专利名称：非病毒类基因送递系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的用于送递核酸的非病毒类送递系统。更具体而言，本发明涉及一种系统，在给予宿主组织后，它促进核酸导入该宿主组织的细胞中。该系统是以含有特定化学和物理化学特征的、衍生自可生物降解的脱乙酰壳多糖多糖类的阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物的组合物为基础，该组合物能有效地送递生物学活性核酸(如编码所需产品的寡核苷酸或聚核苷酸)，并促进所需产品在所述组织的细胞中表达。
背景技术：
基因治疗的概念是以核酸(DNA或RNA)可作为药物产品从而在适当位点引起治疗性蛋白质的体内生产为基础。通常将送递核酸的系统分为病毒类送递系统和非病毒类送递系统。由于其高度进化和特化的组分，病毒类系统是目前最有效的DNA送递工具，该系统可产生高效的送递和表达。但是，病毒类送递系统存在安全性问题。毒性、免疫原性、限于靶向特定细胞类型、有限的DNA携带能力、生产和包装问题、重组和非常高的生产成本都阻碍了它们的临床应用(Luo和Saltzman，2000)。为此，在基础研究实验室和临床应用中越来越需要非病毒类送递系统。但是，从制药学的角度看，由于与病毒类送递系统相比非病毒类送递系统在体内获得的表达相对较低，送递核酸的途径仍然是一个难题(Saeki等，1997)。
现有技术已描述了多种非病毒类送递系统，包括阳离子脂质、肽或聚合物与质粒DNA(pDNA)形成的复合物(Boussif等，1995；Felgner等，1994；Hudde等，1999)。带负电的核酸主要通过离子-离子相互作用而与阳离子分子相互作用，并从游离形式转变形成紧密状态。在这种状态下，阳离子分子可提供针对核酸酶降解的保护，而且还使该核酸-阳离子复合物更易与细胞相互作用并被其摄取的表面特性(Ledley，1996)。
在这些阳离子分子中，已显示合成的聚合物聚氮丙啶(PEI)能与pDNA形成稳定的复合物，并介导了转基因在体外和体内的相对高的表达(Boussif等，1995；Ferrari等，1997；Gautam等，2001)。为此，常用PEI作为试验设计的参比系统。但是，已提出PEI的毒性和效率之间的大致相关性(Luo和Saltzman，2000)，最近的研究还提出使用PEI所涉及到的毒性(Godbey等，2001；Putnam等，2001)。PEI的另一缺点是，它不是可生物降解的，因此，它可能被长时间存储在体内。因此，仍非常需要寻找有效、无毒的可生物降解的非病毒类送递系统。
最常见的是通过肠胃外途径将非病毒类送递系统体内送递。静脉给予小鼠后，紧密的核酸-阳离子分子复合物主要沉积在肺毛细血管中，在那基因在肺泡隔膜(alveolar septi)中毛细血管的内皮细胞中表达(Li和Huang，1997；Ki等，2000；Song等，1997)，甚至在肺泡细胞中表达(Bragonzi等，2000；Griesenbach等，1998)，但是不在上皮细胞中表达。但未配制的裸DNA在达到目的地前在血液循环中快速降解，因此通常没有基因表达。相反，将裸DNA注射到骨骼肌肉则导致剂量依赖性的基因表达(Wolff等，1990)，当将该DNA与非紧密但“相互作用”的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或聚乙烯醇(PVA)复合时，这种基因表达进一步提高(WO 96/21470)(Mumper等，1996；Mumper等，1998)。因此，体内基因转染是组织依赖性的，其方式不可预测，因而这仍是个挑战。
还描述了非病毒类送递系统的粘膜送递，即送递给胃肠道、鼻和呼吸道(Koping-Hoggard等，2001；Roy等，1999，WO 01/41810)。除了DNA以非紧密形式送递到鼻组织获得最佳的基因表达(WO 01/41810)外，当需要在粘膜组织中获得高基因表达时，紧密型核酸-阳离子分子复合物要优于非紧密型DNA。
现有技术中，非病毒类送递系统是以分子量相当高的阳离子聚合物(如脱乙酰壳多糖)为基础的，通常具有几百个千道尔顿(kDa)，5kDa是下限(如MacLaughlin等，1998；Roy等，1999；WO 97/42975)。主要的原因是低分子量聚合物(＜5kDa)与DNA形成不稳定的复合物，导致基因表达少(Koping-Hoggard，2001)。但是，使用高分子量阳离子分子具有很多缺点，如紧密型核酸-阳离子分子复合物的聚集增加和溶解度问题(MacLaughlin等，1998)。此外，使用较低分子量的阳离子分子存在一些生物学优点，即与较高分子量的阳离子分子相比，它们通常显示出较低的毒性和较弱的补体激活(Fischer等，1999；Plank等，1999)。
现有技术已描述了使用低分子量阳离子分子与核酸复合的一些例子(Florea，2001；Godbey等，1999；Koping-Hoggard，2001；MacLaughlin等，1998；Sato等，2001)。但是，这些低分子量阳离子分子与DNA形成不稳定的密合体(compact)，该密合体在电场中分离(琼脂糖凝胶电泳)，结果导致与较佳分子量阳离子分子相比没有体外基因表达或表达量很少。这可以解释为DNA和低分子量阳离子分子之间形成的复合物通常是不稳定的，易于解离(Koping-Hoggard，2001)。实际上，琼脂糖凝胶电泳期间阳离子分子-DNA密合体的离解和裸DNA的释放在文献中被用作区分无效制剂与有效制剂的试验(Fischer等，1999；Gebhart和Kabanov，2001；Koping-Hoggard等，2001)。这样，现有技术已知DNA和阳离子之间形成的复合物必须稳定才能介导高的基因表达。
现有技术公开了使用非病毒载体将核酸送递给呼吸道的方法的各种例子(Deshpande等，1998；Ferrari等，1997；Gautam等，2000)。我们最近鉴别和表征了基于DNA-复合性聚合物脱乙酰壳多糖的这样一种系统(Koping-Hoggard等，2001)，该脱乙酰壳多糖是一种线性多糖，可从壳多糖衍生得到。在美国专利5972707(Roy等，1999)、美国专利申请号2001/0031497(Rolland等，2001)和WO 98/01160中也描述了脱乙酰壳多糖基的基因送递系统。
已将脱乙酰壳多糖作为紧密连接-修饰剂引入，以促进药物送递通过上皮屏障(Artursson等，1994)。认为它在给人口服后是无毒的，而且已被批准作为食物添加剂使用，并且还被加到愈创产品中(Illum，1998)。
脱乙酰壳多糖包括一类由(1→4)-连接的2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-葡萄糖(GlcNAc，A单元)和2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖(GlcN，D单元)以各种组成和顺序形成的水溶性的线性多糖，可参见
图1。在此采用的将壳多糖和脱乙酰壳多糖区分开的定义是以壳多糖在稀释的酸溶液中的不溶性和脱乙酰壳多糖在相同的稀释酸溶液中的可溶性为基础的(Roberts，1992)。
A单元和D单元的相对含量可以A单元的分数表示
FA＝A单元数量/(A单元数量+D单元数量)FA与去-N-乙酰化单元的百分比具有以下关系％去-N-乙酰化单元＝100％-(1-FA)。
每个D单元含有亲水性可质子化的氨基基团，而每一A单元含有疏水性乙酰基。两种单体的相对量(如A/D＝FA/(1-FA))可大范围地变化，导致它们的化学、物理和生物学性能的广泛多样性。这包括脱乙酰壳多糖在溶液、胶凝状态和固体状态下的性能，以及它们与其他分子、细胞和其他生物的和非生物的物质的相互作用。
当脱乙酰壳多糖被用于非病毒类基因送递系统时，其化学结构的影响最近被证实(Koping-Hoggard等，2001)。不同化学组成的脱乙酰壳多糖显示作为基因送递系统的结构依赖性效率。仅有与pDNA形成稳定的复合物的脱乙酰壳多糖能引起显著的转基因表达。这些复合物要求至少65％的脱乙酰壳多糖单糖被脱乙酰化。
可通过化学或酶学方式将脱乙酰壳多糖解聚，得到所需分子大小的脱乙酰壳多糖聚合物或寡聚物。可使用各种化学降解机制将脱乙酰壳多糖解聚，包括酸水解，亚硝酸和氧化-还原解聚作用。也可使用聚合物的超声波解聚作用，但对于要产生非常低分子量的产物而言都是非常不方便的。使用亚硝酸将脱乙酰壳多糖解聚是常规的制备低分子量脱乙酰壳多糖的方法，这在如US3922260和US 5312908中有描述。这一机制涉及D单元的脱氨基，在新的还原端形成2，5-脱水-D-甘露糖单元，可使用NaBH4将该甘露糖单元还原成2，5-脱水-D-甘露醇(参见图2)。或者还可使用各种酶将脱乙酰壳多糖解聚，如US5482843所述，所述酶包括脱乙酰壳多糖酶、壳多糖酶和溶菌酶。还可使用酸水解将脱乙酰壳多糖解聚(Varum等，2001；以及本文所引用的各文献)。
在现有技术中，对脱乙酰壳多糖的分子量对脱乙酰壳多糖-pDNA复合物体外转染效率的影响的研究显示，在20-200kDa的范围内转染效率对分子量的依赖性不明显(Koping-Hoggard等，2001；Maclaughlin等，1998)。但是，在另一研究中(Sato等，2001)，15kDa和52kDa脱乙酰壳多糖的基因表达比＞100kDa的高，但用1.3kDa脱乙酰壳多糖没有检测到基因表达。此外，使用一系列低分子量脱乙酰壳多糖(1.2kDa、2.4kDa和4.7kDa)的体外基因表达和肺组织体内基因表达研究显示，仅4.7kDa的脱乙酰壳多糖介导了显著的基因表达(Koping-Hoggard，2001)。
已使用不同分子量的脱乙酰壳多糖作为用于非病毒类基因送递的复合物的组分。例如，美国专利申请2001/0031497A提出使用低分子量脱乙酰壳多糖作为送递系统的组分，即2-4kDa Mw的脱乙酰壳多糖，使用此类脱乙酰壳多糖得到最小的基因送递系统颗粒，而且在体外用此浓缩的送递系统还获得增强的细胞转染。
用于基因送递系统的不同分子量脱乙酰壳多糖是从商业供应者获得的通常未分级分离的样品，可使用降解剂如有机酸或无机酸、硝酸或脱乙酰壳多糖降解酶对所述样品进行部分降解，得到较低分子量的产物。但不管怎样，分子量分布仍维持较高。举例而言，使用折射率检测器和多角度激光光散射检测器对重均分子量(Mw)为180.000的市售获得的脱乙酰壳多糖进行尺寸排阻色谱法分析。图3A显示洗脱图，即折射率检测器信号，它与脱乙酰壳多糖的浓度成正比，图中还结合有作为洗脱体积的函数的计算分子量(表示为成乙酸盐形式的脱乙酰壳多糖)的图。明显的是，该样品在峰的开始部分含有高达106克/摩尔(1000kDa)的分子量和在峰的末端含有低至104(10kDa)的分子量。重新计算这些数据得到的结果是累积分子量分布(图3B)。可从这些计算值推断，样品的12％(w/w)的分子量低于40kDa，38％低于100kDa。同样地，样品的18％的分子量高于300kDa，9％高于400kDa。因此，样品是多分散性的，因为它含有不同分子量或链长的聚合物。
可以游离胺的形式或不同的盐的形式(如脱乙酰壳多糖氯化物、脱乙酰壳多糖谷氨酸盐和脱乙酰壳多糖乙酸盐)提供脱乙酰壳多糖。盐形式影响了分子量(M)和DP(每分子的糖残基数)的关系。下述方程描述了DP和M之间的关系游离碱M＝DP(161(1-FA)+203FA)＝DP(161+42FA)脱乙酰壳多糖氯化物M＝DP(197.45(1-FA)+203FA)＝DP(197.45+5.55FA)脱乙酰壳多糖乙酸盐M＝DP(221(1-FA)+203FA)＝DP(221-18FA)脱乙酰壳多糖谷氨酸盐M＝DP(308(1-FA)+203FA)＝DP(308-105FA)多分散性样品的重均分子量(Mw)可表示为Mw＝∑ciMi/∑ci，其中ci是该分布内特定分子量(Mi)的浓度(g/l)(Tanford，C.，1961，大分子的物理化学，JohnWiley和Sons，纽约，8b章节)。同样地，数均分子量(Mn)可表示为Mn＝∑ci/∑(ci/Mi)。在上述例子中，Mw＝180kDa，Mn＝84.5kDa，定义为Mw/Mn的多分散性指数为2.1。接近2的多分散性是已经经过随机解聚的线性聚合物的一个特征(Tanford，C.，1961，大分子的物理化学，John Wiley和Sons，纽约，第33a章节)。
线性聚合物如脱乙酰壳多糖随机解聚后链长的分布由以下方程式表示(Tanford，1961)Wx＝xpx-1(1-p)2Wx是含有x个单体(对于脱乙酰壳多糖而言，单体是糖残基)的链的重量分数，p是未解离的键的分数，1-p是解离的键的分数。数均聚合度(xn)等于1/(1-q)。由于Mn＝M0xn，其中M0等于单体的当量，对于N-乙酰基-葡糖胺而言，当它出现在脱乙酰壳多糖中时，M0为203克/摩尔，对于成游离碱形式的葡糖胺残基而言，当它出现在脱乙酰壳多糖中时，M0为161克/摩尔。对于给定的FA，平均M0等于203·FA+161·(1-FA)。
图4显示已被亚硝酸解聚而获得范围在41.500-13.400内的重均分子量的脱乙酰壳多糖的SEC-MALLS色谱图(4A)、微分分子量分布(4B)和累积分子量分布(4C)。图中清楚地显示计算的分子量分布仍然很宽。这些数据清楚表明，采用部分降解由高分子量的脱乙酰壳多糖生产得到的不同分子量的脱乙酰壳多糖维持着多分散性，并含有分子量迥异的链。
可通过选择性除去某些部分的分布而改变聚合物的分子量分布。可采用凝胶过滤分离具有相对短的链的脱乙酰壳多糖样品，以获得具有相对窄的分子量分布的各种寡聚物或级分。Tommerass等(2001)提供了一个例子，该文献获得了每链有2-10个残基的纯化的脱乙酰壳多糖寡聚物。
还可如Ottoy等(1996)就脱乙酰壳多糖所证明的那样，用凝胶过滤将具有较高分子量的样品分离。通常，使用含有Sepharose CL-4B和Sepharose CL-6B的凝胶过滤柱通过将MW＝270.00的常规多分散性样品分离，获得MW/Mn值为1.2-1.5的级分。
在另一方法中，可通过能选择性获得最短的链的透析或膜技术分离多分散性脱乙酰壳多糖，此时所得的分布依赖于最初的分布以及膜的性能，如孔度、转运系数以及操作条件。
根据本发明，令人惊讶的是，单一链长或分子量分布窄的脱乙酰壳多糖作为基因送递的复合剂与具有相当的MW或Mn但分子量分布较宽的其他样品相比具有不同的性能。
用于核酸的复合的许多阳离子(如PEI、聚赖氨酸和脱乙酰壳多糖)的另一缺点是，它们是具有宽的分子量分布的经粗加工的大批量化学物质，因而特性相当不确定(Godbey等，1999)。已公认这些化合物每一批次间是不同的。因此，从制药学的角度看，具有窄的分子量分布的确定的多阳离子是优选的。
将宽分子量分布的多阳离子用于核酸的复合以及随后的转染的另一缺点是不同长度的链可能具有不同的复合和转染效果。
发明内容
本发明涉及一种组合物，它含有以下组分的复合物(a)从阳离子多糖脱乙酰壳多糖衍生得到的阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物，其中，除了重量分数少于20％的聚合度(DP)＞50的寡聚物外，所述阳离子寡聚物还含有重量分数小于20％的DP＜10的寡聚物；和(b)核酸。
根据本发明，令人意想不到的是，含有确定的、具有某个链长分布的阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物与核酸的组合物有利于将该核酸送递到所选择的组织的细胞中，并获得由所述核酸编码的所需分子的体内表达。
本发明的另一目的是提供一种制备本发明组合物的方法，该方法包括(a)将所述阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物暴露于水性溶剂中；(b)将步骤(a)所得的水性溶液与水性溶剂中的核酸混合；和(c)减少步骤(b)所得的产品溶液的体积，以达到所述组合物的所需浓度。
本发明的又一目的是提供一种给予哺乳动物核酸的方法，该方法包括向哺乳动物导入本发明的组合物。
本发明的又一目的是本发明组合物在制备哺乳动物的预防用或治疗用的药剂中的用途，或者在制备用于体外或体内诊断方法的诊断剂中的用途。
下文所述的一个或多个实施例将提供本发明的这些和其他目的。
发明详述可采用化学或酶学方法由阳离子多糖脱乙酰壳多糖得到本发明的组合物。
本发明的优选组合物之一中，其阳离子寡聚物较佳除重量分数少于20％的DP＞40的寡聚物外还含有重量分数少于20％的DP＜12的寡聚物、最佳除重量分数少于20％的DP＞30的寡聚物外还含有重量分数少于20％的DP＜15的寡聚物。
本发明描述了含有在低分子量阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物与核酸形成复合物的组合物，其中，所述阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物具有确定的链长、窄的链长分布和确定的化学组成。通常，阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物的分子量为500-10000Da，较佳为1200-5000Da，最佳为3000-4700Da。通常，阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物A单元的分数(FA)为0-0.35(65-100％去-N乙酰化单元)、较佳为0-0.1(90-100％的去-N-乙酰化单元)，最佳为0-0.1(99-100％的去-N-乙酰化单元)。合适的，所述核酸含有编码序列，在所述核酸被导入宿主细胞时该编码序列将表达其功能。
根据本发明的一个实施例，所述寡聚物衍生自多糖脱乙酰壳多糖，接着将多分散性寡聚物化合物分离成具有很好定义的链长、窄的链长分布和A单元的分数(FA)为0-0.35(65-100％去-N乙酰化单元)、较佳为0-0.1(90-100％的去-N-乙酰化单元)、最佳为0-0.01(99-100％的去-N-乙酰化单元)的寡聚物。通常，所述寡聚物由6-50个单体单元组成，较佳为10-30个单体单元，最佳为15-25个单体单元，分子量为3000-4700Da，FA少于0.01(大于99％的去-N-乙酰化单元)。
根据本发明组合物的另一实施例，所述核酸选自RNA和DNA分子。这些RNA和DNA分子可由环形分子、线性分子或它们的混合物组成。较佳的是，所述核酸分子由质粒DNA组成。
根据本发明的一个优选实施例，所述核酸含有一编码序列，当该核酸被导入宿主细胞时，所述编码序列将表达其功能。例如，它可编码生物学活性产品，如具有治疗、诊断、免疫或抗原活性的蛋白质、多肽或肽。
本发明还涉及上述组合物，其中所述核酸含有编码蛋白质、酶、多肽抗原或多肽激素的编码序列，或所述核酸含有起到反义分子作用的核苷酸序列，如RNA。
较佳的是，本发明的组合物的pH范围为3.5-8。
本发明的组合物还适宜用靶向配体和/或稳定剂进行衍生。
本发明的又一方面涉及雾化后得到的液滴大小的所述组合物。较佳的是，雾化后本发明组合物的液滴大小基本上等于裸pDNA的液滴大小。
本发明还涉及制备本发明组合物的方法，其中该方法包括以下步骤提供上述阳离子脱乙酰壳多糖，(a)将所述阳离子脱乙酰壳多糖暴露于pH为3.5-8.0的水性溶剂中，(b)将步骤(a)所得的水性溶液与水性溶剂中的所述核酸混合，和(c)将步骤(b)中获得的产品溶液脱水，得到体内给药前的高浓度的该组合物。可采用以下方式实现步骤(c)(1)将步骤(b)的产品溶液中的液体蒸发，获得所需的浓度，或者(2)将步骤(b)的产品溶液冻干，接着重新配制以获得所需的浓度。通常，步骤(b)中所述核酸的浓度为1ng/ml-300μg/ml，较佳是1μg/ml-100μg/ml，更佳是10-50μg/ml；使用蒸发方法(1)的步骤(c)中所述核酸的浓度为10ng/ml-3000μg/ml，较佳为10μg/ml-1000μg/ml，更佳是100-500μg/ml。
应理解，本领域熟练的技术人员能配制不同胺/磷酸盐电荷比的本发明组合物，以包括各种负电荷比、中性电荷比或正电荷比。但是，优选的实施例是本发明组合物为净正电荷的组合物。
本发明还涉及一种将本发明的组合物导入哺乳动物从而向哺乳动物给予核酸的方法。较佳的是，通过肺部、鼻、口腔、颊、舌下、直肠或阴道途径经粘膜组织给予所述组合物。根据另一优选实施例，通过肠胃外如静脉内、肌肉内、皮内、皮下或心脏内给药给予哺乳动物所述组合物。
本发明还涉及上述组合物在制备用于哺乳动物的预防用或治疗用的药剂中的用途，或者在制备用于体内或体外诊断方法的诊断剂的用途。本发明还特别涉及所述组合物在制备用于基因治疗、反义治疗或遗传接种以预防或治疗恶性肿瘤、自身免疫疾病、遗传病、病原性感染以及其他病理性疾病的药剂中的用途。
在下文详细描述的基础上将能更容易理解本发明的其他目的、特征和优点。但是，应当主要的是，这些详细的描述和具体实施例虽然表明了本发明的优选实施方式，但它们仅仅是阐述性的，因为在这些详细描述的基础上，在本发明精神和范围内的各种改变和变动对于本领域技术人员来说都是显而易见的。
附图描述图1显示脱乙酰壳多糖的化学组成，其中脱乙酰壳多糖链的一个片段含有一个N-乙酰基-β-D-葡糖胺残基(A单元)和3个β-D-葡糖胺残基(D单元)。D单元的氨基可以是质子化的，也可以是非质子化的，这取决于pH。
图2a显示采用酸或脱乙酰壳多糖酶对脱乙酰壳多糖解聚后得到的化学结构。酸优先解离A单元后的糖苷键(A单元在新形成的还原端)。酶可水解上述两种残基，特异性据此各不相同。
图2B显示使用硝酸对脱乙酰壳多糖解聚，硝酸仅仅攻击D残基，它重排形成2，5-脱水-D-甘露糖。
图3显示使用折射率检测器和多角度激光光散射检测器对重均分子量(MW)为180.000的市售脱乙酰壳多糖进行尺寸排阻色谱法分析得到的结果。柱TSKG6000PWXL、5000PWXL和4000PWXL(串联)。洗脱液0.2M乙酸铵，pH4.5。RI检测器Optomed DSP(Wyatt)。光散射检测器DAWN DSP(Wyatt)。处理参数(Astra软件第4.70.07版)dn/dc＝0.142ml/g(离线测定脱乙酰壳多糖乙酸盐，发现该值与FA无关)。A25.0×10-3mol.ml.g-2。
3A洗脱图，即折射率检测器信号，它与脱乙酰壳多糖的浓度成正比，图中还结合有作为洗脱体积的函数的计算分子量(表示为成乙酸盐形式的脱乙酰壳多糖)的图。
3B由3A提供的数据计算得到的累积分子量分布。
图4显示已被亚硝酸解聚而获得范围在41.500-13.400内的重均分子量的脱乙酰壳多糖的SEC-MALLS色谱图(4A)、微分分子量分布(4B)和累积分子量分布(4C)。实验条件与图3的相同。
图5对应于解聚成100、50、20和10个残基(DPn)的脱乙酰壳多糖的Kuhn分布的计算的累积分子量分布(A)和微分分子量分布(B)。
图6已a)被亚硝酸解聚和被NaBH4(N1-N4)还原或b)被脱乙酰壳多糖酶(E1-E4)解聚的全长去-N-乙酰化脱乙酰壳多糖(FA＜0.01)的尺寸排阻色谱图(Superdex 30；两根串联的2.5×100厘米柱，洗脱液0.15M乙酸铵，pH4.5，流速0.8毫升/分钟)。DP＝6表明全长去-N-乙酰化脱乙酰壳多糖六聚体的洗脱图。
图7经亚硝酸解聚并经NaBH4还原(未分离的样品)的全长去-N-乙酰基脱乙酰壳多糖(FA＜0.01)和从图6所述获得的级分N1-N4的SEC-MALLS色谱图(7A)。实验条件与图3所述的相同，但使用单柱(TSK G3000 PWXL)。图7B显示由图7A数据算得的累积分子量分布。
图8已经脱乙酰壳多糖酶解聚的脱乙酰壳多糖(未分离样品)和从图6所述获得的级分E1-E4的SEC-MALLS色谱图(8A)。实验条件和图3的相同，但使用单个柱(TSK G3000 PWXL)。图8B显示由图7A给出的数据计算得到的累积分子量分布。
图9显示气管内给予小鼠25微克pLuc三天后体内肺荧光素酶表达(皮克/毫克)(每组4只动物)。以60∶1(+/-)的胺/磷酸盐电荷比制备脱乙酰壳多糖寡聚物与pLuc的复合物。使用pLuc与数均聚合度为18(如13C NMR光谱所测定的)的脱乙酰壳多糖寡聚物N0的复合物产生了显著地最高的荧光素酶表达。用ANOVA研究平均值之间的统计学差异。组平均值差异P＜0.05认为是显著的。
图10显示气管内给予小鼠25微克pLuc三天后体内肺荧光素酶表达(皮克/毫克)(每组4只动物)。数均聚合度为18的该脱乙酰壳多糖寡聚物N0被分离成4份不同的样品，每份样品具有确定的窄聚合度分布。以60∶1(+/-)的胺/磷酸盐电荷比制备脱乙酰壳多糖寡聚物与pLuc的复合物。与基于数均聚合度为18的未分离的样品N0的复合物相比，基于含有链长15-21个单体单元的寡聚物的级分(N3)的复合物显示了明显高的(P＜0.05)基因表达。用ANOVA研究平均值之间的统计学差异。组平均值差异P＜0.05认为是显著的。
图11显示琼脂糖凝胶滞留实验的结果。以60∶1(+/-)的胺/磷酸盐电荷比制备脱乙酰壳多糖寡聚物与pLuc的复合物。随着脱乙酰壳多糖寡聚物的分子量(聚合度)的增加，观察复合物的稳定性升高。因而，与15-21个单体单元的级分(N3)形成的复合物相比，用36-50个单体单元的级分(N1)形成的复合物检测到完全的pLuc滞留。
图12显示分别用两批次(隔开9个月制备)的分离的低分子量阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物(N1和E1)和两次购入(时隔3年)的脱乙酰壳多糖(Protasan UPG210)(隔开3年订购)培育293细胞后体外的荧光素酶基因表达。在2批ProtasanUPG210与pLuc以2.4∶1(+/-)的胺/磷酸盐电荷比复合的情况下，基因表达相差了10倍，但两批分离的低分子量阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物(N1和E1)与pLuc以10∶1(+/-)的胺/磷酸盐电荷比复合的情况下没有显著的差别。用ANOVA研究平均值之间的统计学差异。组平均值差异P＜0.05认为是显著的。
图13显示将含有与pLuc复合的阳离子的组合物气溶胶化后的液滴大小(集群中值直径，mass median diameter，MMD)。含有12-21单体单元(N3)和36-50单体单元(N1)的脱乙酰壳多糖寡聚物的级分和超纯脱乙酰壳多糖Protasan PUG210(UPC)与pLuc分别按60∶1(+/-)和3∶1(+/-)的胺/磷酸盐电荷比复合。MMD明显取决于组成。裸pLuc和含有与pLuc复合的15-21个单体单元(N3)的组合物形成了最小的液滴大小。用ANOVA研究平均值之间的统计学差异。组平均值差异P＜0.05认为是显著的。
使用报道蛋白荧光素酶的表达作为体内肺模型中治疗性蛋白的模型，发现含有质粒DNA和具有确定的链长、链长分布以及化学组成的脱乙酰壳多糖寡聚物组合物的制剂有利于将核酸送递到选定的组织的细胞，并获得由所述核酸编码的所需分子的体内表达。
发现由脱乙酰壳多糖制得的、数均聚合度为18(DPn＝18，由13C-NMR光谱测定)、与Kuhn分布相比显示出相对窄的大小分布且具有超过99％的D单元(FA＜0.01)的脱乙酰壳多糖寡聚物级分与pLuc以60∶1(+/-)的胺/磷酸盐电荷比形成了稳定的复合物(如琼脂糖凝胶电泳所揭示的)。与具有6、10和12个单体单元的单分散性脱乙酰壳多糖寡聚物相比，多分散性DPn＝18样品获得了明显较高的体内肺荧光素酶基因表达，前者与pLuc在60∶1(+/-)的胺/磷酸盐电荷比时形成了不稳定的复合物。稳定的复合物比不稳定的复合物产生较高的基因表达的事实与现有技术相符(Fisher等，1999；Gebhart和Kabanov，2001；Koping-Hoggard等，2001)。但是，用平均分子大小高于DPn18样品的脱乙酰壳多糖寡聚物形成的稳定复合物的荧光素酶表达下降。进一步将级分DPn18分级分离，获得更窄分布的级分，即10-14个单体单元(N4)、15-21个单体单元(N3)、22-35个单体单元(N2)和36-50个单体单元(N1)。具有15-21个单体单体的级分与pLuc形成的复合物产生意想不到的最高的体内肺基因表达，虽然在胺/磷酸盐电荷比为60∶1(+/-)时形成了不稳定的复合物。10-14个单体单元的级分也与pLuc形成了不稳定的复合物，结果仅仅产生中等的荧光素酶表达。
此外，具有15-21个单体单元的级分与pLuc形成的复合物的气溶胶化所得的液滴大小与裸pLuc气溶胶化溶液的液滴大小相当。相反，具有36-50个单体单元级分与pLuc形成的复合物以及UPC(大约1000单体)与pLuc形成的复合物的气溶胶化分别形成了大2倍和3倍的液滴大小。液滴大小的这一制剂依赖性影响可解释为，随着阳离子分子量的增加，溶液的粘度增加，从而产生较大的液滴。
实施例实施例1低分子量脱乙酰壳多糖的制备从Pronova Biomedical AS(奥斯陆，挪威)获得脱乙酰壳多糖Protasan UP G210(FA＝0.17，重均分子量为162000)。如Tommeraas等(2001)所述，使用NaNO2对脱乙酰壳多糖进行化学解聚，然后使用NaBH4进行还原，从而获得N-葡糖胺的低分子量寡聚物，其中，通过NaNO2相对脱乙酰壳多糖的相当量控制分子量。如先前所述(Varum等，1991)，通过非均一去乙酰化控制乙酰化单元的分数，获得少于0.001的FA(如采用质子NMR光谱所测定的)。通常，将1.0克脱乙酰壳多糖溶解在100毫升2.5％的乙酸水溶液中，将氮气冲入该溶液5分子，除去溶解氧，加入5毫升以蒸馏水配制的新鲜的NaNO2溶液(10毫克/毫升)。使反应在黑暗中进行4小时，之后加入3克NaBH4对解聚的脱乙酰壳多糖进行常规的还原，放置在黑暗中过夜。使用乙酸将pH调到4.5。用0.2M的NaCl透析所得溶液3次(Medicell透析管，MWCO 12000-14000)，用蒸馏水透析六次，冻干，获得成盐酸盐形式的低分子量寡聚物。或者，使用从灰色链霉菌(Streptomyceus griseus)获得的脱乙酰壳多糖酶(Sigma C 9830或Sigma C0794)通过酶解聚获得低分子量寡聚物，其中，分子量由酶相对于脱乙酰壳多糖的量和培育时间控制。将0.5克的脱乙酰壳多糖以20毫克/毫升的浓度溶解在0.1M乙酸钠/乙酸缓冲液(pH5.5)中，加入0.65单位的脱乙酰壳多糖酶(SigmaC 0794)，在37℃培育18小时。将pH降到2以终止酶反应，然后沸腾5分钟。如上述透析解聚的脱乙酰壳多糖，并冻干，获得成盐酸盐形式的低分子量酶降解脱乙酰壳多糖。
实施例2分离样品的制备和表征如先前公开的内容所述(Tommeraas等，2001)，在两根串联的2.5×100厘米的柱上进行尺寸排阻色谱，对实施例获得的低分子量脱乙酰壳多糖进行分级分离。根据图6的色谱图(a和b)，收集级分，每份4毫升，分别合并，获得4种具有指定的不同分子量的级分N1(亚硝酸降解)或E1(脱乙酰壳多糖酶降解)N2(亚硝酸降解)或E2(脱乙酰壳多糖酶降解)N3(亚硝酸降解)或E3(脱乙酰壳多糖酶降解)N4(亚硝酸降解)或E4(脱乙酰壳多糖酶降解)。
表1采用SEC-MALLS分析各样品，得到下述链长分布(3次的平均值)
其中，DPW＝重均DP，DPn＝数均DP。
实施例3制剂和体内肺基因表达根据实施例1和2所述的方法由脱乙酰壳多糖制备具有聚合度(DP)为6-50(对非还原端进行的13C-NMR光谱所测得的数均DP为18，N0)的多分散性阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物级分和DP为6、10、12、10-14(N4)、15-21(N3)、22-35(N2)、36-50(N1)的各种特定的阳离子寡聚物。从Aldevron(Fargo，ND，美国)购得萤火虫荧光素酶质粒DNA(pLuc)。以无菌去离子水中配制阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物的原液(2毫克/毫升)，pH6.2±0.1，接着无菌过滤。在涡流搅拌器(Heidolph REAX 2000，KEBO实验室，Spanga，瑞典)剧烈搅拌的同时，将阳离子寡聚物加入无菌水中，然后加入pLuc，以60∶1(+/-)的电荷比配制阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物与pLuc的复合物。15分钟后，在SpeedVac Plus离心机(Savant Instruments，Holbrook，NY)中在真空下进行温和蒸发约90分钟，获得约250微克/毫升左右的pLuc浓度(Koping-Hoggard等，2001)。此外，在之前所述的优化条件下，将pLuc与25 kDa的PEI(Aldrich Sweden，Srockholm，瑞典)和超纯的脱乙酰壳多糖Protasan UPG 210(Pronova Biopolymer，奥斯陆，挪威)分别以5∶1(+/-)和3∶1(+/-)的电荷比配制复合物(Bragonzi等，2000；Koping-Hoggard等，2001)。
用氯胺酮/赛拉嗪(5/20体积％，0.1毫升/10克体重)麻醉小鼠(雄性Balb/c，6-8周龄，每组4只，Charles River，Uppsala，瑞典)，切开颈部0.5厘米长的皮肤，将气管暴露出来。将100微升上述复合物缓慢滴加到气管中，然后将伤口缝合。给药72小时后，用一氧化碳杀死动物，取出肺，在PBS中洗涤，加入0.3毫升冰冻的荧光素酶裂解缓冲液(Promega，Madison，WI)和蛋白酶抑制剂混合物(Complete，Boehringer Mannheim Scandinavia AB，Bromma，瑞典)。在液氮中将该组织样品迅速冷冻，在-80℃保存至分析。
在冷的房间里，在珠搅拌器(Biospec Products，Inc.，OK)中将组织样品匀浆，接着在4℃以15000rpm离心10分钟(5403型离心机，Eppendorf-Nethelar-Hinze GmbH，Hamburg，德国)。将从各测试管得到的50微升澄清的上清液与50微升的荧光素酶试剂(Promega)混合，用照明计(Mediators PhL，Vienna，澳大利亚)分析，积分时间为8秒。为了定量荧光素酶表达，将规定量的荧光素酶标准品加到从未处理的对照动物获得的匀浆组织的上清液中，从而获得荧光素酶(Sigma，St.Louis，MO)的标准曲线。采用BCA实验(Pierce，Rockford，IL)分析各样品中的总蛋白含量，并采用BSA(牛血清清蛋白)作为参比蛋白进行定量。在微平板读数器(Multiscan MCC/340，Labsystems Oy，Helsinki，Finland)上读取540纳米的吸光度。
图9显示了给予pLuc与不同聚合度(分子量)的阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物形成的复合物72小时后小鼠肺中的基因转染效率。令人惊讶的是，pLuc与数均聚合度为18为脱乙酰壳多糖寡聚物N0形成的复合物产生了明显最高的荧光素酶表达。
图10显示了给予pLuc与不同聚合度(分子量)的阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物形成的复合物72小时后小鼠肺中的基因转染效率。数均聚合度为18的脱乙酰壳多糖寡聚物N0被分离(如实施例2所述)成4份具有确定的窄的聚合度分布的样品。令人惊讶的是，含有链长为15-21个单体单元的脱乙酰壳多糖寡聚物的级分(N3)的基因表达高于PEI，且显著高于数均聚合度为18的非分离样品N0。
图11显示了琼脂糖凝胶滞留试验的结果。随着脱乙酰壳多糖寡聚物的分子量(聚合度)的增加，所形成的复合物的稳定性升高。因此，与10-14(N4)个和15-21(N3)个单体单元形成的复合物相比，22-35个(N2)和36-50个(N1)单体单元的级分形成的复合物中检测到pLuc近乎全滞留。数均聚合度为18的未分离样品N0也与pDNA形成稳定的复合物。与DPn18(N0)形成的稳定复合物相比，较不稳定的15-21(N3)复合物令人惊讶地产生更高的体内基因表达(图10)。
实施例4体外基因表达分别以60∶1(+/-)和2.4∶1(+/-)的电荷比，将两批如实施例2所述时隔9个月制得的分离的低分子量阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物N1和E1和时隔3年订购的市售脱乙酰壳多糖(Protasan UPG 210，批次1表观粘度为70mPas，批次2表观粘度为146mPas)与pLuc复合，如实施例2所述。使用稳定的pDNA复合物。
转染前24小时，以70％的铺满度将人胚胎肾上皮细胞系293(ATCC，Rockville，MD，美国)接种到96孔组织培育平板(Costar，Cambridge，UK)上。在转染前，洗涤孔，然后将50微升(相对于0.33微克pLuc)的polyplex制剂加到各孔中。培育5小时后，除去该制剂，加入0.2毫升新鲜培养基。如果试验时间超过2天，每2天更换一次培养基。在第96小时和第144小时，用PBS(pH7.4)洗涤细胞，裂解(Promega)，用照明计(Mediators PhL)测量荧光素酶基因表达。根据用萤火虫荧光素酶(Sigma)制得的标准曲线测定表达的荧光素酶的量，使用bichinchoninic acid测试(Pierce)测定总蛋白质。
图12显示分别使用两批分离的低分子量阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物N1和E1以及两批市售脱乙酰壳多糖Protasan UPG 210培育293细胞后荧光素酶基因体外表达的结果。对于Protasan UPG 210，两批的基因表达相差10倍以上，但分离的低分子量阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物N1和E1之间并没有明显的不同。
实施例5气溶胶化后的液滴大小如实施例3所述制备阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物与pLuc的复合物，获得500微克/毫升的pLuc浓度。作为对照，使用超纯的脱乙酰壳多糖(UPC聚合度在1000左右)与pLuc以最优的条件和3∶1(+/-)的电荷比制备的复合物(Koping-Hoggard等，2001)。使用包括液体通道和气体(空气)通道的雾化导管(Trudell Medical International，London Ontario，加拿大)制备含有阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物与pLuc形成的复合物的气溶胶。首先，将100微升的复合物溶液加到与雾化导管相连的液体容器(液体入口)中。然后，为了获得气溶胶，短时间内将加压空气(3.5巴)脉冲施加给该液体容器(20毫秒)和该雾化导管的气体通道(50毫秒)。使用Mastersizer X(Malvem instruments Ltd.，Malvern，UK)测量所产生的气溶胶的液滴大小。
图13显示了含有阳离子与pLuc所成复合物的组合物气溶胶化后的液体液滴大小(集群中值直径)。很明显，MMD取决于组成。裸pLuc和含有15-21个单体单元(N3)与pLuc形成的复合物的组合物产生的液滴最小。
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权利要求
1.一种组合物，含有以下组分的复合物(a)从阳离子多糖脱乙酰壳多糖衍生得到的阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物，其中，除了重量分数少于20％的聚合度(DP)＞50的寡聚物外，所述阳离子寡聚物还含有重量分数小于20％的DP＜10的寡聚物；和(b)核酸。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述阳离子壳多糖寡聚物是采用化学或酶学方法从脱乙酰壳多糖获得的。
3.如权利要求1和2所述的方法，其特征在于，所述阳离子寡聚物较佳除重量分数少于20％的DP＞40的寡聚物外还含有重量分数少于20％的DP＜12的寡聚物、最佳除重量分数少于20％的DP＞30的寡聚物外还含有重量分数少于20％的DP＜15的寡聚物。
4.如权利要求1-3所述的组合物，其特征在于，所述脱乙酰壳多糖寡聚物的N-乙酰化单元分数(FA)少于0.60、较佳少于0.35、更佳少于0.1，最佳少于0.01。
5.如权利要求1-4所述的组合物，其特征在于，所述组合物基本上呈净正电荷比。
6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述脱乙酰壳多糖寡聚物以靶向配体和稳定剂衍生化。
7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述复合物含有编码序列，当所述核酸被导入宿主细胞中时，所述编码序列表达其功能。
8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述核酸选自DNA和RNA分子。
9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述组合物的pH为3.5-8。
10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述组合物气溶胶化后的液滴大小基本上与仅由相同浓度的核酸组成的组合物的液滴大小相当。
11.一种制备权利要求1-10所述的组合物的方法，其特征在于，所述方法包括(a)将所述阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物暴露于水性溶剂中；(b)将步骤(a)所得的水性溶液与水性溶剂中的核酸混合；和(c)减少步骤(b)所得的产品溶液的体积，获得所述组合物的所需浓度。
12.一种给予哺乳动物核酸的方法，包括使用权利要求1-10所述的组合物，并将该组合物导入哺乳动物。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，通过肺部、鼻、口腔、颊、舌下、直肠和阴道途径向粘膜组织给药从而向哺乳动物导入所述组合物。
14.如权利要求12所述的方法，通过肠胃外途径，即静脉内、肌肉内、皮内、皮下或心脏内给药向粘膜下组织，或者通过内部器官、血管或手术中暴露的其他机体表面或腔室给予哺乳动物所述组合物。
15.如权利要求12所述的方法，权利要求1-10所述的组合物使得所述核酸能在所述哺乳动物中发挥其功能。
16.权利要求1-10所述的组合物在制备哺乳动物的预防用或治疗用药剂或者在制备用于体内或体外诊断方法的诊断剂中的用途。
17.权利要求16所述的组合物在制备药剂中的用途，其特征在于，所述药剂是恶性肿瘤、自身免疫疾病、遗传病、致病性感染以及其他病理性疾病的基因治疗、反义治疗或遗传接种的预防用或治疗用的药剂。
全文摘要
本发明涉及一种含有阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物和核酸的组合物，其中，该阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物从阳离子多糖脱乙酰壳多糖衍生得到，除了重量分数少于20％的聚合度(DP)＞50的寡聚物外，它还含有重量分数小于20％的DP＜10的寡聚物。这些含有特定链长分布的阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物和核酸的组合物有利于向选定组织的细胞送递核酸，并实现由所述核酸编码的所需分子的体内表达。
文档编号C12Q1/68GK1655825SQ03812345
公开日2005年8月17日 申请日期2003年5月2日 优先权日2002年5月3日
发明者P·阿尔图松, B·E·克里斯顿森, M·科平-霍格德, K·M·瓦姆 申请人:Fmc生物聚合物联合股份有限公司