专利名称：克服由葡萄糖诱发小鼠2－细胞期胚胎体外发育受阻的方法
技术领域：
本发明涉及生物技领域，具体是指一种克服由葡萄糖诱发的小鼠2-细胞期胚胎体外发育受阻的方法背景技术随着生物技术的发展，各种高技术的胚胎操作，如胚胎分割、胚胎性别鉴定、核移植和基因导入等已相继出现。这些操作都需要将胚胎在体外培养到适当的阶段。因此，各种动物早期胚胎体外发育的培养条件成为近年来人们研究的热点。
目前，对于胚胎体外发育的生理机制还不十分清楚。一般认为，在附植前，胚胎的发育要经过四个关键时期①卵裂的启动；②由卵源物质调控向胚细胞基因组调控的过渡；③桑椹胚向囊胚演化；④囊胚腔的膨胀与囊胚的孵化。其中，第二时期发生的时间与某些物种的胚胎体外发育受阻出现的时间相一致。在体外培养条件下，内部调控机制的改变与外部环境的不适，可能是导致胚胎发育阻滞的根本原因。
大多数哺乳动物的早期胚胎几乎都存在体外发育阻滞现象。由于这些现象普遍存在，研究其发生的机制和克服的方法就成为体外培养中需要首先解决的问题。所谓“体外发育阻滞”是指胚胎在体外培养条件下，在某一发育阶段，胚细胞发育停止或者分裂数减少，达不到正常细胞数目，以及发育至桑椹胚和囊胚的比例下降的现象。体外发育阻滞现象在许多动物中存在。小鼠体外受精-早期胚胎体外培养系统的建立，不仅有助于阐明哺乳动物受精和胚胎早期发育的基本机制，而且为人类辅助生殖、细胞生物学、遗传学等提供了一个有效的实验动物模型。但小鼠受精卵在体外培养时，其发育常停滞于2-细胞期。昆明小鼠是国内研究工作中最为广泛使用的实验动物之一，其早期胚胎发育也存在典型的2-细胞阻滞现象。而哺乳动物早期胚胎体外发育阻滞(小鼠为2-细胞阻滞)的确切发生机制尚未明了。在体外培养系统中，各种因子与胚胎之间的相互作用和影响非常复杂，这是由正常体内胚胎生长环境的复杂性和不断变化的各种因素所决定的。虽然不同的物种可表现出早期发育受阻，但其原因却有着极大的差别。这也表现为种间的不同，例如用仓鼠1-细胞胚胎培养液HECM和适用于大鼠的R1ECM(大鼠1-细胞胚胎培养液)培养昆明小鼠胚胎都不能有效克服胚胎发育阻滞。
现阶段哺乳动物早期胚胎体外发育停滞主要可从以下两方面加以解决一是利用某些体细胞与早期胚胎共培养；二是改进培养液成分，尽量满足早期胚胎发育所需物质并确定和去除对其发育不利的成分。作为体内能量直接来源的物质——葡萄糖自然成为培养液的重要候选成分之一。
尽管葡萄糖是体细胞体外培养所必需的营养成分已为人们所共知，但对它在早期胚胎体外培养中的影响的认识却经历了较长的过程。实验发现，在一定条件下，葡萄糖对仓鼠、牛、猪和绵羊早期胚胎体外发育均有一定的抑制作用。葡萄糖抑制哺乳类动物早期胚胎体外发育已相继得到证实。可见葡萄糖对已研究过的哺乳类动物早期胚胎体外发育的抑制是一种普遍现象。另有研究结果表明，葡萄糖又对小鼠胚胎形成桑椹胚和囊胚有促进作用。此后，许多学者研究发现，多数动物胚胎在最初几次分裂时，不能利用葡萄糖作为能源物质，在胚胎发育早期添加葡萄糖是非必需的甚至是有害的。胚胎发育到桑椹胚阶段，葡萄糖才开始被利用，若不及时添加，会抑制囊胚的形成。所以，人们一般认为，葡萄糖在胚胎发育的早期起抑制作用，后期则起促进作用，然而到目前为止，葡萄糖对早期胚胎引起的抑制作用具体在哪个发育时期尚不清楚，如何克服胚胎体外发育阻滞的现象就成为体外培养中需要首先解决的问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的难题而提供一种克服由葡萄糖诱发的小鼠2-细胞期胚胎体外发育受阻的有效方法。
葡萄糖在代谢过程中产生产生活性含氧化合物(简称活性氧，Reactiveoxygen species，ROS)并引起细胞凋亡，曾有学者发现，糖尿病孕妇分娩畸形胎儿频率高的原因是由ROS引起的，ROS也很可能参与小鼠胚胎发育停滞。抗氧化剂却可以克服由ROS诱导的小鼠胚胎发育受阻现象。根据这一研究发现，本发明的所提供的技术方案为一种克服由葡萄糖诱发的小鼠2-细胞期胚胎体外发育受阻的方法，包括以下步骤a、提供小鼠1-细胞期胚胎；b、培养液的配制去除了谷氨酰胺的mCZB培养液中，加入葡萄糖和抗氧化剂谷胱甘肽；c、胚胎的液滴培养将经过灭菌的培养液置于培养皿中制备液滴，每滴20微升，随即向培养皿中覆盖一层矿物油，完全覆盖液滴，将培养皿放入5％CO2的饱和湿度的二氧化碳培养箱中，在37℃下至少平衡2小时，每个培养液滴中移入约10枚左右经过培养液冲洗的小鼠1-细胞期胚胎。
其中，提供小鼠1-细胞期胚胎的方法可为挑选健康的6～8周龄母鼠，每只母鼠腹腔注射5IU的PMSG，48小时后再腹腔注射5IU的hCG。注射hCG后立即与公鼠合笼，公母比例为1∶1，所用公鼠是至少3天内没配种的健壮公鼠，在注射hCG20～28小时后冲卵，即可得到1-细胞期卵。
在上述培养液的具体配制过程可为首先配制含有浓度为5.6mM葡萄糖的mCZB培养液；再加入谷胱甘肽形成1mM谷胱甘肽浓度培养液，即在已加入葡萄糖的mCZB培养液中加入谷胱甘肽，每10ml含有葡萄糖的mCZB培养液中需加入谷胱甘肽0.003g。
本发明所选用的小鼠可为昆明小鼠。
本发明是以昆明小鼠的早期胚胎为研究对象，以mCZB培养液为基础培养液，通过添加葡萄糖和抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)，对葡萄糖在胚胎体外培养中抑制胚胎早期发育的机理进行初步探讨。在培养不同时间添加葡萄糖对小鼠胚胎发育的影响的实验中，mCZB组、第1～4天组、第2～4天组、第3～4天组和第4天组的囊胚发育率分别为50.0％、55.3％、23.8％、55.3％、69.4％；在培养不同阶段用葡萄糖处理对小鼠胚胎体外发育的影响的实验中，mCZB组的囊胚发育率为60.4％，第1天组、第2天组、第3天组、第4天组的囊胚发育率分别为40.5％、12.8％、54.3％、60.0％；在外源性谷胱甘肽对有葡萄糖作用的小鼠胚胎体外发育的影响的实验中，mCZB组、葡萄糖组、葡萄糖+谷胱甘肽组的囊胚发育率分别为51.5％、14.8％和40.7％。经统计和对相关资料的分析1.葡萄糖抑制小鼠胚胎早期发育的确切时间为体外培养的第2天；2.葡萄糖抑制小鼠胚胎早期发育的作用可被GSH克服；3.葡萄糖氧化产生ROS，是葡萄糖造成小鼠胚胎体外发育的2-细胞阻滞的原因。
下面结合附图对本发明的实施例作进一步说明
图1为本发明实验一中培养不同阶段用葡萄糖处理的示意图。
图2为本发明实验二中谷胱甘肽处理有葡萄糖作用小鼠胚胎发育的示意图。
具体实施例方式
本发明中的实施例并不限制本发明的范围。
1 试验材料供试小鼠实验用的小鼠为昆明小鼠，购买于延边大学医学院小动物实验室。小鼠至少在激素处理前一周购入，放在自动控制光照和温度的饲养室内进行饲养。母鼠群养，公鼠单笼饲养，饲喂颗粒饲料，自由饮水，并进行光照和温度控制(8:00～20:00光照，20:00～8:00黑暗；温度控制在20～23℃)。选用6～8周龄的母鼠，体重25～35g，及8～12周龄的公鼠，体重35～45g，作为试验动物。母鼠共计80只，公鼠共计15只。
主要药品本实验所用的主要药品见表-1表-1 实验所用的主要药品
主要仪器本实验所用的主要仪器见表-2表-2 实验所用的主要仪器
2 试验方法药品的配制所有的药品，包括激素、透明质酸酶、冲卵液及各种培养液按配方在生物超净工作台内配制完成后，均用微孔过滤器过滤。所用蒸馏水为四次蒸馏水。
超数排卵激素的配制孕马血清促性腺激素(PMSG)的配制
PMSG从延吉市兴牧兽药店购入(内蒙古赤峰兽药厂生产)。规格为每瓶1000国际单位。PMSG可使小鼠发情并刺激卵巢内多个卵泡发育、生长。用9％的生理盐水将其稀释为250IU/ml。在容量为10ml的试管内分别装入1ml。放置在-20℃的冰箱内保存、备用。使用前，在每个试管内注入9ml生理盐水，再次稀释成每毫升含25IU的PMSG，每只母鼠腹腔注射0.2ml·(5IU)的PMSG即可。其余的PMSG在冰箱(-4℃条件下)内保存备用。
人绒毛膜促性腺激素(hCG)的配制人绒毛膜促性腺激素购自杭州动物药品有限公司。每瓶为2000国际单位。其生理功能是刺激已注射PMSG的母鼠卵巢排卵。也用9％的生理盐水稀释成250IU/ml，在容量为10ml的试管内分别装入1ml。放置在-20℃的冰箱内保存、备用。使用前，在每个试管内注入9ml生理盐水，再次稀释成每毫升含25IU的hCG。注射时每只母鼠腹腔注射0.2ml(5IU)的hCG即可。其余的hCG在冰箱(-4℃条件下)内保存备用。
透明质酸酶溶液的配制(300mg/L)在进行试验时，虽然大部分1-细胞受精卵都已从颗粒细胞中脱离出来，但因小鼠的个体差异，有时会有颗粒细胞附着在1-细胞受精卵周围。本试验为非共培养试验，所以可用透明质酸酶去除1-细胞期受精卵上的卵丘细胞。称取10mg透明质酸酶，用1mlCZB培养液溶解后，分装成30微升的储备液，放置在-20℃的冰箱内保存、备用。使用时，将30微升的储备液用970微升CZB培养液稀释成1ml。每次试验可取50微升的透明质酸酶稀释液进行去卵丘细胞试验。其余的在冰箱(-4℃条件下)内保存备用。
血清灭活处理购入的胎牛血清，必须在56℃水浴条件下进行30分钟灭活，才能去除其中的有害因子。然后分装在小瓶内，放置在-20℃冰箱内保存备用。
培养液的配制冲卵液的配制冲卵液为D-PBS中加入5％的胎牛血清(FCS)。根据实际需要，在每次试验宰杀5只小鼠的情况下，可用7.6ml的D-PBS加0.4ml的胎牛血清(FCS)制成一次试验所需的冲卵液。
mCZB培养液的配制(200ml)在胚胎体外培养中，根据实验的需要调整已有培养液的成分，CZB培养液是对小鼠胚胎早期体外培养的一种有效的培养液。本实验中所用的培养液是去除了谷氨酰胺的mCZB培养液，之所以去掉谷氨酰胺是因为它具有抗氧化损伤的作用。而本实验的主要内容就是关于葡萄糖在胚胎体外培养中氧化损伤方面的研究，作为基础培养液中有抗氧化损伤作用的物质必须去除，并且在预备实验中该培养液也可克服小鼠胚胎早期体外培养中的发育阻滞。
本实验中所用培养液的成分见表-3表-3 200ml mCZB的配方
含葡萄糖mCZB培养液的配制一些研究结果表明，5.0-5.5mM的葡萄糖对小鼠早期胚胎的发育有抑制作用。本实验采用的葡萄糖浓度为5.6mM，这与血液中葡萄糖浓度一致。先配制成56mM的葡萄糖浓缩液，方法为称取0.05046克葡萄糖，溶于10ml无牛血清白蛋白(BSA)的mCZB中。放在冰箱(-4℃条件下)内保存备用。使用时按10％的比例加入到无牛血清白蛋白(BSA)的mCZB培养液中，之后按比例加入牛血清白蛋白(BSA)。
加葡萄糖和谷胱甘肽的mCZB培养液的配制按1mM浓度的标准，在已加入葡萄糖的mCZB培养液中加入谷胱甘肽。10ml的该培养液需加入谷胱甘肽0.003g。
小鼠1-细胞期胚胎收集超数排卵处理为了获得更多的受精卵，本试验使用PMSG-hCG法进行超排处理。挑选健康的母鼠(6～8周龄)，在下午5:00时每只母鼠腹腔注射5IU的PMSG，48小时后再腹腔注射5IU的hCG。注射hCG后立即与公鼠合笼，公母比例为1∶1。所用公鼠必须是至少3天内没配种的健壮公鼠。
受精卵的采集冲卵的时间可根据所需的胚胎发育阶段而定。本实验是针对小鼠1-细胞期受精卵进行的试验，因此在注射hCG20～28小时后冲卵即可得到1-细胞期卵。根据实际情况，在注射hCG28小时后冲卵，得到1-细胞期卵周围没有颗粒细胞或颗粒细胞较少，有利于进行实验。1-细胞期受精卵处于输卵管中。因此在注射hCG28小时后，将雌鼠用颈椎脱臼法致死，手术取出生殖器管，用眼科剪子剪下输卵管，放入冲卵液中。
在实体显微镜下刺破输卵管膨大部，即可见1-细胞期胚胎自动溢出到冲卵液中，如果有颗粒细胞存在，则用透明质酸酶溶液去除颗粒细胞。方法为将带有颗粒细胞的胚胎移入到300mg/L的透明质酸酶小滴中1～2分钟，并不断吹打。收集形态正常的胚胎，移入到新鲜的受精卵体外培养液中备用。
胚胎的液滴培养严格按比例配制的培养液经灭菌之后，可在35mm的硅化玻璃培养皿中制备6～8个培养液滴，每滴20微升，随即向培养皿中覆盖一层矿物油，完全覆盖液滴。将培养皿放入5％CO2的饱和湿度的二氧化碳培养箱中，在37℃下至少平衡2小时。每个培养液滴可移入约10枚左右胚胎。
在实体显微镜下，将收集到的受精卵用相应的培养液反复冲洗3次，按组将胚胎移入预先平衡好的培养液滴内进行培养。每个培养液滴放入约10枚左右受精卵，在37℃、含5％CO2的饱和湿度的培养箱内进行培养。每隔24h更换一次新培养液，并记录胚胎发育状况。
上述各环节均要求无菌操作，以防止污染引起的胚胎发育率低下及发育停滞，并尽量在短时间内完成对胚胎的体外操作。
为使胚胎正常发育，应尽量满足与母体相似的条件。把它们放在饱和湿度、5％CO2和95％空气的气相条件，并在37℃恒温的二氧化碳培养箱内培养。应定期检查二氧化碳培养箱内CO2的浓度。
试验内容实验一、培养不同阶段用葡萄糖处理胚胎对体外发育的影响注射hCG 28小时后，取出1-细胞胚胎，分别只在第一天、第二天、第三天和第四天用含有葡萄糖的mCZB培养液进行培养。确定葡萄糖抑制胚胎体外发育的确切时间。
分组情况第1天组只用含葡萄糖的mCZB培养液在第一天培养，其余时间用mCZB培养液培养；第2天组只用含葡萄糖的mCZB培养液在第二天培养，其余时间用mCZB培养液培养；第3天组只用含葡萄糖的mCZB培养液在第三天培养，其余时间用mCZB培养液培养；第4天组只用含葡萄糖的mCZB培养液在第四天培养，其余时间用mCZB培养液培养。对照一组一直用mCZB培养液培养。所有胚胎在体外共培养4天。具体处理过程见图1。
实验二、外源性谷胱甘肽对有葡萄糖作用的小鼠胚胎体外发育的影响。
注射hCG 28小时后，取出1-细胞胚胎，先用mCZB培养液进行培养。在含葡萄糖mCZB培养发生抑制作用的阶段，用加葡萄糖与谷胱甘肽的mCZB培养液进行培养。确定作为还原剂的谷胱甘肽是否能解除葡萄糖对胚胎体外发育的抑制作用。
分组情况mCZB组一直用mCZB培养液培养；葡萄糖组只在培养第二天用含葡萄糖的mCZB培养液培养；葡萄糖+谷胱甘肽组只在第二天用含葡萄糖和谷胱甘肽的培养液进行培养。具体处理过程见图2。
统计处理方法mCZB和不同培养液处理组的囊胚发育率间的差异用卡方检验进行显著性检验。差异显著标准为P＜0.05。
结果与分析培养不同阶段用葡萄糖处理对胚胎体外发育的影响结果见表-4表-4 培养不同阶段用葡萄糖处理对胚胎体外发育的影响
※在同一列数据中右肩上标的不同字母之间表示差异显著(P＜0.05)从表中可以看出mCZB组、第1天组、第3天组、第4天组的囊胚发育率分别为60.4％、40.5％、54.3％、60.0％，在统计分析上差异不显著，但与第2天组(囊胚发育率为12.8％)在统计分析上差异显著。
外源性谷胱甘肽对有葡萄糖作用的小鼠胚胎体外发育的影响外源性谷胱甘肽对有葡萄糖作用的小鼠2-细胞期胚胎体外发育的影响的实验。mCZB组用mCZB培养液一直培养；葡萄糖组用含葡萄糖的mCZB培养液在第二天培养；葡萄糖+谷胱甘肽组用含葡萄糖和谷胱甘肽的mCZB培养液在第二天培养。所有胚胎在体外共培养4天。结果见表-5表-5 外源性谷胱甘肽对有葡萄糖作用的小鼠胚胎体外发育的影响
※在同一列数据中右肩上标的不同字母之间表示差异显著(P＜0.05)
从表中可以看出葡萄糖+谷胱甘肽组的发育率为40.7％，与mCZB组(囊胚发育率为51.5％)差异不显著，而与葡萄糖组(囊胚发育率为14.8％)差异显著，说明添加谷胱甘肽能够克服葡萄糖对小鼠胚胎体外发育的抑制作用。
结论1葡萄糖抑制小鼠胚胎早期发育的确切时间为体外培养的第2天；2葡萄糖抑制小鼠胚胎早期发育的作用被GSH克服。
权利要求
1.一种克服由葡萄糖诱发的小鼠2-细胞期胚胎体外发育受阻的方法，包括以下步骤a、提供小鼠1-细胞期胚胎；b、培养液的配制去除了谷氨酰胺的mCZB培养液中，加入葡萄糖和抗氧化剂谷胱甘肽；c、胚胎的液滴培养将经过灭菌的培养液置于培养皿中制备液滴，每滴20微升，随即向培养皿中覆盖一层矿物油，完全覆盖液滴，将培养皿放入5％CO2的饱和湿度的二氧化碳培养箱中，在37℃下至少平衡2小时，每个培养液滴中移入约10枚左右经过培养液冲洗的小鼠1-细胞期胚胎。
2.根据权利要求1所述的克服由葡萄糖诱发的小鼠2-细胞期胚胎体外发育受阻的方法，其特征在于提供小鼠1-细胞期胚胎的方法为挑选健康的6～8周龄母鼠，每只母鼠腹腔注射5IU的PMSG，48小时后再腹腔注射5IU的hCG，注射hCG后立即与公鼠合笼，公母比例为1∶1，所用公鼠是至少3天内没配种的健壮公鼠，在注射hCG20～28小时后冲卵，即可得到1-细胞期卵。
3.根据权利要求1所述的克服由葡萄糖诱发的小鼠2-细胞期胚胎体外发育受阻的方法，其特征在于所述培养液的配制过程中，首先配制含有浓度为5.6mM葡萄糖的mCZB培养液；再加入谷胱甘肽形成1mM谷胱甘肽浓度培养液，即在已加入葡萄糖的mCZB培养液中加入谷胱甘肽，每10ml含有葡萄糖的mCZB培养液中需加入谷胱甘肽0.003g。
4.根据权利要求1、2、或3所述的克服由葡萄糖诱发的小鼠2-细胞期胚胎体外发育受阻的方法，其特征在于所述的小鼠为昆明小鼠。
全文摘要
本发明公开了一种克服由葡萄糖诱发的小鼠2－细胞期胚胎体外发育受阻的方法，包括以下步骤a.提供小鼠1－细胞期胚胎；b.培养液的配制去除了谷氨酰胺的mCZB培养液中，加入葡萄糖和抗氧化剂谷胱甘肽；c.胚胎的液滴培养。本发明以mCZB培养液为基础培养液，通过添加葡萄糖和抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)，对葡萄糖在胚胎体外培养中抑制胚胎早期发育的机理实验。在外源性谷胱甘肽对有葡萄糖作用的小鼠胚胎体外发育的影响的实验中，mCZB组、葡萄糖组、葡萄糖+谷胱甘肽组的囊胚发育率分别为51.5％、14.8％和40.7％。实验证明葡萄糖抑制小鼠胚胎早期发育的作用被GSH克服。
文档编号C12N5/06GK1800366SQ20041001142
公开日2006年7月12日 申请日期2004年12月31日 优先权日2004年12月31日
发明者方南洙, 李钟淑, 金 一, 李兆华, 金庆国 申请人:延边大学