专利名称：一种简单的农杆菌介导大豆整体转化方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种简单的农杆菌介导大豆整体转化方法。
背景技术：
1988年由Hinchee报道大豆转基因植株的获得开始，大豆转基因技术以其把目的基因主动导入、定向改造大豆植株的优点，开始发展成为一种新的大豆育种手段。大豆转基因中常用的转基因方法是农杆菌介导法，基因枪法和花粉管通道法，其它转化方法应用得较少。农杆菌介导法是运用较广泛的一种大豆转化方法，农杆菌介导的大豆遗传转化虽然转化频率很低，并有较强的基因型依赖性，受宿主范围和菌株特异性等因素的限制，但与其它方法比起来具有经济、操作简单、能够准确、完整地将T-DNA转入受体细胞并以单拷贝或低拷贝的形式插入到受体基因组中、转基因遗传较稳定等优点，因此仍然是大豆遗传转化的首选方法。基因枪法受受体材料的影响较小，转化效率相对高，操作简便，可控度高；而且不受基因型和轰击靶组织的限制，是对农杆菌不敏感的物种和基因型转化的常规方法，也是研究瞬时表达的常规技术。但也具有许多缺点，包括价格昂贵，转化过程中经常发生重排和高拷贝插入现象，容易导致外源基因的失活和后代遗传规律紊乱，使后期筛选能够表达目的基因转基因植株比较困难，在植物基因组中拷贝数高，易引起基因沉默。花粉管通道法摆脱了组织培养的限制，让转化在大田条件下进行，减少了实验室处理时间周期，但因为其转化效率低，操作要求高，所以在大豆遗传转化上应用较少。因此，寻找一种能摆脱组织培养的限制，在大田条件下规模化进行转化大豆工作， 且操作要求低的转化方法尤为重要。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种简单的农杆菌介导大豆整体转化方法。本发明的目的可通过如下技术方案实现一种农杆菌介导大豆整体转化方法，具体包括如下步骤将携带目的基因的根癌农杆菌培养至0D_值在0. 8-1. 2，离心，菌体沉淀重悬于溶液A中得转化液，在大豆开花当天的早上、中午、晚上分别利用所述的转化液对大豆花序进行处理，操作完成后加套塑料袋保湿，早上和中午分别维持池 6h，晚上维持IOh 12h ；其中溶液A以水为溶剂，主要包含非离子表面活性剂Sillwet L-77，蔗糖和乙酰丁香酮，其中Sillwet L-77的体积百分比浓度为0. _1%，蔗糖的质量百分比浓度为3% 8%，乙酰丁香酮的质量百分比浓度为 0. 001% 0. 01%。所述的溶液A中Sillwet L-77的体积百分比浓度优选0. 1%-0. 5%，蔗糖的质量百分比浓度优选5%，乙酰丁香酮的质量百分比浓度优选0. 005%。所述的菌体沉淀与溶液A的质量比为1 1 100 500，优选1 200。所述的早上以指5点 7点，中午指11点 13点，晚上指17点 19点。所述的大豆品种优选猴子毛或南农18-6。所述的处理方法包括直接将该根癌农杆菌喷洒或者涂抹在受体花的各个部位和未开的花蕾表面。所述的根癌农杆菌优选根癌农杆菌EHA105。本发明中“％”含义“％”前如果是体积百分比，表示lml/100ml，如果是质量百分比，则表示lg/100g。本发明与现有技术相比，具有如下有益效果1.整个转化过程在大田条件下可完成，可大规模化进行转化实验。2.转化过程脱离了组织培养的限制，可缩短实验时间3-5个月。3.利用根癌农杆菌介导的转化方法可以准确完整地将T-DNA转入受体细胞并以单拷贝或低拷贝的形式插入到受体基因组中，转基因遗传较稳定。4.实验处理操作简便，难度低。
图1表达载体pBI-GmGMPl图谱。质粒T-DNA上带有卡那霉素筛选基因NPT II，绿色荧光蛋白标记基因GFP和1个 CaMV 35S增强子；LB =T-DNA左边界；RB =T-DNA右边界。图2为转基因大豆Tl代卡那霉素喷洒处理结果(非抗性苗)。图3为转基因大豆Tl代卡那霉素喷洒处理结果(抗性苗)。图4为转基因大豆Tl代卡那霉素抗性植株PCR检测(M 标准分子量；P 阳性对照；C 阴性对照；1，2 转基因植株).
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。下述实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。实施例1(1)大豆种植大豆品种南农18-6，于六月中旬种植于转基因试验区大田中，以种两行空一行的方法种植，当年8月中旬进入盛花期，开始用作试验受体。(2)农杆菌培养将pBI121质粒(购自北京拜尔迪生物技术有限公司)分别经过)(ba I>BamH I单酶切，用核酸共沉剂DNAmate沉淀回收酶切后的pBI121线性质粒。利用大豆GmGMPl基因(NCBI上登录号为FJ869891)，设计PCR扩增引物，正向引物 F:5 ‘-atgaaggcattgattctgg-3，(SEQ ID NO. 1)；反向引物 R: 5 ‘-catgacaatctccggcttc-3，(SEQ ID Ν0· 2)。以大豆品种波高(来自国家大豆改良中心种子库)的总cDNA为模板，进行PCR获得GmGMPl读码框序列，PCR扩增反应体系为1 μ 1大豆 cDNA (0. 05 μ g)、1 μ 1 引物对(10 μ Μ),2. 5 μ 1 10XPCR 缓冲液、2. 5μ 1 Mg2+、4y 1 dNTP (IOmM)和1. 25U LA Taq DNA聚合酶(购自TaKaRa公司)，用超纯水补足25 μ 1。反应在 BIO-RAD PTC-200 型 PCR 仪上进行，其程序为 95°C变性 5min ；再 94°C 30s, 58°C 30s， 72°C 2min，共30个循环；然后72°C延伸IOmin ；4°C保存。PCR产物回收后经链接PMD19-T 载体(TaKaRa公司)、转化大肠杆菌DH5ci、蓝白斑筛选、摇菌、测序、序列分析，结果表明PCR 产物具有GmGMPl基因。将测序正确的含有GmGMPl基因的大肠杆菌进行PCR扩增(上游引物F含有)(ba I 的酶切位点5，-gctctagacacatcacaatgaaggcattg-3，(SEQ ID NO. 3)，下游引物 R 含有 BamH I ^61 )^ ^ 5 ‘ -cgggatcctgacctcactcacatgacaat-3 ‘ (SEQ ID NO. 4),
胶回收后进行)(ba I.BamH I双酶切得到含)(ba I/BamH I酶切位点的GmGMPl，将酶切产物含)(ba I、BamH I酶切位点的GmGMPl与酶切后的pBI121线性质粒连接，并转化大肠杆菌 DH5a。蓝白斑筛选及PCR检测得到阳性克隆，命名为pBI-GmGMPl。用限制性内切酶)(ba I/ BamH I双酶切pBI-GmGMPl得到1，IOObp左右的条带，与预期的值相符，所以确认所构建的载体是正确的，即得到了由CaMV35S启动子驱动的GmGMPl基因的表达载体pBI-GmGMPl，载体构造如图1所示。用冻融法将pBI-GmGMPl转入根癌农杆菌菌株EHA105中。将保存于_80°C的含有重组质粒pBI-GmGMPl的EHA105菌株进行活化，划线培养在含50mg/L抗生素利福平和50mg/L卡那霉素的YEB固体平板上，下培养2_3d，然后挑取单菌落于无菌的1. 5ml离心管中(离心管中加入Iml含50mg/L抗生素利福平和50mg/L卡那霉素的YEB液体培养基)，，200rpm,震荡培养Id。而后进行PCR检测，选取PCR阳性的菌液作为母液。配制YEB液体培养基，并向其中加入50mg/L抗生素利福平，50mg/L卡那霉素和 lml/LEHA105 母液，28°C，200rpm，震荡培养 l_2d，直到 OD600 的值为 0. 8-1. 2。4000rpm 离心 lOmin，去上清，得菌体沉淀，菌体沉淀重悬于溶液A中得转化液，其中菌体沉淀与溶液A的质量比为1 200。溶液A以水为溶剂，向其中加入非离子表面活性剂Sillwet L-77，蔗糖和乙酰丁香酮；其中，Sillwet L-77的体积百分比浓度为0.3% (ml/100ml)，蔗糖的质量百分比浓度为5% (lg/100g)，乙酰丁香酮的质量百分比浓度为0.005% (lg/100g)，由于乙酰丁香酮不溶于水，需用适量乙酰丁香酮溶解后加入其中。(3)农杆菌转化液侵染大豆花序①最佳转化时期的选择及转化前预处理每年8月上中旬，大豆进入胜花期。此时，选择花蕾最多的时期(不论花蕾的大小)，处理前一天下午去除植株上所有已开的花，剩下未开放的花蕾。②确定浸染时间于上午6时开始进行浸染，分别针对当天已开的花和未开的花蕾进行涂抹或者喷洒处理，使得已开的花各个部位(包括柱头，花瓣内侧和萼片等)都附着农杆菌转化液。未开的花蕾主要是使其表面附着即可。完毕后用无色透明塑料袋将整株大豆植株套住，包裹起来。③浸染次数及间隔时间同一花序连续浸染3次，时间分别为当天早上6点，中午12点以及晚上18点。处理后立即用无色透明塑料袋包裹，早上和中午处理后3小时后去除塑料袋，晚上一次保留
512小时。同一植株每隔7d处理一次新的花序，旧花序不再处理。(4)转基因植株的筛选将获得的Tl代种子播种于大田，在第一张复叶完全打开时开始喷洒500mg/L硫酸卡那霉素溶液，每天早晚喷洒2次，隔3d对同一植株重复喷洒，9天后开始拔除出现明显黄斑的植株(图2)，喷洒处理10次(15天)后确认转基因植株初步筛选结果(图幻。野生植株喷洒500mg/L硫酸卡那霉素溶液后叶片会出现大面积黄色斑点，而疑似阳性植株则没有黄色斑点或者极少数斑点，通过表型可以分析获得疑似阳性植株。(5)卡那霉素抗性植株PCR检测。以CTAB法提取具有卡那霉素抗性的大豆植株DNA，从CaMV 35S序列中设计一条引物为上游引物F :5，-cactatccttcgcaagaccc-3，(SEQ ID NO. 5)，从目的基因中设计一条引物作为下游引物 R :5，-cgagagaatgaaaaaccgaact-3，(SEQ ID NO. 6)，进行 PCR 扩增，目的片段大小为163bp，PCR扩增程序如下95°C预变性5min，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C 延伸30s，32个循环，72°C延伸IOmin。PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳，证明部分卡那霉素抗性植株中含有与目的片段大小一致的特异条带(图4)。
权利要求
1.一种农杆菌介导大豆整体转化方法，其特征在于具体包括如下步骤将携带目的基因的根癌农杆菌培养至OD6tltl值在0. 8-1. 2，离心，菌体沉淀重悬于溶液A中得转化液，在大豆开花当天的早上、中午、晚上分别利用所述的转化液对大豆花序进行处理，操作完成后加套塑料袋保湿，早上和中午分别维持池 他，晚上维持IOh 12h ；其中溶液A以水为溶剂， 主要包含非离子表面活性剂Sillwet L-77，蔗糖和乙酰丁香酮，其中Sillwet L-77的体积百分比浓度为0. 1% _1%，蔗糖的质量百分比浓度为3% 8%，乙酰丁香酮的质量百分比浓度为0. 001% 0. 01%。
2.根据权利要求1所述的农杆菌介导大豆整体转化方法，其特征在于所述的溶液A中 Sillwet L-77的体积百分比浓度为0. 1%-0. 5%，蔗糖的质量百分比浓度为5%，乙酰丁香酮的质量百分比浓度为0. 005%。
3.根据权利要求1或2所述的农杆菌介导大豆整体转化方法，其特征在于所述的菌体沉淀与溶液A的质量比为1 100 500。
4.根据权利要求3所述的农杆菌介导大豆整体转化方法，其特征在于所述的菌体沉淀与溶液A的质量比为1 200。
5.根据权利要求1所述的农杆菌介导大豆整体转化方法，其特征在于所述的早上以指 5点 7点，中午指11点 13点，晚上指17点 19点。
6.根据权利要求1所述的农杆菌介导大豆整体转化方法，其特征在于所述的根癌农杆菌为根癌农杆菌EHA105。
7.根据权利要求1所述的农杆菌介导大豆整体转化方法，其特征在于所述的大豆品种为猴子毛或南农18-6。
8.根据权利要求1所述的农杆菌介导大豆整体转化方法，其特征在于所述的处理方法包括直接将该根癌农杆菌喷洒或者涂抹在受体花的各个部位和未开的花蕾表面。
全文摘要
本发明属于植物基因工程领域，公开了一种简单的农杆菌介导大豆整体转化方法。包括如下步骤将携带目的基因的根癌农杆菌菌体沉淀重悬于溶液A中得转化液，在大豆开花当天的早、中、晚分别利用所述的转化液对大豆花序进行处理，操作完成后加套塑料袋保湿，早上和中午分别维持3h～6h，晚上维持10h～12h；其中溶液A以水为溶剂，主要包含体积百分比浓度为0.1％-1％的非离子表面活性剂Sillwet L-77，质量百分比浓度为3％～8％的蔗糖和质量百分比浓度为0.001％～0.01％的乙酰丁香酮。本发明整个转化过程在大田条件下可完成，可大规模化进行转化实验。转化过程脱离了组织培养的限制，可缩短实验时间3-5个月。
文档编号A01H5/00GK102250948SQ201110193918
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月12日 优先权日2011年7月12日
发明者徐筋燕, 薛晨晨, 赵晋铭, 邢邯, 郭娜 申请人:南京农业大学