Ron组合物及其使用方法
【专利说明】RON组合物及其使用方法
[0001] 相关申请
[0002] 本申请涉及并要求2012年11月30日提交的美国临时申请号61/732, 048和2013 年5月15日提交的美国临时申请号61/823, 744的优先权权益，所述专利申请通过引用的 方式完整并入本文。
[0003] 序列表
[0004] 本申请含有通过EFS网提交的序列表并因而通过引用方式将其完整并入。所述 ASCII副本在2013年11月20日创建，命名为P5505R1-W0_SL. txt，大小是382千比特。
[0005] 相关技术背景
[0006] 克罗恩氏病（CD)和溃疡性结肠炎（UC)是以肠道内部慢性炎症反应为特征的两 种炎性肠病（IBD)形式。在CD和UC患者中检查单核苷酸多态性（SNP)频率的全基因组 相关性研宄（GWAS)已经鉴定到许多共有的和独特的易感性等位基因。使用GWAS和候选 基因方法，已经鉴定到巨噬细胞刺激蛋白（MSP)中认为与CD和UC易感性相关的多态性。 参见例如，Barrett 等人，2008, Nat Genet 40:955-62,和 Consortium WTCC. 2007, Nature 447:661-78。
[0007] 负责这种增加的遗传风险的可能起因性等位基因是MSP中导致氨基酸689处精 氨酸变成半胱氨酸（689R至689C)的非同义编码性SNP(rs3197999)。参见Goyette等 人，2008, Mucosal Tmmunol 1:131-8。
[0008] MSP是由肝表达的纤维蛋白溶酶原相关的可溶性生长因子，以不能够结合其受体 (Met家族受体酪氨酸激酶，Recepteur d'Origine Nantais(RON))的无活性单链蛋白（MSP 原）形式分泌至血清中。MSP原在R483和V484之间的蛋白酶剪切使其转变成能够以高 亲和力结合RON并诱导受体信号传导的有活性、二硫键连接的双链α/β异二聚体。参见 Gaudino 等人，1994, EMBO J 13:3524-32 和 Wang 等人，1994, Science 266:117-9。α 链包 含N末端PAN结构域和后续的4个三环结构域，β -链含有C末端胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶 结构域。MSP原可以由许多不同的丝氨酸蛋白酶以蛋白酶解方式激活，所述丝氨酸蛋白酶包 含参与凝血级联和在炎症反应期间诱导的那些。参见例如，Wang等人，1994, J Biol Chem 269:3436-40。因此，MSP在组织损伤部位的切割导致RON局部激活。
[0009] 已经报道RON表达在上皮细胞、巨噬细胞亚群、神经内分泌组织和正在发育的骨 中，并且已经与诱导上皮细胞增殖、存活、移行和黏附于胞外基质关联。参见例如Iwama等 人，1995, Blood 86:3394-403、Gaudino 等人，1995, Oncogene 11:2627-37、Danilkovitch 等人，1999，Exp Cell Res248:575-82 和 Danilkovitch 等人，2000，M〇1 Cell Biol 20:2218-27。最近，已经提出MSP-RON途径是炎症反应的关键负向调节物。主要基于对鼠 腹膜巨噬细胞的脂多糖和干扰素-γ刺激的研宄，发现RON信号传导抑制促炎性因子的表 达并上调可能参与组织修复的途径。参见例如，Chen等人，1998, J Immunol, 161:4950-9和 Wilson等人，2008, J Immunol, 181:2303-10。RON在先天炎症反应中的阻抑作用已经得到 体内研宄支持，所述体内研宄显示在RON中具有定向突变的小鼠显示出增强的内毒素攻击 敏感性。参见Waltz等人，2001，J Clin Invest, 108:567-76。这些体外和体内研宄导致了 以下推论：与MSP 689C多态性相关的增加的IBD遗传风险是由MSP和RON之间结合作用的 改变、以及RON介导的巨噬细胞活化抑制作用方面的缺陷所导致的直接结果。参见Khor等 人，2011，Nature 474:307-17、Gorlatova 等人，2011，PLoS One 6:e27269。矛盾的是，更 为近来的研宄发现，689C多态性增加人单核细胞系中的MSP刺激性活性，引起更大的体外 移行和增殖。Hauser 等人，2012, Genes Tmmun 13:321-7〇
[0010] 因此，需要更好地理解MSP多态性在RON信号传导和RON相关疾病（包括IBD)中 的作用、和更好的疗法用于治疗。
[0011] 发明概述
[0012] 本申请提供涉及受体d'Origine Nantais(RON)的试剂和组合物，尤其是RON激动 剂，以及其使用方法和生产方法。在一个方面，本发明提供一种RON激动剂，其包含抗RON 激动剂抗体或其抗原结合片段、或者与RON结合的巨噬细胞刺激蛋白（MSP)融合蛋白或其 功能性片段。在一些实施方案中，RON激动剂包含MSP融合蛋白或其功能性片段。在一些实 施方案中，MSP融合蛋白包含MSP β和融合结构部分。在某些优选的实施方案中，融合结构 部分包含二聚化结构域，包括而不限于免疫球蛋白Fc结构域。在一些实施方案中，免疫球 蛋白Fc结构域包含IgG Fc结构域；并且在某些其他实施方案中，Fc结构域是IgGl、IgG2、 IgG3或IgG4Fc结构域。在某些其他实施方案中，Fe结构域是IgGlFc结构域。在一些实施 方案中，Fc结构域还包含D265A和N297A(DANA)突变。在某些具体实施方案中，MSP融 合蛋白是二聚体。在某些其他实施方案中，MSP融合蛋白在RON结合方面是双价的。在 ? 某些其他实施方案中，MSP融合蛋白还包含连接MSP β和融合结构部分的接头、优选地肽接 头。在一些实施方案中，肽接头具有2至20个氨基酸残基长度、优选地4-16个氨基酸残基 长度和更优选地8-16个氨基酸残基长度。在一些实施方案中，肽接头具有16个氨基酸残基 长度。在某些其他实施方案中，肽接头具有4个氨基酸残基长度。在某些具体实施方案中， MSP融合蛋白是人MSP融合蛋白。在其他实施方案中，MSP融合蛋白包含人MSPI3。在某些 其他实施方案中，MSP融合蛋白包含人IgGlFc结构域。在一些实施方案中，RON激动剂包含 与 SEQ ID Ν0:20、22 或24 的氨基酸序列具有至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、 95 %、96 %、97 %、98 %或99 %序列同一性的MSP融合蛋白。在某些其他实施方案中，RON激 动剂包含与SEQ ID Ν0:20的氨基酸序列具有至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、 95 %、96 %、97 %、98 %或99 %序列同一性的MSP融合蛋白。在某些具体实施方案中，MSP融 合蛋白包含SEQ ID Ν0:20的氨基酸序列。
[0013] 在另外的其他实施方案中，RON激动剂包含抗RON激动剂抗体或其抗原结合片段。 在一些实施方案中，抗RON激动剂抗体包含单克隆抗体YW651. 1或2Ε5. 8. 1的一个或多个 高变区。在某些其他实施方案中，抗体是抗人RON激动剂抗体。在某些其他实施方案中，抗 体是单克隆抗体、嵌合抗体人抗体、双特异性抗体或人源化抗体。
[0014] 在另一个方面，本发明提供了包含一种或多种本文所述的RON激动剂和可药用载 体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含人MSP融合蛋白或 其功能性片段。在某个实施方案中，药物组合物包含含有SEQ ID Ν0:20的氨基酸序的人 MSP融合蛋白。在某些其他实施方案中，药物组合物包含抗人RON激动剂抗体或其抗原结合 片段。
[0015] 在又一个方面，本发明提供在有需求的受试者中治疗MSP相关的或RON相关的疾 病或病症的方法，所述方法包括步骤：向受试者施用如本文所述的RON激动剂或包含该RON 激动剂的药物组合物。在一些实施方案中，RON相关的疾病或病症与降低的RON活性相关。 在某些具体实施方案中，降低的RON活性与上皮细胞增殖、存活或移行相关。在一些实施方 案中，降低的RON活性与伤口愈合方面的缺陷、病况或障碍相关。在某些其他实施方案中， 降低的RON活性与消化道或皮肤中上皮伤口愈合方面的缺陷、病况或障碍相关。在某些其 他实施方案中，RON相关的疾病或病症包括而不限于炎性肠病（IBD)(包括溃疡性结肠炎和 克罗恩氏病）、原发性硬化性胆管炎、或伤口愈合上的缺陷、病况或障碍。在某些其他实施方 案中，IBD是溃疡性结肠炎。在另外的其他实施方案中，IBD是克罗恩氏病。
[0016] 在一些实施方案中，伤口愈合上的缺陷、病况或障碍是纤维化疾病。在某些其他实 施方案中，伤口愈合上的缺陷，病况或障碍与慢性上皮损伤相关，所述慢性上皮损伤包括而 不限于特发性肺纤维化、硬皮病和原发性胆汁性肝硬化。在某些其他实施方案中，伤口愈合 是上皮伤口愈合。在某些具体实施方案中，上皮伤口愈合缺陷发生在腔室、通道或管道的上 皮衬层中。在一些实施方案中，上皮伤口愈合缺陷发生在肠的上皮衬层中。在一些实施方 案中，上皮伤口愈合缺陷发生在结肠的上皮衬层中。不限于特定机制，在一些实施方案中， 增强的上皮伤口愈合由增加的上皮增殖、存活和/或移行反映或实现。在某些其他实施方 案中，伤口愈合由伤口闭合程度度量。在某些其他实施方案中，上皮伤口愈合缺陷出现在皮 肤中。在一些实施方案中，伤口是慢性伤口、压力性伤口或压力性溃疡。在某些其他实施方 案中，上皮伤口愈合缺陷与糖尿病相关。在一些实施方案中，伤口是糖尿病性伤口或糖尿病 性溃疡，包括糖尿病性足溃疡。在某些具体实施方案中，受试者是糖尿病受试者。在某些其 他实施方案中，受试者是糖尿病人患者。在一些实施方案中，RON激动剂包含人MSP融合蛋 白或其功能性片段、或者抗人RON抗体或其抗原结合片段。在某些其他实施方案中，RON激 动剂包含SEQ ID N0:20的氨基酸序列。
[0017] 在一些实施方案中，本发明方法还包括步骤：检测受试者中的血清MSP水平，任 选地检测正常对照中的血清MSP水平，并且当受试者中的血清MSP水平与正常对照中的血 清MSP水平相比较低时，向受试者施用RON激动剂或包含该RON激动剂的药物组合物。在 某些其他实施方案中，该方法还包括步骤：检测受试者中的血清MSP水平，并且当受试者中 的血清MSP水平与在正常对照中预先确定的血清MSP水平相比较低时，向受试者施用RON 激动剂或包含该RON激动剂的药物组合物。在一些实施方案中，该方法还包括检测正常 对照中血清MSP水平的步骤。在某些其他实施方案中，该方法还包括步骤：检测受试者中 rs3197999多态性的存在，并且当受试者中检出rs3197999多态性时和/或当受试者中的 血清MSP水平比正常对照低时，向受试者施用RON激动剂。在某些其他实施方案中，该方法 还包括步骤：当受试者中检出rs3197999多态性并且受试者中的血清MSP水平比正常对照 低时，向受试者施用RON激动剂。在一些实施方案中，RON激动剂包含人MSP融合蛋白或其 功能性片段、或者抗人RON抗体或其抗原结合片段。在某些其他实施方案中，RON激动剂包 含SEQ ID N0:20的氨基酸序列。可以通过本领域已知的任何方法，包括而不限于ELISA测 定法，测量血清MSP水平。可以通过本领域已知的任何方法检测rs3197999多态性；示例 性方法包括使用基于测序或基于PCR的测定法，如Applied Biosystem提供的TaqMan平台 (TaqMan SNP基因分型分析，目录号4351379, Carlsbad，CA)，检测。
[0018] 在另一个方面，本发明提供增强有需求的受试者中上皮伤口愈合的方法，所述方 法包括向受试者施用RON激动剂或包含该RON激动剂的药物组合物的步骤。在又一个方面， 本发明提供一种增加上皮细胞增殖、存活和/或移行的方法，所述方法包括使细胞与RON激 动剂接触。在又一个方面，本发明提供一种增加有需求的受试者中上皮细胞增殖、存活和/ 或移行的方法，所述方法包括向受试者施用RON激动剂或包含该RON激动剂的药物组合物。 在一些实施方案中，受试者患有IBD。在某些其他实施方案中，IBD是溃疡性结肠炎。在某 些其他实施方案中，IBD是克罗恩氏病。在一些实施方案中，将RON激动剂或包含本发明激 动剂的药物组合物有利地施用于已接受了外科手术的受试者，以增强在外部或内部手术切 开后伤口愈合。在某些其他实施方案中，受试者是糖尿病受试者。在另外的其他实施方案 中，受试者是糖尿病人患者。因此，在又一个方面中，本发明提供一种增强糖尿病受试者中 上皮伤口愈合的方法。在一些实施方案中，上皮伤口愈合发生在糖尿病受试者的皮肤中。在 一些实施方案中，RON激动剂包含人MSP融合蛋白或其功能性片段、或者抗人RON抗体或其 抗原结合片段。在某些其他实施方案中，RON激动剂包含SEQ ID N0:20的氨基酸序列。
[0019] 在这些方面的一些实施方案中，所述方法还包括步骤：检测（l)rs3197999多态性 的存在和/或（2)受试者的血清MSP水平，当受试者中检出rs3197999多态性时或当受试 者的血清MSP水平比正常对照低时，向受试者施用RON激动剂。在一些实施方案中，该方法 还包括检测正常对照中血清MSP水平的步骤。在一些实施方案中，该方法还包括步骤：（a) 检测受试者中rs3197999多态性的存在并且当受试者中检出rs3197999多态性时向受试者 施用RON激动剂，或（b)检测受试者中的血清MSP水平并且当受试者中的血清MSP水平与 正常对照中的血清MSP水平相比较低时，向受试者施用RON激动剂。在某些其他实施方案 中，该方法还包括步骤：当受试者中检出rs3197999多态性并且受试者中的血清MSP水平比 正常对照低时，向受试者施用RON激动剂。
[0020] 在又一个方面，本发明提供在有需求的受试者中治疗糖尿病的方法，所述方法包 括向受试者施用RON激动剂或包含该RON激动剂的药物组合物的步骤。在另一个方面，本 发明提供在有需求的受试者中降低血糖的方法，所述方法包括向受试者施用RON激动剂或 包含该RON激动剂的药物组合物的步骤。在又一个方面，本发明提供治疗与糖尿病相关的 病状的方法。在一些实施方案中，病状是但不限于糖尿病酮症酸中毒、代谢性酸中毒、高血 糖、高血糖高渗性综合征或代谢综合征。在这些方面的一些实施方案中，RON激动剂包含人 MSP融合蛋白或其功能性片段、或者抗人RON抗体或其抗原结合片段。在某些其他实施方案 中，RON激动剂包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列。
[0021] 在这些方面的某些其他实施方案中，治疗糖尿病的方法还包括步骤：(a)检测受 试者中rs3197999多态性的存在并且当受试者中检出rs3197999多态性时向受试者施用 RON激动剂，和/或（b)检测受试者中的血清MSP水平并且当受试者中的血清MSP水平与正 常对照中的血清MSP水平相比较低时，向受试者施用RON激动剂。
[0022] 在一些实施方案中，还包括步骤：检测