专利名称：通过在早期胚胎发育期间生长和/或发育相关基因的转基因过量表达来增加种子大小和 ...的制作方法
通过在早期胚胎发育期间生长和/或发育相关基因的转基因过量表达来増加种子大小和种子数目本申请是申请日为2006年12月15日、申请号为200680052853. 3、发明名称为“通
过在早期胚胎发育期间生长和/或发育相关基因的转基因过量表达来增加种子大小和种子数目”的发明专利申请的分案申请。与相关申请的交叉引用本申请要求于2005年12月15日提交的美国专利申请号60/750,991的优先权，所述专利对于所有目的通过提及而整体合并入本文。发明背景 作为农作物改良的目标的最重要性状是产量。通过开发新的植物品种来改善农作物产量的努力可以分成2种方法。一种是通过培育或改造具有増加的对于非生物应激条件例如干旱、寒冷或盐或者由害虫或致病病原体引起的生物应激条件的抗性的农作物品种来减少农作物产量损失。虽然这种方法有价值，但它在不存在应激条件的情况下不提供根本改善的农作物产量。第二种方法是培育或改造新的农作物品种，其中基本生产能力得到增加。传统育种程序最初在改善各种农作物的产量方面产生了实质的进步。通常经历的模式虽然最初在产量方面具有实质进步，但随后为变得更小且更难以获得的増加的进ー步改善。最近开发的基于分子生物学技术的方法原则上已提供了这样的潜力，即通过改变在植物生长和/或发育中起作用的植物基因表达的时机、位置或水平来达到农作物产量方面的实质改善。在过去的20年中，在鉴定在植物生长和/或发育中起作用的植物基因方面已取得重大进展。由于植物生长调节和它最终如何涉及产量性状的复杂性，这些基因中的哪ー些(如果有的话)将是改善农作物产量的明确候选物仍不明了。为了鉴定具有生长和/或发育功能的植物基因而进行的许多工作已在模型植物系统拟南芥(Arabidopsis thaliana)中完成。称为REVOLUTA (REV)的一种此类基因最初被鉴定为拟南芥属物种(Arabidopsis)中的功能丧失突变,称为revl (Talbert等人，Development 121:2723-2735,1995)。这种突变对植物生长和形态具有多效效应。感兴趣的revl突变的ー种表型是明显更大的种子。这种表型是农业上可能需要的，但不幸的是，它伴随着不希望的性状例如減少的花和种子数目、不育和改变的叶形态。除了更大的种子夕卜，revl突变体还显示出更大的叶、莖和花。通过作图克隆方法(在WO 01/33944中描述，该文献通过提及而整体合并入本文)而鉴定出REV基因，并且它被证明是属于转录因子的同源域-亮氨酸拉链(homedomain-leucine zipper, HD-ZIP)家族的转录因子。在植物中，HD-Zip基因參与许多发育途径，包括维管组织发育、毛状体(trichome)和根毛发育、以及光调节应答。因为revl可能是功能丧失突变，所以试图通过表达反向重复REV (REV-IR)构建体或者通过由REV基因的强过量表达所触发的共抑制来敲除转基因拟南芥属物种中的REV功能(W0 01/33944)。REV-IR构建体产生弱的revl表型。revl表型包括更大、更重的种子，这也在REV过量表达品系中观察到，其中REV转基因遍及植物的强组成型表达由组成型35S启动子驱动。有趣的是，这种效应与增加的REV mRNA水平相关，这表明这不是由于内源性REV基因的共抑制。REV过量表达而非抑制导致了増加的种子大小这一事实是重要的发现，因为使用revl突变体的先前工作这是未曾预料到的。REV转基因遍及植物的强组成型表达模拟了 revl突变体的大种子表型，但它还复制了使用revl突变体时可见的不希望的表型。尽管通过REV转基因的组成型过量表达的技术上直捷的方法来获得更大的种子大小表型的能力显示出具有前景，但不希望的表型意味着这种方法对于商业化农业应用将是不可行的。对于许多农作物种类，农业上相关的植物部分是种子。如果可以获得大种子性状而没有普遍组成型REV过量表达的有害副作用，那么它将具有潜在极大的农业价值。克服这个问题的ー种可能途径是将REV过量表达特异地局限于种子。尽管许多种子特异性启动 子是已知的并且具有可以潜在地用于驱动REV转基因表达的特征，但没有证据暗示，原则上，局限于种子的REV过量表达将实际导致増加的种子大小。种子中植物的内源性REV基因的天然功能已知是在分生组织起始和近轴细胞命运决定方面(Otsuga等人,Plant J. 25 223-236,2001 ；McConnell 和 Barton, Development 125 :2935-2942 (1998) ；McConnell 等人，Nature 411 :709-713,2001 ;Emery 等人，Curr. Biol. 13 :1768-1774，2003)而不是在细胞生长或分裂方面。此外，还不知道，在35S/REV过量表达的植物中的大种子大小表型是由于种子中或正在发育的胚胎中REV的过量表达，还是由于由遍及植物组织的REV过量表达所引起的对植物的总体生长和发育的影响。除了缺乏REV在种子中对种子大小决定具有影响的任何己知生物功能外，也没有信息表明，在种子的哪个部分中或在种子发育期间的哪个阶段时尝试过量表达REV转基因以达到种子大小的増加可能是最佳的。本发明提供了在胚胎发育的早期阶段期间生长和/或发育相关基因的胚胎特异性过量表达，当与不过量表达该基因的野生型植物相比较时，这导致种子大小的増加。在一个具体实施方案中，使用早期胚胎特异性启动子来过量表达REV基因。达到了増加的种子大小性状而没有采用遍及植物的REV组成型过量表达时可见的有害副作用。此外，当与野生型植物相比较时，REV的胚胎特异性过量表达产生了关于“种子总数目/植物”的増加方面的未预测到的結果。种子总数目的増加起因于种子数目/荚的增加、总状花序数目/植物的増加、英数目/总状花序的増加、种子败育率的減少，或者这些效应的组合。总之，由于REV在正在发育的胚胎中的过量表达而引起的増加的种子大小和増加的种子数目导致与野生型植物相比较而言总产量的大量増加，并且证实与植物生长和/或发育相关的基因可以与早期胚胎特异性启动子相结合地过量表达，以增加植物产量。发明概述本发明提供了用于增加转基因植物中的种子大小和/或种子数目的方法和组合物。特别地，本发明涉及与基因有效地结合的早期特异性胚胎启动子用于在转基因植物的正在发育的种子中过量表达该基因和/或由该基因编码的蛋白质的用途，所述基因与植物生长和/或发育相关。当与野生型植物相比较时，在转基因植物中在种子发育的这个早期阶段期间所述基因的过量表达在转基因植物中提供了増加的种子产生和/或増加的种子大小。在本发明的ー个具体实施方案中，将REV基因与早期特异性胚胎启动子有效地结合，以提供REV蛋白在转基因植物的正在发育的种子中的过量表达。REV在种子发育的这个早期阶段期间的过量表达令人惊讶地导致在转基因植物中増加的种子大小和増加的种子产生，而没有当遍及植物地过量表达REV时可见的有害副作用。还提供了用于增加植物中的种子大小的方法，其包括在早期胚胎发育期间在种子中过量表达与植物生长和/或发育相关的基因。特别地，该方法包括在早期特异性胚胎启动子的控制下在种子中表达所述生长和/或发育相关基因。所述早期特异性胚胎启动子对于所述植物来说可以是异源的或同源的。在本发明的某些实施方案中，所述启动子是与氨基酸通透酶基因例如AAP1、油酸12-羟化酶去饱和酶基因、2S2白蛋白基因、脂肪酸延长酶(fatty acid elongase)基因例如 FAEl 或叶状子叶基因(leafy cotyledon gene)相关的早期特异性启动子。在本发明中有用的具体启动子包括来自拟南芥的AAPl启动子、来自Lesquerella fendleri的油酸12-羟化酶去饱和酶基因启动子(LFAH12)、来自拟南芥的2S2基因启动子或叶状子叶基因LEC2启动子。在本发明的ー个具体实施方案中，REV基因与早期特异性胚胎启动子有效地结合。在这种方法中，REV基因在种子的早期发育中过量表达，并导致与野生型植物相比较而言种 子大小和种子数目的増加。本发明的方法可以用于增加被表征为单子叶植物或双子叶植物的植物中的种子大小和/或种子数目。特别地，该方法可以用于増加植物中的种子大小和/或种子数目，所述植物是十字花科(Brassicacea (Cruciferae))、禾本科(Gramineae)、锦葵科(Malvaceae)或 科-蝶形花亚科(Leguminosae-Papilionoideae)的成员。对于本发明方法的使用来说感兴趣的具体植物包括卡诺拉油菜(canola)、玉米、亚麻荠、棉花、苜蓿、大豆、小麦、稻或大麦。本发明还提供了遗传构建体，其包含关于与一种或多种控制序列有效地连接的与植物生长和/或发育相关的基因的核酸序列，其中所述ー种或多种控制序列能够促进所述基因在胚胎发育期间的表达。特别地，本发明的遗传构建体包含控制序列，所述控制序列包括早期特异性胚胎启动子。早期特异性胚胎启动子可以包括与氨基酸通透酶基因(AAP1)、油酸12-羟化酶去饱和酶基因、2S2白蛋白基因(2S2)、脂肪酸延长酶基因(FAEl)或叶状子叶基因(LEC2)相关的启动子。本发明的典型遗传构建体包含来自拟南芥的AAPl启动子、来自Lesquerella fendleri的油酸12-羟化酶去饱和酶基因启动子(LFAH12)、来自拟南芥的2S2基因启动子、来自拟南芥的脂肪酸延长酶基因启动子、或来自拟南芥的叶状子叶基因2启动子。具体的本发明的遗传构建体包含与来自拟南芥属物种的REV基因有效地结合的早期特异性胚胎启动子。所述遗传构建体还可以包括有效地结合的PolyA序列。本发明还提供了用于产生具有増加的种子大小和/或种子数目的转基因植物的方法，所述方法包括(a)将如上所述的遗传构建体引入植物或植物细胞内，和(b)在促进再生和成熟植物生长的条件下培养包含所述遗传构建体的所述植物或植物细胞。通常，该方法产生当与相应的野生型植物相比较时具有増加的种子大小和/或种子数目的转基因植物。包含所述遗传构建体的转基因植物可以是单子叶或双子叶植物，特别地其中所述单子叶植物是禾本科的成员。特别感兴趣的来自禾本科的植物包括稻、燕麦、玉米或小麦。此夕卜，本发明的转基因植物是十字花科、锦葵科或豆科-蝶形花亚科的植物。特别地，其中转基因植物是大豆、棉花、亚麻荠、苜蓿或卡诺拉油菜。
本发明还提供了用于选择当与早期特异性胚胎启动子功能性地相结合时增加植物产量的基因的方法，其包括构建表达载体，所述表达载体包含与早期特异性胚胎启动子功能性地相结合的与植物生长和/或发育相关的基因；用所述表达载体转染植物细胞以形成转基因植物；培养所述转基因植物；和选择具有増加的产量的那些转基因植物。选择出产生具有増加的产量的转基因植物的基因以用于转基因植物的进ー步开发。可以在本方法中使用的基因包括，例如但不限干，CAP (环化酶相关蛋白)基因、稻组蛋白脱こ酰酶I基因、E2Fc基因、BKI基因、BRII基因、ARL (Argos-Like)基因、bril (油菜素类固醇激素感受(brassinosteroid hormone perception))基因、FATB 基因、Pepino 基因、RGS (G 蛋白信号传导调节剂(regulator of G protein signaling))基因、TIPl 基因、BB (Big Brother)基因、RHD2基因、INCW2基因、MNl基因、WAK2基因、WAK4基因、AP2基因等。附图
简述图I描述了胚胎特异性启动子在早期胚胎发育期间的表达谱。拟南芥属物种胚胎 发育中的近似阶段早期球状=2天的授粉后天数(days after pollination,DAP)、心形=4DAP、鱼雷形=6 DAP、手杖形=7 DAP、早期成熟胚胎=8 DAP。图2描述了 REVOLUTA和非REVOLUTA HD-ZIPI11类转录因子的区域的氨基酸序列的比对。氨基酸序列的这个区域包含有在氨基酸序列中的特征性差异，所述特征性差异将HD-ZIPIII蛋白质定义为属于REVOLUTA或非REVOLUTA类蛋白质。所述序列的加框部分标明了定义非REVOLUTA HD-ZIPIII蛋白质的氨基酸序列插入的位点。通过缺乏氨基酸序列插入来定义REVOLUTA蛋白质。Athb-9 (拟南芥属物种；SEQ ID NO 2) ；Athb-14 (拟南芥属物种；SEQ ID NO 3) ；REV (拟南芥属物种；SEQ ID NO 4) ；BnLfREV (欧洲油菜(Bassicanapis)；SEQ ID NO 5)；0sREVl (水稻(Oryza sativa)；SEQ ID NO 6)；ZmRLDl (玉蜀黍(Zeamayes)；SEQ ID NO 7)；0sREV2 (水稻；SEQ ID NO 8)；Athb-15 (拟南芥属物种；SEQ ID NO 9);和 Athb-8 (拟南芥属物种；SEQ ID NO :10)。发明详述本发明提供了用于产生当与野生型植物相比较时具有増加的种子大小和/或增加的种子数目的植物的方法和组合物。特别地，所述方法包括在植物的胚胎中过量表达參与植物生长和/或发育的基因，其中转基因的过量表达导致植物中的种子大小的増加和/或増加的种子数目。在ー个具体实施方案中，过量表达REVOLUTA (REV)基因。在本发明的方法中的REV转基因处于启动子的调节下，所述启动子在胚胎发育期间起始表达，并且特别地在早期特异性胚胎发育期间起始表达。出乎意料地，在早期阶段胚胎发育中REV转基因的过量表达导致更大的和/或更多的种子。作为确定是否能够通过參与植物生长和/或发育的基因的过量表达来增加种子大小的第一种尝试，将REV基因靶向种子，测试包含驱动REV表达的胚胎特异性启动子的REV转基因构建体。在拟南芥属物种胚胎发育期间具有经良好表征的表达谱的许多胚胎特异性启动子的可用性使得能够制备转基因植物，其中REV过量表达被靶向几个不同但重叠的胚胎发育阶段。将拟南芥属物种REV转基因构建体引入卡诺拉油菜中以用于测试。关于直接转到卡诺拉油菜的根本原因是拟南芥属物种基因组与卡诺拉油菜非常紧密相关，因此在拟南芥属物种中測定的启动子的已知表达特征将可能延续至卡诺拉油菜，并且卡诺拉油菜是农作物种类。卡诺拉油菜中对种子大小的影响的证实将具有直接的农业关联性。在第ニ个例子中，拟南芥属物种REV如本文所使用的，植物生长和/或发育相关基因是这样的基因，其在决定植物的生长率、总体大小、组织大小或组织数目中起作用，或者在植物发育程序中起作用，导致组织身份和形态的決定。当通过突变、过量表达、或表达的抑制来修饰其功能而导致改变的植物生长率、总体植物大小、组织大小或数目、或改变的发育时，这样的生长和发育相关基因得到鉴定。植物和生长相关基因可以通过许多机制发挥其效应，其中ー些包括细胞周期的调节、植物激素合成/分解途径、对植物激素的敏感性、细胞壁生物合成、细胞身份决定等。通过过量表达或抑制分析，许多植物基因已显示在生长和/或发育中起作用。已知參与生长和/或发育并且可以在本发明的方法中使用或测试的基因的一些但并非所有例子在下文中讨论。拟南芥属物种CAP基因编码參与Ras-cAMP信号传导和肌动蛋白细胞骨架的调节的环化酶相关蛋白。由于表皮和叶肉细胞的延伸減少，CAP在糖皮质激素诱导型启动子下的过量表达引起肌动蛋白丝的丧失和叶大小的减少(Barrero等人，Annals ofBotany 91 :599_603，2003)。棉花中的蔗糖合酶基因表达的抑制导致减少的细胞纤维长度以及更小和更少的纤维细胞(Yong-Ling Ruan等人，Plant Cell 15:952-964,2003)。使用ABA诱导型启动子的稻组蛋白脱こ酰酶I基因在转基因稻中的过量表达导致获得与野生型相比较而言具有生长率的増加以及异常的枝条和根组织发育的植物(In-Cheol Jang等人，Plant J. 33 :531_541，2003)。在拟南芥属物种中经由RNAi对于E2Fc的抑制增加了叶、分生组织和中柱鞘细胞中的増殖活性。器官中的细胞比野生型更小但更众多，并且在叶中存在减少的倍性水平(del Pozo等人，Plant Cell 18 :2224_2235，2006)。经由RNAi对于BKI基因的抑制导致具有増加的下胚轴长度的幼苗，并且BKI的过量表达产生矮化植物(Xuelu和Chory，Science 313:1118-1122,2006)。表达部分地组成性的类固醇受体BRIl的转基因植物具有更长的下胚轴(Wang等人，Dev. Cell 8 :855_865，2005)。拟南芥属物种 中Argos-Like (ARL)的抑制产生更小的子叶、叶和其他侧生器官，而过量表达产生相反的效应。器官大小的变化可以归因于细胞大小而不是细胞数目(Hu等人，Plant J. 47:1-9，
2006)ο对于具有导致改变的生长和/或发育表型的突变的植物所进行的分析已鉴定出了许多在植物生长和发育中起作用的基因。影响油菜素类固醇激素感受bril-5的突变导致矮化植物(Wang等人，Dev. Cell 8 :855_865，2005)。在编码酰基-酰基载体蛋白硫酯酶的拟南芥属物种FATB基因中的T-DNA插入(敲除)导致减少的生长率、减少的鲜重和低种子活力(Bonaventure 等人，Plant Cell 15 1020-1033, 2003)o Pepino (推定的抗-憐酸酶)中的功能丧失突变在枝条顶端分生组织处显示出肿瘤样细胞増殖并且产生多余的异常叶(Haberer 等人，Dev. Genes Evol. 212 :542_550，2002)。拟南芥属物种 RGS 基因(G 蛋白信号传导调节剂)具有G蛋白偶联受体(GPCR)的结构并且包含RGS盒。RGS蛋白质加速Ga亚基的失活并因此降低GPCR信号传导。无效rgs突变体在黑暗中生长时在下胚轴中具有增加的细胞延长，和在光中生长时在根中具有增加的细胞产生(Chen等人，Science301 :1728-1731, 2003)。拟南芥属物种TIPl基因在根毛发育中以及还在细胞生长中起作用。tipl-2突变体具有更小的莲座型叶丛、减少的高度和更短的节间(Ryan等人，NewPhytol. 138 :49-58,1998 ;和 Hemsley 等人，Plant Cell 17 :2554_2563，2005)。产生极少或不产生Big Brother mRNA的Big Brother (BB)基因的突变体(染色体重排或T-DNA插入)发育出更大的花器官、更多的花生物量和更粗的茎。相反地，Big Brother的过量表达导致更小的花器官、更少的花生物量、更细的茎和減少的叶大小。BB可以改变细胞数目(Disch等人，Curr. Biol. 16 :272_279，2006)。RHD2基因编码对于活性氧种类在根毛中的积聚和钙通道的随后活化而言重要的NADPH氧化酶。rhd2突变体在根的尖端生长细胞的细胞扩展方面具有缺陷(Foreman等人,Nature 422:442-446,2003)。玉米中的微小突变引起由INCM2基因表达的细胞壁转化酶的丧失。mnl突变体的细胞比野生型更小，和mnl种子突变体仅具有野生型种子的胚乳重量的20%。扩展可以在mnl胚乳的周围层的细胞中受到损害，并且可以导致这些细胞的减少的有丝分裂活性(Vilhar等人，Plant Physiol. 129 :23-30,
2002)。WAK2的T-DNA插入突变体，wak2_l，在根中具有减少的细胞延长。WAK2可以通过调节液泡的转化酶活性来控制细胞扩展。在植物中WAK2或WAK4的可诱导反义的表达阻止了细胞延长并产生矮化植物(Wagner 和 Kohorn，Plant Cell 13 :303_318，2001 ;Lally 等人，Plant Celll3 :1317-1331,2001 ;和 Kohorn 等人，Plant. J. 46 :307_316，2006)。拟南芥属物种基因AP2在花器官身份中和在花分生组织身份的建立中起作用。与野生型相比较，AP2中的功能丧失突变产生增加的种子质量(Masa-Ohto等人，Proc. Nat' I. Acad. Sci. USA 102 :3123-3128，2005)。teb突变体具有短小的根、锯齿状的叶和扁化。它们显示出在细胞分裂方面的缺陷，这可能是由于在G2/M细胞周期进展方面的缺陷而引起的(Inagaki等人，Plant Cell 18:879-892,2006)。术语“生长和/或发育基因”或“生长和/或发育转基因”在本文中用于指任何这样的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码或促进由该基因编码的核苷酸或蛋白质的表达和/或产生。因此，术语“生长和/或发育基因”或“生长和/或发育转基因”可以包括位于核苷酸和/或蛋白质编码序列侧翼的序列。例如，所述序列可以包括那些核苷酸序列，所述核苷酸序列为蛋白质编码序列(外显子)、间插序列(内含子)、包含对于该基因正常表达而言所需的序列的侧翼5'和3' DNA区域(S卩，分别为启动子和polyA添加区，以及任何增强子序列)。术语“生长和/或发育蛋白质”、“生长和/或发育同系物”或“生长和/或发育相关直向同源物”在本文中用于指这样的蛋白质，所述蛋白质具有调节植物的生长率、总体大小、组织大小或组织数目或者调节植物发育程序(其导致组织身份和形态的決定)的能力(当在本发明方法的实践中使用吋)，并且具有与对于该基因而言的氨基酸序列有着至少约70%同一性、更通常地至少约75%同一性、和更通常地至少约80%同一性的氨基酸序列。如本文所使用的，“胚胎特异性基因”是在植物中的胚胎发育期间优先表达的基因。对本公开内容而言，胚胎发育从合子中的第一次细胞分裂开始，并继续至胚胎发育的晚期(特征在于成熟、干燥、休眠)，并且以产生成熟且干燥的种子作为结束。胚胎特异性基因可以进一歩分类为“早期特异性的”和“晩期特异性的”。早期特异性基因是直至胚胎形态发生结束时在胚胎中表达的那些基因。晩期特异性基因是在从成熟直到产生成熟且干燥的种子这ー过程中表达的那些基因。在早期胚胎发育期间起始表达并且为早期特异性的胚胎特异性基因的例子呈现于图I中。“异源序列”是来源于不同物种的寡核苷酸序列，或者如果来自相同物种，则由其最初形式在实质上进行了修饰。例如，与结构基因有效地连接的异源启动子来自与该结构基因所源自的物种不同的物种，或者如果来自相同物种，则由其最初形式在实质上进行了修饰。术语“载体”指通常为双链的DNA片段，其可以在其内插入外源DNA片段。载体或复制子可以例如具有质粒或病毒来源。载体包含有助于载体在宿主细胞中自主复制的“复制子”多核苷酸序列。在本公开内容的情况下，术语“复制子”还包括靶向或者以其他方式促进载体序列重组入宿主染色体中的多核苷酸序列区域。此外，虽然可以在最初时将外源DNA插入到例如DNA病毒载体中吋，但是将病毒载体DNA转化到宿主细胞中可以导致病毒DNA转化成病毒RNA载体分子。外源DNA被定义为异源DNA，其是在宿主细胞中未天然发现的DNA，其例如复制载体分子、编码可选择或可筛选标记或者转基因。载体用于将外源或异源DNA运输到合适的宿主细胞内。一旦在宿主细胞中，载体就可以独立于宿主染色体DNA或与宿主染色体DNA同时进行复制，并且可以产生载体及其插入的DNA的几个拷贝。备选地，载体可以将外源或异源DNA靶向插入至宿主染色体中。此外，载体还可以包含必需元件，所述元件允许所插入的DNA转录成mRNA分子，或者以其他方式引起所插入的DNA复制成多个拷贝的RNA。某些表达载体另外还包含与所插入的DNA邻近的序列元件，其允许mRNA翻译成蛋白质分子。因此，可以快速合成许多由所插入的DNA编码的mRNA和多肽分子。 术语“转基因载体”指包含所插入的DNA区段(即“转基因”)的载体，所述DNA区段在宿主细胞内转录成mRNA或复制为RNA。术语“转基因”不仅指所插入的DNA的被转化成RNA的那个部分，还指载体的对于RNA的转录或复制而言所必需的那些部分。此外，转基因不一定包含这样的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含能够产生蛋白质的开放读码框。术语“转化的宿主细胞”、“转化的”和“转化”指将DNA引入细胞中。该细胞称为“宿主细胞”，并且它可以是原核或真核细胞。典型的原核宿主细胞包括大肠杆菌(E. coli)的各种菌株。典型的真核宿主细胞是植物细胞(例如，卡诺拉油菜、棉花、亚麻荠、苜蓿、大豆、稻、燕麦、小麦、大麦或玉米细胞等)、酵母细胞、昆虫细胞或动物细胞。引入的DNA通常为包含插入的DNA片段的载体形式。引入的DNA序列可以来自与宿主细胞相同的物种或者来自与宿主细胞不同的物种，或者它可以是包含一些外源DNA和一些源自宿主物种的DNA的杂合DNA序列。术语“植物”包括全植物、植物器官(例如，叶、茎、花、根等)、种子和植物细胞(包括组织培养细胞)及其后代。可以在本发明方法中使用的植物类别一般与顺应于转化技术的高等植物类别ー样广泛，包括单子叶和双子叶植物，以及某些低等植物如藻类。它包括各种倍性水平的植物，包括多倍体、二倍体和单倍体。“异源序列”是来源于外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则由其最初形式在实质上进行了修饰。例如，与结构基因有效地连接的异源启动子来自与该结构基因所源自的物种不同的物种，或者如果来自相同物种，则由其最初形式在实质上进行了修饰。术语“REVOLUTA基因”或“REVOLUTA转基因”在本文中用于指编码或促进REVOLUTA蛋白质的表达和/或产生的任何多核苷酸序列。因此，术语“REVOLUTA基因”或“REVOLUTA转基因”可以包括位于REVOLUTA蛋白质编码序列侧翼的序列。例如，所述序列可以包括那些核苷酸序列，所述核苷酸序列为蛋白质编码序列(外显子)、间插序列(内含子)、包含对于REVOLUTA基因正常表达而言所需的序列的侧翼5'和3' DNA区域(B卩，分别为启动子和PoIyA添加区，和任何增强子序列)。术语“REVOLUTA蛋白质”、“REVOLUTA同系物”或“REVOLUTA直向同源物”在本文中用于指这样的蛋白质，所述蛋白质具有调节植物细胞分裂的能力(当在本发明方法的实践中使用吋)，并且具有与在WO 01/33944(通过提及而整体合并入本文)中所描述的REVOLUTA的氨基酸序列有着至少约70%同一性、更通常地至少约75%同一性、和更通常地至少约80%同一性的氨基酸序列。备选地，术语“REVOLUTA蛋白质”、“REVOLUTA同系物”或“REVOLUTA直向同源物”在本文中用于指被鉴定为与HD-ZIPIII类别的植物转录因子的非REVOLUTA成员不同的REVOLUTA蛋白质。HD-ZIPIII类别的蛋白质的REVOLUTA成员的特征在于，在TO 01/33944中描述且如图2中所示的REVOLUTA氨基酸序列的氨基酸残基146和147之间缺乏或不存在特征性的氨基酸序列插入，其存在于非REVOLUTA HD-ZIPIII蛋白质中。在图2中，命名为athb-8、athb-9、athb-14和athb-15的来自拟南芥的同源异型框转录因子是非REVOLUTAHD-ZIPIII蛋白质，并且全部在REVOLUTA氨基酸序列的氨基酸残基146和147之间具有特征性的氨基酸序列插入。图2中的5个REVOLUTA序列全部在REVOLUTA氨基酸序列中的这 个位置处缺乏氨基酸插入。这个氨基酸序列插入的缺乏是REVOLUTA蛋白质的区别性和定义性的特征。术语“同一性百分比”是指当使用计算机程序例如下文鉴定的程序来并排比对2个氨基酸序列或2个核酸序列时，占据相同的相对位置的氨基酸或核苷酸的百分比。术语“相似性百分比”是2个所比较的蛋白质序列的亲缘关系程度的统计学量度。相似性百分比通过计算机程序来进行计算，所述计算机程序基于化学相似性(例如，所比较的氨基酸是否是酸性的、碱性的、亲水性的、芳香族的等)和/或进化距离(如通过对于使编码所比较的氨基酸对的ー个成员的密码子转变成编码该对的另一个成员的密码子而言所需的最低数目的碱基对改变所测量的)对每个所比较的氨基酸对分派ー个数值。在已通过迭代比较所有可能的比对而凭经验进行2个序列的最佳拟合比对后，进行计算(參见例如，Henikoff等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915-10919，1992)。多核苷酸序列的“基本同一'丨生(substantial identity)”这ー术语是指，当使用下文描述的程序并使用标准參数与參考序列相比较时，多核苷酸包含具有至少60%序列同一性、通常地至少70%同一性、更通常地至少80%同一性和最通常地至少90%同一性的序列。技术人员应认识到，这些值可以进行适当调整以确定由2个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性，其中考虑了密码子简并性、氨基酸相似性、读码框定位等。氨基酸序列同一性可以例如以下述方式进行測定。由生长和/或发育相关基因例如REVOLUTA编码的蛋白质的氨基酸序列的部分，可以用于搜索核酸序列数据库，例如GenBanka 数据库，其中使用程序 BLASTP 版本 2. O. 9(Atschul 等人，Nucl. Acids Res. 25 3389-3402,1997)。2个(或更多)多核苷酸或多肽之间的序列比较通常通过在“比较窗”上比较2个序列的序列来进行，以鉴定并比较序列相似性的局部区域。如本文所使用的，“比较窗”指至少约20个邻接位置、通常地约50-约200个邻接位置、更通常地约100-约150个邻接位置的区段，其中在2个序列进行最佳比对后，可以将序列与具有相同数目的邻接位置的參考序列相比较。用于比较的序列最佳比对可以通过下述方式来进行局部同一性或相似性算法例如在 Smith 等人，Adv. Appl. Math. 2 :482,1981 中描述的那些；Needleman 等人，J. Mol.Biol. 48 :443-453,1970 的同源性比对算法；Pearson 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA85 :2444-2448,1988的相似性搜索法；这些算法的计算机化实现(Wisconsin GeneticsSoftware Package, Genetics Computer Group,575Science Drive, Madison, WI 中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA);或目视检查。有用的算法的ー个例子是PILEUP。PILEUP使用渐进的成对比对而由ー组相关序列产生多重序列比对，以显示相互关系和序列同一性百分比。它还绘制显示出用于产生比对的聚类关系的树或树状图。PILEUP使用简化的Feng等人，J. Mol. Evol. 35 =351-360,1987的渐进比对方法。所使用的方法类似于由Higgins等人，CABIOS 5 :151-153，1989描述的方法。该程序可以比对高达300个序列，每个序列的最大长度为5，000个核苷酸或氨基酸。多重比对过程从2个最相关序列的成对比对开始。这个聚簇(cluster)随后与下一个最相关序列或经比对的序列的聚簇进行比对。2个序列聚簇可以通过2个独个序列的成对比对的简单延伸来进行比对。最終比对通过一系列渐进的成对比对来完成。该程序通过指定序列比较区域的特定序列及其核苷酸或氨基酸坐标(coordinate)和通过指定程序參数来运行。例如，可以将參考序列与其他测试序列进行比较以測定序列同一性百分比 关系，使用下述參数缺省缺ロ权重(3. 00)、缺省缺ロ长度权重(O. 10)、和加权末端缺ロ。适合于測定序列同一性和序列相似性百分比的算法的另ー个例子是BLAST算法，其在Altschul等人，J. Mol. Biol. 215 =403-410,1990中得到描述。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。这种算法包括，首先通过在查询序列中鉴定长度W的短字(word)来鉴定高得分序列对(HSPs)，当与数据库序列中相同长度的字进行比对时，所述HSPs匹配或满足某一正值阈值得分 T。T 称为邻近字得分阈值(neighborhood word score threshold) (Altschul等人，同上)。这些最初邻近字的命中用作起始搜索的种子，以找到包含它们的更长HSPs。随后，字命中(word hits)沿着每个序列在2个方向上进行延伸，远至可以增加累积比对得分。在下列情况时，停止字命中在每个方向上的延伸累积比对得分比其达到的最大值减少X量；由于ー个或多个负得分残基比对的积聚，累积得分变成零或零以下；或达到任一序列的末端。BLAST算法參数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用使用下列作为缺省值字长(W)为11、BL0SUM62评分矩阵(參见，Henikoff等人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89 :10915-10919,1992)比对(B)为 50、期望值(E)为 10、M=5、N=_4 以及 2 条链的比较。除了计算序列同一性百分比外，BLAST算法还进行两个序列之间的相似性的统计分析(參见，例如 Karlin 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877,1993)。由 BLAST算法提供的相似性的ー种量度是最小加和概率(P(N))，它提供了对两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配偶然发生的概率指示。例如，如果比较测试中的最小加和概率小于约O. I、更优选地小于约O. 01、和最优选地小于约O. 001，那么核酸被视为与參考序列类似。用于序列比对和序列相似性分析的另外方法和算法是技术人员众所周知的。在所插入的多核苷酸序列进行转录和翻译以产生功能性多肽的情况下，技术人员会认识到，由于密码子简并性，许多多核苷酸序列将编码相同的多肽。这些变体特别地由术语“生长和/或发育基因”和“生长和/或发育转基因”，以及具体地由“REVOLUTA基因”和“REVOLUTA转基因”所包括。此外，这些术语特别地包括那些全长序列，所述序列与基因序列基本上同一并且编码保留了该基因产物例如REVOLUTA的功能的蛋白质。如果如上所述就最大一致进行比对时，两个序列中的核苷酸或氨基酸残基的序列分别相同时，那么这两个核酸序列或多核苷酸被说成是“同一的”。术语“与……互补”在本文中用于指，互补序列与參考多核苷酸序列的全部或部分是同一的。生长和/或发育相关基因和生长和/或发育相关蛋白质，例如REVOLUTA基因和REVOLUTA蛋白质序列的氨基酸序列中的变异和改变在WO 01/33944中得到描述，所述专利通过提及而合并入本文。目的基因例如REVOLUTA基因、多核苷酸或多核苷酸序列可以从任何植物物种中进行分离或获得。在本发明的ー个具体实施方案中，所使用的REVOLUTA基因序列是来自拟南芥的那种，但也可以使用来自其他感兴趣物种的REVOLUTA基因。例如，来自玉米(玉蜀黍(Zea mays))的REVOLUTA的核苷酸序列和氨基酸序列在WO 2004/063379(通过提及而整体合并入本文)中得到描述。术语“生物学活性”、“生物学上具有活性的”、“活性”、“具有活性的”、“生物学功能”、“ REV生物学活性”和“功能上具有活性的”指目的蛋白质例如REVOLUTA蛋白质进行ニ聚化(或以其他方式装配成蛋白质寡聚体)的能力，或者调节或以其他方式影响天然野生型 (例如，内源的)REVOLUTA蛋白质ニ聚化的能力。然而，所述术语还意欲包括目的蛋白质例如REVOLUTA蛋白质与其他分子结合和/或相互作用的能力，所述其他分子包括例如但不限于，包含由该蛋白质例如REVOLUTA蛋白质所识别的在启动子区中的特异性核苷酸序列的DNA，所述结合和/或相互作用事件介导植物细胞分裂并最终赋予表型；或者包括调节或以其他方式影响其他分子与天然野生型蛋白质结合和/或相互作用的能力，所述结合和/或相互作用事件介导植物细胞分裂并最终赋予与该目的基因相关的表型。如本文所使用的，REV表型意指由REV核酸或蛋白质所赋予的表型，并且特别包括其中展示出种子大小或种子数目的特性。通常，REV表型通过检查在早期特异性胚胎发育期间过量表达REV的植物来确定，其中可以将来自所述植物的种子数目和大小与在亲本或野生型植物的相应组织中的种子数目和大小进行比较。在具有代表性的数目的植物群体内，具有REV表型的植物在种子数目和/或大小方面具有统计上显著的变化。适合于与植物生长和/或发育相关基因有效地连接并使用所描述的本发明方法表达的启动子通常在胚胎中具有更大的表达，和在其他植物组织中具有更低的表达或无表达。特别感兴趣的是在早期特异性胚胎发育中起始表达的那些启动子序列。早期特异性启动子是在拟南芥属物种中在授粉后第7天(手杖形)前或者在另ー个植物物种中的等价阶段起始蛋白质表达的启动子。特别感兴趣的启动子序列的例子包括用于氨基酸通透酶基因(APPl)的启动子(例如，来自拟南芥的AAPl启动子)(Hirner等人，Plant J. 14 =535-544,1998),用于油酸12-轻化酶去饱和酶基因的启动子(例如,来自Lesquerella fendleri的被命名为LFAH12的启动子)(Broun等人，Plant J. 13 :201_210，1998)，用于2S2白蛋白基因的启动子(例如，来自拟南芥的2S2启动子)(Guerche等人，Plant cell 2 =469-478,1990),脂肪酸延长酶基因启动子(FAEl)(例如，来自拟南芥的FAEl启动子)(Ros sak等人，PlantMol. Biol. 46 :717-715, 2001)，和叶状子叶基因启动子(LEC2)(例如，来自拟南芥的LEC2启动子)(Kroj等人，Development 130 :6065_6073，2003)。其他感兴趣的早期胚胎特异性启动子包括但不限于，Seedstick (Pinyopich 等人,Nature 424 :85-88, 2003),Fbp7 和 Fbpll(矮牵牛 Seedstick) (Colombo 等人，Plant Cell. 9 :703-715,1997), Banyuls (Devic 等A, Plant J. 19 :387-398,1999)，agl_15 和 agl-18 (Lehti-Shiu 等人，Plant Mol. Biol. 58 89-107,2005),Phel (Kohler 等人，Genes Develop. 17 :1540-1553,2003),Perl (Haslekas等人，Plant Mol Biol. 36 :833-845,1998 ；Haslekas 等人，Plant Mol. Biol. 53 :313-326,
2003)，embl75 (Cushing 等人，Planta 221 :424-436, 2005), Lll (Kwong 等人，Plant Cell15 :5-18,2003), Lecl (Lotan 等人，Cell 93 :1195-1205,1998), Fusca3 (Kroj 等人，Development 130 :6065-6073,2003), ttl2 (Debeaujon 等人，Plant Cell 13:853-871,2001)，ttl6 (Nesi 等人，Plant Cell 14 :2463-2479,2002), A-RZf (Zou 和 Taylor，Gene196 :291-295,1997)，TtGl(Walker 等人，Plant Cell 11 :1337-1350，1999 ;Tsuchiya 等人，Plant J. 37 :73-81,2004),Ttl (Sagasser 等人，Genes Dev. 16 :138-149，2002)，TT8 (Nesi等人，Plant Cell 12 :1863-1878，2000)，Gea_8 (胡萝卜)(Lin 和 Zimmerman, J. Exp. Botany50 :1139-1147,1999), Knox (稻)(Postma-Haarsma 等人，Plant Mol. Biol. 39 :257-271,1999),OleosinCPlant 等人，Plant Mol. Biol. 25 :193-205,1994 ；Keddie 等人，Plant Mol.Biol. 24 :327-340,1994)，ABI3 (Ng 等人，Plant Mol. Biol. 54 :25-38, 2004 ；Parcy 等人，Plant Cell 6 :1567-1582，1994)，等等。
适合于在本发明中使用的启动子可以来自与待转化的植物相同的物种或可以来自异源物种。此外，启动子可以来自与对于待使用的REV转基因而言相同的物种，或者它可以来自异源物种。在本发明的方法中使用的启动子还可以包括嵌合启动子，其可以包括与上述那些中的ー种或多种具有相同的表达谱的启动子组合。在本发明的一个实施方案中，将来自拟南芥的AAPl基因启动子与拟南芥REV基因相组合，并用于构建转基因卡诺拉油菜(欧洲油菜)。此外，在本发明的另外ー个实施方案中，来自Lesquerella fendleri的油酸12-羟化酶去饱和酶基因启动子LFAH12与拟南芥REV基因有效地连接，并用于构建转基因卡诺拉油菜(欧洲油菜)。上述转基因植物中的每ー种显示了本发明方法的REV表型特征，其中REV在早期胚胎发育中过量表达，从而导致増加的种子大小和/或种子数目。应当指出，上述的早期特异性启动子仅仅是可以在本发明的方法中使用的代表性启动子。用于鉴定和表征植物基因组DNA中的启动子区的方法是技术人员众所周知的，并且包括例如，由 Jordano 等人，Plant Cell I :855-866,1989 ；Bustos 等人，Plant Cell
I:839-854,1989 ；Green 等人，EMBO J. 7 :4035-4044,1988 ；Meier 等人，Plant Cell 3 309-316，1991 ;和 Zhang 等人，Plant Physiol. 110 :1069-1079,1996 描述的那些。在早期胚中过量表达REV的转基因植物可以例如通过将转基因载体(例如，质粒、病毒等)转移至植物中来获得，所述转基因载体编码与编码REVOLUTA的基因有效地连接的早期特异性胚胎启动子。通常，当载体是质粒时，载体还包括选择标记基因，例如编码对于卡那霉素的抗性的卡那霉素基因。如Hoeckeme等人(Nature 303 :179-181,1983)中所描述的，最常见的植物转化方法通过下列方式来进行将靶转基因克隆到植物转化载体中，随后将所述植物转化载体转化到包含辅助Ti-质粒的根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumifaciens)中。另外的方法例如描述在 Maloney 等人，Plant Cell Reports 8 :238,1989 中。如由 An 等人(Plant Physiol. 81 :301-305,1986 ；Hooykaas,Plant Mol. Biol. 13 327-336，1989)所描述的，可以将包含转基因载体的土壤杆菌细胞与待转化的植物的叶切片一起温育。如上所述，培养的植物宿主细胞的转化通常通过根瘤土壤杆菌来完成。通常使用磷酸钙法来转化不具有坚硬的细胞膜屏障的宿主细胞的培养物，所述磷酸钙法由Graham等人(Virology 52 :546,1978)最初描述，并如 Sambrook等人(Molecular Cloning A Laboratory Manual (第 2 版，1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,NY )中所述进行修改。然而，也可以使用用于将DNA引入细胞内的其他方法，例如Po I ybrene(Kawai 等人，Mol. Cell. Biol. 4 :1172,1984)，原生质体融合(Schaffner, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 77 2163,1980)，电穿孔(Neumann 等人，EMBO J. I :841，1982)，和直接显微注射到核内(Capecchi，Cell 22:479,1980)。可以通过选择标记经由在培养基上生长细胞来选择出经转化的植物愈伤组织，所述培养基包含例如卡那霉素以及合适量的植物激素例如萘こ酸和苄基腺嘌呤以用于愈伤组织和幼芽诱导。随后，可以使用本领域技术人员众所周知的技术来再生植物细胞，并将所得到的植物转移至土壌中。除了上述方法外，大量关于将经克隆的DNA转移到广泛多样的植物物种内的方法是本领域众所周知的，所述植物物种包括裸子植物、被子植物、单子叶植物和双子叶植物(參见例如 Glick 和 Thompson,编辑，Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology, CRC Press, Boca Raton, Florida, 1993 ；Vasil, Plant Mol. Biol. ,25 925-937，1994 ;和 Komai 等人，Current Opinions Plant Biol. I : 161-165，1998 (综合性 的综述)；Loopstra 等人，Plant Mol. Biol. 15 1-9,1990 ;和 Brasileiro 等人，Plant Mol.Biol. 17 :441-452,1990 (树的转化)；Eimert 等人，Plant Mol. Biol. 19 :485-490,1992(芸苔的转化)；Hiei 等人，Plant J. 6 :271-282,1994 ；Hiei 等人，Plant Mol. Biol. 35 205-218，1997 ；Chan 等人，Plant Mol. Biol. 22 :491-506,1993 ;美国专利号 5，516，668 和5，824，857 (稻的转化)；以及美国专利号5，955，362 (小麦的转化);5，969，213 (单子叶植物的转化)；5, 780，798 (玉米的转化);5，959，179和5，914，451 (大豆的转化)。代表性的例子包括由电穿孔促进的原生质体对于DNA的摄取(Rhodes等人，Science 240 :204-207,1988 ；Bates, Meth. Mol. Biol. Ill :359-366,1999 ;D' Halluin 等人，Meth. Mol. Biol. Ill 367-373,1999 ;美国专利号5,914, 451);用聚こニ醇处理原生质体(Lyznik等人，PlantMol. Biol. 13 :151-161,1989 ；Datta 等人，Meth. Mol. Biol.，111 :335-334,1999);和用装载有 DNA 的微粒轰击细胞(Klein 等人，Plant Physiol. 91 :440-444,1989 ；Boynton 等人，Science 240 :1534-1538,1988 !Register 等人，Plant Mol.Biol. 25 :951-961,1994 ；Barcelo 等人，Plant J. 5 :583-592,1994 ；Vasil 等人，Meth. Mol. Biol. Ill :349-358,1999 ；Christou, Plant Mol. Biol. 35 :197-203,1997 ;Finer 等人,Curr. Top. Microbiol.Tmmunol. 240 :59-80,1999)。另外,植物转化策略和技术在 Birch, Ann. Rev. Plant Phys.Plant Mol. Biol. 48 :297,1997 ;Forester 等人，Exp. Agric. 33 :15-33，1997 中进行了综述。较小的变化使得这些技术可应用于广泛范围的植物物种。在单子叶植物转化的情况下，粒子轰击通常是所选择的方法。然而，单子叶植物例如玉米也可以通过使用在美国专利5，591，616中所述的土壌杆菌转化法来进行转化。实现单子叶植物例如玉米的转化的另ー种方法将来自胚胎发生悬浮培养物的细胞与纤维(5%w/v, SilarSC-9须晶)和质粒DNA (I μ g/μ I)的悬浮液相混合,并且随后垂直置于VortexGENIE II 润旋混合器(Scientific Industries, Inc.，Bohemia, NY, USA)上的多样品头中，或水平置于 MIXOMAT 牙科萊合金混合器(Degussa Canada Ltd. , Burlington, Ontario,Canada)的固定器中。然后,可以通过以全速混合约60秒(例如,用Vortex GENIE II)或以固定速度振荡I秒(ΜΙΧ0ΜΑΤ)来进行转化。这个过程导致产生可以从其中选择出稳定转化体的细胞群体。从经稳定转化的愈伤组织中再生出植物，并且这些植物及其后代可以通过Southern杂交分析显示为转基因的。该方法的主要优点是其简单性和低成本。与粒子轰击不同，不需要昂贵的设备和供应。对于转化植物细胞特别是玉米而使用须晶例如在美国专利5，464，765中得到描述。美国专利5，968，830描述了用于转化和再生大豆的方法。美国专利5，969，215描述了用于产生转化的甜菜(Beta vulgaris)植物例如糖用甜菜的转化技术。上述转化技术中的每ー种均具有优点和缺点。在每种技术中，对来自质粒的DNA进行遗传改造，从而使得它不仅包含目的基因，还包含可选择和可筛选标记基因。可选择标记基因用于仅选择出具有该质粒的整合拷贝的那些细胞(构建是这样的，即使得目的基因以及可选择和可筛选基因作为ー个単元进行转移)。可筛选基因对于仅成功培养携带目的基因的那些细胞提供了另ー种检查。具有抗生素抗性选择标记的常规的土壌杆菌转化可能是有问题的，因为对于此类植物引起将抗生素抗性散布至动物和人的过度风险存在着公众反对意见。此类抗生素标记可以通过使用类似于在美国专利5，731，179中描述的那些的土壤杆菌技术转化植物而从 植物中消除。抗生素抗性问题还可以通过使用bar或pat编码序列而有效地避免，例如在美国专利号5，712，135中所描述的。这些优选的标记DNAs编码第二种蛋白质或多肽，所述第二种蛋白质或多肽抑制或中和谷氨酰胺合成酶抑制性除草剂膦丝菌素(草铵膦)和草铵膦盐(Basta, Ignite)的作用。通过任何前述技术将包含一种或多种这些基因的质粒引入植物原生质体或愈伤组织细胞中。如果标记基因是可选择基因，那么只有已合并入了所述DNA包的那些细胞在使用合适的植物毒性试剂进行选择的条件下存活。一旦合适的细胞得到鉴定并繁殖后，就再生出植物。来自转化的植物的后代必须进行测试，以确保所述DNA包已成功地整合到植物基因组中。存在影响转化的成功的许多因素。外源基因构建体及其调节元件的设计和构建影响外源序列整合到植物细胞核的染色体DNA内，和转基因被细胞表达的能力。用于以非致死方式将外源基因构建体引入植物细胞核内的合适方法是必需的。重要的是，如果待恢复全植物，那么将构建体引入其中的细胞的类型必须是顺应于再生的类型，其中考虑了合适的再生方案。原生生物也可以用作宿主细胞以用于本发明的初始克隆步骤。可以用于这些初始克隆和扩展步骤的方法、载体、质粒和宿主细胞系统是技术人员众所周知的，并且在本文中不进行描述。在本发明的另ー个实施方案中，可以使用技术人员众所周知的方法插入早期特异性胚胎启动子，以便在待转化的植物中与编码植物生长和/或发育相关基因例如REV的基因有效地连接。启动子的插入将允许基因例如REV在转基因植物的正在发育的种子中的早期胚胎表达。在本发明的方法中特别感兴趣的转基因植物包括但不限于，特别是来自十字花科、禾本科、锦葵科或豆科-蝶形花亚科的单子叶植物和双子叶植物。在这些科中特别感兴趣的植物包括但不限干，卡诺拉油菜、玉米、亚麻荠、棉花、小麦、稻、大豆、大麦及其他产生种子的植物，以及具有农业利益的其他植物，包括但不限于苜蓿等，其在本发明的ー个具体实施方案中包含有在早期特异性胚胎启动子的控制下的REV转基因。转基因可以来自与转基因植物相同的物种，或者转基因可以来自异源植物。特别感兴趣的是包含来自拟南芥的REV转基因的转基因植物。早期特异性胚胎启动子也可以来自与转基因植物相同的物种，或者来自异源植物。例如，早期特异性胚胎启动子可以来自与REV转基因相同的植物物种，或甚至来自另ー个植物物种。特别感兴趣的是来自拟南芥属物种或Lesquerella fendleri的早期特异性胚胎启动子，但早期特异性启动子可以得自另ー个植物物种。已发现适合于本发明方法的早期特异性启动子和REV转基因的特定组合包括但不限干，(a)LeSqUerellafendleri LFAHl2启动子/拟南芥属物种REV ； (b)拟南芥属物种AAPl启动子/拟南芥属物种REV ; (c)拟南芥属物种LEC2启动子/拟南芥属物种REV ;和(d)拟南芥属物种2S2启动子/拟南芥属物种REV。在本发明的ー个具体实施方案中，这些转基因构建体已用于转化卡诺拉油菜，但可以用于转化其他植物物种。特别地，它们可以用于在大豆、玉米、棉花、亚麻荠、稻、小麦、大麦、苜蓿和其他具有农业利益的农作物中产生具有增加的种子大小和/或种子数目的转基因植物。本发明还提供了用于选择増加植物产量的生长和/或发育相关基因的方法。在该方法中，目的基因在表达质粒或载体中与早期特异性胚胎启动子功能性地结合。 使用本领域已知的方法将包含目的基因的表达质粒或载体转染到植物细胞中，以形成转基因细胞。通过已知方法(包括上文公开的那些)使包含转基因的细胞长大并再生成转基因植物，直至获得转基因植物。就与野生型植物相比较而言増加的产量来观察转基因植物，并选择用于获得具有増加的产量的转基因植物的那些生长和/或发育相关基因以用于进ー步发展。包含所选择的生长和/或发育相关基因的转基因植物可以进一歩发展，以提供具有比野生型植物更高的产量的具有农业重要性的植物。仅作为本发明的各个方面的举例说明提供了下述实施例，它们不应解释为以任何方式限制了本发明。
实施例下述实施例描述了各种表达载体的构建，所述表达载体包含早期特异性胚胎启动子和在植物生长和/或发育中具有作用的基因。特别地，将胚胎特异性启动子(a)Lesquerella fendleri LFAH12 ； (b)拟南芥属物种 AAPl ； (C)拟南芥属物种 LEC2 ; (d)拟南芥属物种2S2 ;和(e)拟南芥属物种FAE1，与拟南芥属物种REVOLUTA (REV)基因有效地结合，并用于产生转基因卡诺拉油菜植物。实施例I :转基因卡诺拉油菜植物，其表达被设计为赋予REVOLUTA的胚胎特异性表达的转基因构建体。相对于非转基因野生型拟南芥属物种植物，拟南芥属物种REV基因在转基因拟南芥属物种植物中的组成型过量表达导致増加的种子大小，但这个性状伴随着负面的多效性效应。这些效应包括拟南芥属物种中改变的叶形态和减少的腋生枝形成。改变的叶形态和总体迟缓的植物生长是在以高组成性水平遍及植物地过量表达REV基因的转基因卡诺拉油菜中观察到的负面效应。为了获得増加的种子大小性状并同时避免在非种子组织中的不希望的效应，可以采取将REV转基因的过量表达特异性地靶向种子中的正在发育的胚胎这样的策略。这可以通过使用转基因表达构建体来完成，其中胚胎特异性启动子驱动REV基因的表达。还可以合理地预期，參与植物发育和生长过程的其他植物基因如REV的组成型过量表达将会对转基因植物具有负面的多效性效应。胚胎特异性启动子用于评估在发育和生长中具有作用的植物基因例如可能的产量增加基因的应用提供了就在增加农作物产量方面的功效来评估此类植物基因的一般方法。选择赋予胚胎特异性表达的5种启动子以用于在表达构建体中使用，所述表达构建体被设计为在早期胚胎发育期间在卡诺拉油菜胚胎(欧洲油菜)中产生REV的转基因表达。这些启动子包括AAPl (来自拟南芥的氨基酸通透酶基因)(Hirner等人，Plant J. 14 535-544，1998)，GGTTGCATCT TTGAATACCT TTTTCTCATTTAGGCATAACAATATAATAATTTGTTTTTT GTTTTCATTT TCTTTTGGTGTCATCTTCAAAAATCTGTAAACCCAAAAGT TTGTATAACT TGTTTATTAAGATATTTTTAATTAAATTTTTTTTTTTGAC ATTTTTAAAA AATTATAAAGTGTTTTATGAATTTAAGGAG TAAATAATAT TTATTTAGAA CACTATAAATTAGTTTTACAAGTTCTTAGAAATGTATCTG TAAATTTCAA AAAGGAAAAATATAGCATTTAATTTTGAAGATTTTTTTCT ACATTATATA TATGATAAAAATATTGTATTTTGTACTTTGTAGTTACAAA AAGTCATTAT ATCAACAAATCTAAATATAAAATATTTTTCTATATATTAC TCCAAATTAA CTGTCAGAATAAAAAAGAAGAATAATTATTACAGAATCTG AACATTAAAA TCGTCCCTCCATATGTGGTCTCTGTCTAGTCCAAAAGCAA TTTACACATC CCAAGCCGAAACTATATTAAATAAACATTTTTTTTTCTTT AACTAAAACA TTTATAACATTTAACAATAAAAGTTAAAAATCGAACACGT ATAACGTATT TTTTTACGTATACGTCTTGTTGGCATATATGCTTAAAAAC TTCATTACAT ACATATACAAGTATGTCTATATATATGATATTATGCAAAC ACAAATCTGT TGACTATAATTAGACTTCTTCATTTACTCTCTCTCTGACT TAAAACATTT ATTTTATCTTCTTCTTGTTCTCTCTTTCTCTTTCTCTCA (SEQ ID NO:11);LFAH12(来自 Lesquerella fendleri 的油酸 12-轻化酶去饱和酶基因)(Broun等人，Plant J. 13 :201-210,1998)，TCAGGAAGAT TAAGTCTTTG CTTGTTGTCTGATTTTCTTTAAATACATTAAGAAATCGGT TATGAAGCTT CGTTTTTTGTGTTTTGGGATTATGAAGCTGTCTTTGGATA TTAGTTGCGG TTATTAGCATGCTTCTCTTTTGTGTTTTGGGGATGATGAA GCAGGGTCTC TCTATGTAATGCATTTTGTTTGAAAACTCAGCTAATGCTA ATGCAATTTC TTTTGAAACCTTTGTTATGTTTTCAAAAATATTGAATAGG TTCTGTTATG GATTTATTTGCAAAAGCCATTGATTAAATCAAACCATTAC ATAAGAACAA CATTCATTATTAACTAATTAGAGATGCAAAACACAACATT ACATACAACA TCAGTGACTAATTATTGAGACAAAACAACATCACAGACAC AAACATTCAT CTCATACATCACTTAGAGAGACACAAAAAGCAACCAAACA CAACTATTCC GCCAACAACAATTAGCTTCATACGTTTTGCTTCTCCTTTC AAGCCTTCAA TCATCTTCTCACAGCCACGAATCTGAGCCTTCAATAATAA CATTTCTTCA TCGTGACACTTCTCACGGTTATGAATGCAAGCCTTTATGT CCTCTACTTC TTCTACTAAAGACACATCGGTCCACTTCCA
GGTGTGGAATCCTCCTCTTTTGAAATTTTTCTCACAGGTATGGAATAATCTACCTGGGTTTTTTGGAGTTCTTGAGGTTCTGATCACAACACGGCATCCA CATCGACAGGTCTTAGGAAA ACCACGAAGGTTATGATCTTCAAGCTCACTGTCAAAAGATAAAAACGAGTTTGAAGAAGAAGAAGGCATTATCAATTTCAGAGAATTTTGGAGAATTTTG AGAGATTGAGAATTGGGAAATAAGAACCCTAATCCCCAATTTATGAGATTGAAAATATATCCGTTAGAGAAGAAACATAATGTTGTGCGTTTTAATTAGA AAAAATAGAGATGGGCTTTATCTTTTGTTAAGAGTTTTGGGCTTGGGCTTGGGTTTTTGATAAAAAAATTAATTAAACCAAAACGACGTCGTTTGGTTTA ATTGTTGTTAAAAAAAAATTAAAACACCAAAACGACGTCGTTTTGGTGTTATTAACGGCCTTAAAACGGATTAAATCCATAATCCGTCAGTCAACTAGGG TTACGGATGGTCAACGGCGTTTTTGCATAACGGAGGCACAGTTCAGGCTTAACGGAGTGGACGGAATGGCTTTTTAGGAAGTTTGTAACCGGGGTCTTTTGTTTATGATGTATTTGTCCCCGTCGGCTATTGTTCAGGCCGTTTAGGCCTTTTTCCTATATACTGGAAATAACTATTGTCCAGACGAGTTACTTCTCCAA CATATCAAGAAGTGTTACAAAGATGTGTTACGAAGCCATAAAACTCAAAA CCCTAAGCCTAAACCCTAGAACTTTCTAGCACGTTTATACCTTCTCCTTTCTTTAGTTTCCTTTAAAGGCCTTCGTATCATAAGTTTTATTTTTGCTTAA TACTAACACTAGAAAAAAACAATAATCAACATAAACTAGGTTAAGTCGTG GATCTAATTTTATTGTGAAAATGTAATTGCTTCTCTTAAGAAAAGATTCA TAGCAAAATATTCGCATCTTTCTTGTGAATCATCTTTTGTTTTTGGGGCTATTAAAGAAAAATTGAACTCATGAAATGGTGACAACTTTATTCTAGAGGTAACAGAACAAAAATATAGGAACAACACGTGTTGTTCATAAACTACACGTA TAATACTCAAGAAGATGAATCTTTATAAGAATTTAGTTTTCTCATGAAAA CATAAAAAGTTTTGTCAATTGAAAGTGACAGTTGAAGCAAAGGAACAAAA GGATGGTTGGTGATGATGCTGAAATGAAAATGTGTCATTCATCAAATACTAAATACTACATTACTTGTCACTGCCTACTTCTCCTCTTTCCTCCGCCACC CATTTTGGACCCACGAGCCTTCCATTTAAACCCTCTCTCGTGCTATTCAC CAGAATAGAAGCCAAGAGAGAGAGAGAGATTGTGCTGAGGATCATTGTCTTCTTCATCGTTATTAACGTAAGTTTTTTTTTGACCACTTATATCTAAAATCTAGTACATGCAATAGATTAATGACTGTTCCTTCTTTTGATATTTTCAGC(SEQ I D NO:12);2S2 (来自拟南芥的 2S2 白蛋白基因)(Guerche 等人，Plant Cell 2:469-478，1990)，FAEl (来自拟南芥的脂肪酸延长酶基因)(Rossak等人，Plant Mol. Biol. 46 717-725，2001)，和LEC2 (来自拟南芥的叶状子叶基因)(Kroj等人，Development 130 6065-6073,2003)。CTTTGTTTTGTAGAGTGTTC TATGGGTTATGATTTCGAAAAGAAAAAAAATTGTGAGACACTTAATAAAA TTATTTCGACAAAAAAAGTAGCTTGTATAAAAAAATCAGATTTTAATTTA TGTAAGAACAAATTCCAATATCCAATAGTTAAAAATAATTATTTGTTCCG ATTAATCGAGTTTTGCAAAATATGCACAAA
ATCTATCAT GTACCATTTC TAAGACTATA TATTTGGTTA TATATTTTATGCCGTGTGTT CTGATTCCAA TAAATTTTAG CGCATAGTAA ATTTTCTAAAAAGCAAAATT TTCTCAAAAG TGTACTAATG ACAATTAATT GAGTTTCTACAAAATAAGAA TAACTATTGA CTCGATTTTC ACAAAACTAG TATGCTAAATATCACATTAC TTTTAAAATT AAATGGAATT ATCTTTTTCA ATATTGGATACGAATAATTT TTACACTAAA GTTATTTTAA TAAAATAACC GTTTATTCAAAATATGTAAA GACGACAAAA ATATATATTA AATGGAAAAA CGACTAACTTAGTTTTTGCA AAATTAAATG GATTTGTCCT TTTCAATGTT TGAATACAAA AAAAAATCTA TAATAAGTTT ATTATATTAA AATAACCCGT TTTTTCAGAATACGCAAAAA CGACAAAAAA ATATTAATTA CAAAGAAATT TAGTTTATACAAAAATATG AATGGCTATT AATGGTGTTT ACTCTAAATT TAATTATTATGCATTTATGC TAAATCTTTC TAAAGGTACA AAGATTCGTT TTTTCAATGTTTGAACTGC ATATTAAGGT ATAGATTTGG ACCTTAACAG AGTTAATATATAAGGAAGAG AGCCAAGGAA CTCCAAAATA AAATAAAGAG CCTTCTCTCTCTCTCTCTGA GAAAAAACAC ATATAGCCAA TGACCTTCTC GTGGTCTTCTGTGCCATAAA AGCCATTATA TACATTCAAA CACAATCTGG CGCCACATATACACATGTAC TAGTGTATGT ATATGTCCTA ACCTCTGTAT TCATATCTCTCTCCTTGTCT GAGTGGTGCG ATGGGTATCC CCATAAGCTG CAAACATTGAACCATCTGCA ACATTTTGAC TCGTTTTCTT TTGTGTTTTT CCAACATCTGTCTCTTCTTC ACTCGCTCTC TCCTAATCAA TCTCCCCAAC GACCTCTCTTTTTTTTTGTT TCTTCACTCA GATCTCTCTC CCTCTCTCTC TCTCTCTCTCCGGGAAAA (SEQ ID NO:13)所有5种启动子在拟南芥属物种中产生早期胚胎表达。这5种启动子在早期胚胎发育期间的表达谱在图I中示意性地显示。AAP1、LFAH12、2S2和FAEl启动子在胚胎发育的最早阶段中是不工作的。它们在发育中渐进地在更晚阶段时变得具有转录活性，从AAPl开始，随后为LFAH12、2S2，再随后为FAE1。然后，所有这4种启动子保持具有活性直至更迟的胚胎发育阶段。LEC2启动子具有相反的表达谱，在非常早期胚胎发育中是具有活性的，随后活性逐渐降低直至更迟的阶段。将AAPI、LFAHl2、2S2、FAEI和LEC2启动子在REV转基因表达构建体中与REV编码区序列的2种构造之任ー相组合。将AAPI、LFAHl2、2S2、FAEI和LEC2启动子与REV基因编码序列(包括存在于REV基因中的所有内含子)相组合。还将AAPl和LFAH12启动子与衍生自缺乏内含子的REV cDNA的REV编码区序列相组合。拟南芥REV (At Rev) cDNAATGGAGATGG CGGTGGCTAA CCACCGTGAG AGAAGCAGTG ACAGTATGAATAGACATTTA GATAGTAGCG GTAAGTACGT TAGGTACACA GCTGAGCAAGTCGAGGCTCT TGAGCGTGTC TACGCTGAGT GTCCTAAGCC TAGCTCTCTCCGTCGACAAC AATTGATCCG TGAATGTTCC ATTTTGGCCA ATATTGAGCCTAAGCAGATC AAAGTCTGGT TTCAGAACCG CAGGTGTCGA GATAAGCAGAGGAAAGAGGC GTCGAGGCTC CAGAGCGTAA ACCGGAAGCT CTCTGCGATGV6
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VXX0XX0X3VX3VVX30V30V3VVV0XVXVXVOOXVVVVO30X3X0XX30[VL10]
ΛΤ/-\ τ r\ τ T Tr\r\TTr\T ΤΛ Τ ~\Λ T/-\ r\ T Tr\r\i T T λ rr\ T λ ΤΛ rr\λ rr\ r\i rr\ r\ τ λ rr\ ττ r\ τ γ\λ τλ τλ τ τ λ τλ τΓλ # ι λ
AGCTGGTCTA GACATGCTAG AGACAACACT TGTAGCCTTA CAAGATATAACACTCGAAAA GATATTCGAT GAATCGGGTC GTAAGGCTAT CTGTTCGGACTTCGCCAAGC TAATGCAACA GGGATTTGCT TGCTTGCCTT CAGGAATCTGTGTGTCAACG ATGGGAAGAC ATGTGAGTTA TGAACAAGCT GTTGCTTGGAAAGTGTTTGC TGCATCTGAA GAAAACAAC AACAATCTGC ATTGTCTTGCCTTCTCCTTT GTAAACTGGT CTTTTGTGTG A(SEQ ID NO:I)。REV转基因构建体LFAHl2-At REV 基因-rev 3’ UTR 用EcoRI-LFAH12 (GAATTCTCAGGAAGATTAAGTCTTTGCTTG ；SEQ ID NO :14)和SacI-LFAH12 (GAGCTCGCTGAAAATATCAAAAGAAGGAACA ；SEQ ID NO : 15)引物从 Lesquerellafendleri基因组DNA中扩增出LFAH12启动子的2170碱基对(bp)区域。这些引物分别从离公开的 LFAH12 序列((GeilBank 标号 AF016103. I 或 Gl 3452128)(Broun 等人，Plant.J. 13 :201-210(1998))的5'和3'末端24个核苷酸和15个核苷酸处开始。将几个独立的PCR反应产物克隆到pCR-Blunt (Invitrogen)中并进行测序。所有序列彼此相同(SEQ IDNO :12)，并且与公开的LFAH12序列具有97%同一性。差异可能是由于用于取回启动子的L. fendleri的特定的添加物。用EcoRI将LFAH12移至pBluescript质粒，并且将启动子在pBluescript中的定向确定为KpnI在启动子的5'侧和SaeI在启动子的3'侧(pTG143)。作为来自 PTG95 (在 pCGN1547 中的 35S-At REV 基因-rev 3’UTR，专利 WO 01/33944A1)的SaeI-KpnI片段获取At REV基因-rev 3’UTR盒，并连同LFAH12启动子(来自pTG143的KpnI-SaeI片段)一起以三路连接(three-way ligation)方式连接到已用KpnI进行切割的 pCGN1547 ニ元载体(McBride 等人，Plant Mol. Biol. 14 :269-276,1990)中，以形成与植物NPTII表达盒处于尾对尾定向的LFAH12启动子-At REV基因-rev 3’ UTR0AAPl-At REV 基因-rev 3’ UTR用EcoRI-AAPl(GAATTCGGTTGCATCTTTGAATACCTTTTT ;SEQ ID NO : 16)和 SacI-AAPl(GAGCTCTGAGAGAAAGAGAAAGAGAGAACAA ；SEQ ID NO :17)引物从拟南芥(哥伦比亚生态型)基因组DNA中扩增出AAPI启动子的809碱基对(bp )区域。SacI-AAPI引物从离公开的AAPI序列(GenBankw保存号 X95622. I ；GI :1566687) (Hirner 等人，Plant J. 14 :535-544,1998)的3'末端6个核苷酸处开始。所有PCR产物的序列彼此相同，与公开的C24生态型AAPl序列具有98%同一性，和与经注释的Coi生态型AAPI序列(GenBank 名称AC008051. 3 ；gi 7462019) (SEQ ID NO :11)具有 100% 同一性。用 EcoRI 将 AAPl 移至质粒 pBluescript，并且将启动子在pBluescript中的定向确定为KpnI在启动子的5'侧和SaeI在启动子的3'侧(pTG145)。作为来自 pTG95 (在 pCGN1547 中的 35S_At REV 基因-rev 3’UTR，參见专利W001/33944A1)的SaeI-KpnI片段获取At REV基因-rev 3，UTR盒，并连同AAPl启动子(来自PTG145的KpnI-SaeI片段)一起以三路连接方式连接到已用KpnI进行切割的PCGN1547 ニ元载体(McBride 等人，Plant Mol. Biol. 14 :269-276,1990)中，以形成与植物NPTII表达盒处于头对尾定向的AAPl启动子-At REV基因-rev 3’ UTR0LFAHl2-At REV cDNA-rev 3’ UTR从合成自总RNA的cDNA中扩增出At REV cDNA,所述总RNA分离自Columbia生态型的拟南芥属物种的叶。所使用的引物在ATG处掺入NcoI位点和在終止密码子后掺入BamHI 位点NcoI_ATG rev CCATGGAGATGGCGGTGGCTAAC (SEQ ID NO : 18)和 BamHI-TGA revGGATCCTCACACAAAAGACCAGTTTACAAAGGA (SEQ ID NO: 19)。将所得到的 At REV cDNA PCR产物克隆到质粒pCR-Blunt中并进行测序(pTG230)。使用pTG95作为模板，用引物扩增Rev 3’UTR，所述引物在5'末端处掺入EcoRV位点，和在3'位点处掺入Notl/Kpnl :EcoRVrevUTR GATATCTTCGATTGACAGAAAAAG (SEQ ID NO :20)和 Not/Kpn revUTR GCGGCCGCGGTACCCTCAACCAACCACATGGAACCA (SEQ ID NO :21 )。将所得到的 At REV 3' UTR 克隆到质粒PCR-BIunt中并进行测序。使用EcoRV和NotI位点将Rev 3' UTR移至质粒pBluescript(PTG234)。然后使用EcoRV和NotI位点从pTG234中获取Rev 3，UTR,并连接到pTG230中(pTG239)。作为来自 pTG239 的 SpeI-KpnI 片段获取 At REVcDNA_rev3’ UTR 盒，并连同LFAHl2启动子(来自pTG143的KpnI-SpeI片段)一起以三路连接方式连接到pCGN1547 ニ元载体中，以形成与植物NPTII表达盒处于头对尾定向的LFAH12-At REV cDNA-rev 3’UTR(pTG241)。AAPl-At REV cDNA-rev 3’ UTR
作为来自pTG239 的 SpeI-KpnI 片段获取 At REVcDNA-rev 3’UTR 盒，并连同 AAPl启动子(来自PTG145的KpnI-SpeI片段)一起以三路连接方式连接到pCGN1547 ニ元载体中，以形成与植物NPTII表达盒处于头对尾定向的AAPl-At REV cDNA-rev 3’UTR (pTG242)。FAEl-At REV 基因-rev 3’ UTR使用KpnI和SpeI位点从⑶载体中扩增出933 bp FAEl启动子，克隆到质粒PCR-BIunt中，并进行测序(pTG238)。然后,用EcoRI将FAEl启动子移至质粒pBluescript中(PTG243)。作为来自pTG95的SpeI-KpnI片段获取At REV基因-rev 3’UTR盒，并连同FAEl启动子(来自PTG243的KpnI-SpeI片段)一起以三路连接方式连接到已用KpnI进行切割的 PCGN1547 ニ元载体(McBride 等人，Plant Mol. Biol. 14 :269-276,1990)中，以形成与植物NPTII表达盒处于头对尾定向的FAEl启动子-At REV基因-rev 3’ UTR02S2-At REV 基因-rev 3’ UTR从CD 质粒 p4163(2S2_At REV SwaI 片段)中切出 1379 bp 2S2 启动子，并在 EcoRV位点处连接到pBluescript中。启动子在pBluescript中的定向被确定为KpnI在启动子的5'侧和BamHI在启动子的:V侧(pTG251)。作为来自pTG138(在TOPO中的35S_At REV基因-rev 3’ UTR)的BamHI-KpnI片段获取At REV基因-rev 3’ UTR盒，并连同2S2启动子(来自PTG251的KpnI-BamHI片段)一起以三路连接方式连接到已用KpnI进行切割的PCGN1547 ニ元载体(McBride 等人，Plant Mol. Biol. 14 :269-276,1990)中，以形成与植物NPTII表达盒处于头对尾定向的2S2启动子-At REV基因-rev 3’ UTR0LEC2-At REV 基因-rev 3，UTR用ApaI和PstI从CD质粒p5217中切出1256 bp LEC2启动子，并且在相同位点处克隆到质粒pBluescript中(pTG252)。然后，作为KpnI-BamHI片段将该启动子置于在相同位点处线性化的PTG112 (在质粒pCR-Blunt中的At REV基因)中以产生pTG280，这是在pCR-Blunt质粒中的LEC2-At REV基因。使用pTG234作为模板，用引物扩增出Rev 3' UTR,所述引物在Y末端处掺入NotI位点，和在:V末端处掺入Notl/Kpnl :Not REV UTR startGCGGCCGCTTCGATTGACAGAAAAAG (SEQ ID NO :22)和 NotKpn Rev UTRGCGGCCGCGGTACCCTCAACCAACCACATGGAACCA (SEQ ID NO :23)。将所得到的 At REV 3’UTR 克隆到质粒 pCR-Blunt中并进行测序(PTG281)。然后，使用NotI位点将Rev 3’UTR移至pTG280，并就正确定向进行筛选。所得到的质粒是在质粒pCR-Blunt中的LEC2-At REV基因-rev 3’UTR(pTG283)。作为KpnI片段将LEC2-At REV基因-rev 3’ UTR移至用KpnI线性化的pCGN1547质粒，并就与植物NPTII表达盒的头对尾定向进行筛选(PTG288)。卡诺拉油菜(欧洲油菜)的转化用REV转基因表达构建体转化双单倍体卡诺拉油菜变种DH12075，其中使用基于Maloney 等人(Maloney 等人,Plant Cell Reports 8 :238,1989)的那种的土壤杆菌介导的
转化方法。 使经灭菌的种子在15 X 60mm培养皿中在含有1%蔗糖的1/2MS (Murashige &Skoog)培养基上发芽5天,其中姆个平板大约40-大约60粒种子。对于姆个转化构建体，使总共约1500粒种子发芽。种子并不完全浸入发芽培养基中。使发芽的幼苗在组织培养室中于25°C进行生长，采用16小时光/8小时暗循环。正好在顶端分生组织上切割子叶，而不获得任何分生组织。这通过用镊子紧在顶端分生组织区域上轻轻夹住2个叶柄来完成。小心不要用镊子压碎叶柄。使用镊子的尖端作为引导，使用具有锋利号(sharp No.)为12的刀片的解剖刀切割叶柄。将子叶放到15mmX IOOmm的共培养培养基平板上。经正确切割的子叶容易地分开。如果它们不是这样，那么非常可能已获得了分生组织，并且不使用这样的子叶。每个平板容纳约20片子叶。在每制备少数平板后用土壤杆菌接种子叶外植体以避免萎蔫，所述萎蔫将对该方案的随后阶段产生负面影响。通过电穿孔将REV转化构建体引入根瘤土壤杆菌中。具有REV转化构建体的土壤杆菌在含有合适抗生素的AB培养基中于28°C摇动生长2天。为了接种子叶外植体，将少量土壤杆菌培养物加入至10_ X 35mm培养皿中。将姆个外植体的叶柄浸泡在土壤杆菌培养物中，并且将切割末端放入培养皿中的共培养培养基内。将平板密封，并在组织培养室中于250C ,16小时光/8小时暗下放置3天。3天后，将外植体以每组10个的方式转移到包含幼芽诱导培养基的新鮮的25mm xIOOmm培养皿。这种培养基包含选择试剂(20mg/l卡那霉素)和激素(4. 5mg/l油菜素类固醇(BA))。只转移看上去健康的外植体。使外植体在幼芽诱导培养基上保持14-21天。在这时，可能能够观察到緑色的愈伤组织和可能地某些幼芽形成以及某些未转化的幼芽。通过其白色和紫色而容易地识别出未转化的幼芽。卡那霉素敏感性幼芽通过将其切掉来去除，并且将所有看上去健康的愈伤组织转移至新鮮的幼芽诱导培养基平板中。使外植体在这些平板上再保持14-21天。2-3周后，将颜色为深緑色的幼芽转移至包含幼芽伸长培养基的平板。这种培养基包含选择试剂(20mg/l卡那霉素)，但不包含任何激素。每个平板转移5个幼芽。将平板密封并送回组织培养室。将看起来有活力的转化的幼芽转移至包含间苯三酚(150mg/l)的幼芽伸长培养基。将变得健康和緑色的幼芽返回至幼芽伸长培养基平板。在某些情况下需要进行有活力的幼芽至相同培养基的新鮮平板的反复转移，以获得外表正常的幼芽。将具有正常形态的幼芽转移到具有生根培养基的4盎司婴儿食品罐中，所述生根培养基含有0.5mg/l吲哚丁酸。当将幼芽转移至罐时，将任何多余的愈伤组织切棹。通过大约每6周将其转移至包含O. 2mg/l吲哚丁酸的新鲜罐中，可以将幼芽无限期地維持在罐中。一旦形成了良好的根系，就将Ttl代幼芽从罐中取出，将琼脂从根上除去，并且将小植物转移至盆栽土壌中。每个独立的Ttl小植物代表了转基因插入至卡诺拉油菜基因组中的独立发生，并被称为事件。将透明杯置于小植物上数日，以允许植物适应新环境。一旦植物已变硬，就移去杯。然后，使Ttl转基因事件在温室中生长至成熟，并且收集T1种子。T0事件的表征通过Southern分析来測定每个事件中转基因插入位点基因座的数目。通过Northern分析或终点RT-PCR来验证在Ttl事件中的REV转基因表达。在19天的授粉后天数(DAP )，对于胚胎发育中的单个时间点，获得REV表达数据。从这些数据中得出结论，在这个发育时间点时，LFAHl2和2S2白蛋白启动子驱动比AAPI启动子更高水平的REVRNA产生。2S2/REV构建体在许多事件中产生中等至高水平的表达。所述表达数据证实，所有5种启动子在转基因卡诺拉油菜植物中驱动REV转基因表达方面具有功能。
对于所有7种REV转基因构建体成功地产生了 Ttl植物。所测试的构建体包括(a)AAP1/REV 基因；(b) AAPI/REVcDNA ；(c) LFAH12/REV 基因；(d) LFAHl 2/REVcDNA ；(e) 2S2/REV 基因；(f)FAEl/REV 基因；和(g) LEC2/REV 基因。实施例2 :在重复田间试验中评估在胚胎发育期间REV转基因的表达对于卡诺拉油菜产量的影响。在这个实施例中，将包含有在各种胚胎特异性启动子控制下的拟南芥属物种REV转基因的转基因卡诺拉油菜植物在田间试验中进行测试。转基因REV事件进展至田间试验基于转基因表达和转基因插入基因座数目的组合来选择Ttl事件以用于进展至田间试验。将具有经验证的转基因表达和单个转基因插入基因座的事件指定为最高优先级以推进至田间测试。在某些情况下，如果多个基因的存在由于基因剂量而产生高的总体转基因表达水平，那么选择具有多个插入基因座的事件。使来自所选事件的T1种子在田间地块中作为分离性T1群体(segregating T1populations)进行生长。将每个事件种植为2行、24个植物的地块。对于具有单个转基因插入基因座的事件，在所述24个T1植物中的转基因分离将产生大约6个缺乏转基因的无效植物、12个杂合子植物和6个纯合子植物的分布。在开花前将每个T1植物独个地装入袋中，以防止异型杂交。分开地收获来自所述24个T1植物中每ー个的T2种子。将T2种子原种用于鉴定所述24个亲本T1植物中的哪些是无效的、杂合子的或纯合子的。使来自每个T1植物的大约30粒T2种子在培养皿中的滤纸上进行发芽，所述培养皿具有包含抗生素G418 (卡那霉素的类似物)的溶液。因为使用nptll抗性基因作为选择标记来共转化植物，所以只有携带转基因的那些种子将发芽并继续生长。如果平板上的所有种子被证实对于G418敏感，那么该T1亲本被鉴定为无效品系。如果平板上的所有种子对于G418具有抗性，那么该T1亲本被鉴定为纯合子品系。如果平板上大约四分之ー的种子是敏感的和其余的种子具有抗性，那么该T1亲本被鉴定为杂合子品系。将从来自相同转化事件的纯合子T1亲本获得的'种子混合在一起，以产生用于田间试验测试的纯合子种子原种。将从来自相同转化事件的无效T1亲本获得的T2种子混合在一起，以产生用于田间试验测试的无效同胞种子原种。
田间试验设计通过在大規模重复试验中在田间使每种转基因品系直接与其无效同胞进行比较，在转基因卡诺拉油菜品系中测试胚胎特异性启动子用于评估REV转基因作为产量増加基因的潜力的用途。因为无效同胞由于T1代中转基因的分离而产生，所以无效和纯合子同胞在遗传上几乎是相同的。唯一的显著差异是REV转基因的存在或不存在。这种紧密的遗传同一性使得无效同胞成为用于评估REV转基因的效应的最佳对照。因为试验的主要目的是比较来自事件的转基因品系与其无效分离子，所以选择裂区(split plot)设计。这种设计使得能够高水平地评估转基因和非转基因分项之间的相互作用以及事件间的转基因副区之间的差异(副区(subplot)和主区(main plot)的相互作用),并且较低水平地评估总体事件或主区之间的差异。
田间试验在跨越草原环境的多个位置处进行，以在卡诺拉油菜所通常在其中进行生长的环境条件范围下评估产量表型。在所有位置处，每个转基因事件与在邻近区块中的其无效同胞进行物理配对。纯合子和无效同胞的每个区块对在每个试验位置处重复4次。将在每次实验中的4个重复区块对的位置在每个试验位置处进行随机分布。区块为I. 6m X6m，并且以约142粒种子/平方米的密度进行种植。使用对于卡诺拉油菜的商业生产而言典型的标准农学实践来使植物生长至成熟。实施例3 :从胚胎特异性启动子表达REV转基因以增加转基因卡诺拉油菜中的种
子产量。在每个产量田间试验位置处的所有区块用联合收割机独个地进行收割。作为来自每个区块的就水份含量进行了调整的种子总重量，收集种子总产量数据。对于每次试验中的每个转基因事件，将来自每个纯合子品系的4个重复区块的总产量平均值与来自相关的无效同胞品系的4个重复区块的总产量平均值进行比较。这种比较用于评估REV转基因对于种子总产量的影响。将来自多个试验位置中每ー个位置的结果相组合，以产生REV转基因对种子总产量的影响的交叉试验分析。在每个试验位置处的统计学方差分析允许对纯合子转基因品系与其无效同胞之间的种子总产量中的差异指定显著性阈值(P = O. 05)。在种子总产量方面显示出统计学显著增加的转基因REV卡诺拉油菜品系概括在表I中。对于所有7种启动子/REV转基因构建体鉴定出在总产量方面显示出统计学显著増加的转基因品系。这些结果证实，使用胚胎特异性启动子过量表达REV导致增加的种子产量。用LEC2启动子获得了对产量的最大影响，这暗示REV的过量表达在胚胎发育的最早阶段中可能是最有效的，因为LEC2启动子在发育中非常早地具有最大活性，并逐渐降低转录活性直至胚胎发育的更迟阶段。AAP1、LFAH12和2S2启动子在胚胎发育中的渐进地更迟的阶段时开始具有转录活性，但在增加产量方面也是有效的。就所回收的独立事件的数目而言LFAH12启动子是突出的，所述独立事件显示出显著增加的产量，这表明使用这种启动子获得了性状的高度外显率。对于FAEl启动子只回收了 I个在产量方面具有中等増加的事件，这可能暗示在胚胎发育的较早阶段中开始具有转录活性的启动子提供了用于产量增加的最佳手段，并证实基因的早期胚胎过量表达可以用于评估參与植物生长和/或发育的基因是否具有在转基因植物中增加农作物产量的潜力。表I.相对于其无效同胞而言纯合子REV植物中种子总产量的变化。所有值都是统计学上显著的(P=O. 05)。
权利要求
1.用于增加植物中的种子大小的方法，其包括在早期胚胎发育期间在种子中过量表达植物生长和发育相关基因。
2.根据权利要求I的方法，其中在所述种子中的所述生长和/或发育相关基因的表达处于早期特异性胚胎启动子的控制下。
3.根据权利要求2的方法，其中所述早期特异性胚胎启动子对于所述植物来说是异源的。
4.根据权利要求2的方法，其中所述早期特异性胚胎启动子对于所述植物来说是同源的。
5.根据权利要求2的方法，其中所述早期特异性启动子是与氨基酸通透酶基因(AAP1)、油酸12-羟化酶去饱和酶基因、2S2白蛋白基因(2S2)、脂肪酸延长酶基因(FAEl)或叶状子叶基因(LEC2)相关的启动子。
6.根据权利要求5的方法，其中所述AAPl启动子是来自拟南芥的AAPl启动子，所述油酸12-轻化酶去饱和酶启动子是来自Lesquerella fendleri的油酸12-轻化酶去饱和酶基因启动子(LFAH12)，所述2S2基因启动子来自拟南芥，所述脂肪酸延长酶基因启动子来自拟南芥，或所述叶状子叶基因启动子来自拟南芥。
7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中所述植物生长和/或发育相关基因是REV基因、CAP (环化酶相关蛋白)基因、稻组蛋白脱乙酰酶I基因、E2Fc基因、BKI基因、BRIl基因、ARL (Argos-Like)基因、bril (油菜素类固醇激素感受)基因、FATB基因、P印ino基因、RGS (G蛋白信号传导调节剂)基因、TIPl基因、BB (BigBrother)基因、RHD2基因、INCW2基因、MNl基因、WAK2基因、WAK4基因或AP2基因。
8.根据权利要求7的方法，其中所述生长和/或发育相关基因是REV。
9.根据权利要求8的方法，其中所述REV基因来源于拟南芥。
10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物。
11.根据权利要求10的方法，其中所述植物是十字花科、禾本科、锦葵科或豆科-蝶形花亚科的成员。
12.根据权利要求11的方法，其中所述植物是卡诺拉油菜、玉米、亚麻荠、棉花、苜蓿、大豆、小麦、稻或大麦。
13.根据权利要求12的方法，其中所述植物是卡诺拉油菜或大豆，所述植物生长和/或发育相关基因是REV，和所述早期特异性启动子是与氨基酸通透酶基因(AAP1)、油酸12-羟化酶去饱和酶基因、2S2白蛋白基因(2S2)、脂肪酸延长酶基因(FAEl)或叶状子叶基因(LEC2)相关的启动子。
14.根据权利要求13的方法，其中所述AAPl启动子是来自拟南芥的AAPl启动子，所述油酸12-轻化酶去饱和酶启动子是来自Lesquerella fendleri的油酸12-轻化酶去饱和酶基因启动子(LFAH12)，所述2S2基因启动子来自拟南芥，所述脂肪酸延长酶基因启动子来自拟南芥，或所述叶状子叶基因启动子来自拟南芥。
15.用于增加可从植物获得的种子数目的方法，其包括在早期胚胎发育期间在种子中过量表达植物生长和发育相关基因。
16.根据权利要求15的方法，其中在所述种子中的所述生长和/或发育相关基因的表达处于早期特异性胚胎启动子的控制下。
17.根据权利要求16的方法，其中所述早期特异性胚胎启动子对于所述植物来说是异源的。
18.根据权利要求16的方法，其中所述早期特异性胚胎启动子对于所述植物来说是同源的。
19.根据权利要求16-18中任一项的方法，其中所述早期特异性启动子是与氨基酸通透酶基因(AAP1)、油酸12-羟化酶去饱和酶基因、2S2白蛋白基因(2S2)、脂肪酸延长酶基因(FAEl)或叶状子叶基因(LEC2)相关的启动子。
20.根据权利要求19的方法，其中所述AAPl启动子是来自拟南芥的AAPl启动子，所述油酸12-轻化酶去饱和酶启动子是来自Lesquerella fendleri的油酸12-轻化酶去饱和酶基因启动子(LFAH12)，所述2S2基因启动子来自拟南芥，所述脂肪酸延长酶基因启动子来自拟南芥，或所述叶状子叶基因启动子来自拟南芥。
21.根据权利要求15-20中任一项的方法，其中所述植物生长和/或发育相关基因是REV基因、CAP (环化酶相关蛋白)基因、稻组蛋白脱乙酰酶I基因、E2Fc基因、BKI基因、BRIl基因、ARL (Argos-Like)基因、bril (油菜素类固醇激素感受)基因、FATB基因、P印ino基因、RGS (G蛋白信号传导调节剂)基因、TIPl基因、BB (Big Brother)基因、RHD2基因、INCW2基因、MNl基因、WAK2基因、WAK4基因或AP2基因。
22.根据权利要求21的方法，其中所述生长和/或发育相关基因是REV。
23.根据权利要求22的方法，其中所述REV基因来源于拟南芥。
24.根据权利要求15-23中任一项的方法，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物。
25.根据权利要求24的方法，其中所述植物是十字花科、禾本科、锦葵科或豆科-蝶形花亚科的成员。
26.根据权利要求25的方法，其中所述植物是卡诺拉油菜、玉米、亚麻荠、棉花、苜蓿、大豆、小麦、稻或大麦。
27.根据权利要求26的方法，其中所述植物是卡诺拉油菜或大豆，所述植物生长和/或发育相关基因是REV，和所述早期特异性启动子是与氨基酸通透酶基因(AAP1)、油酸12-羟化酶去饱和酶基因、2S2白蛋白基因(2S2)、脂肪酸延长酶基因(FAEl)或叶状子叶基因(LEC2)相关的启动子。
28.根据权利要求27的方法，其中所述AAPl启动子是来自拟南芥的AAPl启动子，所述油酸12-轻化酶去饱和酶启动子是来自Lesquerella fendleri的油酸12-轻化酶去饱和酶基因启动子(LFAH12)，所述2S2基因启动子来自拟南芥，所述脂肪酸延长酶基因启动子来自拟南芥，或所述叶状子叶基因启动子来自拟南芥。
29.遗传构建体，其包含编码与一种或多种控制序列有效地连接的植物生长和/或发育相关基因的核酸序列，其中所述一种或多种控制序列能够在胚胎发育期间促进所述植物生长和/或发育相关基因的表达。
30.根据权利要求29的遗传构建体，其中所述控制序列是早期特异性胚胎启动子。
31.根据权利要求30的遗传构建体，其中所述早期特异性胚胎启动子是与氨基酸通透酶基因(AAP1)、油酸12-羟化酶去饱和酶基因、2S2白蛋白基因(2S2)、脂肪酸延长酶基因(FAEl)或叶状子叶基因(LEC2)相关的启动子。
32.根据权利要求31的遗传构建体，其中所述AAPl启动子是来自拟南芥的AAPl启动子，所述油酸12-轻化酶去饱和酶启动子是来自Lesquerella fendleri的油酸12-轻化酶去饱和酶基因启动子(LFAH12)，所述2S2基因启动子来自拟南芥，所述脂肪酸延长酶基因启动子来自拟南芥，或所述叶状子叶基因启动子来自拟南芥。
33.根据权利要求29-32中任一项的遗传构建体，其中所述植物生长和/或发育相关基因是REV基因、CAP (环化酶相关蛋白)基因、稻组蛋白脱乙酰酶I基因、E2Fc基因、BKI基因、BRIl基因、ARL (Argos-Like)基因、bril (油菜素类固醇激素感受)基因、FATB基因、P印ino基因、RGS (G蛋白信号传导调节剂)基因、TIPl基因、BB (Big fcother)基因、RHD2基因、INCW2基因、MNl基因、WAK2基因、WAK4基因或AP2基因。
34.根据权利要求33的遗传构建体，其中所述植物生长和/或发育相关基因是REV基因。
35.根据权利要求34的遗传构建体，其中所述REV基因是拟南芥REV基因。
36.根据权利要求29-35中任一项的遗传构建体，其中所述构建体进一步包含polyA序列。
37.用于产生具有增加的种子大小的转基因植物的方法，所述方法包括(a)将根据权利要求29-36中任一项的遗传构建体引入植物或植物细胞内jP(b)在促进再生和成熟植物生长的条件下培养包含所述遗传构建体的所述植物或植物细胞。
38.根据权利要求37的方法，其中所述植物或植物细胞来源于为单子叶植物或双子叶植物的植物。
39.根据权利要求38的方法，其中所述植物是十字花科、禾本科、锦葵科或豆科-蝶形花亚科的成员。
40.根据权利要求39的方法，其中所述植物是卡诺拉油菜、玉米、亚麻荠、棉花、苜蓿、大豆、小麦、稻或大麦。
41.根据权利要求40的方法，其中所述植物是卡诺拉油菜或大豆。
42.用于产生具有增加的种子数目的转基因植物的方法，所述方法包括(a)将根据权利要求29-36中任一项的遗传构建体引入植物或植物细胞内jP(b)在促进再生和成熟植物生长的条件下培养包含所述遗传构建体的所述植物或植物细胞。
43.根据权利要求42的方法，其中所述植物或植物细胞来源于为单子叶植物或双子叶植物的植物。
44.根据权利要求43的方法，其中所述植物是十字花科、禾本科、锦葵科或豆科-蝶形花亚科的成员。
45.根据权利要求44的方法，其中所述植物是卡诺拉油菜、玉米、亚麻荠、棉花、苜蓿、大豆、小麦、稻或大麦。
46.根据权利要求45的方法，其中所述植物是卡诺拉油菜或大豆。
47.用于产生具有增加的种子大小和增加的种子数目的转基因植物的方法，所述方法包括(a)将根据权利要求29-36中任一项的遗传构建体引入植物或植物细胞内jP(b)在促进再生和成熟植物生长的条件下培养包含所述遗传构建体的所述植物或植物细胞。
48.根据权利要求47的方法，其中所述植物或植物细胞来源于为单子叶植物或双子叶植物的植物。
49.根据权利要求48的方法，其中所述植物是十字花科、禾本科、锦葵科或豆科-蝶形花亚科的成员。
50.根据权利要求49的方法，其中所述植物是卡诺拉油菜、玉米、亚麻荠、棉花、苜蓿、大豆、小麦、稻或大麦。
51.根据权利要求50的方法，其中所述植物是卡诺拉油菜或大豆。
52.转基因植物，其包含根据权利要求29-36中任一项的遗传构建体，并且当与相应的野生型植物相比较时具有增加的种子大小，当与相应的野生型植物相比较时具有增加的种子数目，或当与相应的野生型植物相比较时具有增加的种子大小和种子数目。
53.根据权利要求52的转基因植物，其中所述植物或植物细胞来源于为单子叶植物或双子叶植物的植物。
54.根据权利要求53的转基因植物，其中所述植物是十字花科、禾本科、锦葵科或豆科-蝶形花亚科的成员。
55.根据权利要求54的转基因植物，其中所述植物是卡诺拉油菜、玉米、亚麻荠、棉花、苜蓿、大豆、小麦、稻或大麦。
56.根据权利要求55的转基因植物，其中所述植物是卡诺拉油菜或大豆。
57.根据权利要求53的转基因植物，其中所述单子叶植物是稻、燕麦、玉米或小麦。
58.根据权利要求57的转基因植物，其中所述植物是十字花科、锦葵科或豆科-蝶形花亚科的成员。
59.根据权利要求53的转基因植物，其中所述双子叶植物是大豆、棉花、亚麻荠、苜蓿或卡诺拉油菜。
60.根据权利要求52-59中任一项的转基因植物，其中所述植物是全植物、植物器官、种子、植物细胞或其后代。
61.根据权利要求60的转基因植物，其中所述植物器官是叶、茎、花或根。
62.根据权利要求60的转基因植物，其中所述植物细胞是组织培养细胞。
63.用于选择当与早期特异性胚胎启动子功能性地相结合时增加植物产量的基因的方法，其包括 构建表达载体，所述表达载体包含与早期特异性胚胎启动子功能性地相结合的与植物生长和/或发育相关的基因； 用所述表达载体转染植物细胞以形成转基因植物； 培养所述转基因植物；和 在当与野生型植物相比较时具有增加的产量的转基因植物中选择生长和/或发育相关基因O
64.根据权利要求63的方法，其中所述生长和/或发育相关基因是CAP(环化酶相关蛋白)基因、稻组蛋白脱乙酰酶I基因、E2Fc基因、BKI基因、BRIl基因、ARL (Argos-Like)基因、bril (油菜素类固醇激素感受)基因、FATB基因、Pepino基因、RGS (G蛋白信号传导调节剂)基因、TIPl基因、BB (Big fcother)基因、RHD2基因、INCW2基因、MNl基因、WAK2基因、WAK4基因或AP2基因。
65.根据权利要求63的方法，其中所述早期特异性胚胎启动子是与氨基酸通透酶基因(AAP1)、油酸12-羟化酶去饱和酶基因、2S2白蛋白基因(2S2)、脂肪酸延长酶基因(FAEl)或叶状子叶基因(LEC2)相关的启动子。
66.根据权利要求63的方法，其中所述AAPl启动子是来自拟南芥的AAPl启动子，所述油酸12-轻化酶去饱和酶启动子是来自Lesquerella fendleri的油酸12-轻化酶去饱和酶基因启动子(LFAH12)，所述2S2基因启动子来自拟南芥，所述脂肪酸延长酶基因启动子来自拟南芥，或所述叶状子叶基因启动子来自拟南芥。
全文摘要
本发明提供了用于增加植物中的种子大小和/或种子数目的方法和组合物。特别地，提供了用于在胚胎发育期间过量表达植物生长和/或发育相关或关联基因的方法和组合物。用遗传构建体转化的转基因植物提供了在田间产生更大和/或更多种子的成熟植物，所述遗传构建体具有在早期特异性胚胎启动子控制下的植物生长和/或发育相关基因。还提供了用于选择生长和发育相关基因的方法，所述生长和发育相关基因提供具有更高产量表型的转基因植物。
文档编号C12N15/82GK102839191SQ201210347079
公开日2012年12月26日 申请日期2006年12月15日 优先权日2005年12月15日
发明者J·德罗彻, T·恩谷彦 申请人:目标栽培公司