一种基于时间参数和卵裂模式组合的胚胎质量评估方法与流程

本发明涉及辅助生殖技术中对进行体外受精—胚胎移植患者的胚胎进行评估，挑选优质胚胎进行移植的方法。
背景技术：
：多胎妊娠被认为是辅助生殖技术(AssistedReproductiveTechnology,ART)中最常见和最严重的并发症之一。为避免多胎妊娠，实施单胚胎移植(SingleEmbryoTransfer,SET)作为优生优育的重要措施，已成为辅助生殖的主要方向。推动SET开展的核心环节是准确评估胚胎发育潜能，挑选最优胚胎进行移植。在众多评估方法中，形态学评估是目前临床胚胎质量评估最常用的方法。它是基于在胚胎发育的几个时间点对胚胎形态，如：反映胚胎发育速度的卵裂球数目、碎片程度、卵裂球大小的均一性、卵裂球多核及反映胞质质量的空泡等形态学特征，进行的观察。但是，这种静态的时间点观察可能漏掉与胚胎发育潜能相关的信息，而且由于缺少可量化的公认指标，不可避免地带有观察者的主观因素，影响了胚胎质量评估的全面性及客观性，因而在预测评估胚胎发育潜能时具有一定的局限性。与之相比，时差成像技术(Time-lapseimaging,TLI)克服了传统形态学评估的弊端，在保证了观察过程中胚胎发育微环境稳定的同时，可以连续获取胚胎发育全过程的动态影像，对胚胎发育进行更加全面和细致的记录，一些被记录下来的与胚胎发育潜能密切相关的生物学特征，如原核的形成及消失、卵裂时间、卵裂过程有无异常行为等，已经帮助胚胎学家更为有效地评价胚胎质量。目前，国外学者对TLI的研究主要运用时间参数(MeseguerM,HerreroJ,TejeraA,KM,RamsingNB,RemohíJ.:“Theuseofmorphokineticsasapredictorofembryoimplantation.”HumReprod，26(10):2658-2671.)或者卵裂模式(YangST,ShiJX,GongF,ZhangSP,LuCF,TanK,LengLZ,HaoM,HeH,GuYF,LuGX,LinG.:“Cleavagepatternpredictsdevelopmentalpotentialofday3humanembryosproducedbyIVF.”ReprodBiomedOnline，2015，30(6):625-634.)进行胚胎挑选，并且也出现了相关专利(国际专利申请2014800024095；中国专利2014104577569)。然而，仅基于以上单方面指标进行胚胎评估具有一定局限性，无法全面的反应胚胎发育潜能，且缺乏公认的有效指标。如果仅单方面从时间参数优选胚胎，部分胚胎因卵裂模式的异常而缺乏相应 时间点，难以进行数据统计及挑选胚胎。如果单方面从卵裂模式进行优选胚胎，对于正常卵裂的胚胎，由于发育速度不同，不能从时间参数的角度进一步优选。技术实现要素：本发明旨在克服上述现有胚胎评估方法中使用单方面指标进行评估的不足，建立了一种基于时间参数和卵裂模式组合进行体外受精胚胎评估的分层筛选方法，以便于预测胚胎发育潜能，更高效、快捷的筛选优质胚胎，确保妊娠结局。本发明的技术方案具体如下：本发明提供了一种基于时间参数和卵裂模式组合的胚胎质量评估方法，包括如下步骤：1).通过TLI系统对受精卵进行胚胎培养及动态观察；2).根据卵裂模式对胚胎进行挑选，将正常卵裂、不均或者非轴性卵裂的胚胎纳入下一层筛选；3).根据时间参数进行挑选：先后将s2和t5作为优质胚胎挑选的最佳时间参数再次分层筛选，胚胎的时间参数满足符合s2≤0.50h或/和t5≤48.93h。优选地，最优胚胎定义为：其卵裂模式属于正常卵裂、不均和非轴性卵裂的其中一种，同时，时间参数满足符合s2≤0.50h和t5≤48.93h。可选地，所述步骤1中，受精卵转入含有G1序贯培养液(又称卵裂液)的WOW皿中，置于TLI系统进行培养至第三天(37℃/6％CO2)，拍摄频率为5min/次。本发明的技术方案的有益效果是：(1)本发明将胚胎发育的时间参数与卵裂模式相组合，弥补了传统形态学评估及目前已有的TLI胚胎评估方法的局限性；(2)在众多的胚胎评估参数中，通过科学计算选择了最有效的参数进行胚胎评估，使得胚胎评估更加有效、简便，优化胚胎筛选流程：采用SPSS18.0软件对数据进行统计分析(SPSSInc,Chicago,Illinois,USA)。Logistic回归分析卵裂模式与优质囊胚形成的关系，结果显示：正常卵裂、不均和非轴性卵裂这三类胚胎的优质囊胚形成率较高，可纳入挑选范围；而大碎片、发育阻滞、非二倍性卵裂、非对称卵裂、卵裂球碎裂、融合及混合卵裂模式的胚胎，其优质囊胚形成率较低(p<0.05,与正常卵裂比较)，作为排除条件。时间参数方面，用四分位数法对时间参数进行分类分析，以优质囊胚形成率为结局，计算各参数的优势时间 段；再通过Logistic回归分析，结果显示：s2和t5有统计学意义，相对应的优势时间范围是s2≤0.50h和t5≤48.93h，且s2的危险系数OR值较大，所以优先筛选。(3)本发明应用已建立的分层筛选模型进行优质胚胎的挑选，推动分裂胚单胚胎移植技术的实施，在有效降低多胎妊娠的基础上，改善其妊娠结局。用此筛选模型进行胚胎挑选，第三天分裂期单胚胎移植的临床妊娠率为67.83％，远高于本同期通过传统形态学参数挑选胚胎的单胚胎临床妊娠率(46.43％)。此外，在单纯使用时间参数进行胚胎评估的Meseguer模型(MeseguerM,HerreroJ,TejeraA,KM,RamsingNB,RemohíJ.:“Theuseofmorphokineticsasapredictorofembryoimplantation.”HumReprod，26(10):2658-2671.)中，其在挑选两枚胚胎进行移植的情况下达到的最优组种植率为66％；在单一使用卵裂模式(YangST,ShiJX,GongF,ZhangSP,LuCF,TanK,LengLZ,HaoM,HeH,GuYF,LuGX,LinG.:“Cleavagepatternpredictsdevelopmentalpotentialofday3humanembryosproducedbyIVF.”ReprodBiomedOnline，2015，30(6):625-634.)进行胚胎挑选时，其最优组胚胎种植率为67％；与此两者相比，本发明提出的分层筛选模型的第三天卵裂期最优单胚胎移植的妊娠率即种植率为73.24％，其临床妊娠率明显得到显著提高。附图说明图1胚胎的异常卵裂模式。图2胚胎的分层筛选模式。具体实施方式为了阐明本发明的技术方案及技术目的，下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步的介绍。实施例11.通过TLI对来源于211例IVF周期的1728枚胚胎进行胚胎培养和动态观察，以及应用分层筛选模型进行胚胎评估：对应用常规促排卵方案促排，获得卵母细胞于IVF培养液(又称卵裂液，Vitrolife,Sweden)中进行体外受精，将受精卵转入含有G1序贯培养液(Vitrolife,Sweden)的WOW皿中，置于PrimoTLI系统中进行培养(37℃/6％CO2)及观察。该系统是一种实时的胚胎监测工具，由数码倒置胚胎显微镜、控制台主机、专用软件系统及专用集合培养皿(WOW皿，Cryo-Innovation)组成。将数码倒置胚胎显微镜置于传统培养箱内，控制台主机放置于 培养箱外，通过USB数据线与箱内的显微镜相连接，拍照频率为5min/次，安全地连续监测胚胎发育的动态过程。WOW皿为9孔集合培养皿，具有明确的位置标记，便于识别跟踪每一枚胚胎。(PribenszkyC,MátyásS,KovácsP,etal.“Pregnancyachievedbytransferofasingleblastocystselectedbytime-lapsemonitoring.”ReprodBiomedOnline,2010,21(4):533-536.)在培养过程中，对胚胎的时间参数和卵裂模式进行观察，进行数据收集。其中时间参数包括：原核消失时间(pronucleidisappearance,PND)，发育至两细胞的时间(t2)，三细胞的时间(t3)，四细胞的时间(t4)，五细胞的时间(t5)，两细胞发育至三细胞的时间(cc2＝t3–t2，即停留在两细胞的持续时间)，三细胞发育至四细胞的时间(s2＝t4–t3，即停留在三细胞的持续时间)；卵裂模式包括：正常卵裂、大碎片、发育阻滞、非二倍性卵裂、非对称卵裂、卵裂球碎裂、融合及混合卵裂模式。2)第一层根据卵裂模式进行挑选：剔除排除条件的卵裂模式，包括大碎片、发育阻滞、非二倍性卵裂、非对称卵裂、卵裂球碎裂、融合及混合卵裂模式，将正常卵裂、不均和非轴性卵裂的胚胎纳入下一层筛选；3)第二层根据时间参数进行挑选：先后将s2和t5作为优质胚胎挑选的最佳时间参数再次分层筛选。2.通过计算优质囊胚率证明本发明技术方案的有益效果：患者常规促排卵后，将受精卵转入含有G1卵裂液(Vitrolife,Sweden)的3x3WOW皿中，置于TLI系统进行培养至第三天(37℃/6％CO2)，再将胚胎转入G2囊胚培养液(Vitrolife,Sweden)中继续培养，于第五天观察囊胚形成及其质量。根据Garnder囊胚分级法对囊胚进行分级。根据囊胚的扩张和孵出程度分为I-VI级:I级,早期囊胚,囊胚腔体积<囊胚总体积的一半；II级,囊胚腔体积>囊胚总体积的一半；III级,完全扩张囊胚,囊胚腔占据整个囊胚；IV级,扩张后囊胚,囊胚腔体积较早期囊胚明显扩大,透明带变薄；V级,正在孵化的囊胚,囊胚正在从透明带破裂口孵出；VI级,孵化出的囊胚,囊胚完全从透明带中脱出。3～6级囊胚需对内细胞团和滋养外胚层细胞进行评分。内细胞团评分:A级,细胞数目多,结合紧密；B级,细胞数目较少,结合较松散；C级,细胞数目极少。滋养层评分:A级,细胞数目多,囊胚四周均有细胞分布；B级,细胞数目较少,上皮细胞较松散；C级,细胞数目极少。本研究将囊胚评分≥IVBB(IVBB，IVBA，IVAB及IVAA)被定义为优质囊胚。拍摄频率为5min/次。在1728枚胚胎中，共有866枚胚胎属于正常卵裂、不均或非轴性卵裂模式，经过第一层 卵裂模式的筛选后，优质囊胚率为53.58％(464/866)。对866枚胚胎再次依次进行时间参数s2及t5的分层筛选(挑选条件为s2≤0.50h，t5≤48.93h)，同时符合s2和t5组的优质囊胚率为68.80％(172/250)，符合s2不符合t5的优质囊胚率为49.15％(116/236)，符合t5不符合s2的优质囊胚率为57.61％(106/184)，既不符合s2也不符合t5的优质囊胚率为35.71％(70/196)，此结果提示，该分层筛选模型可以显著区分出胚胎的发育潜能(p<0.05)。实施例2患者随机挑选入组，分为TLI观察组，传统形态学评估组(两组患者基本情况无统计学差异，见表1)，开展第三天卵裂期单胚胎移植。表1单胚胎移植患者一般资料TLI观察组传统形态学组周期数(n)8856年龄(years)33.53±3.5932.57±3.62体重指数(kg/m2)23.69±3.8224.59±3.71基础FSH(mIU/ml)7.80±1.837.28±2.06基础LH(mIU/ml)4.03±2.364.17±2.57获卵数(n)11.50±2.9911.41±3.02正常受精数(n)8.44±2.778.46±2.74正常卵裂数(n)8.19±2.808.23±2.88有88名患者入TLI观察组，常规促排卵后，将受精卵转入含有G1卵裂液(Vitrolife,Sweden)的3x3WOW皿中，置于TLI系统进行培养至第三天(37℃/6％CO2)，通过分层筛选方法(详见实施例1中相关描述)挑选一枚最优质的胚胎进行移植，临床妊娠率为68.18％(60/88)；其中有71例患者的移植胚胎完全符合优选条件(卵裂模式属于正常卵裂、不均和非轴性卵裂的其中一种，同时时间参数符合s2≤0.50h和t5≤48.93h的胚胎)，其临床妊娠率达73.24％(52/71)。有56名患者入传统形态学组，常规促排卵后，将受精卵转入含有G1卵裂液(Vitrolife,Sweden)的微滴培养皿中，置于培养箱进行培养至第三天(37℃/6％CO2)，通过形态学参数评估，挑选一枚最优质的胚胎进行移植，临床妊娠率为46.43％(26/56)。根据结果提示，应用分层筛选模型进行胚胎挑选可显著提高单胚胎移植的临床妊娠率(p<0.05)。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原 理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。当前第1页1 2 3