专利名称：microRNA 302在早期胚胎发育中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及畜牧学(动物繁殖)，尤其涉及一种microRNA 302在早期胚胎发育中的应用。
背景技术：
在哺乳动物胚胎发育过程约有30% 70%的胚胎夭折，绝大部分在胚胎发育的早期。特别是在体外培养时，早期胚胎凋亡指数更高。近年来，由于早期胚胎作为细胞形态发生和分化模型的重要性有所增加，以及发育生物学技术的日新月异，早期胚胎阶段日益受到重视，研究早期胚胎基因表达及调控，具有重要的理论和实践意义。microRNA是一类内生的、长度约20- 个核苷酸的小RNA，miRNA基因通常是在核内由RNA聚合酶II (polll)转录的，最初产物为大的具有帽子结构(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的pre-miRNA。pre_miRNA在核酸酶Drosha和其辅助因子Pasha的作用下被处理成70个核苷酸组成的pre-miRNA。RAN-GTP和exportin 5将pre-miRNA输送到细胞质中。随后，另一个核酸酶Dicer将其剪切产生约为22个核苷酸长度的miRNA:miRNA* 双链。这种双链很快被引导进入沉默复合体(RISC)复合体中，其中一条成熟的单链miRNA 保留在这一复合体中。成熟的miRNA结合到与其互补的mRNA的位点通过碱基配对调控基因表达。而miRNA是近年来才发现的一类小分子RNA，它们构成了多细胞生物中一类更为丰富的基因调控分子，影响许多编码蛋白的基因的表达，与细胞的生长和分化，胚胎的发育，肿瘤的形成和抑制都有密切的关系。
发明内容
本发明的一个目的是提供物质在制备具有抑制胚胎发育功能的产品中的应用。本发明提供了如下1)-3)中任一所述物质在制备具有抑制胚胎发育功能的产品中的应用DmicroRNA 302 ；2)含有microRNA 302的编码基因的重组载体；3)含有microRNA 302的编码基因的重组病毒。所述microRNA 302的核苷酸序列为序列表中的序列1 ；所述microRNA 302的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列2自5’末端第 251-273 位。所述抑制胚胎发育为滞后早期胚胎发育，所述早期胚胎发育为从受精卵发育开始至囊胚形成。所述胚胎为小鼠胚胎；所述产品为药物。所述含有microRNA 302的编码基因的重组载体为将microRNA 302的编码基因插入pmR-mCherry载体得到表达microRNA 302的重组载体，具体为将microRNA 302的编码基因插入pmR-mCherry载体的BglII和HindIII酶切位点间得到的含有microRNA 302的编码基因的重组载体。本发明的另一个目的是提供一种重组载体。本发明提供的重组载体，为将microRNA 302的编码基因插入pmR-mCherry载体的 BglII和HindIII酶切位点间得到的载体。所述的重组载体在制备用于筛选促进胚胎发育功能药物的模型中的应用也是本发明保护的范围。本发明的另一个目的是提供一种抑制胚胎发育功能的产品。本发明提供的产品，其活性成分为如下1)-3)中任一一种DmicroRNA 302 ；2)含有microRNA 302的编码基因的重组载体；3)含有microRNA 302的编码基因的重组病毒。所述microRNA 302的核苷酸序列为序列表中的序列1 ；所述microRNA 302的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列2自5’末端第 251-273 位。所述抑制胚胎发育为滞后早期胚胎发育；所述早期胚胎发育为从受精卵发育开始至囊胚形成。所述产品为药物。所述胚胎为小鼠胚胎。本发明的实验证明，本发明初步阐明早期胚胎发育的生理机制，在原核期胚胎中显微注射microRNA 302超表达载体片段，可以观察到microRNA 302使早期胚胎发育滞后。 本发明的优点为新颖、准确。
图1为microRNA 302对胚胎发育的影响
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、microRNA 302抑制早期胚胎发育1、microRNA 302超表达载体的构建DmicroRNA 302的获得提取野生型小鼠(FVB/N小鼠，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心)鼠尾基因组DNA作为模板，以miRNA302F和miRNA302R进行PCR 扩增。引物如下miRNA302F AGCCATAGGGATCCGGTCACTTTACTTTCCTGTGGGmiRNA302R GGCTTCGCAAGCTTGCGAGGAGGTTATACCATTGAG得到719bp的PCR产物，经过测序，结果为序列表中的序列2，其中自5’末端第 251-273位microRNA 302的编码基因，microRNA 302的核苷酸序列为序列表中的序列1。
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2)将步骤1)得到的PCR产物连接到TOPO载体上(pcDNA 3. l/V5_His TOPO TAExpression Vector, hvitrogen，货号45-0005)，得到重组载体T0P0-micro302，经过测序，该重组载体为将序列表中的序列2插入载体上TOPO载体中得到的载体。3)将步骤2)得到的重组载体T0P0-micro302经BamHI和HindIII酶切，回收酶切片段，与经过同样酶切得到的pmR-mCherry载体(Clontech，货号632M2)连接，得到的连接产物转化大肠杆菌，得到转化子，菌落PCR鉴定阳性克隆，PCR引物为forward :5’ CAC CAT CGT GGA ACA GTA CG 3，；Reverse :5，GGG AGG TGT GGG AGGTTT T 3，，得到 867bp 的产物为阳性克隆，提取该阳性克隆的质粒，送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列2 插入载体上pmR-mCherry的BglII (与BamHI为同尾酶)和HindIII酶切位点间得到的载体，命名为 pmR-mCherry-micro302o2、显微注射导入携带microRNA 302的载体片段将pmR-mCherry-micro302被TfiI酶切(在载体上有多个酶切位点)，纯化回收 3954bp的片段(带有mCherry红色荧光和microRNA 302片段序列2、，经过测序，为序列 3。通过显微注射将3%4bp的片段目的片段注射入离体的昆明白小鼠(购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心昆明白小鼠)的原核期胚胎中，在50ul的KSOM培养小滴中(Millipore，货号MR_121_D)中，37°C，5% CO2环境中培养，每两天换一次液，得到mir-302注射组胚胎。以pmR-mCherry空载体(其核苷酸序列为序列4)为对照，用Tf i I酶切，回收 3270bp的线性片段(序列4的自5，末端第1-3238和4698-47 位核苷酸，质粒为环，因此是47 位和1位是连接的。)，采用通过显微注射将3270bp的线性片段注射入昆明白小鼠的原核期胚胎中，同上培养条件，得到空载体注射组胚胎。3、胚胎发育情况监测将上述mir-302注射组胚胎和空载体注射组胚胎从注射后开始培养算起，每M 小时观察一次胚胎发育情况(有荧光表达为microRNA 302表达胚胎)，包括卵裂率，胚胎的形态(如2细胞，4细胞等)以及荧光表达情况。结果如图1所示(第72小时的图)，空载体注射组有荧光表达的胚胎已发育到4细胞阶段(分裂出4个卵裂球)，但 mir-302注射组有荧光表达的胚胎只发育到2细胞阶段(分裂出2个卵裂球)。将荧光场的不同时间的细胞进行计数卵裂率(卵裂球数/总培养胚胎数(总培养胚胎数为注射后挑出要培养的存活胚胎数))统计，实验重复三次，结果取平均值，如表1所示，表1为不同阶段阳性胚胎发育状况统计
权利要求
1.如下1)-3)中任一所述物质在制备具有抑制胚胎发育功能的产品中的应用 DmicroRNA 302 ；2)含有microRNA302的编码基因的重组载体；3)含有microRNA302的编码基因的重组病毒。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述microRNA 302的核苷酸序列为序列表中的序列1 ；所述microRNA 302的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列2自5’末端第 251-273 位。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于 所述抑制胚胎发育为滞后早期胚胎发育，所述早期胚胎发育为从受精卵发育开始至囊胚形成。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于 所述胚胎为小鼠胚胎；所述产品为药物。
5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于所述含有microRNA302的编码基因的重组载体为将microRNA 302的编码基因插入pmR-mCherry载体得到表达microRNA 302的重组载体。
6.一种重组载体，为将microRNA 302的编码基因插入pmR-mCherry载体的多克隆位点得到的载体。
7.权利要求6所述的重组载体在制备用于筛选促进胚胎发育功能药物的模型中的应用。
8.一种抑制胚胎发育功能的产品，其活性成分为如下1)-3)中任一一种 DmicroRNA 302 ；2)含有microRNA302的编码基因的重组载体；3)含有microRNA302的编码基因的重组病毒。所述microRNA 302的核苷酸序列为序列表中的序列1 ；所述microRNA 302的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列2自5’末端第 251-273 位。
9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于 所述抑制胚胎发育为滞后早期胚胎发育；所述早期胚胎发育为从受精卵发育开始至囊胚形成。 所述产品为药物。
10.根据权利要求8或9所述的产品，其特征在于 所述胚胎为小鼠胚胎。
全文摘要
本发明公开了一种microRNA 302在早期胚胎发育中的应用，本发明提供了如下1)-3)中任一所述物质在制备具有抑制胚胎发育功能的产品中的应用1)microRNA 302；2)含有microRNA 302的编码基因的重组载体；3)含有microRNA 302的编码基因的重组病毒。本发明的实验证明，本发明初步阐明早期胚胎发育的生理机制，在原核期胚胎中显微注射microRNA 302超表达载体片段，可以观察到microRNA 302使早期胚胎发育滞后。本发明的优点为新颖、准确。
文档编号A01K67/027GK102266571SQ20111019414
公开日2011年12月7日 申请日期2011年7月12日 优先权日2011年7月12日
发明者刘笑然, 孙婧, 李冬冬, 李向东, 高建明 申请人:中国农业大学