（A)或亲本3T3细胞（B)结合的结合数据。图IOC显示蛋白质印迹分析的图像， 所述分析检测人原代结肠细胞中由ml2m(mMSPi3-L12-mIgG2a，SEQ ID N0:30)融合蛋白诱 导的磷酸化Akt (顶部小图）或总Akt (底部小图）。图IOD的图总结接头长度对3T3-mR0N 稳定细胞中mRON激活的影响。图IOE的柱形图显示激活作用依赖于3T3细胞中mRON表达。
[0045] 图11显示实施例8的实验设计和结果，其中在小鼠结肠上皮细胞上检查MSP融合 蛋白的体内结合作用。将注射PBS的、注射抗豚草同种型对照的、和注射MSPf3 -L12-mIgG2a 的小鼠的结肠上皮切片，用Alexa Fluor647缀合的山羊抗小鼠抗体（Invitrogen)染色，并 且使用Leica SPE共聚焦显微镜（Leica Microsystems)检测信号。
[0046] 图12A显示在体内检查RON激动作用的实施例9的实验设计。图12B显示蛋白质 印迹分析的图像，其中在野生型或RON敲除小鼠中在小鼠结肠裂解物内检测由MSP β-Fc融 合物或抗豚草同种型对照诱导的磷酸化Akt。图12C总结了通过用多种mMSP β -Fc融合蛋 白测量Akt磷酸化获得的RON激活水平。
[0047] 图13Α显示了检验结肠上皮组织中RON信号传导的实验设计。使用抗磷酸Akt抗 体，通过免疫组织化学，对来自注射MSPe-Fc融合蛋白的小鼠（图13C)或注射抗豚草同种 型对照的小鼠（图13Β)的结肠组织切片，进行染色。这些图涉及实施例9。
[0048] 图14Α和图14C展示了抗RON单克隆抗体2Ε5. 8. 1和YW651. 1与3T3-mR0N细胞表 面上表达的mRON结合的曲线。图14B和图14D显示的结果说明，结合作用是RON特异的， 因为在不表达mRON的亲本3T3细胞中未检测到结合作用。这些图涉及实施例10。
[0049] 图15A-B展示实施例11的结果，显示3T3-mR0N细胞或对照细胞中由MSP融合蛋 白和抗mRON激动剂抗体诱导的Akt磷酸化。
[0050] 图16的柱形图总结抗RON抗体阻断RON测定试验的结果，如实施例12中所述。
[0051] 图17展示了检验RON激动剂抗体下调RON的实施例13的实验设计。
[0052] 图18的柱形图总结实施例13的结果，显示激动剂抗体不下调R0N。
[0053] 图19A展示实施例14的结果，显示在3T3-mR0N细胞中MSP融合蛋白和Ron激动 剂抗体对伤口愈合的影响。在RON阴性的亲本3T3细胞中显示无影响（图19B)。
[0054] 图20A显示实施例15的实验设计、以及在分离自注射了 RON激动剂抗体的小鼠的 结肠细胞中体内RON活性测定试验的结果。图20B-C显示在db/db小鼠（B)或WT和RON TK^小鼠（C)中在用激动剂抗体YW651. 1处理或不处理的情况下在无伤口皮肤中pAKT诱 导的结果。*，ρ〈0·003;**，ρ〈0·0001。
[0055] 图21Α显示的曲线总结实施例16的体内伤口愈合试验的数据，其中在db/db糖尿 病小鼠中使用RON激动剂抗体YW651. 1进行所述试验。图21B显示用对照抗体或激动剂抗 体YW651. l-IgG2a处理的db/db小鼠中在第4日或第20日的皮肤伤口闭合的拍摄图像。图 21C展示受伤组织中激动剂抗体诱导pAKT的定量性数据。
[0056] 图22总结实施例16的结果，显示RON激动剂抗体在降低db/db小鼠血糖水平上 的作用。
[0057] 发明详述
[0058] 本文中引用的全部出版物、专利和专利申请特此通过参考的方式明确并入用于全 部目的。
[0059] 在本申请范围内，除非另外声明，否则所用的技术可以在几种熟知参考文献的任 一者中找到，如：Molecular Cloning:A Laboratory Manual (Sambrook 等人，1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)和 PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications (Innis 等人 1990. Academic Press, San Diego, CA) 〇
[0060] 如本文中所用，除非上下文另外清楚地说明，否则单数形式"一个（a) "、"一种 (an) "和"该（the) "包括复数称谓。例如，对"一种分离的抗体"的提及意指一种或多种分 离的抗体。
[0061] 除非上下文另外清楚地指明，否则下文描述的任何和每个实施方案适用于本发明 的任何和每个方面。除非上下文另外清楚地说明，否则在不同方面之中和之间的全部实施 方案可以组合。
[0062] I.定义
[0063] 如本文所用的术语MSP包括来自任何哺乳动物来源的任何天然MSP，所述哺乳动 物来源包括哺乳动物如灵长类（例如人）和啮齿类（例如，小鼠和大鼠）。术语MSP涵盖 "全长MSP"、"MSP原"和缺少前导序列（例如，信号肽或信号序列）的分泌型MSP。如本文 所用，全长MSP和MSP原具有相同的长度，但差异在于：MSP原为尚未进行蛋白酶解加工以 产生α链和β链的无活性MSP。MSP原由转化酶如丝氨酸蛋白酶hepsin进行蛋白酶解切 割以产生α和β链，所述链形成由二硫键连接的异二聚体（全长MSP)。前导序列在成熟 之前切去，活性的MSP蛋白从细胞分泌。在一些实施方案中，MSP还涵盖天然存在的MSP变 体，例如，剪接变体或等位变体。在某些其他实施方案中，MSP包含在不削弱功能的情况下 促进重组产生蛋白质的一或多个突变。这类突变例如包括具有组氨酸标签（His标签）的 MSP、人MSP中的C672A、和小鼠 MSP中的C677A。在某些具体实施方案中，该MSP是人MSP。 SEQ ID NO: 2中显示示例性人MSP的氨基酸序列。
[0064] MSP β指含有RON结合部位的MSP的β链。MSP β单独足以与RON结合。在某些 有利实施方案，二聚化MSP β促进RON结合和募集。在一些实施方案中，MSP β构建体含有 在MSPI3从细胞分泌到胞外环境之前移除的外源前导序列（例如，如SEQ ID Ν0:55中所 示的HGF前导序列）。在某些其他实施方案中，将突变引入MSP β中，以移除在全长MSP情 况下与MSPa链形成二硫键的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，突变是在人MSP β中的 C588S或C588A突变，或小鼠 MSP0中的C593S或C593A突变。在本公开全文，MSP或MSP0 的氨基酸残基编号基于MSP原的氨基酸残基编号。
[0065] 在一些实施方案中，MSP融合蛋白包含MSP β和融合结构部分。在某些其他实施 方案中，MSP融合蛋白包含MSP β的功能性片段和融合结构部分。在某些其他实施方案中， MSP融合蛋白包含MSP β和融合结构部分，或其功能性片段。
[0066] 术语蛋白质的"功能性片段"指比全长蛋白质短但仍保留全长蛋白的期望功 能（如与RON结合）的截短多肽。在一些实施方案中，MSP融合蛋白的功能性片段包含 人 MSP 的氨基酸序列 V484-M708、V484-V700 或 V484-F694。参见 Carafoli 等人，FEBS J 272(22) : 5799-807。基于本领域已知的MSP序列和结构和本文提供的指导，本领域的普通 技术人员能够设计并制备适用于本发明的MSP功能性片段。
[0067] 术语"scMSP"或"单链MSP"指在MSP原切割位点的Pl位置中含有突变的不可切 割的无活性MSP原。例如，单链人MSP含有阻断h印sin切割的R483E突变。scMSP可以含 有如所示的其他突变（如R689C)。
[0068] 在某些方面，本发明提供治疗方法或诊断方法，所述方法包括步骤：检测在试验受 试者中的血清MSP水平，当受试者的血清MSP水平低于正常对照时，向受试者施用RON激动 剂或作出RON相关疾病或MSP相关疾病的诊断。在正常对照中的血清MSP水平可以是在群 体中先前测量的或已知的已知平均正常水平，或可以每次测量。在一些实施方案中，"正常 对照"或"对照"在本上下文中指具有野生型MSP基因的个体、优选地人。在某些其他实施 方案中，对照样品源自不具有rs3197999多态性的个体，优选地人。
[0069] 术语"R0N激动剂"指刺激RON活性和/或通过RON激活RON下游信号传导事件 的分子。在一些实施方案中，通过Akt的磷酸化测量RON活性。本领域技术人员能够分析 其他RON下游效应子作为RON激动剂活性的指示。在一些实施方案中，RON激动剂是MSP 融合蛋白。在某些优选的实施方案中，MSP融合蛋白包含能够形成二聚体的融合结构部分。 在某些其他实施方案中，二聚体MSP融合蛋白结合并募集细胞表面上的R0N，刺激RON信号 传导。在一些实施方案中，融合蛋白是Fc融合蛋白。可以理解，融合结构部分可以是能够 二聚化的另一分子。这种融合结构部分包括而不限于亮氨酸拉链基序。在某些其他实施方 案中，二聚体RON激动剂包含通过接头、优选地柔性接头、最优选地柔性肽接头连接的两个 MSP β结构域。
[0070] 术语"rs3197999多态性"指人MSP基因座中的R689C突变。可以通过本领域已知 的任何合适方法，包括而不限于测序、限制性片段长度多态性分析、PCR分析如基于TaqMan 的qPCR测定法，或通过微阵列方案如SNP阵列，检测rs3197999多态性的存在。本领域技 术人员能够设计用于检测多态性的合适引物和探针。
[0071] 出于本文目的，"人构架"是这样的构架，它包含源自人免疫球蛋白构架或人共有 构架（如下文定义）的轻链可变结构域（VL)构架或重链可变结构域（VH)构架的氨基酸序 列。"源自"人免疫球蛋白构架或人共有构架的受体人构架可以包含与其相同的氨基酸序 列，或它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更小、9 或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小、或2或更小。在一些实 施方案中，VL受体人构架在序列上与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列相同。 [0072] "亲和力"指分子（例如，抗体）的单一结合位点及其结合配偶体（例如，抗原）之 间非共价相互作用的总和的强度。除非另外指出，否则如本文所用，"结合亲和力"指固有结 合亲和力，反映结合对子的成员（例如，抗体和抗原）之间的1:1相互作用。分子X对其配 偶物Y的亲和力通常可以由解离常数（Kd)代表。亲和力可以由本领域已知的常见方法测 量，包括本文所述的那些方法。本申请中描述了用于测量结合亲和力的具体举例说明性和 示例性实施方案。
[0073] "亲和力成熟的"抗体指在一个或多个高变区（HVR)中存在一个或多个改变的抗 体，其中与不拥有这些改变的亲本抗体相比，所述改变导致抗体对抗原的亲和力改善。
[0074] 术语"抗RON抗体"和"与RON结合的抗体"指这样的抗体，所述抗体能够以足够亲 和力结合R0N，从而该抗体可用作靶向RON的诊断药和/或治疗药。在一个实施方案中，抗 RON抗体与不相关的非RON蛋白结合的程度小于该抗体与RON结合的约10%，如通过放射 免疫测定试验（RIA)所测量。在一些实施方案中，与RON结合的抗体具有< 1 μ Μ、< ΙΟΟηΜ、 彡10nM、彡InM、彡0· InM、彡O.OlnM、或彡O.OOlnM(例如KT8M或更小、例如从KT8M至 10- 13Μ、例如从KT9M至I(T13M)的解离常数（Kd)。在一些实施方案中，抗RON抗体与在不同 物种的RON之间保守的RON表位结合。在某些优选的实施方案中，抗RON抗体是激动剂抗 RON抗体。
[0075] 术语"抗体"在本文中以最广意义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克 隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体（例如，双特异性抗体）和抗体片段，只要它们显示出所 需的抗原结合活性即可。
[0076] "抗体片段"或"抗原结合片段"指不同于完整抗体的分子，所述分子包括完整抗 体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv ;Fab ; Fab' ；Fab' -SH ;F(ab'）2 ;双体抗体；线性抗体；单链抗体分子（例如scFv);和从抗体片段 形成的多特异性（包括双特异性）抗体。
[0077] 术语"嵌合"抗体指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物 种，而重链和/或轻链的剩余部分源自不同来源或物种。
[0078] 抗体的"类"指由抗体重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类的抗 体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类（同种型），例 如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域 分别称作α、δ、ε、γ和μ。
[0079] "效应子功能"指随抗体同种型变动的、归因于抗体Fe区的那些生物学活性。抗体 效应子功能的例子包括：Clq结合和补体依赖的细胞毒性（CDC) ;Fc受体结合作用；抗体依 赖的细胞介导的细胞毒性（ADCC);吞噬作用；细胞表面受体（例如，B细胞受体）的下调； 和B细胞活化。
[0080] 药物（例如，药物制剂）的"有效的……量"、"有效量"或"治疗有效量"指，按所 需剂量和时间段，所述量可以有效地实现期望的治疗或预防结果，例如刺激RON信号传导、 促进上皮增殖或增强伤口愈合。构成"有效量"或"治疗有效量"的化合物的量可以根据疾 病的严重性、待治疗患者的状况或年龄、或施用途径而变动，但是可以由本领域普通技术人 员常规地确定。
[0081] 术语"Fc区"在本文中用来定义含有至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链C端 区域。该定义包括天然序列Fe区和变体Fe区。在一个实施方案中，人IgG重链Fe区从 Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fe区的C端赖氨酸（Lys447)可以存在 或可以不存在。除非本文中另外说明，否则Fe区或恒定区中的氨基酸残基编号根据Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interes,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991 中所述的EU编号体系，也称 作EU索引。
[0082] "构架"或"FR"指除高变区（HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR 通常由4个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常按以下顺 序出现在 VH (或 VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
[0083] 术语"全长抗体"、"完整抗体"和"全抗体"在本文中可互换使用，指所述抗体具有 与天然抗体结构基本上相似的结构或具有含有如本文定义的Fc区的重