胶原生物织物以及其制备和使用方法

专利名称：胶原生物织物以及其制备和使用方法
本申请是于2002年3月26日提交的美国申请号10/106,653的部分继续申请，此处以其整体引用美国申请号10/106,653作为参考。
1.发明领域本发明涉及从羊膜制得的胶原膜，此处称为胶原生物织物。本发明的胶原生物织物具有天然的未处理的羊膜的结构完整性，即天然的三级和四级结构。本发明提供了通过对羊膜进行去细胞化而从胎盘膜制备胶原生物织物的方法，优选地从具有绒毛膜和羊膜的人胎盘膜制备。在一个优选的实施方案中，羊膜完全地进行去细胞化。本发明的胶原生物织物在内科和外科领域有着许多的应用，包括例如血管的修复、血管的构建和替换、腱和韧带的替换、创伤敷裹、外科移植物、眼科用途、缝合等等。该生物织物的优点部分地是由于其物理特性，例如生物机械强度、屈曲性、可缝合性和低免疫原性，特别是当其来源自人胎盘时。
2.发明背景2.1羊膜解剖学和组织学胎盘囊由通过疏松结缔组织密切连接的两层膜组成。它们被称为羊膜层和绒毛膜层(见

图1)。羊膜层是两层膜中最里面的一层，其与围绕胎儿的羊水接触，而且羊膜和羊水一起形成羊膜囊。羊膜层是无血管的，其内表面是覆盖在基底膜上的简单的柱状上皮细胞，并且其厚度为30-60微米。绒毛膜是囊的外层，而且其是高度细胞化的。血管树状结构从胎盘开始，并通过绒毛膜层延伸至胎盘膜。绒毛膜层通过疏松结缔组织而与羊膜层分隔开，并由此联合在一起，这两层的厚度为120-180微米。胎盘膜具有大量负载了粘多糖的胶原基质，而且胎盘膜据信主要用作对于正在发育的胎儿的保护性囊。这些膜还保持了对于母体循环系统中存在的传染剂和免疫剂的屏障。胎盘膜具有主动和被动转运。最小的分子和蛋白质能够自由地通过它们进行移动，但大的蛋白质如IgM不能穿过基底层。
在以50-50％的比例与组织培养基混合的95％乙醇或者甘油中保存胎盘膜(其为动物或人来源的)已经用于在冷冻之前保存羊膜。这些保存剂去除了形成固缩核的胎盘组织的活力，但胶原基质核基底膜得到了保存。有趣的是，这两种形式的保存方法还去除了移植的膜的抗原性，和还去除了任何潜在具有毒力的试剂。保存通常在小心地将羊膜与绒毛膜分离之后完成。羊膜具有基底层和上皮细胞的一面是光亮的，而朝向绒毛膜的另一面是暗淡的。
2.1先前的羊膜的临床应用使用异源组织(来自其他物种的组织)而带来人兽互传疾病或者引起种间交叉排异反应的可能潜在问题已经使得对于这些组织的期望变小了。异源移植物或者来自同一物种的不同个体的移植物继续是人移植物材料的优选的来源。用于移植的人供体组织的不足成为日益增加的问题，其促进了用于组织移植的新材料的开发。最通常的是，这些生物天然材料的来源是不足的、难以获得的和非常昂贵的。可是，来自人羊膜的胶原层具有所希望的在组织移植应用中有用的生物机械特性。因此，羊膜是异源移植材料的良好来源。
包括羊膜和绒毛膜的胎膜已经用于外科手术，这早在1910年就得到了证实，并且由Trelford和Trelford-Sauder于1979年进行了回顾(见Trelford和Trelford-Sauder，1979，Am.J.Obstet.Gynecol.833)。在1910年，Davis第一个报道了胎膜在皮肤移植中作为外科材料的用途，例如在烧伤的和溃烂的皮肤上(Davis等人，1910，JohnsHopkins Med.J.；15307)。这些研究主要是在动物中进行的，而人试验的结果令人失望。其后，羊膜在外科手术中的用途已经扩大了(见例如，Stern等人，1913，JAMA，13973-4；Sabella等人，1913，Med.Records NY，83478-80；de Rotth等人，1940，Arch.Opthalmol.23522-5；Sorsby等人，1946，Br.J.Opthamlol.30337-45)。现在其用作用于烧伤的皮肤、皮肤创伤和腿部慢性溃疡的生物敷料，用作人造阴道的外科重建中的附属组织，和用于修复脐突出(见例如，Trelford和Trelford-Sauder，1979，134Am.J.Obstet.Gynecol.833；Colocho等人，1974，Arch.Surg.109370-3；Faulk等人，1980，Lancet，1156；Prasad等人，1986，J.Trauma，26945-6；Subrahmanyan等人，1995，J.Plastic Surg.48477-8；Gruss等人，1978，J.Can.Med.Assoc.1181237-46；Ward等人，1984，Br.J.Plastic Surg.37191-3；Dhall，1984，J.Obstet.Gynaecol.91279-82)。其还已经用于在腹部、头部和骨盆的外科程序中防止组织粘连(Gharib等人，1996，Pediatr.Surg.Int.1196-9；Rennekampff等人，1994，Invest.Surg.7187-93)。在20世纪40年代，几个作者报道了羊膜在治疗多种眼表面病症中的有益作用(见例如，de Rotth等人，1940，Arch.Opthalmol.23522-5；Sorsby等人，1946，Br.J.Opthalmol.30337-45；Lavery等人，1946，Trans.Opthalmol.Soc.UK，66668)。
先前已经描述了在本领域中的大量尝试，这些尝试是为了最优化用于移植的羊膜的制备和保存(综述见例如，Dua等人，1999，Br.J.Opthalmol.83748-52(“Dua”))。各种羊膜的制备包括用盐水和抗生素混合物进行保存，和在有或没有将羊膜层与绒毛膜层分离的情况下的醇脱水。可是，在Dua中和在上述文献中所描述的所有方法仍具有这样的缺点，即需要羊膜的制备和保存中的改进来引导。
更近来的一段时间，已经公开了依赖于冷冻保存羊膜的方法，这些冷冻保存的羊膜应用于为了矫正角膜上皮缺损所进行的组织移植外科程序之中。见例如，U.S.专利号6,152,142和6,326,019B1(“Tseng”)。Tseng公开了这样的羊膜，即其置于基质之上，且保存在Dulbecco氏修饰Eagle培养基和甘油的混合物之中，并于-80℃冷冻。在其制备期间的任何时候冷冻组织的过程使得Tseng羊膜变得易碎，甚至是在融解和活化步骤之后变得更加易碎。另外，融解和活化步骤增加了操作羊膜所需的时间。此外，因为保存和制备程序中的冷冻步骤所引起的Tseng羊膜的易碎性，因此需要结构支持物或背衬来确保Tseng羊膜在贮存期间的结构完整性。这就带来了将保存的羊膜与背衬分离开的附加困难，该羊膜由于其易碎性而难以操作和完整地分离。因此将羊膜与背衬分离增加了膜破裂的可能性，和增加了活化羊膜所需的时间长度，这一时间使得能够在进行外科程序之前让活化溶液完全浸透冷冻的羊膜，从而导致增加了外科手术系列过程中的准备时间。贮存和运输还由于需要-80℃冷冻而变得复杂。最后，Tseng的膜一般是不去细胞化的；因此，如此制备的羊膜通常是不透明的，而且不具有一致的结构组成。
更近来的一段时间，Yui等人(U.S.专利号5,618,312(“’312专利”))描述了从组织膜致密层中制备胶原层。虽然所描述的材料主要是胶原，但是其由于其处理方法而太脆弱，以致需要单独的交联步骤来使其变得足够结实以用于医学用途，例如可用于缝合。在’312专利中描述的一种交联方法采用高热处理，优选地于100-110℃，这据信对于胶原的天然构象产生不利影响。Yui等人(U.S.专利号5,876,451)描述了类似的来源自胎盘的胶原材料。可是，这种材料在制备期间作为去细胞化步骤的一部分而用蛋白酶进行处理，这很可能导致基质组分的天然构象的破坏和/或瓦解；因此，结果所得的胶原不能保持其天然构象。
因此，在本领域中继续存在需要来获得经改良的羊膜以用于医疗、诊断和美容应用，其具有经改善的结构特性。本发明提供了这样一种含有胶原的生物织物，其不同于以前的基于胶原的生物织物而保持了天然的胶原四级结构。因此，本发明的生物织物容易制备、容易使用，和其强度足够用于内科和外科目的，并提供了用于伤口愈合的优良基质。
3.发明概述本发明部分地涉及发明者发现一种新型方法来从胎盘(优选为人胎盘)中制备胶原生物织物，这导致获得具有改善的物理和生物物理特性的新型胶原生物织物。该制备方法优选地包括尽量减少羊膜的操作。本发明的胶原生物织物由于其处理方法而与现有技术中所描述的那些不同，其具有完整的天然三级和四级结构。本发明还提供了来源自胎盘的羊膜或生物织物，其具有优良的特性，即增强的抗拉强度、可缝合性和导致减少宿主—移植物排异的减少的免疫源性。本发明还提供了来源自胎盘的羊膜或生物织物，其能够作为脱水的层进行贮存，而不需冷冻或深低温保藏。优选地，来源自胎盘的羊膜来自人胎盘以在人患者中使用。可是，可以用来自多种动物物种的胎盘而使用同样的方法以在患病动物中进行兽医学应用。
本发明提供了制备胶原生物织物的方法，包括提供胎盘优选为人胎盘，分离羊膜层和绒毛膜层，和将羊膜进行去细胞化，并同时保留下面的细胞外基质的结构。该方法此外还需要洗涤和干燥经去细胞化的膜。该方法产生脱水的、去细胞化的生物织物，其能够在无菌的贮存条件下于室温保持稳定，而且随后进行再水化并移植入受试者中。
在一个特殊的实施方案中，胎盘来自经历了剖腹产术分娩或者自然分娩的女性人类。在优选的实施方案中，使用对于本领域熟练技术人员已知的常用的血清学和细菌学测定来确定胎盘是否来自没有传染病的供体。在一个特殊的实施方案中，胎盘经过测试而没有至少一种传染病。在另一个实施方案中，胎盘的来源是已知的，包括供体的医疗史、血型、免疫学数据和基因型特征。虽然胎盘可以来自任何哺乳动物，但供体优选为女性人类。在一些实施方案中，在将羊膜和绒毛膜分离开之前，用本领域熟练技术人员已知的常用方法来去除胎盘中的血。
根据本发明的方法将羊膜进行去细胞化，这包括从羊膜上去除所有可见的细胞材料和细胞碎片，例如从羊膜的母体侧和从羊膜的胎儿侧。羊膜的去细胞化不应当导致羊膜结构完整性的破坏或者改变生物化学组成。因此，根据本发明的方法进行羊膜的去细胞化不会要求在制备羊膜过程中的任何一点上进行冷冻或者将膜与蛋白酶进行接触。羊膜优选地用含有弱去污剂的溶液进行去细胞化，例如含有0.01-1.0％一水合脱氧胆酸钠、非离子去污剂、Triton X-100、阴离子去污剂或十二烷基硫酸钠或者其组合的溶液。
一旦根据本发明的方法将羊膜进行去细胞化，膜就可以进行洗涤和干燥，优选地用低热在真空中进行。
在一些实施方案中，本发明提供了含有脱水的、去细胞化的且无基质的羊膜的胶原生物织物，因此膜具有天然的三级和四级结构。在其他实施方案中，本发明提供了含有去细胞化的且无基质的羊膜的胶原生物织物，其含有胶原、弹性蛋白和纤连蛋白。在其他实施方案中，本发明提供了含有脱水的、去细胞化的、均一的、半透明的和无基质的羊膜的胶原生物织物，并且规定羊膜从未与蛋白酶接触。
在一些实施方案中，生物织物此外还含有一种或多种生物分子，例如治疗剂，包括抗生素、激素、生长因子、抗肿瘤剂、抗真菌剂、抗病毒剂、疼痛药物、抗组胺剂、抗炎剂、抗感染剂、伤口愈合剂、伤口封闭剂、细胞吸引剂和支架试剂等等，但并不局限于此。在一个特殊的实施方案中，胶原生物织物可以用一种或多种生长因子进行浸渍，例如成纤维细胞生长因子、上皮细胞生长因子等等。生物织物还可以用一种或多种小分子进行浸渍，包括小有机分子如特殊生物化学过程的特异性抑制剂，例如膜受体抑制剂、激酶抑制剂、生长抑制剂、抗癌药物、抗生素等等，但并不局限于此。在一些实施方案中，胶原生物织物在生产期间或者在用于外科手术的准备期间用生物分子进行浸渍，这取决于其想要的用途。
在一些实施方案中，本发明包括含有至少两层本发明的生物织物的层压制品，和包括制备该层压制品的方法。在其他实施方案中，本发明包括依赖于想要的用途而将该层压制品定形成复杂的三维支架，包括片层、纤维、球、管，但并不局限于此。
在一个实施方案中，本发明包括制备羊膜层压制品的方法，其包括提供含有羊膜和绒毛膜的胎盘；分离羊膜和绒毛膜；和将羊膜进行去细胞化。在另一个实施方案中，该方法此外还包括洗涤去细胞化的羊膜至少一次；将至少两层去细胞化的羊膜以相互接触的方式层叠在一起，从而形成羊膜层压制品；和干燥去细胞化的羊膜层压制品。可选择地，在另一个实施方案中，用于制备羊膜层压制品的方法包括干燥至少两层根据本发明制备得到的羊膜，和将至少两层羊膜以相互接触的方式层叠在一起，从而形成羊膜层压制品。
在一些实施方案中，根据本发明的方法生产出的羊膜层可以在存在粘合剂的条件下以相互接触的方式放置在一起，以形成羊膜层压制品。根据本发明的方法和组合物所使用的粘合剂可以为任何本领域熟练技术人员已知的生物胶合剂，优选为生物相容的胶合剂，其包括天然胶合剂如纤连蛋白、血纤蛋白以及合成的胶合剂，但并不局限于此。在其他实施方案中，将根据本发明的方法制备得到的羊膜层相互进行交联以形成羊膜层压制品。任何本领域熟练技术人员已知的交联试剂和方法在本发明的范围之内，包括化学交联、肽交联、UV交联、放射交联、纤连蛋白交联、血纤蛋白原交联、水凝胶交联，但并不局限于此。在其他实施方案中，根据本发明的方法生产出的羊膜层压制品不含有粘合剂。
在一些实施方案中，本发明包括使用胶原生物织物作为外科移植物。在一个特殊的实施方案中，本发明包括于在受试者(优选为人)中进行的外科程序之中使用外科移植物，这包括将移植物直接置于外科部位。
本发明提供了胶原生物织物、羊膜层压制品或者进一步含有一种或多种水凝胶组合物的三维支架，和提供了制备这些材料的方法。水凝胶组合物可以含有聚合物，包括聚乙烯醇、聚乙二醇、透明质酸以及其衍生物和类似物，但并不局限于此。
在一些实施方案中，可以进一步在本发明的胶原生物织物、层压制品、三维支架或者其水凝胶组合物上移植细胞，例如干细胞、分化的成熟细胞、祖细胞等等，优选为人细胞，从而这些细胞是均一的和汇合的。
本发明提供了高水平生产胶原生物织物、其层压制品、其三维支架和其水凝胶组合物的方法，特别是商业规模的生产，但并不局限于此。本发明解决了在生产大量的用于临床试验和商业销售的羊膜中的困难。
本发明包括含有本发明的胶原生物织物的组合物，其适合于药物递送；组织工程；泌尿学相关用途，例如尿失禁的矫正；眼的用途，例如用于治疗眼表面病症和作为眼外科移植物；血管的用途，例如血管的修复、血管的构建和替换；心脏病学的用途，例如在构建有病的瓣膜中作为假体装置；神经元相关用途，例如修复受损伤的神经(尤其是切断的外周神经)、作为硬脑膜的替代物和作为围绕神经吻合的假体；骨相关用途，例如用于处理矫形缺陷、作为骨替代物；皮肤病学的用途，例如用于治疗伤口(外部的和内部的)、急性和慢性伤口、先天性伤口和烧伤；用于处理皮肤状况，例如皮肤损伤、老化的皮肤、皱纹、细纹、变薄、降低的皮肤弹性、粗糙的皮肤和阳光损害的皮肤；作为创伤敷料；和用于治疗伤口感染。
在一个特殊的实施方案中，本发明包括用于在受试者中治疗和/或预防眼相关疾病或病症例如眼表面疾病的方法，其包括使用本发明的胶原生物织物，例如通过将生物织物作为外科移植物置于受试者的有病的角膜表面上。在另一个实施方案中，本发明包括在受试者中处理和/或预防皮肤状况，其包括使用本发明的生物织物，例如通过将生物织物与皮肤接触。在另一个实施方案中，本发明包括在受试者中治疗创伤和/或烧伤，其包括将本发明的生物织物与创伤和/或烧伤处接触。在另一个特殊的实施方案中，本发明包括在受试者(优选为人)中矫正尿失禁的方法，其包括使用本发明的胶原生物织物作为植入物。
在其他实施方案中，本发明包括向受试者递送治疗剂的方法，其包括将本发明的胶原生物织物与受试者接触。此外本发明还包括向受试者递送细胞，其包括例如在组织工程中在本发明的胶原生物织物或层压制品上移植活细胞。
本发明提供了用于外科程序的并含有本发明的生物织物的外科移植物。该外科移植物可以应用于受试者(优选为人)的内部或外部部位。
4.附图简述图1人胎盘的绒毛膜和羊膜图2胶原生物织物的显微照片A.处理前B.处理后图3胶原生物织物。举例说明了本发明的胶原生物织物，其具有带有绸纹图案的均一的半透明表面。
图4网架和正在那里干燥的生物织物5.发明详述本发明提供了来源自哺乳动物(优选为人)的胎盘的胶原膜或生物织物。制备胶原生物织物，以在终产品中保持天然的胶原构象，即天然的三级和四级构象。除了胶原生物织物之外，本发明还提供了制造胶原生物织物的方法，和在医学环境中使用该生物织物的方法。
本发明提供了含有脱水的、去细胞化的且无基质的羊膜的胶原生物织物，因此羊膜具有天然的三级和四级结构。在一些实施方案中，本发明提供了去细胞化的且无基质的胶原生物织物，其含有胶原、弹性蛋白和纤连蛋白。
在一些实施方案中，本发明提供了含有本发明的胶原生物织物的羊膜层压制品。根据本发明的方法制备得到的羊膜层压制品含有至少两层胶原生物织物，这些胶原生物织物以相互接触的方式放置在一起以形成羊膜层压制品。在其他实施方案中，本发明提供了含有本发明的胶原生物织物的三维支架，例如管。在其他实施方案中，本发明提供了本发明的胶原生物织物、其层压制品或者进一步含有水凝胶组合物的其三维支架。
因此，本发明提供了多种形式和构造的胶原生物织物，包括层压制品、三维支架和水凝胶组合物，但并不局限于此。本发明提供了本发明组合物的任何医学上有用的形式。不管特殊的形式或构造，本发明的组合物可以进一步含有一种或多种生物分子，优选为治疗剂。正如此处所详细描述的，含有生物分子的本发明的组合物在内科领域中有着许多用途。在一些实施方案中，本发明包括在本发明的组合物上移植活细胞，从而这些细胞是均一的和汇合的。移植了细胞的本发明的组合物在内科和牙科领域中有着许多用途，例如用于组织工程目的。
本发明还涉及制备胶原生物织物、其层压制品、其三维支架或水凝胶组合物的方法。在一个特殊的实施方案中，本发明提供了从具有羊膜和绒毛膜的胎盘制备胶原生物织物的方法，包括分离羊膜层和绒毛膜层；和将羊膜进行去细胞化，以致羊膜不与酶例如蛋白酶接触。在其他实施方案中，该方法此外还需要洗涤和干燥经去细胞化的羊膜。在另一个特殊的实施方案中，本发明提供了从具有羊膜和绒毛膜的胎盘制备羊膜层压制品的方法，包括分离羊膜层和绒毛膜层；将羊膜进行去细胞化；和将至少两层去细胞化的羊膜以相互接触的方式层叠在一起，从而形成羊膜层压制品。在一个特殊的实施方案中，去细胞化的羊膜在层叠之前进行干燥。在另一个特殊的实施方案中，去细胞化的羊膜在层叠之后进行干燥，以致于至少两层去细胞化的羊膜相互接触。
本发明提供了在内科、牙科和外科环境中使用本发明的胶原生物织物、其层压制品、其三维支架或其水凝胶组合物的方法。其实，期望本发明的组合物相对于本领域中已知的其他生物材料具有增强的治疗和临床效用。在一些实施方案中，本发明提供了使用本发明的组合物在受试者中治疗和/或预防眼相关疾病或病症的方法。在一个特殊的实施方案中，本发明提供了在受试者中治疗和/或预防眼相关疾病或病症的方法，其包括将生物织物置于受试者的患病的眼表面上。
在其他实施方案中，本发明提供了用本发明的组合物在受试者(优选为人)中处理和/或预防皮肤状况的方法。在一个特殊的实施方案中，该方法包括将组合物与受试者的皮肤接触。在另一个特殊的实施方案中，将组合物直接置于受试者的皮肤表面上，该皮肤表面是皮肤状况的部位。
本发明还提供了在受试者(优选为人)中治疗创伤或烧伤的方法，其包括在创伤或烧伤的部位接触组合物。
在其他实施方案中，本发明提供了在外科程序中使用本发明的组合物(例如胶原生物织物、羊膜层压制品)，例如在眼外科、心血管外科、牙周外科、神经外科、牙外科和矫形外科。
本发明提供了使用本发明的组合物来向受试者(优选为人)递送生物分子(优选为治疗剂)的方法。本发明还包括使用本发明的组合物来向受试者(优选为人)递送细胞的方法，其中已经进一步在组合物上移植了细胞。
5.1胶原生物织物本发明提供了胶原羊膜，此处称为胶原生物织物。本发明的胶原生物织物保持了天然的、未处理的羊膜的结构完整性，即在其组成中保持了结构蛋白(例如胶原、弹性蛋白或许还有纤连蛋白)的三级和四级结构。因此，本发明的胶原生物织物由与天然的或未处理的羊膜一样的结构蛋白所组成。生产羊膜的现有技术方法需要使用蛋白酶或高热处理，因此这些膜不能在它们的组成中保持结构蛋白的三级和四级结构。
在一个特殊的实施方案中，本发明提供了脱水的、去细胞化的且无基质的(即无过滤背衬)羊膜，因此羊膜具有天然的三级和四级结构(见图2A和B)。本发明的脱水的、去细胞化的羊膜是均一的(即最少至没有细胞材料)、半透明的生物织物，其具有图3中显示的外观，其具有去细胞化的基质的左手三股螺旋α螺旋片(见例如，Molecular Biology of the Cell，1989，Alberts等人(编者)，Garland Publishing公司，New York，NY；此处以其整体进行引用作为参考)。
本发明的胶原生物织物可以来源自任何哺乳动物的羊膜，例如马、牛、猪或狭鼻类动物来源，但是最优选的是来源自人胎盘。在一个优选的实施方案中，本发明的生物织物在其组成中具有胶原材料的天然的三级和四级结构。
与现有技术中所描述的那些不同，本发明的胶原生物织物以最小限度进行操作，即本发明的胶原生物织物进行至多一个化学或生物处理或者操作，例如在弱去污剂中进行去细胞化。在此处使用时，“以最小限度进行操作”是指在制备胶原生物织物期间的任何步骤，本发明的羊膜没有进行酶处理例如蛋白酶处理、高热处理、强烈的化学处理、暴露于强去污剂或酸。作为去细胞化步骤的一部分，羊膜的蛋白酶处理会损害生物织物的结构完整性，例如影响胶原材料的三级和/或四级结构。与此不同，在制备本发明生物织物中的羊膜的最小限度的操作导致获得相对于现有技术中的产品来说具有增强的机械强度的产品和半透明的产品。
本发明的去细胞化的且无基质的胶原生物织物含有胶原(包括I型、IV型和II型胶原，但并不局限于此)以及纤连蛋白和弹性蛋白。这种联合部分地是造成根据此处描述的方法制备得到的本发明生物织物具有增强的机械强度的原因。作为最小限度的处理和操作的结果，本发明的胶原生物织物保持了天然膜的组成。胶原是主要的脊椎动物结构材料，其存在于主要具有机械功能的组织中。胶原分子由三条称为α链的多肽链(每条的长度为大约1000个氨基酸)构成，这三条链如在三股绳中一样相互缠绕在一起，从而形成规则的左手超螺旋。已经鉴定了至少胶原的19种类型，它们都具有同样的三维组构(见例如，Lee等人，2001，International J.of Pharmaceutics，2211-22)。
本发明的羊膜在形式、生物机械和结构特征上比现有技术中所报道的和发明者已知的那些要优良，这部分地是基于如此处所述发现了制备羊膜的新型方法和人胎盘的受控和充足的来源(见5.2节)。
特别地，与一种或多种现有技术的羊膜相比，本发明的胶原生物织物具有一个或多个下列的特征增强的抗拉强度；优良的可缝合性；减小的免疫原性，这导致减小宿主一移植物排异反应；容易贮存和运输，而不需冷冻或深低温保藏；在制备之后最小限度需要操作和活化，即再水化、使用前的程序；和能够于室温贮存延长的一段时间，而同时保持结构和功能的完整性。表1概括了本发明的生物织物与现有技术中的那些相比时所得的优点。
在可选择的实施方案中，本发明提供了含有脱水的、去细胞化的且无基质的绒毛膜(优选为人绒毛膜)的胶原生物织物。期望含有绒毛膜的胶原生物织物会具有与含有羊膜的本发明胶原生物织物相当的特性。本发明提供了含有绒毛膜的胶原生物织物的所有医学有用形式，包括层压制品、三维支架和水凝胶组合物，但并不局限于此。
表1.本发明的生物织物与传统的羊膜制剂的比较
在一个优选的实施方案中，本发明的胶原生物织物是半透明的，即是光学透明的。在另一个优选的实施方案中，本发明的胶原生物织物是薄的和轻的。在一个特殊的实施方案中，脱水的本发明的胶原生物织物为0.3-0.6mg/cm2。在一个特殊的实施方案中，本发明的胶原生物织物的厚度为至少30微米。在另一个特殊的实施方案中，本发明的胶原生物织物厚度为大约10-40微米。
本发明包括使用多种构造的本发明的胶原生物织物，例如插入物、防护物。一般地，生物织物可以定形成任何医学上有用的形式。例如，胶原生物织物可以设定为以其整体进行使用，即使用来自完整胎盘的胶原生物织物。可选择地，胶原生物织物可以切成条、片或卷，或者可以织成线。在另一个实施方案中，作为单厚度的片或者层压制品的胶原生物织物可以规则的间隔进行切割并将其张开，例如形成网。
在一些实施方案中，胶原生物织物是平的，例如具有没有倾斜或弯曲的表面。在其他实施方案中，本发明的胶原生物织物不是完全平的，而是具有带有微凹的表面，例如在表面上有凹陷或凹入。
在一个特殊的、优选的实施方案中，本发明包括含有至少两层本发明的胶原生物织物的层压制品。这些层可以物理方式结合在一起，例如通过使用胶合剂、持着器，或者通过热压生物织物的一部分(例如这些层中的至少一个的外周)以融合这些层。因为生物织物有“颗粒”，所以生物织物可以多种方法层压成层压制品。在一个实施方案中，所述层压制品的所有层具有同样的颗粒方向。在另一个实施方案中，至少一个层的颗粒方向相对于至少另一个层的颗粒方向旋转了大约90度(即大约垂直)。在一个更特殊的实施方案中，所述的垂直的层彼此相邻。在另一个实施方案中，所述的层压制品含有至少三层胶原生物织物，其中所述至少三个层中的每一个的颗粒结构相对于余下层中的两个的颗粒结构旋转了大约60度。在另一个实施方案中，所述层压制品含有至少第一种材料和第二种材料，其中该第一种材料是本发明的胶原生物织物，该第二种材料是任何其他能够与胶原生物织物形成层压制品的物质。在一个特殊的实施方案中，所述第二种材料是来源自除了羊膜之外的膜的片或膜。在另一个特殊的实施方案中，所述第二种材料是非天然的材料，例如聚内酯、聚乙酸酯、塑料膜等等。在一些实施方案中，羊膜层压制品是多层的，其含有至少6层、至少8层、至少10层、至少20层、至少80层、至少100层、至少1000层根据本发明的方法制备得到的羊膜。本发明的羊膜层压制品可以含有无限数量的层。
层压制品具有增加的结构刚性，这使得层压制品能够塑造成复杂的三维结构。这种三维结构可以包括片、管、微球体。
胶原生物织物还可以单片或者层压制品的形式与另一种材料联合在一起。例如，生物织物可以与可屈曲的塑料膜、纱布、塑料片、支架、瓣膜、矫形装置、绷带、贴剂等等联合即结合在一起。
胶原生物织物可以含有一种或多种不为生物织物的胶原基质的部分的化合物或物质。例如，胶原生物织物可以在生产或者外科程序准备期间用生物分子进行浸渍。这种生物分子包括抗生素(例如克林霉素、二甲胺四环素、强力霉素、庆大霉素)、激素、生长因子、抗肿瘤剂、抗真菌剂、抗病毒剂、疼痛药物、抗组胺剂、抗炎剂、抗感染剂(包括银(例如银盐包括硝酸银和磺胺嘧啶银，但并不局限于此)、元素银、抗生素、杀菌的酶(例如溶菌酶)，但并不局限于此)、伤口愈合剂(例如细胞因子包括PDGF、TGF，但并不局限于此；胸腺素)、作为伤口愈合剂的透明质酸、伤口封闭剂(例如有或没有凝血酶的血纤蛋白)、细胞吸引剂和支架试剂(例如纤连蛋白)等等，但并不局限于此。在一个特殊的实施方案中，胶原生物织物可以用至少一种生长因子进行浸渍，例如成纤维细胞生长因子、上皮细胞生长因子等等。生物织物还可以用小有机分子进行浸渍，例如特殊生物化学过程的特异性抑制剂，如膜受体抑制剂、激酶抑制剂、生长抑制剂、抗癌药物、抗生素等等。
在另一个实施方案中，本发明的胶原生物织物可以联合水凝胶。本领域熟练技术人员已知的任何水凝胶组合物包括在本发明的之内，例如在下列综述中所揭示的任何水凝胶组合物Graham，1998，Med.Device Technol.9(1)18-22；Peppas等人，2000，Eur.J.Pharm.Biopharm.50(1)27-46；Nguyen等人，2002，Biomaterials，23(22)4307-14；Henincl等人，2002，Adv.Drug Deliv.Rev 54(1)13-36；Skelhorne等人，2002，Med.Device.Technol.13(9)19-23；Schmedlen等人，2002，Biomaterials 234325-32；所有这些文献在此处以其整体进行引用作为参考。在一个特殊的实施方案中，水凝胶组合物应用于胶原生物织物之上，即放置于胶原生物织物的表面上。水凝胶组合物例如可以喷洒在胶原生物织物上、布满生物织物的表面、浸泡胶原生物织物、浸洗胶原生物织物、或者包被至胶原生物织物的表面。
在本发明的方法和组合物中可用的水凝胶可以从任何本领域中已知的与水相互作用或者水溶性的聚合物制得，包括聚乙烯醇(PVA)、聚羟乙基异丁烯酸酯、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、透明质酸、葡聚糖或者其衍生物和类似物，但并不局限于此。
在一些实施方案中，本发明的胶原生物织物进一步在与水凝胶联合之前用一种或多种生物分子进行浸渍。在其他实施方案中，水凝胶组合物进一步在与本发明的胶原生物织物联合之前用一种或多种生物分子进行浸渍。这种生物分子包括抗生素(例如克林霉素、二甲胺四环素、强力霉素、庆大霉素)、激素、生长因子、抗肿瘤剂、抗真菌剂、抗病毒剂、疼痛药物、抗组胺剂、抗炎剂、抗感染剂(包括银(例如银盐包括硝酸银和磺胺嘧啶银，但并不局限于此)、元素银、抗生素、杀菌的酶(例如溶菌酶)，但并不局限于此)、伤口愈合剂(例如细胞因子包括PDGF、TGF，但并不局限于此；胸腺素)、作为伤口愈合剂的透明质酸、伤口封闭剂(例如有或没有凝血酶的血纤蛋白)、细胞吸引剂和支架试剂(例如纤连蛋白)等等，但并不局限于此。在一个特殊的实施方案中，胶原生物织物或者水凝胶组合物可以用至少一种生长因子进行浸渍，例如成纤维细胞生长因子、上皮细胞生长因子等等。优选地，生物分子为治疗剂。
在一些实施方案中，水凝胶组合物与含有本发明的生物织物的层压制品联合。
水凝胶/胶原生物织物组合物在医学领域中具有用途，包括治疗创伤、烧伤和处理皮肤状况(例如处理瘢痕)，以及用于美容用途(例如美容外科)和作为植入物的任何用途，但并不局限于此。在一些实施方案中，水凝胶/胶原生物织物组合物局部施用于受试者，即施用在皮肤表面上，以例如用于治疗创伤。在其他实施方案中，水凝胶/胶原生物织物组合物可以在受试者的内部使用，例如作为植入物，以便成为体内永久性或半永久性的结构。在一些实施方案中，将水凝胶组合物配制成不可生物降解的。在其他实施方案中，将水凝胶组合物配制成可生物降解的。在一个特殊的实施方案中，将水凝胶组合物配制成可在几天之内降解。在另一个特殊的实施方案中，将水凝胶组合物配制成可在几个月之内降解。
在一些实施方案中，在本发明的胶原生物织物上移植细胞，以致于这些细胞是均一的和汇合的。可以用于在本发明的生物织物上移植的细胞包括干细胞(优选为人干细胞)、人分化的成熟细胞、全能干细胞、多能干细胞、多潜能干细胞、组织特异性干细胞、胚胎样干细胞、定向祖细胞、类成纤维细胞，但并不局限于此。在其他实施方案中，本发明包括在本发明的生物织物上移植特殊种类的祖细胞，包括软骨细胞、肝细胞、造血细胞、胰实质细胞、成神经细胞和肌肉祖细胞，但并不局限于此。
5.2生产胶原生物织物的方法本发明提供了制备本发明的胶原生物织物的方法。特别地，本发明包括制备胶原生物织物的方法，其包括提供含有羊膜和绒毛膜的胎盘；分离羊膜和绒毛膜；和将羊膜进行去细胞化。在一个特殊的实施方案中，该方法此外还需要洗涤和干燥经去细胞化的羊膜。
优选地，胎盘来自人胎盘以在人受试者中使用。在一些实施方案中，本发明包括来自动物物种的胎盘以在人受试者中使用。在其他实施方案中，本发明包括来自动物物种的胎盘以在动物受试者中进行兽医学应用。
在优选的实施方案中，在本发明的方法中使用的胎盘在新生儿分娩之后尽可能快地取得。在另一个优选的实施方案中，胎盘在剖腹产术分娩出正常健康的婴儿之后紧接着取得胎盘。如果在无菌的条件下收集胎盘。在一些实施方案中，胎盘在任何进一步的处理之前从分娩的时候起贮存48小时。在其他实施方案中，胎盘在任何进一步的处理之前从分娩的时候起贮存直至5天。
优选地，将胎盘、脐带和脐带血从分娩或生育室转移至另一个地点例如实验室以便进一步的处理。胎盘优选地转移至无菌的运输装置中，例如无菌的袋或容器中，其可选地是隔热的。在一些实施方案中，将胎盘于室温贮存直至进一步的处理。在其他实施方案中，将胎盘进行冷藏直至进一步的处理，即于大约2-8℃的温度贮存。在其他实施方案中，将胎盘于进一步处理之前在无菌条件下贮存直至5天。在一个最优选的实施方案中，正如本领域熟练技术人员已知的，在无菌条件下操作和处理胎盘。实验室优选地装备HEPA过滤系统(如洁净室分级所定义的，具有1000级或更好)。在一个优选的实施方案中，在使用实验室之前将HEPA过滤系统开启至少1小时以便施行本发明的方法。
在某些实施方案中，去除胎盘中的血，即完全排干生育之后剩余的脐带血。在一些实施方案中，胎盘中血的去除率为70％、80％、90％、95％、99％。
本发明包括在生育之前用本领域熟练技术人员已知的标准技术来对孕妇进行筛选以检查传染病，包括HIV、HBV、HCV、HTLV、梅毒、CMV和其他已知会污染胎盘组织的病毒病原体，但并不局限于此。优选地，用于筛选传染病的方法遵循联邦药品管理局所提出的规章。孕妇可以在生育的一个月之内进行筛选(即取得血液样品用于诊断目的)，优选地在生育的两个星期之内，甚至更优选地在生育的一个星期之内，和最优选地在生育的时候。只使用从这样的供体中收集得到的组织来生产本发明的生物织物，即其母亲经检测对于上面提及的病原体呈阴性或者无反应性。优选地，获得胎盘膜的供体的详细的父亲以及医疗和社会历史资料，包括例如详细的家族史。
使用本领域熟练技术人员已知的标准血清学和细菌学测试来筛选供体。任何鉴定病原体的测定或诊断测试在本发明的方法的范围之内，但是优选的测定为那些联合了高精确度与高处理量能力的测定。在一个特殊的实施方案中，本发明包括用本领域熟练技术人员已知的标准技术来对供体进行筛选以检查抗原和/或抗体。抗原和抗体的非限制性例子包括抗体筛选(ATY)；丙氨酸转氨酶筛选(ALT)；肝炎核心抗体(核酸和ELISA)；乙型肝炎表面抗原；丙型肝炎病毒抗体；HIV-1和HIV-2；HTLV-1和HTLV-2；梅毒测试(RPR)；CMV抗体测试；以及丙型肝炎和HIV测试。所使用的测定可以是基于核酸的测定或者基于ELISA的测定，这些对于本领域熟练技术人员来说是已知的。
本发明此外还包括用本领域熟练技术人员已知的标准技术来检测来自新生儿脐带的血液(见例如，Cotorruelo等人，2002，ClinLab.48(5-6)271-81；Maine等人，2001，Expert Rev.Mol.Diagn.，1(1)19-29；Nielsen等人，1987，J.Clin.Microbiol.25(8)1406-10；所有这些文献在此处以其整体进行引用作为参考)。在一个实施方案中，用本领域熟练技术人员已知的标准技术来检测来自新生儿脐带的血液以检查细菌病原体(包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，但并不局限于此)和真菌。在一个特殊的实施方案中，用本领域熟练技术人员已知的标准技术来测定新生儿脐带血的血型和Rh因子。在另一个实施方案中，用本领域熟练技术人员已知的标准方法从来自新生儿脐带的血液中获得具有差异的CBC。在另一个实施方案中，用本领域熟练技术人员已知的标准方法从来自新生儿脐带的血液中取得需氧细菌培养物。只使用从这样的供体中收集得到的组织来生产本发明的生物织物，即其具有在正常限度内的CBC(例如没有显著的离开正常水平的异常或偏差)，经检测在血清学和细菌学上是阴性的，和经检测对于传染病和污染呈阴性或无反应性。
用于制备本发明的胶原生物织物的范例性方法包括下列步骤。
步骤I。本发明包括处理胎盘膜，以便(可选择地)从胎盘中分离出脐带，和分离羊膜和绒毛膜。在一个优选的实施方案中，在切割胎盘膜之前将羊膜和绒毛膜进行分离。羊膜和绒毛膜的分离优选地从胎盘膜的边缘开始进行。在另一个优选的实施方案中，使用钝器解剖来分离羊膜和绒毛膜，例如用戴着手套的手指。在将羊膜与绒毛膜和胎盘分离之后，例如用剪刀切割下脐带残端，并从胎盘上移开。在某些实施方案中，当不撕裂组织就不可能分离羊膜和绒毛膜时，本发明包括将羊膜和绒毛膜作为一块从胎盘上切割下来，然后将它们剥离开。
然后优选地将羊膜贮存于无菌盐溶液中。在一些实施方案中，无菌盐溶液是缓冲溶液。在一个特殊的优选实施方案中，用于贮存羊膜的无菌盐溶液为0.9％无菌NaCl溶液。优选地，通过于至少4℃的温度进行冷藏来贮存羊膜。在某些实施方案中，羊膜于至少2℃、至少6℃或者直至8℃的温度进行冷藏。在这一点上，如果将羊膜冷藏并保持覆盖有无菌盐水，那么羊膜可以贮存直至5天。优选地，在程序中的下一个步骤之前将分离的羊膜从分娩的时候起冷藏至多72小时。
步骤II。一旦将羊膜与绒毛膜分离，本发明就包括将羊膜进行去细胞化。本发明的方法包括任何本领域熟练技术人员已知的去细胞化方法，但规定用于将本发明的羊膜进行去细胞化的方法不包括任何冷冻羊膜的步骤。在此处使用时，去细胞化是指从本发明的羊膜上去除所有细胞材料和细胞碎片(例如所有可见的细胞材料和细胞碎片)。羊膜的去细胞化确保基本上所有通常与羊膜的胶原基质相联系的细胞都被去除。本发明的羊膜的去细胞化去除了“基本上所有”与胶原基质相联系的细胞，其优选地去除至少90％的细胞，更优选地去除至少95％的细胞，和最优选地去除至少99％的细胞。根据本发明的方法进行去细胞化的羊膜是均一地薄的即厚度为10-40微米，是光滑的(通过触摸测定)和在外观上是清澈的。
在一个优选的实施方案中，本发明的羊膜的去细胞化包括从羊膜的母体侧去除基本上所有细胞材料和细胞碎片，随后从羊膜的胎儿侧去除所有细胞材料和细胞碎片。在一个特殊的实施方案中，本发明的羊膜的去细胞化包括物理性刮削，并联合使用无菌溶液的漂洗。在另一个特殊的实施方案中，羊膜的物理性刮削包括使用无菌的细胞刮刀进行刮削。在另一个特殊的实施方案中，用于在去细胞化期间漂洗羊膜的无菌溶液为水溶液，即含有生理缓冲液或盐溶液的溶液，例如0.9％NaCl溶液。
羊膜的去细胞化包括去除天然存在的细胞以及其他来自羊膜的抗原和细胞碎片，和可选择地进行处理以抑制新的免疫位点的产生。在对于羊膜进行去细胞化的过程中，去除天然的活细胞以及其他可能引起不利的免疫反应的细胞和非细胞结构或成分。根据本发明所使用的去细胞化技术不应当导致羊膜的解剖学的显著破坏，或者改变其结构组分的生物机械特性，即胶原、弹性蛋白和还可能的纤连蛋白的结构和生物化学完整性不受去细胞化的影响。明确地说就是，羊膜的强烈化学处理和蛋白酶处理不在本发明的去细胞化技术的范围之内。
优选地，羊膜的去细胞化包括使用含有去污剂的溶液。根据本发明的方法可以使用的去污剂包括非离子去污剂、Triton X-100、阴离子去污剂或十二烷基硫酸钠，但并不局限于此。在本发明的方法中，去污剂可以单独或联合使用。根据本发明的方法可以使用任何温和的阴离子去污剂，即非腐蚀性的去污剂，其具有6-8的pH和低起泡性。在一个特殊的实施方案中，在羊膜的去细胞化中使用0.01-1％的一水合脱氧胆酸钠。虽然不想被特殊的作用模式所束缚，但是根据本发明的方法，羊膜的去细胞化可能裂解了细胞膜，和有助于从羊膜上去除细胞碎片。可是，应当采取措施来消除羊膜中的任何残留去污剂水平，以便例如避免干扰后来在羊膜上再次移植活细胞。
根本的是在制备本发明的生物织物中限制蛋白酶的活性。添加剂如金属离子螯合剂可形成对于许多蛋白酶来说不利的环境，例如1，10-菲咯啉和乙二胺四乙酸(EDTA)。提供对于蛋白酶如胶原酶来说不最适宜的条件可以有助于在裂解步骤期间保护羊膜组分如胶原不被降解。对于蛋白酶来说不最适宜的条件可以通过这样来获得，即配制低渗裂解溶液以去除或限制溶液中可用的钙和锌离子的数量。许多蛋白酶在存在钙和锌离子的情况下是有活性的，而在没有钙和锌离子的环境中失去许多它们的活性。优选地，低渗裂解溶液会通过选择下列条件来制备，即pH、减少钙和锌离子的可用性、存在金属离子螯合剂和使用对于胶原酶特异的蛋白酶抑制剂，从而该溶液将会最佳地裂解天然存在的细胞，而同时保护下面的羊膜不会不利地被蛋白酶降解。例如，低渗裂解溶液可能包括水的缓冲溶液，其pH为5.5-8，优选为7-8，无钙和锌离子，并含有金属离子螯合剂如EDTA。此外，在用低渗裂解溶液处理羊膜期间，温度和时间参数的控制也可以用于限制蛋白酶的活性。
优选的是，羊膜的去细胞化处理还限制了新免疫位点的形成。因为胶原的酶降解据信导致增加的免疫原性，所以本发明包括用酶例如核酸酶处理羊膜，这些酶在抑制细胞代谢、蛋白质产生和细胞分裂中是有效的，它们将羊膜组分的蛋白酶解降至最低，因此保存了羊膜的下层结构。根据本发明的方法能够使用的核酸酶的例子为那些在消化天然存在的细胞的DNA和RNA中有效的核酸酶，包括外切核酸酶和内切核酸酶。根据本发明的方法能够使用的核酸酶的非限制性例子包括抑制细胞活性的外切核酸酶如DNAase I(SIGMA Chemical Company，St.Louis，Mo.)和RNAase A(SIGMA Chemical Company，St.Louis，Mo.)，以及抑制细胞活性的内切核酸酶如EcoR I(SIGMA ChemicalCompany，St.Louis，Mo.)和Hind III(SIGMA Chemical Company，St.Louis，Mo.)。更优选的是，将选择出的核酸酶在含有离子如镁、钙的生理缓冲溶液中应用，这些离子对于核酸酶的活性是最适宜的。优选地，缓冲溶液的离子浓度、处理温度和处理时间长短由本领域熟练技术人员通过常规的实验来选择，以确保所希望的核酸酶活性水平。缓冲液优选地是低渗的，以促进核酸酶进入细胞内部。
在一个特殊的实施方案中，将本发明的羊膜进行去细胞化包括下列步骤。首先，将羊膜转移至洁净的无菌容器中，并可选择地用无菌水漂洗，然后用无菌纱布进行干燥。然后将羊膜置于无菌托盘上，并且将母体侧朝上。用无菌的细胞刮刀(例如，32cm，PE刀片，PS把手，NalgeNunc International)而通过从羊膜的母体侧物理性地去除所有可见的细胞材料来将羊膜进行部分去细胞化。如果需要，使用无菌水来帮助去除细胞和细胞碎片。在完成羊膜的母体侧的部分去细胞化之后，将羊膜翻转，从而将胎儿侧朝上。用细胞刮刀轻轻地去除胎儿侧上的所有可见的细胞碎片，在这过程中对于羊膜使用最小的压力以防止撕裂。可以使用无菌水来帮助去除细胞和碎片。
在一个实施方案中，将去细胞化的羊膜在进一步处理之前置于无菌容器中，该容器充满了无菌生理溶液例如无菌0.9％NaCl溶液。根据本发明的方法，羊膜的下一步处理步骤应当不迟于将羊膜置于无菌生理溶液中之后2-3小时开始施行。在一个特殊实施方案中，当步骤III紧接着步骤II施行时，不需要将羊膜置于含有无菌溶液的容器中。
在清洁过程期间，羊膜可以用例如无菌解剖刀进行切割，从而对其进行形状修整以便更易清洁，或者去除不能清洁的区域。
步骤III。在去细胞化之后，洗涤羊膜以确保去除可能包括细胞蛋白质、细胞脂类和细胞核酸在内的细胞碎片，以及去除任何细胞外碎片如细胞外可溶性蛋白质、脂类和蛋白聚糖。虽然不想被任何作用机制所束缚，但是去除这种细胞和细胞外碎片减少了羊膜的免疫原性。
一旦将本发明的羊膜进行了去细胞化，就进一步洗涤羊膜以便有效地达到从羊膜的两侧完全地去除所有可见的细胞材料和细胞碎片。该溶液优选为配制成可有效地裂解天然存在的组织细胞的低渗或低离子强度水溶液。这种低渗水溶液可以为去离子水或者低渗水缓冲溶液。此外，低渗水缓冲溶液优选地含有添加剂，这些添加剂提供了对于蛋白酶的活性不最适宜的条件，例如可能由于细胞裂解而释放出的胶原酶。
优选地，将羊膜在去污剂中轻轻地摇动，例如在摇动平台上，从而帮助去细胞化。在某些实施方案中，将羊膜摇动至少15分钟、至少20分钟、至少30分钟或者直至120分钟。在去污剂去细胞化之后，羊膜可以再次如上所述进行物理性去细胞化；当需要时可以重复物理性和去污剂去细胞化步骤，只要保持羊膜的完整性，直至没有剩下可见的细胞材料和细胞碎片。
在一个特殊的实施方案中，羊膜的洗涤包括下列步骤将去细胞化的羊膜置于无菌容器中，然后用去细胞化溶液以足够覆盖羊膜的数量充满容器；然后将含有羊膜和去细胞化溶液的容器置于摇动平台上(例如100型，VWR Scientific Products Corp.，P.O.Box 640169，Pittsburgh，PA 15264-0169)。然后将去细胞化溶液中的羊膜在摇动平台上摇动15-120分钟。在摇动步骤之后，将羊膜从容器中取出，并置于充满无菌溶液如0.9％NaCl溶液的洁净的无菌托盘中。使用新的无菌细胞刮刀来去除残留的去细胞化溶液，并从羊膜的两侧去除任何剩余的细胞材料。该步骤可以按需要重复多次，以便从羊膜的两侧去除所有可见的残留细胞材料。
在某些实施方案中，羊膜在去细胞化步骤之后紧接着(即在30分钟内)进行干燥。可选择地，当不是立即进行进一步的处理时，羊膜可以在干燥之前冷藏直至28天，例如贮存于2-8℃的温度。当去细胞化的羊膜的贮存时间超过3天但少于28天时，覆盖羊膜的无菌溶液优选地定时进行更换，例如每1-3天更换一次。
在某些实施方案中，当羊膜在洗涤之后未进行冷藏时，将羊膜在开始施行制备的步骤IV之前洗涤至少3次。在其他实施方案中，当羊膜已经进行了冷藏和无菌溶液已经更换过1次时，将羊膜在开始施行制备的步骤IV之前洗涤至少2次。在其他实施方案中，当羊膜已经进行了冷藏和无菌溶液已经更换过2次或更多次时，将羊膜在开始施行制备的步骤IV之前洗涤至少1次。
在一个特殊的实施方案中，去细胞化的羊膜在无菌条件下贮存，并且不施行进一步的处理，即没有干燥。在开始施行步骤IV之前，根本的是评估所有的细菌学和血清学测试以确保所有的测试是阴性的。
步骤IV。本发明的方法的最后一个步骤包括干燥本发明的去细胞化的羊膜，从而生产胶原生物织物。可以使用任何可干燥羊膜从而产生平且干的胶原片的方法。可是，羊膜优选地在真空中干燥。
在一个特殊的实施方案中，对于干燥本发明的去细胞化的羊膜的范例性方法包括下列步骤装配去细胞化的羊膜以便干燥。从无菌溶液中取出去细胞化的羊膜，并轻轻地挤压出过量的液体。然后例如在托盘上将去细胞化的羊膜轻轻地进行伸展直至其变平，在这过程中胎儿侧朝下。然后将去细胞化的羊膜翻转，从而胎儿侧朝上，并置于干燥架上，优选为塑料网状干燥架(例如Quick CountPlastic Canvas，Uniek，Inc.，Waunakee，WI)。在其他实施方案中，干燥架可以为耐高压加热的不锈钢网。在一个最优选的实施方案中，大约0.5cm的羊膜与干燥架的边缘重叠。在某些实施方案中，将伸展至干燥架之外的重叠的羊膜包裹住架的顶部，例如用夹子或止血钳。一旦将羊膜置于干燥架上，就将无菌纱布置于热干燥器(凝胶干燥器)(例如583型，Bio-RadLaboratories，200Alfred Nobel Drive，Hercules，CA 94547)的干燥平台上，从而覆盖住比置于塑料网状干燥架上的羊膜稍大的区域。优选地，纱布层的总厚度不超过一个折叠成4×4的纱布的厚度。可以使用任何适合于干燥片样材料的热干燥装置。将干燥架置于干燥平台上的纱布之上，从而塑料架的边缘伸出纱布边缘之外，优选地伸出0.1-1.0cm，更优选地伸出0.5-1.0cm。在一个最优选的实施方案中，将具有羊膜的干燥架置于无菌纱布之上，并且羊膜的胎儿侧朝上。在一些实施方案中，将另一个塑料架网置于羊膜之上。网架和在其中干燥的膜的图像显示在图4中。在另一些实施方案中，将薄塑料片(例如SW 182、透明的PVC、AEP Industries Inc.，SouthHackensack，NJ 07606)或生物相容的硅氧烷置于膜覆盖的网上，从而片正好延伸至所有边缘之外。在该实施方案中，第二个网架是不需要的。
在一个可选择的实施方案中，将羊膜置于一个或多个无菌Tyvek材料片(例如用于医学包装的Tyvek片，Dupont Tyvek，P.O.Box80705，Wilmington，DE 19880-0705)上，可选择地用一个Tyvek片置于膜上(在放置塑料膜之前)。该可选择的方法将会产生更光滑形式的生物织物(即没有顺着和垂直于材料的轴的不同纤维密集区域的图案)，这种生物织物可能对于某些应用是有利的，例如如此处所述用作用于细胞扩展的基质。
羊膜的干燥。在一个优选的实施方案中，本发明包括在真空中加热干燥本发明的羊膜。虽然真空中的干燥可以在大约0℃-大约60℃的任何温度来完成，但是羊膜优选地于大约35℃-大约50℃进行干燥，最优选为大约50℃。应当注意，将会预期到胶原在50℃以上的温度有一些降解。干燥温度优选地进行设置，并通过使用采用扩展性探针的经校准的数字温度计来进行校验。优选地，将真空压力设置为大约-22英寸Hg。继续干燥步骤，直至例如用水分分析仪测得羊膜的胶原基质含有低于3-12％的水。为了达到这一点，羊膜可以进行加热-真空干燥例如大约60分钟，从而获得脱水的羊膜。在一些实施方案中，将羊膜干燥大约30分钟-2小时，优选为大约60分钟。虽然不想被任何作用机制所束缚，但是据信低热环境联合真空压力使得羊膜能够达到脱水的状态而不会让胶原变性。
在根据本发明完成干燥过程之后，在真空泵运转的情况下将羊膜冷却大约2分钟。
羊膜的包装和贮存。一旦如所述将羊膜根据本发明的方法进行干燥，就将膜轻轻地提离干燥架。“提起”膜可以包括下列步骤当泵仍然在运转时，将塑料膜从边角开始轻轻地从羊膜上去除，同时压住羊膜；将带有羊膜的框架提离干燥平台，然后置于切割板上，并让羊膜一侧朝上；进行切割，沿着离框架边缘1-2mm的边缘进行切割；然后将羊膜剥离框架；和切开成由其随后的用途所决定的合适大小。优选地，在这一阶段的羊膜的操作通过使用无菌手套来进行。
将羊膜置于无菌容器如揭片袋中，并密封。如上所述，根据本发明的方法生产出的生物织物可以于室温贮存延长的一段时间。
在可选择的实施方案中，本发明提供了制备含有绒毛膜的胶原生物织物的方法。期望上述方法将可应用于制备含有绒毛膜的生物织物的方法。在一个特殊的实施方案中，本发明包括制备胶原生物织物的方法，其包括提供含有羊膜和绒毛膜的胎盘；分离羊膜和绒毛膜；和将绒毛膜进行去细胞化。在一个特殊的实施方案中，该方法此外还需要洗涤和干燥去细胞化的绒毛膜。
5.2.1制备三维支架和层压制品的方法本发明提供了制备含有本发明胶原生物织物的三维支架、三维构造和层压制品的方法。
在一些实施方案中，本发明提供了制备羊膜层压制品的方法，其包括提供含有羊膜和绒毛膜的胎盘，优选为人胎盘；用此处公开的方法分离羊膜和绒毛膜；用此处公开的方法将羊膜进行去细胞化；用此处公开的方法洗涤去细胞化的羊膜至少一次；将至少两层去细胞化的羊膜以相互接触的方式层叠在一起，从而形成羊膜层压制品；和用此处公开的方法干燥羊膜层压制品。
可选择地，在另一个实施方案中，制备羊膜层压制品的方法包括，干燥至少两层根据本发明的方法制备得到的羊膜，和将至少两层羊膜以相互接触的方式层叠在一起，从而形成羊膜层压制品。
在一些实施方案中，根据本发明的方法生产出的羊膜层可以在存在粘合剂的条件下以相互接触的方式放置在一起，从而形成羊膜层压制品。根据本发明的方法和组合物所使用的粘合剂可以为任何本领域熟练技术人员已知的生物胶合剂，优选为生物相容的胶合剂，其包括天然胶合剂如纤连蛋白、血纤蛋白以及合成的胶合剂，但并不局限于此。在其他实施方案中，将根据本发明的方法制备得到的羊膜层相互进行交联以形成羊膜层压制品。任何本领域熟练技术人员已知的交联试剂和方法在本发明的范围之内，包括化学交联、肽交联、UV交联、放射交联、纤连蛋白交联、血纤蛋白原交联、水凝胶交联，但并不局限于此。在其他实施方案中，根据本发明的方法生产出的羊膜层压制品不含有粘合剂。
5.3胶原生物织物的贮存和操作本发明包括将本发明的胶原生物织物作为脱水的片状物于室温(例如25℃)进行贮存。在某些实施方案中，本发明的胶原生物织物可以于至少10℃、至少15℃、至少20℃、至少25℃或至少29℃的温度进行贮存。优选地，本发明的胶原生物织物不进行冷藏。在一些实施方案中，本发明的胶原生物织物可以于大约2-8℃的温度进行冷藏。在其他实施方案中，本发明的胶原生物织物可以于任何上面确定的温度贮存延长的一段时间。在一个最优选的实施方案中，本发明的生物织物在无菌和非氧化条件下进行贮存。根据本发明的方法生产出的生物织物可以于任何指定的温度贮存12个月或更长，而生物化学或结构完整性没有变化(例如没有降解)，并且胶原生物织物的生物化学或生物物理学特性没有任何改变。根据本发明的方法生产出的生物织物可以贮存几年，而生物化学或结构完整性没有变化(例如没有降解)，并且胶原生物织物的生物化学或生物物理学特性没有任何改变。期望根据本发明的方法制备得到的本发明的生物织物会无限期地保持着。生物织物可以贮存在任何适合于长期贮存的容器中。优选地，本发明的胶原生物织物贮存在无菌的双揭片袋包装中。
本发明包括在其干燥状态操作本发明的胶原生物织物。在一个特殊的实施方案中，将胶原生物织物在使用之前进行修整，例如在用作外科移植物之前。本发明包括任何与其用途相适应的本发明生物织物的维数，这是由本领域的熟练技术人员来确定的。在一些实施方案中，本发明包括为1×2cm、2×3cm、4×4cm、5×5cm或6×8cm的胶原生物织物。可以将本发明的生物织物切割成任何所需的大小，该大小位于羊膜的大小的限制之内。
本发明的胶原生物织物的表面方向可以通过肉眼来鉴定。本发明的胶原生物织物具有“网格”图案，这使得本领域熟练技术人员能够用肉眼来鉴定母体和胎儿侧的表面。在一个特殊的实施方案中，胶原生物织物的表面方向在放大的条件下进行鉴定。本领域熟练技术人员将会意识到，胶原生物织物的胎儿侧可以通过其凹陷的即下凹的网格图案来进行鉴定。相反地，母体侧可以通过其凸起的即升高的网格图案来进行鉴定。
本发明的胶原生物织物需要最少的使用之前的准备时间。在一个优选的实施方案中，本发明的胶原生物织物可在5分钟或更少时间之内、在10分钟或更少时间之内、在15分钟或更少时间之内准备好进行使用。本发明的胶原生物织物在使用例如用作外科移植物之前的准备时间包括通过再水化来活化脱水的胶原生物织物。在一些实施方案中，本发明的胶原生物织物当在外科部位上时进行水化。在其他实施方案中，本发明的胶原生物织物在皿中于无菌条件下进行水化。本发明包括用无菌生理缓冲液来水化本发明的胶原生物织物。在一个特殊的实施方案中，本发明包括用无菌盐溶液如0.9％无菌NaCl溶液来水化本发明的胶原生物织物。在一些实施方案中，无菌盐溶液是缓冲液。在某些实施方案中，本发明的胶原生物织物的水化需要至少2分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟或至少20分钟。在一个优选的实施方案中，本发明的胶原生物织物的水化在5分钟之内完成。在另一个优选的实施方案中，本发明的胶原生物织物的水化在10分钟之内完成。在另一个实施方案中，本发明的胶原生物织物的水化不需要超过10分钟。
一旦将本发明的胶原生物织物进行水化以便使用例如用作外科移植物，根据本领域熟练技术人员的测定，其相对于本领域中的羊膜具有增强的可缝合性。本发明的胶原生物织物不像本领域中的羊膜一样容易撕裂，其也不像本领域中的羊膜一样易碎。本发明包括能够有效地缝合的胶原生物织物。
5.3.1灭菌本发明的生物织物的灭菌优选地使用本领域熟练技术人员已知的方法通过电子束辐射来进行，例如Gorham，D.Byrom(编者)，1991，Biomaterials，Stockton Press，New York，55-122。任何足够杀死至少99.9％的细菌或其他潜在污染生物的辐射剂量在本发明的范围之内。在一个优选的实施方案中，使用至少18-25kGy的剂量来完成本发明的生物织物的最终灭菌。可是，本发明的生物织物的灭菌不包括在抗生素或甘油中的贮存。
5.4使用本发明的胶原生物织物的方法本发明的胶原生物织物在内科和外科领域有着许多的应用，这部分地是由于其与本领域中所使用的传统膜相比的物理特性，例如生物机械强度、屈曲性、可缝合性和低免疫原性。例如期望本发明的胶原生物织物对于在现有技术的膜上的引导性组织再生具有增强的治疗效用，这些膜例如为合成的不可再吸收性PTFE膜如Goretex？；合成的可再吸收性膜，其由乙交酯和丙交酯共聚物所形成；WO-88/08305、DE-2631909、U.S.专利号5,837,278中所公开的膜。
制备本发明的胶原生物织物的方法确保保留了生物织物的三级和四级结构，因此使得该生物织物对于其在内科和外科领域中的想要的用途来说是理想的。正如下面详细描述的，本发明提供了这样的胶原生物织物，即该胶原生物织物的物理特性使得其适合于在多种内科和牙科应用中使用，包括血管修复、子宫修复、腱的替换、角膜的替换、人造皮肤、牙周病的治疗和伤口愈合，但并不局限于此。依赖于其想要的用途，本发明包括使用胶原生物织物作为二维的膜，例如可以制作形成管状容器的膜；作为三维的支架，例如植入物；或者作为一维的纤维。
5.4.1使用本发明的胶原生物织物进行治疗的方法5.4.1.1处理皮肤状况的方法人皮肤是表皮和真皮的复合材料。表皮的上面部分是角质层，其是皮肤最硬的一层，以及是受周围环境影响最大的一层。在角质层的下面是表皮的内部。在表皮的下面是乳突状真皮，其由相对疏松的结缔组织组成，这些结缔组织决定了皮肤的微起伏。位于乳突状真皮之下的网状真皮是有间隙地组织在一起的紧密结缔组织。网状真皮还与粗糙的皱纹有关。在真皮之下是皮下层。
皮肤的主要功能包括保护、排泄、分泌、吸收、温度调节、色素形成、蓄积、感官知觉和免疫过程的调节。这些功能不利地受到由于老化和过度阳光暴露所引起的皮肤结构变化的影响。与皮肤老化相关的生理性变化包括屏障功能的削弱和降低的表皮细胞的更新率，例如见Cerimele，D.等人，1990，Br.J.Dermatol.，122Suppl.35，13-20页。现有技术中的方法和组合物对于改善皮肤状况例如改善皮肤的弹性和柔软性或者去除皱纹取得了有限的成功。
本发明的胶原生物织物具有医疗以及美容的应用。本发明的胶原生物织物在处理皮肤状况中具有临床和治疗效用，包括皮肤损伤、老化的皮肤、皱纹、细纹、变薄、降低的皮肤弹性、粗糙的皮肤、先天的和变性的皮肤状况、VII型胶原缺乏以及阳光损害的皮肤。在某些实施方案中，本发明的胶原生物织物可以用作用于皮肤状况如痤疮瘢痕、眉间沟、切除性瘢痕或者任何其他本领域中已知的软组织缺损的皮下植入物。本发明的胶原生物织物在处理与皮肤老化相关的变化中具有临床和治疗效用。在某些实施方案中，本发明的胶原生物织物对于改善皮肤皱纹和/或其他状况如皮肤弹性和柔软性具有效用。本发明的胶原生物织物可以用作用于处理皮肤状况的植入物、层压制品或三维卷缩的形式。期望本发明的胶原生物织物相对于本领域中已知用于处理这种皮肤状况的方法例如U.S.专利号5,972,999、5,418,875、5,332,579、5,198,465具有增强的临床效用，这部分地是由于其稳定性，这可能提供了更长的持续效应。
在优选的实施方案中，本发明的胶原生物织物进一步用一种或多种本领域中已知用于处理皮肤状况的试剂来加以补充。这种试剂的例子包括维生素、矿物质、基于儿茶素的制剂、N-乙酰葡糖胺和葡糖胺(见例如，Neldner，1993，Amer.Acad.Derm.Annl.Mtg.Wash.DC.；Lubell 1996，Cosmetic Dermatol，9(7)58-60；Swaine等人，1995，J.Am.Board of Family Practice，8(3)206-16；Shan等人，1994，Kidney International，46(2)388-95；所有这些文献在此处以其整体进行引用作为参考)，但并不局限于此。
本发明的胶原生物织物可以用任何可用于处理皮肤状况的生物分子进行浸渍，包括抗生素(例如克林霉素、二甲胺四环素、强力霉素、庆大霉素)、激素、生长因子、抗肿瘤剂、抗真菌剂、抗病毒剂、疼痛药物、抗组胺剂、抗炎剂、抗感染剂(包括银(例如银盐包括硝酸银和磺胺嘧啶银，但并不局限于此)、元素银、抗生素、杀菌的酶(例如溶菌酶)，但并不局限于此)、伤口愈合剂(例如细胞因子包括PDGF、TGF，但并不局限于此；胸腺素)、作为伤口愈合剂的透明质酸、伤口封闭剂(例如有或没有凝血酶的血纤蛋白)、细胞吸引剂和支架试剂(例如纤连蛋白)等等，但并不局限于此。在一个特殊的实施方案中，胶原生物织物可以用至少一种生长因子进行浸渍，例如成纤维细胞生长因子、上皮细胞生长因子等等。生物织物还可以用小分子进行浸渍，例如小有机分子如特殊生物化学过程的特异性抑制剂，如膜受体抑制剂、激酶抑制剂、生长抑制剂、抗癌药物、抗生素等等。
5.4.1.2创伤和烧伤与本领域中已知的其他生物材料例如U.S.专利号3,157,524、4,320,201、3,800,792、4,837,285、5,116,620中所描述的那些相比，期望本发明的胶原生物织物作为用于促进硬组织和/或软组织修复的创伤敷料具有增强的临床效用，这部分地是由于其物理特性。因为本发明的胶原生物织物保持了胶原的天然四级结构，所以其造成增强了组织通过细胞迁移而向内生长进胶原基质的间隙中。本发明的生物织物使得细胞能够粘附在胶原基质上，并生长进胶原基质中，和使得细胞能够合成它们的大分子。细胞由此产生出能够让新组织生长的新的基质。这种细胞生长没有在其他已知的胶原形式例如纤维、毛状物和可溶性胶原上观察到。
在一些实施方案中，本发明包括通过将本发明的胶原生物织物直接置于受试者的创伤部位的皮肤上即角质层上来治疗创伤，因此例如用粘合带覆盖伤口。在其他实施方案中，本发明包括使用本发明的胶原生物织物作为植入物例如作为皮下植入物来治疗创伤。
本发明包括通过添加能够促进组织向内生长进本发明的胶原生物织物中的大分子来增加伤口愈合率。这种大分子包括透明质酸、纤连蛋白、层粘连蛋白和蛋白聚糖(见例如，Doillon等人(1987)Biomaterials 8195-200；以及Doillon和Silver(1986)Biomaterials 73-8)，但并不局限于此。
本发明此外还包括在此处描述的本发明的胶原生物织物中掺入药理活性试剂以便如在5.4.2.7节中用于将药物递送给皮肤，和掺入任何上述的生物分子，药理活性试剂包括血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、转化生长因子-β、血管生成因子、抗生素、抗真菌剂、杀精剂、激素、酶、酶抑制剂，但并不局限于此。药理活性试剂优选地以生理有效剂量进行提供。
在一些实施方案中，进一步于应用于创伤部位之前在胶原生物织物上移植活细胞，包括异源干细胞、干细胞和自身成熟细胞，但并不局限于此。
本发明的胶原生物织物对于治疗伤口感染是特别有用的，例如随后出现外科或外伤性伤口的贯穿的伤口感染。在一个特别的实施方案中，胶原生物织物用治疗有效剂量的用于治疗伤口感染的试剂进行浸渍，包括抗生素、抗微生物剂和抗菌剂，但并不局限于此。本发明的胶原生物织物在治疗由任何本领域中已知的微生物所引起的伤口感染之中具有临床和治疗效用，例如源自人体内的感染伤口的微生物，这是一个已知的病原生物库，或者源自环境来源的感染伤口的微生物。其在伤口中的生长可以被本发明的方法和组合物所减少或防止的微生物的非限制性例子为金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(St.epidermis)、β-溶血性链球菌(Streptococcus)、大肠杆菌(E.coli)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)物种和假单胞菌属(Pseudomonas)物种，和在厌氧细菌中为韦氏梭菌(Clostridiumwelchii)或(tartium)，它们是造成气性坏疽的原因，主要是在深的外伤性伤口中。
在其他实施方案中，本发明的胶原生物织物用于创伤治疗，包括表皮伤口、皮肤伤口、慢性伤口、急性伤口、外部伤口、内部伤口(例如胶原生物织物可以在外科手术期间包裹在吻合部位的周围，以便防止血从缝合线中渗漏出来，和防止身体与缝合材料形成粘连)、先天性伤口(例如营养不良性大疱性表皮松解症)，但并不局限于此。特别地，胶原生物织物在治疗压力性溃疡(例如褥疮性溃疡)中具有增强的效用。压力性溃疡常常出现在长期卧床休息的患者中，例如四肢瘫痪患者和截瘫患者，他们由于局部压力的影响而遭受皮肤损失。结果造成的压力性溃疡表现出真皮糜烂以及表皮和皮肤附属物的损失。
本发明的胶原生物织物还可以用于治疗烧伤，包括一度烧伤、二度烧伤(部分厚度烧伤)、三度烧伤(完全厚度烧伤)、烧伤伤口的感染、切除的和未切除的烧伤伤口的感染、移植伤口的感染、供体部位的感染、先前移植的或愈合的烧伤伤口或者皮肤移植供体部位的上皮损失以及烧伤伤口脓疱病，但并不局限于此。
5.4.1.3组织工程本发明包括使用本发明的胶原生物织物作为用于运送培养皮肤细胞的载体，例如作为对于上皮细胞生长和分化的支持物。在某些实施方案中，为了在生物织物上移植细胞以形成组织和/或类器官(即在表面外观或结构上与身体的任何器官或腺体类似)，在生物织物上再次移植这种新细胞的过程期间，生物织物可以用细胞粘着因子进行处理以增强细胞与生物织物的附着。在某些实施方案中，细胞附着程度是通过用血清处理羊膜来增加的，例如人血清或胎牛血清。在其他实施方案中，细胞附着程度是通过用纤连蛋白处理羊膜来增加的。
本发明的胶原生物织物可以用于引导性组织再生技术，例如再生或替换有病的或受损的组织。本发明包括本发明的生物织物的使用，即将生物织物直接植入于治疗部位，或者形成假体装置。本发明的胶原生物织物在任何情况下都是特别有用的，例如在外科手术尤其是口部或牙科外科手术之后(在5.4.2.2节中有更详细的描述)，其中有望获得提高的伤口愈合和/或真皮替换。本发明的胶原生物织物在引导性组织再生中的效用部分地是由于其能够提供这样的条件，即这些条件防止了其他组织向内生长进需要再生的区域中。
例如，在由于腐烂或疾病而去除了牙根的实质部分的地方，希望出现健康的骨的再生以替换去除的骨组织。可是，已经发现由于去除了骨而留下的空腔很快被结缔组织充满，而且这种结缔组织的向内生长有效地防止了骨再生。为了防止这种向内生长，可以将本发明的胶原生物织物通过外科手术插入从而环绕在伤口空腔的边缘。生物织物防止或阻止伤口空腔被不想要的细胞类型侵入，因此能够让首选的细胞生长入空腔中，由此愈合了伤口。
在一些实施方案中，胶原生物织物用作用于眼表面重建的移植物，例如在患有Stevens Johnson综合征、化学灼伤之后的继发性边缘干细胞缺乏的受试者中，或者在具有化学灼伤和/或热灼伤的受试者中。期望本发明的生物织物例如通过促进上皮形成而具有增强的临床效用。期望本发明的生物织物相对于在本领域中用于组织工程目的的羊膜具有增强的临床效用，见例如，Gomes等人，2003，Opthalmology，119166-73；Ti等人，2001，Opthalmology，1081209-1217；Meller等人，2000，Opthalmology，107980-9；Gris等人，2002，Opthalmology，109508-12；Koizumi等人，2000，Invest.Opthal.and Visual Science，412506-13；Pires等人，1999，Arch.Opthalmol.1171291-7；Tseng等人.，1998，Arch.Opthalmol.116431-441；Heiligenhaus等人，2001，Invest.Opthal.andVisual Science 421969-74；Anderson等人，2001，Br.J.Opthalmol.85567-75。
本发明包括在胶原生物织物上移植活细胞，包括成熟组织细胞、自身细胞和干细胞，但并不局限于此。在本发明的方法中使用的干细胞可以为全能细胞、多能细胞或分化的组织特异性细胞。在本发明的方法中使用的干细胞可以通过本领域熟练技术人员已知的标准方法来获得。优选地，根据于2002年2月13日提交的U.S.申请号10/74,976中所公开的方法来收集干细胞，在此处引用该文献作为参考。
本发明包括将本发明的胶原生物织物(例如三维支架)用于形成生物工程改造的组织和类器官，包括血管、心脏瓣膜、肝、胰腺和韧带，但并不局限于此。虽然不想被任何作用机制所束缚，但是本发明的生物织物作为生物工程改造的组织的效用部分地是由于其在促进血液凝固中的止血特性。本发明的生物织物对于血管假体和作为血管外科中的移植物是特别有用的。本发明的生物织物可以例如用作在血管外科程序期间环绕在血管(或者血管与移植物)吻合部位上的覆盖物，以防止血从缝合线中渗漏出来，和防止身体与缝合材料形成粘连。
5.4.2在外科程序中使用胶原生物织物的方法本发明包括使用本发明的胶原生物织物作为外科移植物。本发明包括含有本发明的胶原生物织物或其层压制品的外科移植物。本发明此外还包括制备和使用外科移植物的方法。
在一些实施方案中，本发明包括在外科程序中使用外科移植物的方法，从而将外科移植物直接应用于受试者的外科部位，例如内部部位或外部部位。在一些实施方案中，在外科程序期间使用胶原生物织物作为外科移植物，这在下面会更详细地进行公开，以便例如防止血从缝合线中渗漏出来，和防止身体与缝合材料形成粘连。在其他实施方案中，外科移植物用作吻合部位上的覆盖物，例如在GI外科手术期间GI管道的吻合部位，以便防止肠液和胆汁从缝合线中渗漏出来，和防止身体与缝合材料形成粘连。
本发明包括使用生物织物作为覆盖烧伤或经过外科手术的皮肤伤口的移植物或敷料；防止在所有腹膜内外科手术中或者在其他于覆盖腹部、胸腔和心包的浆膜面上的重建中出现粘连；重建衬在口腔和鼻腔、呼吸道、胃肠道和泌尿生殖道内的所有粘膜面；作为支持脑外科中的硬脑膜修复的基质；作为促进在中枢和外周神经系统中的神经再生的基质；和重建软组织以防止在关节或腱修复中的粘连。
本发明包括用一种或多种生物分子浸渍本发明的外科移植物，优选为治疗剂，这取决于特殊的想要的外科用途。这种生物分子包括抗生素(例如克林霉素、二甲胺四环素、强力霉素、庆大霉素)、激素、生长因子、抗肿瘤剂、抗真菌剂、抗病毒剂、疼痛药物、抗组胺剂、抗炎剂、抗感染剂(包括银(例如银盐包括硝酸银和磺胺嘧啶银，但并不局限于此)、元素银、抗生素、杀菌的酶(例如溶菌酶)，但并不局限于此)、伤口愈合剂(例如细胞因子包括PDGF、TGF，但并不局限于此；胸腺素)、作为伤口愈合剂的透明质酸、伤口封闭剂(例如有或没有凝血酶的血纤蛋白)、细胞吸引剂和支架试剂(例如纤连蛋白)等等，但并不局限于此。在一个特殊的实施方案中，胶原生物织物可以用至少一种生长因子进行浸渍，例如成纤维细胞生长因子、上皮细胞生长因子等等。生物织物还可以用小有机分子进行浸渍，例如特殊生物化学过程的特异性抑制剂，如膜受体抑制剂、激酶抑制剂、生长抑制剂、抗癌药物、抗生素等等。
本发明此外还包括在本发明的外科移植物上移植活细胞，包括干细胞、全能干细胞、多能干细胞、多潜能干细胞、组织特异性干细胞、胚胎样干细胞、定向祖细胞、类成纤维细胞，但并不局限于此。在其他实施方案中，本发明包括在本发明的外科移植物上移植特殊种类的祖细胞，包括软骨细胞、肝细胞、造血细胞、胰实质细胞、成神经细胞和肌肉祖细胞，但并不局限于此。
5.4.2.1眼科学本发明的胶原生物织物在治疗眼相关疾病或病症中具有临床和治疗效用。本发明的胶原生物织物对于治疗和/或预防眼表面疾病是特别有用的，包括角膜溃疡/穿孔、大泡性角膜病变、眼部皮样囊肿/肿瘤、原发性翼状胬肉、持续性角膜上皮缺损、急性和慢性碱灼伤、热灼伤、无虹膜、特应性角膜炎、特发性边缘干细胞缺乏、角膜翳、新血管生成、类风湿性角膜融化、眼瘢痕性类天疱疮、渗漏性滤过性水泡、暴露的Ahmed瓣膜管、具有随后的睑球粘连的沙雷氏菌(Serratia)蜂窝组织炎、急性和慢性Stevenson Johnson综合征，但并不局限于此。本发明的胶原生物织物在下列应用中是特别有效的，即促进具有溃疡的持续性角膜上皮缺损的愈合；促进上皮形成；促进上皮细胞和干细胞的生长；减轻炎症和疼痛、抑制血管生成和瘢疤形成；上皮表型的恢复；和作为在翼状胬肉的“裸露巩膜”消除期间的结膜自体移植物的可选择替代的基质。
本发明包括用本发明的胶原生物织物进行移植以治疗症状性大泡性角膜病变，优选是在人中，最优选是在具有差的视力的人中。期望本发明的生物织物相对于本领域中用于治疗症状性大泡性角膜病变(明确地说就是结膜瓣构建)的其他标准程序来说具有增强的治疗和临床效用。相对于本领域中用于治疗症状性大泡性角膜病变(明确地说就是结膜瓣构建)的其他标准程序来说，用本发明的生物织物进行移植的优点包括减轻疼痛、容易实施、美容上更加能够接受的外观以及减少并发症如上睑下垂和边缘干细胞缺乏，但并不局限于此。本发明的胶原生物织物提供了改良的结膜瓣的可选择替代物以促进具有溃疡的角膜上皮缺损的愈合；改进的用于对于睑球粘连消散的结膜表面重建的方法；改进的用于从结膜或角膜表面外科去除肿瘤、损伤或瘢痕组织的方法；改进的用于通过矫正疱疹的渗漏而进行青光眼外科手术的方法；在翼状胬肉的“裸露巩膜”消除期间的结膜自体移植物的可选择替代的改良基质；和用于防止带状角膜病变的复发。
本发明还提供了生物织物用作眼外科移植物的用途。本发明包括移植物的制备，这些移植物含有进一步含有一种或多种治疗剂的本发明的生物织物，当给予受体时可以将这些治疗剂递送给受体。治疗剂的例子包括匹鲁卡品、红霉素、庆大霉素、万古霉素、妥布拉霉素、奈替米星、硫酸多粘菌素B、三甲氧苄二氨嘧啶、两性霉素B、抗癌剂、抗生素、环孢菌素等等，但并不局限于此。
本发明的胶原生物织物还在减少由于受激准分子激光器光折射/治疗角膜切除术所引起的角膜模糊中具有效用。
用于眼科程序的本发明的胶原生物织物可以多种构造进行提供，包括插入物、防护物、颗粒、凝胶、含水注射剂、海棉状物、薄膜，但并不局限于此。
本领域熟练技术人员已知的用于眼科移植物的常规外科技术包括在本发明的范围内。
使用本发明的胶原生物织物作为眼外科移植物的范例性方案可以包括下列步骤去除有病的角膜和/或结膜组织；在无菌条件下提供根据本发明的方法制备得到的外科移植物，并通过自由的技术进行修整以覆盖角膜上皮或裸露的巩膜。通过缝合将移植物锚定于裸露的巩膜与结膜的连接处；进行主要的缝合；然后使用中断的缝合来形成移植物表面上的张力平均分布；以致于避免在移植物与受体巩膜或角膜之间出现任何空隙。在移植物和宿主的连接处，移植物的游离边缘必须保持在受体结膜之下，以允许宿主上皮于与供体组织的连接点处在基底层上滑动，否则移植物会被受体挤压出来。
5.4.2.2牙科本发明的胶原生物织物在牙科学中具有特别的效用，例如牙周外科、用于牙周组织再生的引导性组织再生、引导性骨再生和牙根覆盖。本发明包括使用本发明的胶原生物织物来促进牙周骨内缺损的再生，包括匹配性两侧牙周缺损、齿间骨内缺损、3层壁深的骨内缺损、2层壁深的骨内缺损以及骨内缺损2和3，但并不局限于此。期望本发明的胶原生物织物相对于本领域中已知的其他技术来说在治疗牙周骨内缺损中具有增强的治疗效用和提高的临床参数，本领域中已知的其他技术例如为使用交联的胶原膜，例如在下列文献中公开的那些，即Quteish等人，1992，J.Clin.Periodontol.19(7)476-84；Chung等人，1990，J.Periodontol.61(12)732-6；Mattson等人，1995，J.Periodontol.66(7)635-45；Benque等人，1997，J.Clin.Periodontol.24(8)544-9；Mattson等人，1999，J.Periodontol.70(5)510-7。通过使用本发明的胶原生物织物而得到改善的参数的例子包括斑块和齿龈指数评分、探测袋深度、探测附着深度以及分叉牵涉和骨缺损的分类，这些对于本领域熟练技术人员来说是已知的，但并不局限于此。
本发明还包括在治疗II类分叉缺损中使用本发明的生物织物，包括两侧缺损、成对的口腔II类下颌臼齿分叉缺损和两侧下颌分叉缺损，但并不局限于此。本发明的胶原生物织物在治疗II类分叉缺损中的效用可以部分地用其能够再生出在分叉缺损中丧失的牙周组织的能力来解释。期望本发明的生物织物相对于本领域中用于治疗II类分叉缺损的胶原膜来说具有增强的治疗和临床效用，本领域中用于治疗II类分叉缺损的胶原膜例如为在下列文献中公开的那些，即Paul等人，1992，Int.J.Periodontics Restorative Dent.12123-31；Wang等人，1994，J.Periodontol.651029-36；Blumenthal，1993，J.Periodontol.64925-33；Black等人，1994，J.Periodontol.54598-604；Yukna等人，1995，J.Periodontol.67650-7。
本发明此外还包括在牙根覆盖程序中使用本发明的生物织物。本发明的生物织物在牙根覆盖中的效用可以解释为这是部分地由于其能够基于引导性组织再生的原理而替换丧失的、损伤的或有病的牙龈组织。由于上面说到的原因，期望本发明的生物织物与本领域中传统用于牙根覆盖的胶原膜相比具有增强的临床效用，本领域中传统用于牙根覆盖的胶原膜例如为在下列文献中公开的那些，即Shieh等人，1997，J.Periodontol.68770-8；Zahedi等人，1998，J.Periodontol.69975-81；Ozcan等人，1997，J.Marmara Univ.Dent.Fa.2588-98；Wang等人，1997，J.Dent.Res.78(Spec Issue)119(Abstr.106)。
本发明此外还包括在患有牙周病的受试者中使用胶原生物织物，包括牙周炎和牙龈炎，但并不局限于此。本发明的生物织物还具有附加于刮治和根面平整程序的临床效用。本发明包括用本发明的胶原生物织物治疗患有牙周病的受试者。使用本发明的胶原生物织物在受试者中治疗牙周病的范例性方法包括将优选地用抗生素如葡萄糖酸氯己定浸溃的胶原生物织物插入受试者中的一个或多个牙周袋中，例如插入大于或等于5mm。胶原生物织物优选地是可生物降解的。
在牙科学中使用的本发明的胶原生物织物取决于待治疗的牙科病症的类型而可以用一种或多种生物分子进行浸渍。本领域中已知用于治疗牙科病症的任何生物分子包括在本发明的方法和组合物之内。在一个特殊的实施方案中，在治疗伴随有感染的牙科病症中使用的胶原生物织物可以用一种或多种抗生素进行浸渍，包括强力霉素、四环素、葡萄糖酸氯己定和二甲胺四环素，但并不局限于此。
5.4.2.3神经学本发明的胶原生物织物还用于修复受损伤的神经特别是修复切断的外周神经，以及用于神经外科程序。本发明包括例如在硬脑膜替换和在外周神经修复中使用胶原生物织物。由于上面提及的原因，本发明的胶原生物织物与本领域中使用的其他方法相比在用作硬脑膜替代物时或者在神经修复中具有增强的临床效用，本领域中使用的其他方法例如为Berger等人，1970，Acta.Neurochir.23141；Ducker等人，1968，Mil.Med.133298；U.S.专利号4,778,467；4,883,618；3,961,805；5,354,305。
在一些实施方案中，本发明的胶原生物织物可以用作环绕神经吻合的假体，例如其可以用于包裹外周神经吻合。本发明的胶原生物织物在神经修复中有特别的效用，这例如是通过这样的过程来完成的，即促进穿过修复区域的纵向结缔组织框架的形成，因此引起鞘细胞和轴突再生的纵向式样。
外周神经的修复在称为nerorraphy(Jennings等人，1955，Surgery206)的程序中通常通过使用缝合来进行。可是，该方法只获得了有限的成功，因为缝合切断的神经的方法是困难的。因此，本发明的胶原生物织物为神经修复的无缝合方法提供了另一种选择，由此例如将神经末端装入含有本发明的生物织物的管状假体装置中，因此将切断的末端靠得很近以便再生。
5.4.2.4泌尿学本发明的胶原生物织物在矫正尿失禁中具有特别的效用。尿失禁是由于尿道不能在储尿期间保持关闭而造成的。该原因可以是外在的，例如尿道和膀胱颈的差的解剖学支持导致失禁，和对于骨盆底重悬作出响应。尿道失效可选择地也可以是内在的，即弱的尿道功能。在传统上，尿失禁通过使用膨胀剂如胶原、脂肪、硅氧烷来矫正(见综述Lightner，2002，Current Opinionin Urology，12(4)333-8)。本发明的胶原生物织物相对于本领域中所述膨胀剂来说具有增强的效用，即增强了自控能力。此外，本发明的胶原生物织物还具有增强的治疗效用，例如减少局部的并发症、减少尿道感染、无宿主反应、可靠的耐久性和更高的安全性。
本发明的胶原生物织物在矫正尿失禁中的效用部分地是由于此处描述的胶原生物织物独特的物理特性，特别是其无免疫原性。在一些实施方案，将胶原生物织物用作植入物，例如尿道植入物。虽然不想被任何特殊的理论所束缚，但是本发明的胶原生物织物可能通过增加尿道闭合压力和对于尿液被动流出的抗性而具有增强的治疗效用。
5.4.2.5矫形学本发明的胶原生物织物可以在矫形外科程序中使用。在某些实施方案中，胶原生物织物可以用于矫形缺陷，例如后天或先天缺陷。由于外伤或者骨肿瘤的外科恢复引起的局部缺陷的重建是矫形外科或颌面外科中的主要问题。通常地，已经使用了合成的骨替代物或胶原膜，这部分是由于它们的诱导骨生成的活性(见例如，Rao等人，1995，J.Biomater.Sci.Polymer Edn.7(7)623-45)。可是，常见的问题是由于植入的材料造成的全身性感染。可是，本发明的胶原生物织物比本领域中所使用的材料是有利的，这特别是由于其作为用于矫形缺陷的骨替代物的低免疫原性。在一些实施方案中，胶原生物织物可以用作用于重建腱、韧带和软骨的假体。在其他实施方案中，本发明的胶原生物织物可以用作作为骨替代物的假体。
5.4.2.6心血管外科本发明的胶原生物织物可以在心血管外科程序中使用，例如用作假体以用于构建大和小血管；用于修复先天性血管畸形和有病的瓣膜。
本发明的生物织物特别可用作血管外科中的移植物，例如静脉或动脉移植物。生物织物在血管外科中的效用部分地是由于其无毒性；无免疫原性；稳定性；容易操作；抗凝血酶原的特性；最小的血管壁移植孔隙度；在多种大小的可用性；材料的再生产性。在一些实施方案中，本发明的生物织物可以用作瓣膜替代物。
5.4.2.7药物递送本发明的胶原生物织物可以用作用于药物例如治疗剂的可控递送的药物递送载体。在一些实施方案中，胶原生物织物递送一种或多种治疗剂给受试者，优选为人。包括在本发明的范围内的治疗剂为蛋白质、肽、多糖、多糖缀合物、基于遗传的疫苗、减毒活疫苗、完整的细胞。在本发明的方法中使用的药物的非限制性例子为抗生素、抗癌剂、抗菌剂、抗病毒剂、疫苗、麻醉剂、镇痛药、抗哮喘剂、抗炎剂、抗抑郁剂、抗关节炎剂、抗糖尿病剂、抗精神病药、中枢神经系统刺激剂、激素、免疫抑制剂、肌肉松弛剂、前列腺素。
胶原生物织物可以用作用于向受试者优选为人可控递送一种或多种小分子的递送载体。在一些实施方案中，胶原生物织物递送一种或多种小分子给受试者，优选为人。在此处使用时，术语“小分子”和类似的术语包括肽、肽模拟物、氨基酸、氨基酸类似物、多核苷酸、多核苷酸类似物、核苷酸、核苷酸类似物、具有低于大约10,000克/摩尔的分子量的有机或无机化合物(即包括杂有机化合物和有机金属化合物)、具有低于大约5,000克/摩尔的分子量的有机或无机化合物、具有低于大约1,000克/摩尔的分子量的有机或无机化合物、具有低于大约500克/摩尔的分子量的有机或无机化合物、具有低于大约100克/摩尔的分子量的有机或无机化合物，以及这样的化合物的盐、酯和其他药物上可接受的形式，但并不局限于此。还包括了这样的化合物的盐、酯和其他药物上可接受的形式。
在某些实施方案中，相对于本领域中已知的其他药物递送系统来说，本发明的胶原生物织物用作用于药物递送的载体导致药物的增强的吸收；改善的药物动力学特性；和药物的全身性分布。改善的药物动力学表示，当例如用标准药物动力学参数进行测量时获得了药物动力学特性的增强，例如达到最大血浆浓度的时间(Tmax)；最大血浆浓度的数量(Cmax)；引起可检测的血液或血浆浓度的时间(Tlag)。增强的吸收表示，当用这样的参数进行测量时，药物的吸收得到了改善。药物动力学参数的测量按照本领域的常规方法来进行。
6.实施例6.1生产胶原生物织物的方法材料下面的材料用于制备胶原生物织物。
材料/设备·分娩记录的复本·材料/家族健康史/知情同意的复本·来源条形码标记(供体ID号)·收集#(将连续的号分配给收入的材料)·组织处理记录(文件ID#ANT-19F)；保留每个批号的处理的详细记录·人胎盘(在处理开始时小于48小时的存放时间)·无菌的外科夹子/止血钳·无菌的剪刀·无菌的解剖刀·无菌的细胞刮刀(Nalgene NUNC Int.R0896)·无菌的纱布(非无菌的PSS 4416，灭菌)·无菌的漂洗不锈钢托盘·消毒的处理不锈钢托盘·消毒的塑料箱·无菌0.9％NaCl溶液(Baxter 2F7124)·无菌水(Milli Q plus 09195或Baxter 2F7113)·无菌的样品容器(VWR 15704-014)·个人防护设备(包括无菌的或非无菌的手套)·具有证明书的洁净室·事先制备的去细胞化溶液(D-细胞)；0.01-1％一水合脱氧胆酸钠·消毒的箱·摇动平台(VWR 100型)
·记时器(VWR 21376890)·消毒的塑料架网·PVC包裹膜·真空泵(Schuco-Vac 5711-130)·凝胶干燥器(即热干燥器；BioRad 583型)·消毒的不锈钢切割板·用于包装的袋·无菌的不锈钢尺(General Tools MFG.Co 1201)·可追踪的数字温度计(61161-364型，Control公司)·Accu-Seal自动密封器(Accu-Seal，630-1B6型)在生育时对孕妇进行筛选以检查传染病，例如HIV、HBV、HCV、HTLV、梅毒、CMV和其他病毒，以及其他会污染待收集的胎盘组织的病原体。只使用从这样的供体中收集得到的组织来生产本发明的胶原生物织物，即其母亲经检测对于上面提及的病原体呈阴性或者无反应性。
在正常生育之后，胎盘、脐带和脐带血自然地从收缩的子宫中排出。在生育之后收集胎盘、脐带和脐带血。将这些材料转移至实验室，在那儿它们在具有HEPA过滤系统的洁净室中于无菌条件下进行处理，HEPA过滤系统在处理之前开启至少1小时。在操作产品时总是戴上手套(无菌的或非无菌的，在适当的时候)。一旦可以实施的时候就处置掉所有的羊膜/绒毛膜的未使用(多余)部分和在组织处理期间产生的污染液体。
步骤I用无菌的Steri-Wrap片设置出一个无菌场地，并将下列用于处理的器械和附件放置在该场地上。
·无菌的托盘包·无菌的细胞刮刀·无菌的解剖刀·消毒的处理托盘在处理记录中记录下无菌包ID#。
从转移容器中取出胎盘，并置于消毒的不锈钢托盘上。用外科夹子和剪刀从胎盘上剪下大约2英寸的脐带。将脐带置于单独的无菌容器中以用于进一步的处理。容器用组织ID条形码进行标记；和鉴定材料和贮存溶液的存在(例如介质的类型)。在一些情况下，如果不需要用于其他计划，则丢弃脐带。
从胎盘膜的边缘开始，通过使用手指的钝器解剖来分离羊膜和绒毛膜。这一操作在切割膜之前进行。
在将羊膜与绒毛膜和胎盘的整个表面分离之后，用剪刀环绕脐带残端切割羊膜，并将羊膜与胎盘分开。在一些情况下，如果不撕裂组织就不可能分离羊膜和绒毛膜，将羊膜和绒毛膜作为一块从胎盘上切割下来，然后将它们剥离开。
将绒毛膜置于单独的样品容器中，以便用于其他计划。容器用组织ID条形码进行标记，鉴定材料和贮存溶液的存在(例如介质的类型)，标上首字母缩写和标上日期。
如果羊膜片仍然粘附在胎盘上，将其从胎盘上剥离，并用剪刀环绕脐带切割下来。将胎盘放回转移容器中以用于其他计划。
在组织处理记录中记录下适当的数据。
羊膜用无菌0.9％NaCl溶液保持在托盘中。优选地，在处理的下一个步骤之前，将羊膜从分娩的时候起通过冷藏贮存最多72小时。
步骤II从样品容器中一次取出一片羊膜，并置于消毒的不锈钢托盘上。将其他片置于单独的注满无菌水的无菌不锈钢托盘中，直至准备对它们进行清洁。从处理托盘上移去多余的羊膜片，并置于单独的注满无菌水的漂洗不锈钢托盘中。
如果被血液、母体或胎儿液体/材料严重污染，则用无菌水漂洗羊膜，并在需要时更换无菌水。
将羊膜置于处理托盘上，并保持母体侧朝上。用无菌的细胞刮刀从羊膜的母体侧小心地去除尽可能多的可见污染物和细胞材料。(注意对于该步骤应当使用最小的压力以防止撕裂膜)。使用无菌水来帮助去除细胞和细胞碎片。羊膜进一步在单独的无菌不锈钢漂洗托盘中用无菌水漂洗。
将羊膜翻转从而将胎儿侧朝上，并将其放回处理托盘上，然后用无菌水漂洗。用细胞刮刀轻轻地去除可见的细胞材料和碎片(注意对于该步骤应当使用最小的压力以防止撕裂膜)。使用无菌水来帮助去除细胞和细胞碎片。
在单独的无菌漂洗托盘中于两个清洁循环之间用无菌水漂洗羊膜。以按需要一样多的次数(清洁循环数)来清洁组织，以便从膜的两侧去除大部分(如果不是全部)可见的细胞材料和碎片。在两次漂洗之间更换漂洗托盘中的无菌水。
在每次清洁循环之后用无菌水漂洗处理托盘。
所有其他的羊膜片以同样的方式进行处理，并置于同一个容器中。贴上组织ID条形码，鉴定材料和贮存溶液的存在(例如介质的类型)，加上首字母缩写和日期。
在组织处理记录中记录下适当的信息和日期。
步骤III从漂洗托盘中(或者从贮存容器中)取出羊膜，用手指轻轻地挤压出过量的液体，并将膜置于无菌样品容器中。容器用D-细胞溶液装满至150ml标线，并保证覆盖住所有的羊膜和关闭了容器。
将容器置于摇动平台上的箱中。开启摇动平台，并让膜于设置#6在D-细胞溶液中摇动至少15分钟和至多120分钟。
以步骤I中同样的方式用新的无菌设备和消毒的托盘设置出一个新的无菌场地。在处理记录中记录下无菌包ID#。
在完成摇动之后，关闭摇动平台，并从容器中取出膜。将膜置于新的不锈钢处理托盘中，加入无菌0.9％NaCl溶液以覆盖托盘的底部。
用新的无菌细胞刮刀从组织的两侧去除残留的D-细胞和细胞材料(如果有的话)。该步骤以按需要一样多的次数进行重复以便从两侧的整个表面上去除尽可能多的可见的残留细胞材料。于两个清洁循环之间在单独的漂洗托盘中用无菌0.9％NaCl溶液漂洗膜。在两次漂洗之间更换漂洗托盘中的无菌0.9％NaCl溶液。
在最后的清洁循环完成之后，膜用无菌0.9％NaCl溶液进行漂洗，并置于新的注满无菌0.9％NaCl溶液的无菌样品容器中。
所有余下的羊膜片以完全一样的方式进行处理。
当所有羊膜片都进行了处理并置于含有无菌0.9％NaCl溶液的容器中时，将容器置于摇动平台上的箱中，以便于设置#6摇动至少5分钟。在摇动完成之后，从样品容器中取出膜，更换容器中的无菌0.9％NaCl溶液，和将膜放回样品容器中。
样品容器用组织ID条形码和检疫标签进行标记。鉴定材料和贮存溶液的存在(例如介质的类型)，标上首字母缩写和标上日期。将样品容器置于洁净的拉链锁袋中，并置于冰箱(2-8℃)中。
在组织处理记录中记录下所有适当的数据。
当血清学结果显示可用时，在检疫标签之上放上适当的标签(血清学阴性或仅供研究使用)，并将那些容器与经检验的分开。
步骤IV在用步骤IV进行处理之前，检查组织状态检验以确保所有可应用的检测结果都是阴性的。
以步骤II和III中同样的方式用无菌的Steri-Wrap片设置出一个无菌场地，并放置好所有无菌和消毒的器械和附件。
从冰箱中取出膜，并置于新的无菌不锈钢处理托盘中。加入无菌0.9％NaCl溶液以覆盖托盘的底部。
用新的无菌细胞刮刀轻轻地去除所有可见的细胞材料和碎片(如果有的话)(注意对于该步骤应当使用最小的压力以防止撕裂膜)。使用无菌0.9％NaCl溶液来帮助去除细胞和碎片。
在单独的注满无菌0.9％NaCl溶液的无菌不锈钢漂洗托盘中漂洗膜。在两次清洁循环之间更换0.9％NaCl溶液。将膜置于新的无菌样品容器中，容器用新鲜的无菌0.9％NaCl溶液注满，并置于摇动平台上以便于设置#6摇动至少5分钟。
前述步骤重复3次，并在每次摇动之间更换无菌0.9％NaCl溶液。在组织处理记录中记录下适当的数据。
从样品容器中一次取出一片膜，用手指轻轻地挤压出过量的液体，并将膜置于无菌处理托盘上。轻轻地将膜进行伸展直至其变平；并保证其胎儿侧朝下。
框架通过用无菌剪刀切割消毒的塑料片来制备。框架的大小应当在每个方向上比膜部分小大约0.5cm。在注满无菌0.9％NaCl溶液的漂洗托盘中漂洗框架。
将框架置于稍微伸展的膜表面上，并轻轻地在上面进行按压。必要的是将塑料框架的光滑的一侧朝向组织。
用解剖刀环绕框架切割膜，并保留大约0.5cm伸展至框架边缘之外。多余的膜放回样品容器中。
用夹子或镊子将伸展至框架之外的膜边缘包裹住框架的边缘，并暂时放在同一个托盘中备用。
下一片膜以同样的方式进行处理。重要的是，将要进行干燥的总区域不要超过300cm2/热干燥器。在“架开”这一片膜的同时，未上架的片应当保持在容器中的无菌0.9％NaCl溶液中。
设置干燥器的干燥温度，并使用采用扩展性探针的经校准的数字温度计来进行校验。将干燥温度设置于50℃。在组织处理记录中记录下数据。
开启真空泵。
将无菌纱布置于热干燥器的干燥平台上，覆盖住比架开的膜的区域稍大的区域。重要的是确保纱布层的总厚度不超过一个折叠成4×4的纱布的厚度。
将一片塑料架网置于纱布之上。塑料网的边缘应当伸展出纱布边缘大约0.5-1.0cm。
将架开的膜轻轻地提起，并置于位于塑料网之上的热干燥器平台上，同时保持膜一侧朝上。重复该步骤直至将最大数量的膜(不超过300cm2)置于热干燥平台上。(注意羊膜的胎儿侧朝上)。
将一片PVC包裹膜切割成足够的大小以覆盖热干燥器的整个干燥平台还加上额外的脚。
在真空泵运转的同时，用塑料膜轻轻地覆盖热干燥器的整个干燥平台，并在两侧让1/2的脚伸展出干燥平台边缘之外。要注意的是，膜紧紧地拉在膜和框架片之上(即其被真空“吸进去了”)，而且没有漏气和在组织区域上没有起皱纹。随后关闭盖子。
将真空泵设置为大约-22英寸Hg的真空。在2-3分钟的干燥循环之后记录泵表的数值。将膜进行热-真空干燥大约60分钟。干燥过程中大约15-30分钟，在热干燥器中放置上一层新的无菌纱布。纱布层的总厚度一定不能超过一个折叠成4×4的纱布的厚度。
在改变之后，要注意的是，塑料膜紧紧地拉在膜和框架片之上，而且没有漏气和在膜区域上没有起皱纹。
真空密封的完整性通过检查泵压单计量表而定时进行检查。在完成干燥处理之后，打开热干燥器，在泵运转的同时让膜冷却大约2分钟。
用无菌的Steri-Wrap和位于其下的消毒的不锈钢切割板设置出一个新的无菌场地。在这一点上使用无菌的手套。在泵仍在运转的同时，从边角上开始轻轻地从膜片上去除塑料膜，并用戴着手套的手压住膜片。将框架与膜一起轻轻地提离干燥平台，并置于位于消毒的不锈钢切割板之上的无菌场地上，同时让膜一侧朝上。用解剖刀通过沿着离框架边缘1-2mm的边缘形成切口而对膜片进行切割。用戴着手套(无菌手套)的手将膜保持在原处。通过将膜片缓慢地剥离而将其轻轻地提离框架，然后置于切割板之上的无菌场地上。
用解剖刀或锋利的剪刀将膜片切割成指定尺寸的片段。在包装之前，在无菌的场地上切割所有的片并进行妥善保管。用一只手(无菌的)将单片的膜置于内部的揭片袋包装中，同时用另一只手(非无菌的)拿住袋子。要注意的是不要用“无菌的”手接触袋子。在将所有的片置于内袋中之后，将它们密封。在袋子外部的指定区域中贴上具有适当的信息(例如部分#、批#等等)的标签。所有的膜片以同样的方式进行处理。将经标记和密封的揭片袋包放置于防水的拉链锁袋中进行贮存，直至准备将它们运送到灭菌设备或分配器中。在组织处理记录中记录下所有适当的数据。
6.2胶原生物织物的水化/可缝合性的评价为了获得关于本发明生物织物的外科操作、水化期和可缝合性的定性和定量的反馈，将根据本发明的方法制备得到的羊膜样品提供给四位富有经验的、非常知名的眼表面外科医生以进行评价。样品由外科医生通过下列方法进行评价，即在猪眼试样上施行组织移植以确定本发明生物织物的外科操作特性和可缝合性。
每个外科医生可能使用下列的方法(1)将生物织物在干燥的状况下进行切割以适合猪眼的单个象限；(2)将切割出的生物织物置于猪眼的表面上；(3)在猪眼上用无菌的盐溶液将生物织物进行水化而让移植物进行活化即再水化，其水化期时间为2、5、10和20分钟；(4)将生物织物通过几个9-0Vicryl缝合咬合而缝合到猪眼的上皮上；和(5)外科医生作出关于经水化的羊膜的组织品质、一致性和可缝合性的定性评注。
等同方案不是要用此处描述的特殊实施方案来限制本发明的范围。事实上，从前面的描述和附图中，除了所述的那些之外的本发明的多种修饰对于本领域熟练技术人员来说将会是显而易见的。这种修饰将会落在附加的权利要求的范围之内。
此处引用了多种出版物、专利和专利申请，它们的公开内容以其整体进行引用作为参考。
权利要求
1.从具有羊膜和绒毛膜的胎盘制备胶原生物织物的方法，包括(a)分离羊膜和绒毛膜；和(b)将羊膜进行去细胞化，以致羊膜不与酶接触。
2.权利要求1的方法，其进一步包括洗涤和干燥去细胞化的羊膜。
3.权利要求1的方法，其中胎盘为人胎盘。
4.权利要求1的方法，其中胎盘来自经历了剖腹产术分娩或者自然分娩的女性人类。
5.权利要求1的方法，其中该方法另外包括确定胎盘膜来自已经检测了至少一种传染病的供体的步骤。
6.权利要求1的方法，其中供体为女性人类。
7.权利要求1的方法，其中胎盘在生育的48小时之内提供。
8.权利要求1的方法，其中该方法另外包括在步骤(a)之后和步骤(b)之前将羊膜贮存直至72小时的步骤。
9.权利要求8的方法，其中所述贮存包括将在步骤(a)中获得的羊膜冷藏直至5天。
10.权利要求1的方法，其中步骤(b)中的羊膜的去细胞化包括从羊膜上去除所有可见的细胞材料和细胞碎片。
11.权利要求1的方法，其中步骤(b)中的羊膜的去细胞化包括从羊膜的母体侧和羊膜的胎儿侧去除所有可见的细胞材料和细胞碎片。
12.权利要求1的方法，其中步骤(b)中的羊膜的去细胞化包括物理性刮削所述的膜。
13.权利要求1的方法，其中步骤(b)中的羊膜的去细胞化包括用含有去污剂的溶液将羊膜进行去细胞化。
14.权利要求13的方法，其中含有去污剂的溶液为含有0.01-1.0％一水合脱氧胆酸钠的溶液。
15.权利要求13的方法，其中在含有去污剂的溶液中的去污剂选自非离子去污剂、Triton X-100、阴离子去污剂和十二烷基硫酸钠或者其组合。
16.权利要求12的方法，其中所述的物理性刮削包括用细胞刮刀进行刮削。
17.权利要求1的方法，其中步骤(b)中的羊膜的去细胞化在无菌溶液中进行。
18.权利要求2的方法，其中羊膜的洗涤在无菌溶液中进行。
19.权利要求2的方法，其中去细胞化的羊膜的干燥于大约35℃-大约50℃的温度进行。
20.从具有羊膜和绒毛膜的胎盘制备羊膜层压制品的方法，其包括(a)分离羊膜和绒毛膜；(b)将羊膜进行去细胞化；和(c)将至少两层去细胞化的羊膜以相互接触的方式层叠在一起，从而形成羊膜层压制品。
21.权利要求20的方法，其进一步包括在步骤(b)之后和步骤(c)之前洗涤去细胞化的羊膜至少一次。
22.权利要求20的方法，其进一步包括干燥去细胞化的羊膜层压制品。
23.权利要求20的方法，其进一步包括将至少两层所述的羊膜层压制品装配成复杂的三维支架。
24.含有脱水的、去细胞化的且无基质的羊膜的胶原生物织物，其中所述的羊膜具有天然的三级和四级结构。
25.去细胞化的且无基质的胶原生物织物，其含有胶原、弹性蛋白和纤连蛋白。
26.用权利要求1的方法制备得到的胶原生物织物。
27.权利要求24的胶原生物织物，其中羊膜为人羊膜。
28.权利要求24-26中任何一项的胶原生物织物，其中生物织物的厚度为大约10-40微米。
29.权利要求24-26中任何一项的胶原生物织物，其中生物织物进一步用一种或多种生物分子进行浸渍。
30.权利要求29的胶原生物织物，其中生物分子选自抗生素、激素、生长因子、抗肿瘤剂、抗真菌剂、抗病毒剂、疼痛药物、抗组胺剂、抗炎剂、抗感染剂、伤口愈合剂、伤口封闭剂、细胞吸引剂和支架试剂。
31.权利要求29的胶原生物织物，其中生物织物进一步用一种或多种小分子进行浸渍。
32.权利要求24-26中任何一项的胶原生物织物，其中进一步在生物织物上移植细胞，从而所述细胞是均一的和汇合的。
33.权利要求32的胶原生物织物，其中细胞为人干细胞或人分化的成熟细胞。
34.权利要求24-26中任何一项的胶原生物织物，其进一步含有一种或多种治疗剂。
35.权利要求34的胶原生物织物，其中所述的治疗剂选自激素、多肽、抗生素、抗真菌剂和酶。
36.权利要求24-26中任何一项的胶原生物织物，其进一步含有一种或多种水凝胶组合物。
37.权利要求36的胶原生物织物，其中水凝胶组合物含有选自聚乙烯醇、聚乙二醇、透明质酸、葡聚糖和其衍生物或类似物的聚合物。
38.含有权利要求24-26中任何一项的胶原生物织物的三维支架。
39.权利要求38的三维支架，其中支架为管。
40.权利要求38的三维支架，其进一步含有一种或多种水凝胶组合物。
41.权利要求40的三维支架，其中水凝胶组合物含有选自聚乙烯醇、聚乙二醇、透明质酸、葡聚糖和其衍生物或类似物的聚合物。
42.用权利要求20的方法产生出的羊膜层压制品。
43.含有至少两层权利要求24-26中任何一项的胶原生物织物的羊膜层压制品。
44.含有权利要求24-26中任何一项的胶原生物织物的羊膜层压制品。
45.权利要求42-44中任何一项的羊膜层压制品，其进一步含有一种或多种水凝胶组合物。
46.权利要求45的羊膜层压制品，其中水凝胶组合物含有选自聚乙烯醇、聚乙二醇、透明质酸、葡聚糖和其衍生物或类似物的聚合物。
47.含有权利要求24-26中任何一项的胶原生物织物的外科移植物。
48.在外科程序中使用权利要求47的外科移植物的方法，其中所述的外科移植物直接应用于受试者的外科部位。
49.权利要求48的方法，其中所述的外科部位选自眼、皮肤、腹部的浆膜面、胸腔的浆膜面、浆膜心包、口腔的粘膜面、鼻腔的粘膜面、呼吸道的表面、胃肠道的表面、泌尿生殖道的表面。
50.权利要求48的方法，其中所述的外科移植物应用于受试者身体的内部部位。
51.权利要求48的方法，其中所述的外科移植物应用于受试者身体的外部部位。
52.权利要求48的方法，其中所述的受试者为人。
53.在受试者中治疗和/或预防眼病的方法，其包括将权利要求24-26中任何一项的胶原生物织物置于受试者的患病的眼表面上。
54.权利要求53的方法，其中眼病选自溃疡/穿孔、大泡性角膜病变、眼部皮样囊肿/肿瘤、原发性翼状胬肉、持续性角膜上皮缺损、急性和慢性碱灼伤、热灼伤、无虹膜、特应性角膜炎、特发性边缘干细胞缺乏、角膜翳、新血管生成、类风湿性角膜融化、眼瘢痕性类天疱疮、渗漏性滤过性水泡、暴露的Ahmed瓣膜管、具有随后的睑球粘连的沙雷氏菌蜂窝组织炎、急性和慢性Stevenson Johnson综合征。
55.在外科程序中使用权利要求24-26中任何一项的胶原生物织物的方法，其中外科程序选自眼外科、心血管外科、牙周外科、神经外科、牙外科和矫形外科。
56.在受试者中矫正尿失禁之中使用权利要求24-26中任何一项的胶原生物织物的方法。
57.将治疗剂递送给受试者的方法，其包括使权利要求24-26中任何一项的胶原生物织物与受试者接触。
58.权利要求56或57的方法，其中受试者为人。
59.权利要求57的方法，其中治疗剂选自抗生素、抗癌剂、抗菌剂、抗病毒剂、疫苗、麻醉剂、镇痛药、抗哮喘剂、抗炎剂、抗抑郁剂、抗糖尿病剂、抗精神病药、中枢神经系统刺激剂、激素、免疫抑制剂、肌肉松弛剂、前列腺素。
60.使用权利要求24-26中任何一项的胶原生物织物的方法，其中胶原生物织物的制备时间包括胶原生物织物的水化。
61.权利要求60的方法，其中生物织物的水化包括用无菌盐溶液进行水化。
62.权利要求60的方法，其中生物织物在使用之前水化至少2分钟。
63.使用羊膜层压制品的方法，其进一步包括在层压制品上移植活细胞。
64.权利要求63的方法，其中所述的活细胞选自成熟组织细胞和干细胞。
65.权利要求64的方法，其中所述的干细胞为全能性的。
66.权利要求64的方法，其中所述的干细胞为多能性的。
67.权利要求64的方法，其中所述的干细胞为组织特异性的。
68.在受试者中处理或预防皮肤状况的方法，其包括使权利要求24-26中任何一项的胶原生物织物与所述的皮肤状况接触。
69.权利要求68的方法，其中所述的皮肤状况选自皮肤损伤、皱纹、细纹、皮肤变薄、降低的皮肤弹性、粗糙的皮肤、痤疮瘢痕、眉间沟、切除性瘢痕、软组织缺损、先天的皮肤状况、变性的皮肤状况、VII型胶原缺乏和阳光损害的皮肤。
70.权利要求68的方法，其进一步包括向受试者施用一种或多种治疗剂以处理皮肤状况。
71.权利要求70的方法，其中所述的一种或多种治疗剂选自维生素、矿物质、基于儿茶素的制剂和葡糖胺。
72.在受试者中治疗伤口的方法，其包括使权利要求24-26中任何一项的胶原生物织物与所述的伤口接触。
73.权利要求72的方法，其中所述的伤口选自表皮伤口、皮肤伤口、压力性溃疡、慢性伤口、急性伤口、外部伤口、内部伤口、先天性伤口、烧伤伤口、外科伤口和伤口感染。
74.在受试者中治疗烧伤的方法，其包括使权利要求24-26中任何一项的胶原生物织物与所述的烧伤接触。
75.权利要求74的方法，其中所述的烧伤选自一度烧伤、二度烧伤、三度烧伤、感染的烧伤伤口和烧伤伤口脓疱病。
76.权利要求68、72或74的方法，其中受试者为人。
全文摘要
本发明涉及从羊膜制得的胶原膜，此处称为胶原生物织物。本发明的胶原生物织物具有天然的未处理的羊膜的结构完整性，即天然的三级和四级结构。本发明提供了通过对羊膜进行去细胞化而从胎盘膜制备胶原生物织物的方法，优选地从具有绒毛膜和羊膜的人胎盘膜制备。在一个优选的实施方案中，羊膜完全地进行去细胞化。本发明的胶原生物织物在内科和外科领域有着许多的应用，包括例如血管修复、血管的构建和替换、腱和韧带的替换、创伤敷裹、外科移植物、眼科用途、缝合等等。该生物织物的优点部分地是由于其物理特性，例如生物机械强度、屈曲性、可缝合性和低免疫原性，特别是当其来源自人胎盘时。
文档编号C12N5/00GK1791331SQ03812096
公开日2006年6月21日 申请日期2003年3月26日 优先权日2002年3月26日
发明者R·J·哈里里, A·M·卡普鲁诺维斯基, P·A·墨菲 申请人:人类起源公司