专利名称：环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法
技术领域：
本发明涉及一种毒性测试方法，具体为环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方 法，属于鱼类急性毒性测试领域。
背景技术：
近三十年来，环境中的外源性化合物——环境雌激素(Environmental estrogens)能够造成人类和野生动物发育和繁殖方面的健康损害，引起了人们高度重视， 目前已报道的环境雌激素危害包括男性精液减少、野生鱼类性发育紊乱(包括雌雄同体、 雄鱼雌化等)、两栖动物(如短吻鳄、蟾蜍)种群减少等。环境雌激素是内分泌干扰物中重要 的一类，它们或者属于天然雌激素(即由生物体内源雌激素排泄而进入环境)，或者属于人 工合成雌激素以及具有雌激素活性的合成化学品，当其进入生物体后能模拟体内内源性雌 激素的功能和行为，引发类雌激素反应，从而对生物体的激素平衡、生殖、发育和行为等造 成负面影响。研究证实，目前环境中已经存在成百上千种具有不同雌激素活力的化合物。其 中，几种常见的环境雌激素及其雌激素活力和来源如表1所示；
*EEq (17 β-E2 Equivalent)换算成17 β -雌二醇的雌激素活力当量。
雌激素活力当量越大，对生物体潜在的内分泌干扰效应就越强，因此，E2和EE2是 两种最受关注的环境雌激素，它们的化学结构式和理化性质见表2。前者是天然雌激素中雌 激素活力最强的一种，通常被用作值为1的雌激素当量，以衡量其他化合物的雌激素活力。 E2由人或动物分泌而成，主要通过粪便和尿液进入自然环境。据报道，一头奶牛每天排泄的 粪便中E2含量达17(Γ1230 μ g/kg，成年女性E2的排泄量可达82 695 μ g/天，而怀孕期 间妇女E2的排泄量可达平时的1000倍。后者是人工合成的雌激素，主要作为女性避孕药 和治疗绝经期综合症的雌激素替代疗法用药；
权利要求
环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，其特征在于具体步骤如下1)首先称取1 mg的E2溶于500 ml标准稀释水中，配制成2 mg/L的E2储备液，将试剂瓶用膜封口后置于2℃冰箱避光保存，用同样的方法配制2 mg/L的EE2储备液并保存；2)试验时，取出上述储备液，待恢复到室温并充分摇匀后，用标准稀释水分别于玻璃培养皿内配制浓度为1、0.2、0.04 mg/L，8、1.6 μg/L和10、0.05 mg/L的E2和EE2的暴露溶液，并各移取20 ml放入培养皿中；空白对照为20 ml标准稀释水，另取经脱脂棉过滤的长江水20 ml作为自然水体环境对照，以上暴露液和对照液均设置3组平行；3)随机挑选处于囊胚期的活胚胎置于倒置显微镜下进行观察试验，在每个装有暴露液和对照液的培养皿内放入10个胚胎，然后将胚胎置于恒温培养箱内培养，在2 10℃条件下保持恒温、无光照，试验持续30天，每天用倒置显微镜观察测试的终点，并记录；4)使用SPSS 13.0 for Windows软件，对大银鱼胚胎在暴露浓度下与空白下的存活、生长和发育进行显著性分析。
2.根据权利要求1所述的环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，其特征在于 所述的标准稀释水，采用分析纯的化学品和全玻璃蒸馏水或去离子水，取氯化钙溶液、硫酸 镁溶液、碳酸氢钠溶液和氯化钠溶液4种溶液各25 ml加以混合，稀释至1 L，稀释用水需经 曝气至氧饱和为止，然后储存备用。
3.根据权利要求1所述的环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，其特征在于 所述的氯化钙溶液是将11. 76 g CaCl2CH2O溶解于1 L水中，所述的硫酸镁溶液是将4. 93 g MgSO4WH2O溶解于1 L水中，所述的碳酸氢钠溶液是将2. 59 g NaHCO3溶解于1 L水中， 所述的氯化钠溶液是将0. 23 g KCl溶解于1 L水中。
4.根据权利要求1所述的环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，其特征在于 步骤2)中各暴露浓度组的配制方法如下取12. 5 ml E2或EE2储备液于等体积的标准稀 释水中，配成1 mg/L的E2或EE2暴露液25 ml ；充分混勻后按5倍体积逐级稀释成200、 40、8和1. 6 μ g/L的暴露液；然后再取125 μ L的1. 6 μ g/L暴露液于19. 875 ml标准稀 释水中，配成10 mg/L的暴露液；取100 μ L的10 mg/L暴露液于19. 9 ml稀释水中，配成 0. 05 ng/L的暴露液。
5.根据权利要求1所述的环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，其特征在于 步骤3)中，将胚胎置于恒温培养箱内培养，在8°C条件下保持恒温。
6.根据权利要求1所述的环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，其特征在于 步骤3)中，采用半静态暴露方式，所有暴露液和对照液每2天更换一次；更换溶液时，用吸 管逐一地吸取胚胎转移至新鲜溶液内，如有死亡胚胎或死亡的幼鱼，采用吸管吸取将之移 除；测试的终点包括致死、致畸和孵化延迟。全文摘要
本发明公开了一种环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，利用胚胎对环境污染物或者化学物质刺激的敏感性，将大银鱼胚胎暴露于含有受试物的一系列浓度的标准稀释水溶液中，以半静态条件进行试验。试验从将处于囊胚期的活胚胎暴露于含受试物的水溶液开始，至对照组和暴露组中所有的胚胎孵化完成结束，持续30天左右。毒性终点包括致死、致畸和孵化延迟。通过对暴露组毒性终点的观察及与对照组的比较，确定该受试物对大银鱼胚胎发育的毒性。研究两种天然雌激素E2和EE2对大银鱼胚胎-卵黄囊阶段的影响，以确定它们对大银鱼胚胎发育毒性的剂量-效应关系，并且评价该鱼种暴露在雌激素环境浓度水平下存在的潜在风险。
文档编号A01K61/00GK101982072SQ201010502878
公开日2011年3月2日 申请日期2010年10月11日 优先权日2010年10月11日
发明者史江红, 孟耀斌, 张洪渠, 朱江, 朱英, 沈根祥, 王振旗, 王晓丹, 胡双庆, 赵庆节, 郭春霞, 钱晓雍, 顾海蓉 申请人:上海市环境科学研究院;北京师范大学