受试者中rs3197999多态性的存在，检测受 试者中的血清MSP水平，并且当受试者中检出rs3197999多态性时和/或当受试者中的血 清MSP水平比正常对照中低时，向受试者施用RON激动剂。在另外的其他实施方案中，该方 法还包括步骤：检测受试者中rs3197999多态性的存在，检测受试者中的血清MSP水平，并 且当受试者中检出rs3197999多态性时和当受试者中的血清MSP水平比正常对照中低时， 向受试者施用RON激动剂。
[0023] 在又一个方面，本发明提供一种在疑似患有IBD的试验受试者中诊断IBD的方法， 所述方法包括步骤（a)检测或确定受试者的血清MSP水平，（b)任选地检测或确定正常对 照的血清MSP水平，和（c)如果受试者的血清MSP水平低于对照的血清MSP水平，诊断该受 试者患有IBD。在又一个方面，本发明提供一种在疑似有罹患IBD风险的试验受试者中诊断 IBD的方法，所述方法包括步骤（a)检测或确定受试者的血清MSP水平，（b)任选地检测或 确定正常对照的血清MSP水平，和（c)如果受试者的血清MSP水平低于对照的血清MSP水 平，诊断该受试者有罹患IBD的风险。在一些实施方案中，该方法还包括步骤：确定试验受 试者中rs3197999多态性的存在，并且当受试者中检出rs3197999多态性时，诊断受试者患 有IBD或有罹患IBD的风险。
[0024] 在又一个方面，本发明提供诊断疑似患有或有风险患有伤口愈合缺陷、病况或障 碍的受试者的方法，包括步骤（a)检测受试者的血清MSP水平或检测受试者中rs3197999 多态性的存在；(b)任选地检测正常对照的血清MSP水平；和（c)如果受试者的血清MSP水 平低于正常对照的血清MSP水平，诊断受试者患有或有风险患有伤口愈合缺陷。在一些实 施方案中，该方法还包括检测正常对照的血清MSP水平的步骤。在一些实施方案中，该方法 还包括步骤：检测受试者的血清MSP水平并检测受试者中rs3197999多态性的存在，并且当 受试者中检出rs3197999多态性时或当受试者的血清MSP水平低于正常对照的血清MSP水 平时，诊断受试者患有或有风险患有伤口愈合缺陷、病况或障碍。在某些其他实施方案中， 该方法还包括步骤：检测受试者的血清MSP水平并检测受试者中rs3197999多态性的存在， 并且当受试者中检出rs3197999多态性且当受试者的血清MSP水平低于正常对照的血清 MSP水平时，诊断受试者患有或有风险患有伤口愈合缺陷、病况或障碍。在一些实施方案中， 伤口愈合是上皮细胞伤口愈合。在一些实施方案中，受试者患有IBD或有风险患有IBD。在 某些其他实施方案中，受试者是糖尿病受试者。
[0025] 在另一个方面，本发明提供使用本发明的抗RON抗体或MSP融合蛋白检测样品中 RON的方法。在又一个方面，本发明提供了使用抗RON抗体或MSP融合蛋白在受试者中或在 来自受试者的样品中诊断与改变的RON表达水平相关的疾病或病状的方法。
[0026] 在以上全部方面的一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在以上全部方面的某些 其他实施方案中，受试者是人。在以上全部方面的某些其他实施方案中，受试者是患有糖尿 病的人。
[0027] 在又一个方面，本发明提供分离的核酸分子，其具有编码RON激动剂的多核苷酸 序列。在一些实施方案中，分离的核酸分子包含编码抗RON抗体的多核苷酸序列。在某些 其他实施方案中，分离的核酸分子包含编码MSP融合蛋白的多核苷酸序列。在一些实施方 案中，核酸分子包含与SEQ ID N0:19、21或23的多核苷酸序列至少80%、85%、90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的多核苷酸序列。在一些实施方案中， 核酸分子包含SEQ ID NO: 19、21或23的多核苷酸序列。在某些具体实施方案中，核酸分子 包含SEQ ID NO: 19的多核苷酸序列。
[0028] 在另一个方面，本发明提供包含多核苷酸序列的载体，所述多核苷酸序列编码RON 激动剂。在又一个方面，本发明提供宿主细胞，所述宿主细胞包含含有多核苷酸序列的核酸 分子或包含多核苷酸序列的载体，其中所述多核苷酸序列编码RON激动剂。在一些实施方 案中，载体是包含编码抗RON抗体的多核苷酸序列的表达载体。在某些其他实施方案中，载 体是包含编码MSP融合蛋白的多核苷酸序列的表达载体。在某些具体实施方案中，融合蛋 白包含SEQ ID N0:20的氨基酸序列。本发明也提供一种产生MSP融合蛋白的方法，所述方 法包括步骤（a)在允许表达MSP融合蛋白的条件下培养宿主细胞；和（b)回收MSP融合蛋 白。
[0029] 在另一个方面，本发明提供分离的RON激动剂抗体。在一些实施方案中，RON激动 剂抗体包含与单克隆抗体YW651. 1或2E5. 8. 1的高变区序列至少95 %相同的高变区序列。 在一些实施方案中，抗体是抗人RON激动剂抗体。
[0030] 在其他方面，本发明提供包含多核苷酸序列的分离核酸分子，所述多核苷酸序列 编码RON激动剂抗体。在一些实施方案中，抗体是抗人RON激动剂抗体。在另一个方面，本 发明提供包含多核苷酸序列的载体，所述多核苷酸序列编码抗人RON抗体。在又一个方面， 本发明提供宿主细胞，所述宿主细胞包含含有编码抗体的多核苷酸的核酸分子，或包含含 有编码抗体的多核苷酸序列的载体。在一些实施方案中，载体是包含多核苷酸序列的表达 载体，所述多核苷酸序列编码分离的抗体。本发明也提供一种产生本文所述的分离抗体的 方法，所述方法包括步骤（a)在允许表达分离抗体的条件下培养宿主细胞；和（b)回收分离 的抗体。
[0031] 在又一个方面，本发明提供RON激动剂用于制备治疗MSP相关或RON相关的疾病 或病症的药物的用途。在一些实施方案中，MSP相关或RON相关的疾病或病症是IBD或伤口 愈合，特别地是上皮伤口愈合，的缺陷。在某些其他实施方案中，RON激动剂是抗人RON抗 体或人MSP融合蛋白。
[0032] 本发明的具体实施方案将从以下对某些优选实施方案的更详细描述和权利要求 书显而易见。
[0033] 除非上下文另外清楚地指明，否则上文描述的任何和全部实施方案可以适用于本 发明的任何和全部方面。
[0034] 附图简述
[0035] 图IA-D显示了检验RON在小鼠髓样细胞群体和上皮细胞群体中表达的结果。图IA 显示所示细胞群体或组织的单细胞悬液的直方图，其中使用鼠 RON特异性单克隆抗体（Ph4 抗体，Genentech) (Chaudhuri等人，提交用于发表的手稿）或同种型对照抗体（加阴影直 方图），通过流式细胞术分析所述单细胞悬液的RON表达。对巨噬细胞群体设门，其中对离 体来源的细胞使用⑶45 +F4/80+CDllb+MHC II类+，对骨髓培养细胞使用F4/80+CDllb+。结肠 上皮细胞设门为⑶45?钙黏着蛋白+。图IB显示来自正常小鼠结肠的组织切片的免疫组织 化学染色的显微照片，显示了 RON在上皮细胞的基底外侧面表达。图IC展示来自正常小鼠 结肠的组织切片的免疫荧光染色的显微照片，其中对所述组织切片进行RON染色并且对细 胞核进行复染。白色箭头显示单个上皮细胞的顶面。图ID显示来自小鼠结肠的组织切片 的免疫荧光染色的显微照片，其中在用硫酸葡聚糖钠（DSS)处理后6日取得所述组织，进行 RON、MHC II类、F4/80染色，并进行细胞核复染（A-D)。显示单独染色和合并图像（A-D)。 图IE显示RON的免疫荧光染色的显微照片。比例尺=100ym(B)，10ym(C)，20ym(D)和 40μπι(Ε)。这些图涉及实施例1。
[0036] 图2A-D展示实施例1中描述的结果，显示RON在人类中由上皮细胞优先地表达。 图2A显示人细胞系和原代细胞中RON表达的定量RT-PCR调查结果。栏I :HEK293对照，栏 2-4 :上皮细胞系（HCT115、HT29、HPC4)，栏 5-6 :单核细胞系（U937、THP-1)，栏 7 :人 CD14+ 单核细胞（monos)，和栏8-11 :保持未处理的或用所示刺激物处理的单核细胞来源的巨噬 细胞（MDM)。栏1-7中的数据是三份独立样品的均数+/-SD，栏8-11中的数据是两个供体 的均数。图2B显示单细胞悬液的RON表达的流式细胞分析的直方图。用人RON特异性单 克隆抗体（克隆 1A2. 2, Chaudhuri 等人，2011，J Biol Chem. 286 (37) :32762-74)或同种型 对照抗体（加阴影直方图）染色细胞。将MDM设门为⑶14+⑶33+。图2C显示来自正常结 肠、UC结肠和⑶结肠的组织切片的显微照片，对所述组织切片进行RON表达的免疫组织化 学染色。比例尺=100 μπι。图2D总结了在人肠道活组织检查样品中定量RT-PCR分析RON 表达的数据，其中所述人肠道活组织检查样品取自正常个体以及UC患者和CD患者的未发 炎区域和发炎区域。图2E显示从溃疡性结肠炎患者切除的肠组织的单细胞悬液中RON表 达的流式细胞分析的直方图，其中使用人RON特异性单克隆抗体（克隆1A2. 2)或同种型对 照抗体（加阴影直方图）进行分析。将巨噬细胞设门为⑶45+CD14+HLADR+并且将上皮细胞 设门为CD45TpCAM +细胞。巨噬细胞数据代表六个供体，上皮细胞数据代表三个供体。图2F 显示来自多个供体的切除肠组织的巨噬细胞和上皮细胞中RON表达的定量结果。显示患者 数目。数据表示RON染色对同种型对照染色的平均荧光强度比。点划线表示比率1:1，即缺 少RON表达。N，无 IBD。图2G描述的直方图显示未处理的细胞或用与图2E相同的消化条 件处理的细胞中RON表达水平。
[0037] 图3A-E显示实施例2重组人MSP蛋白结合研宄的结果。图3A是这项研宄中使用 的重组人MSP蛋白的示意图。显示了含有由二硫键连接的α和β链的野生型MSP蛋白 (SEQ ID NO: 12)，指出了 PAN结构域（N)、三环结构域（K)、丝氨酸蛋白酶样结构域（SPL)。 单链MSP(scMSP)(SEQ ID N0:6)是组成型无活性的，原因是蛋白酶剪切位点处的R483E突 变（箭头）。产生689R形式和689C形式的全长MSP蛋白和MSPI3蛋白（分别是SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 10)。图3B显示使用平板结合的RON-Fc (SEQ ID NO: 44)和可溶性MSP 的无细胞结合试验的结果。显示每组三个重复的均数。曲线代表针对4参数方程拟合的 剂量-反应曲线，针对 MSP 689R、689C、MSP0 689R(SEQ ID N0:2、4 和 8)和 MSP0 689C(SEQ ID NO: 10)分别产生了 EC50值0. 1、0. 2、0. 05和0.1 nM。图3C展示MSP蛋白与固定化RON Sema/PSI结合的SPR分析结果，以响应单位显示相对响应。数据代表三次独立实验。图3D 显示MSP与RON结合的放射配体结合试验结果。显示了与3T3-hR0N细胞的竞争结合（大 图），用来产生亲和力和斯卡查德图（插图）。显示三次独立实验的均数+/_标准差（SD)。 图3E是与MSP b (PDB代码2ASU)(显示在顶部）结合的RON Sema/PSI (PDB代码4FWW)(显 示在底部）结构的同源模型。将RON和MSPI3与Met/HGFi3复合物（PDB代码1SHY)在总 体上对齐。星号标出在RON 4Λ内的MSP β接触残基的预测位置。MSP β残基689突变成 半胱氨酸并由箭头标出。RON的残基Α223位于:MSPP的假Sl 口袋顶部。
[0038] 图4Α-Β展示考马斯亮兰染色的凝胶电泳图，其显示MSP原的蛋白酶解加工。由 MSP原和MSP组成的纯化MSP 689R (图4Α)和MSP 689C (图4Β)与渐增量的h印sin混合并 在还原条件下通过凝胶电泳分析。显示与MSP原、MSPa和MSP β对应的相对迀移率。数 据代表三次独立实验。数据涉及实施例3。
[0039] 图5A展示在所示处理的A2780-hR0N细胞和BxPC3细胞中总Akt和pAkt的蛋白 质印迹分析的照片。一式三份进行印迹并且显示PAkt/总比率的均数。图5B显示MSD分 析用scMSP或MSP变体处理的3T3-hR0N细胞的结果。显示三次处理的均值+/-SD。数据代 表三次独立实验。图5C显示来自用scMSP或MSP变体处理的3T3-hR0N细胞的划痕试验的 图像。在划痕后在所示时间自相同的细胞培养物获取图像。短划线代表初始划痕的位置。 图显示对来自3T3-hR0N细胞划痕试验的结果的定量，所述3T3-hR0N细胞用培养基单独 处理或用scMSP或MSP变体处理。显示三次处理的均值+/-SD。数据代表三次独立实验。 图5E显示对来自亲本3T3细胞（不表达RON受体）的划痕试验结果的定量，所述亲本3T3 细胞用scMSP或MSP变体处理。显示三次处理的均值，误差线显示标准差。数据代表三次 独立实验。这些图涉及实施例4。
[0040] 图6A总结了实施例5分析来自EMBARK队列的正常、UC患者和⑶患者的DNA样 品中rs3197999等位基因的结果。C等位基因编码MSP689R，T等位基因编码MSP 689C。显 示每个组的等位基因频率和数目。图6B显示EMBARK受试者的匹配血清样品中由ELISA测 定的血清MSP浓度，结果按rs3197999基因型分组。*，ρ = 0·0009;#，ρ〈0·001。图6C显 示按基因型和疾病状态分组的血清MSP浓度。图6D显示MSP ELISA测定在重组人MSP变 体和scMSP上的灵敏度。误差线代表标准差。
[0041] 图7A涉及实施例5,其显示使用对pcDNA5/FRT中MSP表达盒特异的引物在稳定 转染的细胞上获得的定量PCR数据的柱形图。使用AC t方法，将MSP盒的值对总DNA归一 化。显示了两个表达689R的克隆和两个表达689C的克隆的值。数据是三份独立样品的均 数，误差线代表标准差。亲本293FlpIn细胞。图7B的柱形图显示ELISA测定的结果，所述 ELISA测定测量稳定转染的细胞克隆向细胞上清液分泌的MSP。通过CellTiter-Gl0测定 法（Promega)，相对于细胞量的差异，控制ELISA值。显示了两个表达689R的克隆和两个表 达689C的克隆的值。数据是三份独立样品的均数并且误差线代表标准差。亲本293FlpIn 细胞。
[0042] 图8描述了 MSPI3 -IgG Fc融合蛋白的设计。人或小鼠 MSPI3与具有或没有长4、 8、12或16个氨基酸残基的肽接头的小鼠 IgG2a的Fc结构域融合。在实施例部分中描述融 合蛋白的克隆。
[0043] 图9显示了检查人全长MSP、人及鼠 MSPg:和不同MSP^-Fc融合蛋白对鼠 RON-Fc的结合活性的结合测定试验的实验设计和结果。该图涉及实施例6。
[0044] 图10显示实施例7的结果，显示在体外MSP β -Fc融合蛋白与小鼠 RON (mRON)结 合并且激活mRON信号传导。图IOA-B显示各种mMSP|3-IgG2a蛋白与细胞表面上表达mRON 的3T3细胞