG132开辟了新的药物应用领域。
文档编号A61K38/05GK101337065SQ200810062998
公开日2009年1月7日 申请日期2008年7月11日 优先权日2008年7月11日
发明者何俏军, 应美丹, 方艳芬, 朱迪峰, 波 杨, 罗沛华 申请人:浙江大学