基于卵裂球分裂和运动的胚胎质量评估的制作方法

专利名称：基于卵裂球分裂和运动的胚胎质量评估的制作方法
技术领域：
本发明涉及基于所观察的细胞分裂以及伴随的细胞和细胞器运动的 计时、持续时间、空间分布和程度，选择用于体外受精的胚胎的方法和系 统。
背景技术：
不育症影响全球8千多万人。据估计，10%的夫妇患有原发性或继发 性不育症(Vayena等，2001)。体外受精(IVF)是一种有效的内科疗法，其 可以提供给以其他方式不能具有怀孕机会的夫妇。这是一种将卵(卵母细 胞)从女性卵巢中取出然后在实验室与精子受精的过程。在该过程中所创 造的胚然后被放置到潜在植入的子宫内。为避免多胎妊娠和多胞胎，仅仅 移植几个胚胎(通常少于四个并且理想地仅为一个(Bhattacharya等， 2004))。选择用于移植的适当胚胎在任何IVF处理中是关键的步骤。目前 的选择程序大部分完全基于在发育过程的不同时间点处对胚胎的形态学 评价，特别是在移植时利用标准立体显微镜进行的评价。然而，广泛认识 到，该评价过程需要定性的以及定量的改进。
早期细胞分裂。 一种有前景的新方法是利用'早期分裂'至2-细胞期(即 在授精/注射后25-27 h之前)作为质量指示。在该方法中，在受精后25-27 小时视觉观察胚胎，以确定是否第一细胞分裂已经完成。几项研究证明， 在个体胚胎的早期卵裂以及随后的发育潜能之间存在强的关联(Shoukir 等，1997; Sakkas等，1998,2001; Bos國Mikich等，2001; Lundin等，2001; Petersen等，2001; Fenwick等，2002; Neuber等，2003; Salumets等，2003; Windt等，2004)。几位观察者已经指出需要更频繁的观察。然而，频繁的 视觉观察由于伴随从温育器转移至倒置显微镜，引起可能阻碍或者甚至使 胚胎发育停止的生理应激。其也是耗时的并且难以并入IVF临床的日常工几位研究者已经在胚胎发育过程中进行了縮时图像采集。这主要通过
将研究用显微镜放置在温育器内部或者将"温育器载物台(stage)"构建到 具有自动图像采集的显微镜镜台上来进行。"温育器"保持可接受的温度 (37°C)、湿度(>90%)和气体组成(5%<:02和在一些情况下减少的氧浓度)。 縮时图像的手动评估已经产生了关于定时以及连续细胞分裂起始之间的 时间间隔的重要信息(Grisart等，1994， Holm等，1998， Majerus等，2000， Holm等，2002， Holm等，2003， Lequarre等，2003， Motosugi等，2005)。
在申请中或在本申请中所引用的所有专利和非专利参考文献因此也 通过参考以其全部并入。

发明内容
本发明涉及基于所观察到的细胞分裂以及伴随的细胞和细胞器运动 的计时、持续时间、空间分布以及程度，有助于选择体外受精(IVF)后所植 入的最佳胚胎的方法和系统。
因此，在第一方面，本发明涉及用于测定胚胎质量的方法，其包括监 测胚胎一段时间期间，所述时间期间的长度足以包括至少一个细胞分裂期 和至少一部分分裂间期(inter-divisionperiod),以及测定i)所述至少一个 细胞分裂期的持续时间；和/或ii)测定在细胞分裂期内细胞或细胞器运动的 程度和/或空间分布；和/或iii)测定分裂间期的持续时间；和/或iv)测定在 分裂间期内细胞或细胞器运动的程度和/或空间分布，从而获得胚胎质量测 量。
所得到的胚胎质量测量然后可以被用于鉴定和选择适于移植到女性 子宫中的胚胎以便提供妊娠和活产婴儿。
因此，在进一步的方面，本发明涉及选择适合用于移植的胚胎的方法, 所述方法包括如上述定义监测胚胎，获得胚胎质量测量，并选择具有最高 胚胎质量测量的胚胎。
在进一步的方面，本发明涉及系统，该系统具有实施上述方法的装置。所述系统可以是任何合适的系统，诸如包括计算机代码部分的计算机，该 计算机构成执行上述方法的装置。所述系统可以进一步包括用于在不同时
间间隔下获取胚胎图像的装置，诸如在于2006年10月16日提交的名称 为"细胞群变化之测定(Determination ofa change in a cell population)"的 在审PCT申请中所述的系统。
在又一方面，本发明涉及数据载体，该数据载体包括计算机代码部分， 所述数据载体构成用于执行上述方法的装置。


图2:两个代表性牛胚胎的卵裂球活动。"好的"发育成孵化的胚泡。 "坏的"从不发育成胚泡。
图3: 41个牛胚胎的卵裂球活动。卵裂球活动以假-凝胶-图像显示， 其屮活动峰由黑色条带表示，无活动是白色的，每个泳道对应单个胚胎。 黑色带型图案或拖尾反应胚胎内细胞活动的期间。"好的"胚胎发育成上 面所示的胚泡，"坏的"胚胎不发育成胚泡期。对于好的胚胎观察到更清 晰的初始条带(通常为三个)。
图4: 13个代表性牛胚胎的卵裂球活动。"好"胚胎发育成由绿色曲 线表示的孵化胚泡。"坏的"胚胎从不发育成以红色显示的胚泡。x-轴是
帧数，y-轴是卵裂球活动。图像采集始于受精后24小时并以2帧/小时进 行。通过向卵裂球活动值添加30，绿色曲线已经在y-轴上被移位。
图5:所有获得帧的平均卵裂球活动(亮区=高卵裂球活动，暗区=低 卵裂球活动)。
图6: 21个牛胚胎的卵裂球活动，其不发育成高质量胚泡。用于划分 卵裂球活动模式的三个曲线部分被标明。
图7: 18个牛胚胎的卵裂球活动，其不发育成高质量胚泡。用于划分
卵裂球活动模式的三个曲线部分被标明。
图8: 13个代表性胚胎的手动检测与自动检测的细胞分裂之间的关联
性。大约10%的细胞分裂通过该算法未被检测到，但是其它的对应性是优
6良的。
图9:好和坏胚胎的手动检测的细胞分裂。
图10:衍生参数的估计。右上角中的图显示作为帧数函数的原始卵裂 球活动。绿色和蓝色直线分别表示第二和第三时间间隔的开始。在右下角 中的图显示如上所述的衍生参数。垂直的红线分别表示峰或谷内最高或最 低活动值的时间和值。
图11:来自94个胚胎的卵裂球活动分析的衍生参数(见上图)。发育成 质量好的扩张胚细胞的胚胎以红色显示(好实例)，不发育成质量好的扩张 胚细胞的胚胎以蓝色显示(坏实例)。
图12:前五个PCA轴的PCA绘图。红色点是具有好质量的胚胎，而 蓝色是具有坏质量的胚胎。
图13: 94个不同胚胎在时段3 (即受精后76至96小时)的卵裂球活动 基线值。该等级是给定的牛胚胎在温育7天后的卵裂球质量量度。等级1 胚胎品质最佳并且具有比等级5显著更高的基线值，等级5是最低的品质 并且经常是闭锁的(attretic)。
具体实施例方式
定义
细胞分裂期从在细胞膜中第一次观察到凹入(表明胞质分裂开始)到 胞质细胞分裂完成使得随后的子细胞的细胞质被分离成两个个体细胞的 时间期间。
分裂间期(Inter-division period):从一个细胞分裂期结束到随后的细 胞分裂期开始的时间期间。
分裂周期在连续细胞分裂开始之间的时间间隔，即从一个细胞分裂 期开始到随后的细胞分裂开始。
细胞位置的重排=细胞运动(见下述)。
细胞运动细胞中心以及外部细胞膜的运动。细胞器在细胞内的内部
运动不是细胞运动。外部细胞膜是动态结构，因此细胞界限将连续轻微地改变位置。然而，这些轻微的变动不被认为是细胞运动。细胞运动是指细 胞的重心及其位置相对于其他细胞改变以及指细胞分裂。细胞运动可以通 过计算运动细胞的两个连续数字图像之间的差异来量化。此类量化的实例
详细描述在于2006年10月16日提交的名称为"细胞群变化之测定"的 在审PCT中。然而，测定细胞重心和/或细胞质膜位置运动的其他方法可 以通过例如利用FertiMorph软件(丹麦哥本哈根的ImageHouse Medical)以 便半自动描绘在通过胚胎的连续光学狭样区中每一卵裂球的界限来预见。
细胞器运动可以通过显微镜观察胚胎内的内部细胞器以及细胞器膜
的运动。在本申请的上下文中细胞器运动不是细胞运动。
运动物体的空间重排。运动通过很多不同参数来表征和/或量化和/ 或描述，所述参数包括但不限于运动的程度、运动中所涉及的面积和/
或体积、旋转、平移向量、运动的方向、运动的速度、大小调整(resizing)、 膨胀/收縮等。细胞或细胞器运动的不同量度因此可以被用于不同的目的， 一些目的反映出运动的程度或强度， 一些反映出运动物体的空间分布，一 些反映出运动所经历的轨迹或体积。胚胎在一些情况中术语"胚胎"被用于描述在受精后八周变成胎儿
前移植入子宫后的受精卵母细胞。根据该定义，受精的卵母细胞在进行移
植前通常被称为胚前期(pre-embryo)。然而，贯穿该专利申请，我们将使 用更宽的术语胚胎定义，其包括胚前期阶段。因此其包括从卵母细胞受精 到桑葚胚、胚泡期孵化和植入的所有发育阶段。
胚胎质量是所述胚胎在转移之后在子宫中成功植入和发育的能力的 量度。高质量的胚胎在转移后将在子宫中成功植入和发育，而低质量胚胎 将不会。
胚胎成活力是所述胚胎在转移后在子宫内成功植入和发育的能力的 量度。高成活力的胚胎在转移后将在子宫内成功植入和发育，而低成活力 的胚胎将不会。成活力和质量在本文中被互换使用。
胚胎质量(或成活力)测量是意欲反映胚胎质量(或成活力)的参数，以便 具有高质量参数值的胚胎具有高的概率成为高质量(或成活力)的胚胎，以 及具有低的概率成为低质量(或成活力)的胚胎。然而具有相关的低质量(或成活力)参数值的胚胎仅具有具备高质量(或成活力)胚胎的低概率以及具 有成为低质量(或成活力)胚胎的高概率。
胚胎
胚胎近似球形并且由一个或多个由明胶样外壳包围的细胞(卵裂球)组 成，无细胞的基质被称为透明带。透明带执行多种功能，直到胚胎孵化为 止，并且透明带是用于胚胎评价的好标志。该带是球状且半透明的，并且 应当清晰地区别于细胞碎片。
当通过精细胞(精子)的融合或注射而使卵母细胞受精时，形成胚胎。 该术语传统也用于孵化后(即透明带的破裂)和随后的植入。对于人类而言， 受精的卵母细胞在前八周传统上被称为胚胎。之后(即在八周之后，以及当 所有主要器官已经被形成时)其被称为胎儿。然而，胚胎与胎儿之间的差别 通常未被充分限定。
在胚胎发育期，卵裂球数目几何增加(l-2-4-8-16-等)。同步的细胞分 裂通常被保持到胚胎中的16-细胞期。之后，细胞分裂变成不同步的，并 且最终个体细胞拥有它们自己的细胞周期。对于牛胚胎组成胚胎的卵裂 球在16-细胞期成为球形细胞前应当是容易识别的，。在大约32-细胞期(桑 葚胚期)，胚胎经历压縮(compaction),因为当黏着蛋白被表达时发生细 胞间粘附。结果是，经过该阶段后，难于评价胚胎中的个体细胞的数目。 对于人胚胎，压縮发生地稍微更早，并且在16细胞期，个体卵裂球不易 识别。在不育症治疗中所产生的人胚胎通常在桑葚胚期前被转移至受体， 而其他哺乳动物胚胎在转移至受体或排出之前通常被实验培养到进一步 的发育阶段(扩张胚泡)。在一些情况中，人胚胎在移植之前也被培养到胚 泡期，在有很多好质量胚胎或者需要长时间的温育来等待植入前遗传诊断 (PGD)的结果时，这种情况被优选地进行。因此，术语胚胎被用来表示以 下的各个阶段——受精卵母细胞、受精卵(zygote)、 2-细胞、4-细胞、8-细胞、16-细胞、桑葚胚、胚泡、扩张胚泡和孵化胚泡，以及位于其间的所 有阶段(例如3-细胞或5-细胞)。
质量测定
基于一种或多种胚胎的测定，本发明提供胚胎质量测量[见上述胚胎
9质量测量的定义]，诸如i)至少一个细胞分裂期的持续时间；和/或ii)测定 在细胞分裂期期间细胞或细胞器运动的程度和/或空间分布；和/或i")测定 分裂间期的持续时间；和/或iv)测定分裂间期期间细胞或细胞器运动的程 度和/或空间分布，从而获得胚胎质量测量。
本发明依赖于这样的观察除每一细胞分裂前后短的时间间隔，细胞 位置在细胞分裂之间通常是相对固定的(即很少的细胞运动)，此时一个细 胞分裂成两个，导致分裂细胞以及周围细胞的短暂但是相当大的重排(即 显著的细胞运动)。
本发明的特定用途是评价发育中的胚胎的图像系列(縮时图像)。这些 縮时图像可以通过差分成像来分析(见于2006年10月16日提交的名称为 "细胞群变化之测定"的在审PCT申请)。得到的差分图像可以用于量化 在图像系列中连续帧之间发生的变化量。
本发明可以被应用于差分图像数据的分析，其中作为细胞运动结果的 细胞界限改变的位置(即细胞膜)使得衍生自该差分图像的一系列参数暂时 增加(见于2006年10月16日提交的名称为"细胞群变化之测定"的在审 PCT申请)。这些参数包括(但不限于)平均绝对强度或方差的增加。细胞分 裂及其持续时间以及相关的细胞重排因此能够通过差分图像中所有像素 的标准偏差上的暂时变化——即增加或减少，或者通过在于2006年10月 16日提交的名称为"细胞群变化之测定"的在审PCT申请中所列举的"卵 裂球活动"的任何其他衍生参数进行检测。然而，所述选择标准也可以被 用于视觉观察和分析縮时图像以及与胚胎发育有关的其他暂时分辨的数 据(例如代谢产物的排泄或摄取，物理或化学外观变化，衍射，散射，吸收 等)——这些数据如在2006年10月16日提交的名称为"细胞群变化之测 定"的在审PCT申请所定义，与卵裂球活动无关。
特别感兴趣的是细胞分裂的开始、强度和持续时间，它们在衍生参数 值中可以被量化为波峰或波谷。这些极限——波峰或波谷——通常表示细 胞分裂事件。这些事件的定时和持续时间以及在这些事件过程中以及之间 所观察到的参数值用来表征胚胎以及评价其发育潜能。和通常峰的大小一 样，每个峰的形状也提供另外的信息。峰也可以表示卵裂球的突然崩溃以及同时发生的细胞死亡。然而，通过事件前后峰形状以及基线值的变化区 分细胞分裂与细胞死亡事件也是可能的。大多数参数的基线通常不受细胞 分裂的影响，而细胞溶解通常伴随着基线值的显著变化(对于大多数参数， 溶解后减小)。
另一特别感兴趣的是细胞和细胞器运动的空间分布。缺乏运动的透明
带内的体积(或类似地，保持静止的胚胎投影2D图像中的面积)表示胚胎 内的"死亡"区。这些不能动的"死亡"区越多越大，成功胚胎发育的可 能性越低。在縮时系列胚胎图像内缺乏任何类型运动(即既无细胞运动也 无细胞器运动)的大片面积表明低的成活力。细胞器运动通常应当在整个 胚胎中是可检测的，即使当仅比较两个或几个连续的帧时也是如此。细胞 运动可以更集中在特别是胚胎发育的后期中，然而，当评价很多连续的帧 时，细胞运动应当在透明带内在整个体积内是可检测的，这表明胚胎内所 有卵裂球都分裂并改变位置。
因此，胚胎质量测量包括关于在至少一个细胞分裂和/或个分裂间 期的至少一部分期间细胞和细胞器运动的信息，诸如i)所述至少一个细
胞分裂期的持续时间；禾n/或ii)测定在细胞分裂期内细胞或细胞器运动的 程度和/或空间分布；和/或iii)测定分裂间期的持续时间；和/或iv)测定在 分裂间期内细胞或细胞器运动的程度和/或空间分布。在优选的实施方式 中，胚胎质量测量包括本文所述的两个或多个测定信息，诸如三个或多个 本文所述的测定。在更优选的实施方式中，胚胎质量测量包括本文所述的 所有测定的信息。具体而言，胚胎质量测量包括关于细胞分裂期长度和分 裂间期长度的信息，或者胚胎质量测量包括关于细胞分裂期中的运动以及 分裂间期中的运动方面的信息。在另一实施方式中，胚胎质量测量包括关 于期间的长度以及在该相同期间内的运动方面的信息。
胚胎质量测量基于下面的观察
a)突然的细胞分裂——其中真正的细胞质分裂进展迅速并且随后发生 的其他卵裂球位置的重排也迅速发生(例如，尖的卵裂球活动峰)，预示着 高质量的胚胎。延长的胞质分裂持续时间以及其他卵裂球随后广泛的空间 重排(即细胞运动)表示胚胎质量差(例如宽的卵裂球活动峰)。(实施例1 )b) 细胞分裂之间很少的卵裂球位置重排表示高质量胚胎，而可见的细 胞分裂之间的运动经常表示胚胎质量差。(实施例1)
c) 细胞分裂之间延长的细胞位置重排(例如宽的卵裂球活动峰)通常与 差的胚胎质量、不同步的细胞分裂和大量断裂有关。(实施例1)
d) 当胚胎基因组被活化并且蛋白质合成从母体转向胚胎转录时，对于 大多数哺乳动物而言，观察到非常少的细胞运动的静息期间。如果该期间 具有i)早期开始，")非常低的活动(=很少的细胞运动=静息的)，和叫早 期终止，则其是高质量胚胎的强有力的象征。在坏胚胎中静息期间的开始 经常被延迟，并且有时被细胞运动中断。坏胚胎也可以在"静息"期具有 升高的细胞运动基线水平，而无可检测的细胞分裂。(实施例2)
e) 在随后停止发育的劣质胚胎中，经常观察到特定的且始终不移动的 区域，其持续不变并最终导致发育停止。此类不移动的区域可与大量断裂 或卵裂球死亡和溶解有关。如果这些区域在给定的发育期大于给定的百分 比，则胚胎具有非常低的存活可能性。在高质量胚胎中，在每-胞质分裂 事件之后很快发生的细胞活动最初分布在整个胚胎表面上(即所有的卵裂 球轻微移动)，仅在桑葚胚期的压縮之后观察到局部运动(实施例3)。
f) 细胞器运动的均匀空间分布通常发现于有活力的高质量胚胎中；而 缺乏活动的"死亡"区通常发现于低质量胚胎中。己经对细胞运动进行了 类似的观察，但是在较长时间-窗口期间进行的观察是测定细胞运动的空间 均匀性所必需的(实施例3)。
g) 在不同时间间隔中细胞运动的量是胚胎质量的优良指标。质量相关 的参数可以从不同时间段中的平均运动的比率和/或不同时间段中标准偏 差的比率计算。胚胎选择程序可以基于这些参数的值来建立(实施例4)。
h) 细胞运动和细胞器运动的基线水平逐渐或突然的减小通常与低胚胎 质量和发育停止的高度可能性相关。基线水平的变化可与不活动区/区域的 出现相关(见上述(e)和(f))。(实施例6)
i) 首次细胞分裂的早期开始是高胚胎质量的象征。首次(和随后细胞 分裂)的晚期开始表示低质量胚胎。然而，对于大多数胚胎而言，单独首 次细胞分裂的确切开始不提供明确的胚胎质量指示(实施例4)。j)对于描述细胞和细胞器运动的大部分衍生参数，可以定义正常范围， 使得在该正常范围之外的值(例如异常高的或异常低的)都表明坏的胚胎
质量(实施例6)。
k)连续的细胞分裂之间的间隔是胚胎成活力的重要(以及种类特异的) 指标， 一个实例是2和2—4细胞分裂之间的间隔的比率与2—4和4—8 细胞分裂之间的间隔之间的比率。这些间隔的比率应当在活胚胎的给定范 围内。
I)在后期(例如2^4， 4^8)的同步进行的细胞分裂主要发现于高质量胚 胎中，而对于低质量胚胎经常观察到不同步的细胞分裂(例如 2^344454647—8)(实施例1 )。
下面的测定产生最高的胚胎质量测量
短的细胞分裂期，其中短的被定义为小于2小时。
在分裂间期很少的细胞运动，其中很少的被定义为视觉上不存在超 出常规的振荡和细胞器运动的细胞位置变化，所述常规的振荡和细胞器运 动总是促成差分图像。很少的细胞运动暗示细胞的重心是固定的(运动<3 [im)并且细胞质膜很大程度上是不移动的(〈3 [im)。
首次细胞分裂期的早期开始，即对于人胚胎而言，在受精后25小时 之前(对于牛胚胎而言，在受精后30小时之前)。
在分裂间期中短的细胞运动期，其中短的被定义为小于3小时。
在透明带内细胞运动随时间均匀的分布，即不存在在较长时间期间 内未观察到细胞运动(即> 24小时)的胚胎的不活动区域/区/体积。此类不 移动的区域可能是由于死亡的或濒死的卵裂球和碎片，其可阻碍进一步的 发育。
细胞运动的基线值持续的轻微的增加。
所有衍生参数在特定胚胎的正常范围内。
胚胎质量测量越接近最高质量测量，胚胎的质量越高。
神经网络或者其他定量模式识别算法可以用于评价上述复杂的细胞 运动模式。此类网络可以用来发现最佳质量的胚胎用于IVF治疗中的移植。
13实施例6描述了在胚胎发育期间从"卵裂球活动"(见于2006年10月16 曰提交的名称为"细胞群变化之测定"的在审PCT申请)获得的胚胎发育 的关键参数，并随后利用不同的数学模型(线性，主成分分析，Markov模 型等)评价所述衍生参数。
其他测量
最终的分析步骤可以包括比较所进行的观察与不同质量和发育能力 的胚胎的类似观察，以及比较给定胚胎的参数值与在同一胚胎上进行的其 他定量测量。这可以包括与在线测量诸如卵裂球运动性、呼吸率、氨基酸 摄取等的比较。卵裂球活动性分析、呼吸率以及其他定量参数的结合数据 组有可能改进胚胎选择并使胚胎学家能够可靠地选择用于移植的最佳胚 胎。
因此，在一个实施方式中，根据本发明的方法可以结合其他测量，以 便评价正在讨论的胚胎，并且可以用于选择用于移植至受体的有能力的胚 胎。
此类其他测量可以选自呼吸率、氨基酸摄取、运动性分析、卵裂球活 动、形态、卵裂球大小、卵裂球粒化(blastomere granulation)、断裂、卵 裂球颜色、极体定向、核化、纺锤体形成和完整性以及很多其他定量测量。 呼吸测量可以如在PCT公布号WO 2004/056265中所述进行。
培养基
在优选的实施方式中，在细胞群培养的过程中进行观察，诸如其中细 胞群被放置在培养基中。培养细胞群的方法在本领域是已知的。培养胚胎 的实例描述在PCT公布号WO 2004/056265中。
数据载体
本发明进一步涉及数据载体，其包含直接可装载在数字处理设备的存 储器中的计算机程序以及包含构成用于执行如上所述的本发明方法的装 置的计算机代码部分。
数据载体可以是磁盘或光盘或者可以是EEPROM或Flash类型的电子 卡的形状，并且被设计成装载到现有的数字处理装置中。胚胎的选择或鉴定
本发明进一步提供选择用于移植的胚胎的方法。该方法暗示已经如上 所述对胚胎进行监测，以测定胚胎中的变化，以便测定细胞分裂何时发生 以及任选测定是否已经发生细胞死亡以及测定细胞分裂的质量和胚胎的 总体质量。优选选择具有基本同步的细胞分裂、产生差分图像的清晰衍生 参数的胚胎，以及更优选选择无细胞死亡的胚胎。
选择或鉴定方法可以结合如上所述的其他方法，以便评价胚胎的质 量。胚胎的形态学评价的重要标准是(l)胚胎的形状，包括卵裂球的数目 和断裂的程度；(2)透明带的存在和质量；(3)大小；(4)颜色和结构；(5)对 与胚胎发育期有关的胚胎年龄的了解；和(6)卵裂球膜完整性。
移植然后可以通过本领域技术人员己知的任何合适的方法进行。
实施例1
材料和方法.从得自屠宰场的卵巢抽取牛未成熟卵丘-卵母细胞复合 体(COCs)，选择并在四孔皿中成熟24 h (Nunc, Roskilde,丹麦)。每孔含有 400 4的碳酸氢盐缓冲的TCM-199培养基(Gibco BRL, Paisley, UK)，该 培养基补充以15。/。牛血清(CS; Danish Veterinary Institute, Frederiksberg，丹 麦)、10 IU/mL eCG和5 IU/mL hCG (Suigonan Vet; Intervet Scandinavia, Skovlunde,丹麦)。使胚胎在38.5'C在5% C02于增湿空气中在矿物油下成 熟。利用冻融的Percoll-选择精子在改良的Tyrode's培养基中进行受精。
在22h后，通过涡旋去除卵丘细胞，并将假定的受精卵转移至400^1 培养基——该培养基由含有氨基酸、柠檬酸和肌醇(SOFaaci)并补充抗生素 (硫酸庆大霉素，10mg/ml)的合成的输卵管液体和5% CS组成——中，并 在38.5。c下于具有最大湿度的5q/。c02、 5%02、 90。/qN2气体下温育。
温育器系统已经在以前予以详细地描述，并且已经证明适于体外胚胎 培养(Holm等，1998)。简言之，将4-孔培养皿放置在倒置Nikon TMD显 微镜(Diaphot, DFA A/S,哥本哈根，丹麦)的显微镜镜台上(MultiControl 2000扫描台，Marzhauser，德国)。通过空气温度控制器(Air-ThermTM， World Precision Instruments, Aston, UK)调节的黑色有机玻璃温育箱围绕镜台固 定。具有开放底部的塑料盖被放在培养皿上，并将已经经过放置在温育器箱内部的洗气瓶之后的增湿的气体混合物导入该半封闭培养室中。
该培养箱先前已经证明可用于体外胚胎培养(Holm等，1998, 2003)， 其提供稳定的温度和湿度条件。在试验期间我们每周例行的体外胚胎生产 用作该基本培养系统完整性的对照。
照相机系统.縮时记录通过图像分析软件(ImageProTM, Unit One, Birkerad,丹麦)指挥，该图像分析软件控制扫描台在x-轴、y-轴和z-轴的 运动、所连接的高度光敏录像摄像机的操作(WAT-902H, Watec, DFA A/S, Copenhagen,丹麦)以及縮时顺序在计算机硬盘上的记录和存储。在整个7 天的培育期内每个胚胎的縮时图像(总放大率x265)在30分钟间隔下以最 小光顺序进行记录。在记录之间，胚胎被移出光场。
手动分析縮时图像系列由记录首次出现下列卵裂/胚胎阶段_一2-细 胞、4-细胞、8-细胞、16-细胞——的时间和具有可见的相干细胞群和桑葚 胚的时间:最大的致密桑葚胚，胚泡的第一扩张，胚泡的崩溃以及胚泡的孵 化组成。
基于自动化计算机的分析由计算差分图像的标准偏差组成，该标准偏 差计算为两个连续帧之间的差异。为避免校准的人为产物以及其他问题， 使用下面的详细步骤
1) 图像采集。(见上述)。
2) 通过从序列中的每个图像中扣除人为产物的散焦参考图像，去除固 定位置的人为产物(照相机灰尘)。
3) 移位以补偿不精确的镜台运动(stage movement)。非常简单的校准 图像的方法是比较原始差分图像与在给定方向移动原始图像之一后以单 像素计算的差分图像。如果改变位置之后计算的差分图像的方差低于原始 的差分图像的方差，则改变位置产生改进的校准。通过系统地尝试所有可 能的移动方向以及所有相关的移动幅度，能够得到校准的时间序列。然而， 在目前的情况下，我们使用由Thevenaz等1998开发的高级ImageJ macro 进行图像校准。
4) 鉴定感兴趣区(ROI)和外部参考区域。由于布朗运动排列问题等，比 较胚胎内的细胞运动与胚胎外的"运动"是有利的。这是通过描绘胚胎并比较胚胎内的差分图像与胚胎外类似区域中计算的差分完成的。描绘胚胎 通常手动完成。参比区域我们选择无任何胚胎的图像区域。
5) 计算强度差。
6) 计算各差分图像的衍生参数。计算几种差分参数，但是证明最有益 的参数是差分图像中所有像素的强度标准偏差。该参数在下面被称为"卵 裂球活动"。
7) 鉴定和测定卵裂球活动的峰的形状。
8) 计算诊断相关时间间隔的卵裂球活动的标准偏差和平均值。见实施 例4。
试验设计.大约20牛胚胎于Nunc-4孔皿的单孔中一起温育7天，每 30分钟采集图像。该试验被重复5次，总计产生99个牛胚胎的縮时图像 系列。
结果
基于发育胚胎的縮时图像系列的定性评价，(基本通过使它们作为电影
演示很多次进行观察并记录变化)，我们观察到高质量胚胎的指标是突然
的细胞分裂，其中真正的细胞质分裂进展迅速，并且跟着发生的其他卵裂 球位置的重排快速发生，接着为很少细胞位置重排的静息"期间"，直到 下一次细胞质分裂突然开始。坏胚胎经常在细胞质分裂之后以及胞质细胞 分裂之间显示出延长的卵裂球位置重排。为定量和记录这些观察，我们从
縮时图像系列计算卵裂球活动，如在上面定义的PCT申请中所述。代表性 的卵裂球活动示于图2中。
一些观察的活动是由于不同步的细胞分裂(例如2—34445—6—7—8)和 断裂，这与所观察的高质量胚胎的同步细胞分裂(例如2—4,"8)相反。
41个胚胎卵裂球活动以假-凝胶-图像展示在图1中，其中活动峰以黑 带表示，不活动是白色的。
实施例2
材料和方法.与实施例1相同 结果在哺乳动物胚胎中的最初蛋白质合成使用来自卵母细胞的母体
mRNA，但是在数次细胞分裂之后，胚胎基因组被激活、转录和翻译。从 母体基因组向胚胎基因组的转变在胚胎发育中是关键的步骤。对于牛而言 该期间发生在8-细胞期并具有相对长的持续时间，对于人胚胎而言，该转 变发生在4至8细胞期的早期并具有较短的持续时间。
当胚胎基因组被激活并且蛋白质合成从母体转向胚胎基因时，对于大 多数哺乳动物而言，观察到非常少的细胞运动的静息期间。如果该期间具 有i)早期开始，ii)非常低的活动(—艮少的细胞运动^静息的)，禾卩iii)早期 终止，则其是高质量胚胎的强有力的象征。在坏胚胎中静息期间经常被延 迟，并且有时被细胞运动中断。显示13个不同胚胎的卵裂球活动的实例 示于图4中。
实施例3
材料和方法.与实施例l相同
结果.在随后停止发育的坏胚胎中，经常观察到特定的且始终不移动 的区域，其持续不变并最终导致发育停止。此类不移动的区域可与大量断 裂或卵裂球死亡和溶解有关。如果这些区域在给定的发育期大于给定的百 分比，则胚胎具有非常低的存活可能性。在高质量胚胎中，在每一胞质分 裂事件之后很快跟着发生的细胞活动最初分布在整个胚胎表面上(即所有 的卵裂球轻微移动)，仅在桑葚胚期的压縮之后观察到局部运动。
发育成胚泡的胚胎诸如图5中的左侧板具有均匀分布的卵裂球活动。 不具有均匀分布的卵裂球活动的胚胎诸如图5中的右侧板从不发育成胚 泡。
实施例4
材料和方法.与实施例1相同
结果.在不同时间间隔中细胞运动的量是胚胎质量的好指标。质量相 关的参数可以从不同时间段中的平均运动的比率和/或不同时间段中标准 偏差的比率计算。胚胎选择程序可以基于这些参数的值来建立。不同阶段 (=部分)的实例示于图6和图7上。在这种情况下，部分l是受精之后32 至60小时的时间段，部分2是受精之后的60至75小时，部分3是受精之后的75至96小时。
基于不同部分中的卵裂球活动和/或卵裂球活动的标准偏差，能够对胚 胎进行分类。在此种情况下，我们使用下述选择标准，其基于*R1=对 于给定胚胎，胚泡活动模式的部分1与部分3中的平均胚泡活动之间的比 率<image>image see original document page 20</image> R2=对于给定胚胎，胚泡活动模式的部分2与部分3中的胚泡活动 标准偏差之间的比率
如果(RK 1.15和R2〈 0.50)，则其是"好的"胚胎，否则其是"坏的" 胚胎。利用这些标准，根据其随后如何发育，39个胚胎中所有36个胚胎 被正确分类。
实施例5
材料和方法.与实施例1相同
结果.下面图8显示自动与手动测定细胞分裂开始之间的好的一致 性。非常早的首次细胞分裂的开始预示高胚胎质量。非常晚的首次(以及随 后的细胞分裂)开始表示低质量胚胎。然而，对于大多数胚胎而言，单独首 次细胞分裂的确切开始不提供胚胎质量的明确指示，如在下面图8中所示。 尽管对于差的胚胎细胞分裂的平均开始被延迟，大的固有标准偏差使得绝 对值成为不佳的选择标准，除在极端情况下之外，(例如，在30小时之前 的第一次分裂表明好的胚胎)。35小时之后的第一次分裂表明差的胚胎， 但是所调查的大多数牛胚胎具有不易被解释的中间分裂时间。
实施例6a
材料和方法.与实施例1相同
结果.典型的时间系列的卵裂球活动由温育过程中每小时数个测量组 成(例如，在前2至3天期间——其是诊断上感兴趣的时间窗，对于每个所 测量的胚胎为大约150个数据点)。大多数统计方法对分析具有此类高维数 的数据具有困难。因此，重要的是通过选取衍生参数找到用于降低维数的 有利方法。为实现此种目的，在开始图像采集之后，卵裂球活动被分为三 个间隔0-32、 32-52和52-72小时(图9)。在这些间隔的每一个中，利用 下面的方法发现三个峰第一峰是最高的卵裂球活动。第二峰是在第一峰 之前或之后至少3.5h的最高卵裂球活动值。第三峰是距第一峰和第二峰至 少3.5h的最高活动。从每个峰得到下面的参数时间，峰值，以及从该峰 之前0.5h到该峰之后1.5h的活动值的平均值。另外，两个峰之间的波谷通过最小值、最小值的时间和平均值来描述(有关衍生参数的实例见图io)。
如果不同胚胎的衍生参数被归一化为相同的方差和平均值，则对于不会适 当发育的胚胎所发现的异常值(即太高或太低)变得显而易见(差的胚胎= 图11中是蓝色的点)。发育良好的胚胎(红色的点)具有较窄范围的值。可以 基于上述衍生参数来开发胚胎质量的统计模型。如果已经根据最终发育对 每个胚胎进行评价，则存在很多不同的统计方法用于分析衍生参数与最终
发育之间的关系。这些方法包括线性和非线性模型、贝叶斯网络、神经 网络、隐马尔科夫模型、最近邻法、主成分分析及其他。下面的图12显
示了数据的主成分分析的(PCA)的实例。
随着新数据被产生，统计模型可以被评价和/或延伸。为便于此，重要 的是发现有利的数据结构和衍生参数集合。
甚至非常简单的单独参数的分析诸如参数39=在第三时间段中的卵裂 球活动的基线值(受精后76至96小时)在某种程度上可以挑选出异常的和 无活力的胚胎。基于这个单一参数，在72%的准确性下自动选择好质量胚 胎因此是可能的。
实施例6B
材料和方法.与实施例1相同
结果.典型的卵裂球活动的时间系列由温育期间每小时几个测量组成 (例如，在前2至3天期间——其是诊断上感兴趣的时间窗，对于每个所测 量的胚胎为大约150数据点)。大多数统计方法对分析具有此类高维数的数 据具有困难。因此，重要的是通过选取衍生参数找到用于降低维数的有利 方法。为实现此种目的，在开始图像采集之后，卵裂球活动被分为三个间 隔0-32、 32-52和52-72小时(图9)。选择三个时间间隔来反映牛胚胎的 三个发育期。阶段l:从1-细胞到8-细胞的初始细胞分裂。阶段2:静息 期，具有相对很少的活动和运动。据认为在此阶段胚胎基因组被激活。在 一些胚胎中，静息期在8-细胞水平开始，在其他胚胎中，在16-细胞阶段
开始，但是在所有发育的胚胎中，其是一个无细胞分裂的延长期。阶段3:
继续细胞分裂，发育成桑葚胚。在该阶段计算单独的卵裂球通常是不可能 的，但是縮时图像显示细胞分裂己经重新开始。在这三个反映三个发育期
22的时间间隔屮的每一个中，卵裂球活动中的三个峰利用下面的方法来鉴 定第一峰是最高的卵裂球活动。第二峰是在第一峰之前或之后至少3.5h 的最高卵裂球活动值。第三峰是从第一峰和第二峰至少3.5h的最高活动。
从每个峰得到下面的参数发生的时间，峰值，以及从该峰之前0.5h
到该峰之后1.5h的活动值的平均值。另外，两个峰之间的波谷通过最小值、 最小值的时间和平均值来描述(有关衍生参数的实例见图9)。
关于三个阶段中的每一个，我们因此得到下面的参数
1峰l，值
2峰1时间
3峰1平均
4谷l，值
谷1时间
6谷l平均
了峰2，值
8峰2时间
9峰2平均
10谷2，值
11谷2时间
12谷2平均
13峰3，值
14峰3时间
15峰3平均
另外，我们计算该阶段中的卵裂球活动的平均值和标准偏差 16平均值
17 StDev
我们也利用上述参数中的一些来描述峰形状，其反映出胚胎细胞分裂 事件的持续时间或同步性。卵裂球活动中尖锐峰(即迅速同步化的细胞分裂)的特征在于低的峰平均值与峰值之比，然而较高的比率反映出峰平均值 与峰值更类似的较宽峰。峰平均值除以峰值将总是< 1，值接近1表示宽峰，
值接近o表示非常陡的峰。
18 (峰1平均-平均值)/ (峰1 ，值-平均值)=(PI -P16)/(P3- P16)
19 (峰2平均-平均值)/ (峰2，值-平均值)=(P7-P16)/(P9- P16) 20(峰3，平均-平均值)/(峰3，值-平均值)-(P13-P16)/(P15-P16)
最后，我们计算第一峰与第二峰之间的时间比以及第二峰与第三峰之 间的时间比。
21 (峰2，时间國峰1 ，时间)/ (峰3，时间-峰2，时间)=(P8- P2)/(P14-P8)
上面所示的21个参数的参数集合被用于快速分析，因为其仅包括可 以从第一阶段即孵育32小时得出的信息。
小的数据集含有可以被用于将胚胎分类为有活力和无活力的重要信 息。然而，如果下面两个时间间隔的数据可得，则对于两个下述阶段可以 重复该分析。我们没有计算下述阶段的比率(即形状特征以及峰之间的间隔) 但是仅计算了峰和谷(即，15个参数/阶段)。最后，总平均值、总标准偏差 (StDev)和总最小值与最大值被包括在下面所示的59个参数的整个参数 集合中
总平均值
卵裂球活动的总标准偏差
卵裂球活动的总最小值
卵裂球活动的总最大值
SEG 1平均值
SEG 1 StDev
SEG1峰L值
SEG 1峰1 pos
SEG 1峰1平均
SEG1谷1，值SEG 1谷1 pos SEG1谷1平均 SEGl峰2,值 SEG 1峰2 pos SEG 1峰2平均 SEG1谷2，值 SEG 1谷2 pos SEGl谷2平均 SEG 1峰3，值 SEG 1峰3 pos SEG 1峰3平均 SEG2平均值 SEG2 StDev SEG2峰1 ，值 SEG2峰1 pos SEG2峰1平均 SEG2谷1平均 SEG2谷1 pos SEG2谷1平均 SEG2峰2，值 SEG2峰2 pos SEG2峰2平均 SEG2谷2，值 SEG2谷2 pos SEG2谷2平均 SEG2峰3，值SEG2峰3 pos SEG2峰3平均 SEG3平均值 SEG3 StDev SEG3峰1，值 SEG3峰1 pos SEG3峰1平均 SEG3谷1，值 SEG3谷1 pos SEG3谷1平均 SEG3峰2，值 SEG3峰2 pos SEG3峰2平均 SEG3谷2，值 SEG3谷2 pos SEG3谷2平均 SEG3峰3，值 SEG3峰3 pos SEG3峰3平均 SEG 1峰1比率 SEG 1峰2比率 SEG1峰3比率 SEG1谷1谷2比率
如果不同胚胎的衍生参数值被归一化为相同的方差和平均值，则对于 不会适当发育的胚胎而言，异常值的发现(即太高或太低)变得显而易见 (差的胚胎=图11中是蓝色的点)。图中的参数与上述顺序相同但是在末尾省略了四个比率参数。发育良好的胚胎(红色的点)具有较窄范围的值。
可以基于上述衍生参数来开发胚胎质量的统计模型。如果己经根据最 终发育对每个胚胎进行评价，则存在很多不同的统计方法，用于分析衍生 参数与最终发育之间的关系。这些方法包括但不限于线性和非线性模型、 贝叶斯网络、神经网络、隐马尔科夫模型、最近邻法、主成分分析及其他。 下面的图11显示了数据的主成分分析的(PCA)的实例。
线性模型应用的实例示于实施例7中。
随着新数据被产生，统计模型可以被评价和/或延伸。为便于此，重要 的是发现有利的数据结构和衍生参数集合。
甚至非常简单的单独参数的分析诸如参数39=在第三时间段中的卵裂 球活动的基线值(受精后76至96小时)在某种程度上可以挑选出异常和 不存活的胚胎。基于这个单一参数，在72%的准确性下自动选择好质量胚 胎因此是可能的。
实施例7.基于自动化检测或胚胎学家检测的胚胎选择的比较
设计.在恒定的温度、湿度和C02下培养7天的95个牛胚胎被放置 在縮时显微镜中。从受精后24小时至96小时采集阁像，每小时两次。评 价图像分析程序正确鉴定随后(即7天后)发育成扩张胚泡的38个胚胎 的能力，并基于每一胚胎的相同的145个图像，同由受过训练的胚胎学家 作出的质量评价进行比较。
材料&方法.从得自屠宰场的卵巢抽取牛未成熟卵丘-卵母细胞复合 体，在受精24h之前成熟22h。然后去除卵丘细胞，并将假定的受精卵转 移并在合成的输卵管液体培养基中培养。在固定到倒置Nikon显微镜镜台 上的温育箱内采集縮时图像，该显微镜镜台安装有灵敏摄像机。
结果.全自动图像分析程序基于在縮时系列中的连续图像之间观察到 的运动产生了细胞卵裂球活动的定量测量。卵裂球活动与细胞分裂之间的 关联通过比较縮时图像系列的自动和手动分析进行确认。卵裂球活动中显 著的峰被发现与细胞分裂相关。细胞分裂确切的开始和持续时间基于所记 录的峰的位置、形状和大小可以被量化。给定胚胎的卵裂球活动模式因此 可以被简化为一组对应主峰的峰高度、位置和宽度的关键参数，以及描述峰之间的卵裂球活动水平的类似参数。在简单的线性模型中对于每个胚胎
使用了总计55个参数来将胚胎分类为"有活力的"或"无活力的"。在所 观察到的胚胎模式的子集上校正模型并在不同的独立子集上进行评价。相 同的图像縮时系列由熟练的胚胎学家进行评价，以尝试预测胚胎是否将发 育成扩张胚泡。
尽管该模型仅仅是具有有限精确度的简单线性模型，应当注意，全自 动化的分析在预测哪些胚胎将发育成扩张胚泡方面(出错率20%， 95个错 误19个)优于受过训练的胚胎学家(出错率26%， 94个错误24个)，而 且，自动化分析也具有更少的假阳性(45个中13个=29%，相对于手动分 析(60中23个，38%))。假阳性是据认为具有高活力然而却停止发育并且 在7-天观察期内从不达到扩张胚泡期的胚胎。此类胚胎的移植不可能导致 妊娠。
牛胚胎试验阶段1 - 3
从受精后24小时至96小时每30分钟采集图像
在7天=终点之后评价的结果(N=94，胚泡率=40%)
结果手动评价图像分析
好差好差
扩张胚泡371326
停止的发育23331344
不正确分类26%20%
假阳性&阴性38%3%29%12%参考文献 文章
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权利要求
1.用于测定胚胎质量的方法，其包括监测胚胎一段时间，所述时间的长度足以包括至少一个细胞分裂期和至少一部分分裂间期，以及测定i)所述至少一个细胞分裂期的长度；和/或ii)测定在细胞分裂期内细胞或细胞器运动的程度和/或空间分布；和/或iii)测定分裂间期的持续时间；和/或iv)测定在分裂间期内细胞或细胞器运动的程度和/或空间分布，从而获得胚胎质量测量。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述胚胎被监测包括至少两个细 胞分裂期的时间。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述胚胎被监测包括至少三个细 胞分裂期的时间。
4. 根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述每个细胞分裂期的 长度被测定。
5. 根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述每个分裂间期的长 度被测定。
6. 根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在至少两个分裂间期中 的细胞运动期被测定。
7. 根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在至少两个分裂间期中 的细胞运动的程度被测定。
8. 根据权利要求6或7所述的方法，其中所述至少两个分裂间期是连 续的分裂间期。
9. 根据前述权利要求任一项所述的方法，其中进行至少一个细胞分裂 期长度的测定以及分裂间期中细胞运动的测定。
10. 根据前述权利要求任一项所述的方法，其中进行至少一个细胞分 裂期长度的测定以及分裂间期中细胞运动期间的测定。
11. 根据前述权利要求任一项所述的方法，其中进行至少一个细胞分 裂期长度的测定和分裂间期中细胞运动的测定以及分裂间期中细胞运动期的测定。
12. —种用于选择适合移植的胚胎的方法，所述方法包括如权利要求 1-11任一项所定义监测所述胚胎获得胚胎质量测量，以及选择具有最高胚 胎质量测量的胚胎。
13. 用于测定胚胎质量的系统，其包括用于监测胚胎一段时间的装置， 所述时间的长度足以包括至少一个细胞分裂期和至少一部分分裂间期，所 述系统进一步具有用于测定所述至少一个细胞分裂期长度和/或测定分裂 间期中细胞运动和/或测定分裂间期中细胞运动的时间长度的装置，并且具 有基于所述细胞分裂期(一个或多个)和分裂间期(一个或多个)中的测 定来测定胚胎质量测量的装置。
14. 根据权利要求13所述的系统，其包括测定如权利要求1-11任一 项所定义的一个或多个特征的装置。
全文摘要
本发明涉及测定胚胎质量的系统和方法，其包括监测胚胎一段时间期间，所述时间期间的长度足以包括至少一个细胞分裂期和至少一部分分裂间期，以及测定所述至少一个细胞分裂期的长度；和/或ii)测定在细胞分裂期内细胞或细胞器运动的程度和/或空间分布；和/或iii)测定分裂间期的持续时间；和/或iv)测定在分裂间期内细胞或细胞器运动的程度和/或空间分布，从而获得胚胎质量测量。因此，基于所观察到的细胞分裂以及伴随的细胞和细胞器运动的计时、持续时间、空间分布以及程度，可促进对体外受精(IVF)后被植入的最佳胚胎的选择。
文档编号C12N5/073GK101495619SQ200780027901
公开日2009年7月29日 申请日期2007年6月15日 优先权日2006年6月16日
发明者于尔根·伯恩特森, 尼尔斯·B·拉姆辛 申请人:尤尼森斯繁殖技术公司