编码乙酰乳酸合酶的基因的制作方法

专利名称：编码乙酰乳酸合酶的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码支链氨基酸生物合成途径中的限速酶-乙酰乳酸合酶的基因。
背景技术：
乙酰乳酸合酶(此后称为“ALS”)是支链氨基酸，如亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸的生物合成途径中的限速酶，是已知的对于植物生长重要的酶。已知ALS存在于许多种高等植物中。此外，在多种微生物中发现了ALS，例如酵母(酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))、大肠杆菌(Escherichia coli)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)。
已知在大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌中存在ALS的三种同工酶。每种同工酶都是杂寡聚体，其中由控制酶催化活性的大分子量的催化亚基和通过结合支链氨基酸而具有反馈抑制剂功能的小分子量调节亚基组成(Chipman等，Biochim.Biophys.Acta.1385，401-419，1998)。催化亚基分别位于IIv IH、IIv GM和IIv BN操纵子上。另外，酵母中的ALS是单体酶，同细菌中的一样，其中包括催化亚基和调节亚基(Pang等，Biochemitry，38，5222-5231，1999)。催化蛋白亚基位于ILV2基因座。
已知在植物中的ALS同上述微生物中一样由催化亚基和调节亚基组成(Hershey等，Plant Molecular Biology.40，795-806，1999)。例如，烟草(双子叶植物)中的ALS的催化亚基由两个基因座，SuRA和SuRB编码(Lee等，EMBO J.7，1241-1248，1988)；玉米中的由两个基因座，a1s1和a1s2编码(Burr等，Trends in Genetics 7，55-61，1991；Lawrence等，Plant Mol.Biol.18，1185-1187，1992)。双子叶植物包括烟草、拟南芥、油菜籽、棉花、苍耳属、苋属和地肤属中编码催化亚基的基因的核苷酸序列已经完全测定(见Chipman等，Biochim.Biophys.Acta.1385，401-419，1998和专利申请WO97/08327的PCT国际公开的国内再公开)。但是，单子叶植物中只有玉米和水稻的该核苷酸序列被完全测定(Kaku等，the 26thConference of Pesticide Science Society of Japan，LectureAbstract，p101，2001)。
同时，除草剂例如磺酰脲除草剂、咪唑啉酮除草剂、三唑嘧啶除草剂和嘧啶羧基除草剂(此后称之为“PC除草剂”)已知是通过抑制ALS来抑制植物生长的(Ray，Plant Physiol.75，827-831，1984；Shaner等，Plant Physiol.76，545-546，1984；Subramanian等，Plant Physiol.96，310-313，1991；Shimizu等，J.Pestic Sci.19，59-67，1994)。
如表1和表2所示，已知的对这些除草剂抗性的植物包含的编码ALS的基因中有一个或两个核苷酸被取代，该取代能诱导不同物种的保守区域中一个或两个氨基酸的取代。
表1造成对ALS抑制型除草剂抗性的植物ALS突变(1)
表2造成对ALS抑制型除草剂抗性的植物ALS突变(2)
这种基因的实例包括编码特异性抗磺酰脲除草剂的ALS的基因(见Kathleen等，EMBO J，7，1241-1248，1988；Mourad等，Planta，188，491-497，1992；Guttieri等，Weed Sci.43，175-178，1995；Bernasconi等，J.Biol.Chem.270，17381-17385，1995；和日本公开专利(未审查申请)No.63-71184)；编码特异性抗咪唑啉酮除草剂的ALS的基因(见Mourad等，Planta，188，491-497，1992；Lee等，FEBS Lett.452，341-345，1999；和日本公开专利(未审查申请)No.5-227964)；编码同时特异性抗磺酰脲除草剂和咪唑啉酮除草剂的ALS的基因(见Kathleen等，EMBO J，7，1241-1248，1988；Bernasconi等，J.Biol.Chem.270，17381-17385，1995；Hattori等，Mol.Gen.Genet.246，419-425，1995；Alison等，PlantPhysiol.111，1353，1996；Rajasekarau等，Plant Sci.119，115-124，1996；日本公开专利(未审查申请)No.63-71184；日本公开专利(未审查申请)No.4-311392；和Bernasconi等，美国专利5633437，1997)；以及编码高水平抗PC除草剂的ALS的基因(Kaku等，the 26thConference of Pesticide Science Society of Japan，Lecture Abstracts，p101，2001)。尝试通过将含有特异性抗磺酰脲除草剂的ALS植物和含有特异性抗咪唑啉酮除草剂的ALS的植物杂交得到如下植物体，其显示出对磺酰脲除草剂和咪唑啉酮除草剂都抗(Mourad等，Mol.Gen.Genet，243，178-184，1994)。此外，也尝试着将编码ALS的基因人工改变成除草剂抗性基因(见Ott等，J.Mol.Biol.263，359-368，1996，日本公开专利(未审查申请)No.63-71184，日本公开专利(未审查申请)No.5-227964，日本公开专利(PCT译文)No.11-504213)，结果发现一个氨基酸的缺失会使ALS显示出同时抗磺酰脲除草剂和咪唑啉酮除草剂(见日本公开专利(未审查申请)No.5-227964)。
如上所述，具有抗除草剂的ALS和编码ALS的基因得到深入的研究。然而，只有少数一些关于利用抗PC除草剂作为指示的ALS突变基因具有特异性抗PC除草剂的报道。此外，也只有少数一些有关于抗PC除草剂和其它除草剂的研究的报道。
发明概述本发明的目的是提供一种编码显示以非常高水平抗PC除草剂或磺酰脲除草剂的ALS蛋白的基因，一种由该基因编码的ALS蛋白，一种带有该基因的重组载体，一种带有该重组载体的转化体，一种带有该基因的植物，一个培养该植物的方法，以及一种利用该基因作为筛选标记筛选转化体细胞的方法。
作为实现上述目的而进行彻底研究的结果，我们发现了一种来源于野生型ALS的ALS突变体，它是通过用一个特定氨基酸将野生型ALS的一个特定氨基酸残基替换而得到的，其显示出非常高的对PC除草剂的抗性能力，从而完成了本发明。
(1)具体而言，本发明是一种编码下列蛋白(a)或(b)的基因(a)一种由SEQ ID NOS2、4、6和8中任意一种氨基酸序列组成的蛋白；(b)一种由通过SEQ ID NOS2、4、6和8中任意一种氨基酸序列进行替换、缺失或添加至少一个或多个氨基酸而衍生得到的氨基酸序列组成的蛋白，该蛋白具有对嘧啶羧基除草剂的抗性和乙酰乳酸合酶的活性。
(2)进一步，本发明是一种由基因(1)编码的乙酰乳酸合酶蛋白。
(3)进一步，本发明是一种带有基因(1)重组载体。
(4)进一步，本发明是一种带有重组载体(3)转化体。
(5)进一步，本发明是一种带有基因(1)并且对PC除草剂有抗性的植物。
(6)进一步，本发明是一种包含在PC除草剂存在时培养植物(5)的方法。
(7)更进一步，本发明是一种利用基因(1)作为筛选标记筛选具有基因(1)的转化体细胞的方法。
以下对本发明作出更详细的说明。
编码本发明中乙酰乳酸合酶的基因(此后称为“突变ALS基因”)编码一种乙酰乳酸合酶蛋白(此后称为“突变ALS蛋白”)，该蛋白具有不同于野生型的乙酰乳酸合酶蛋白(此后称为“野生型ALS蛋白”)的氨基酸序列。突变的ALS蛋白可通过突变水稻植物中表达的野生型ALS蛋白一个特定位点而得到。本发明中的突变ALS蛋白由任何一种SEQ ID NO2、4、6和8的氨基酸序列组成。
氨基酸序列SEQ ID NO2是由野生型ALS蛋白的氨基酸序列中的脯氨酸171由组氨酸替换，精氨酸172由丝氨酸替换而衍生的。含有氨基酸序列SEQ ID NO2的突变ALS蛋白被称为“P171H/R172S突变ALS蛋白”或“P171H/R172S突变体”。
氨基酸序列SEQ ID NO4是由野生型ALS蛋白的氨基酸序列中的脯氨酸171由组氨酸替换，色氨酸548由亮氨酸替换而衍生的。含有氨基酸序列SEQ ID NO4的突变ALS蛋白被称为“P171H/W548L突变ALS蛋白”或“P171H/W548L突变体”。
氨基酸序列SEQ ID NO6是由野生型ALS蛋白的氨基酸序列中的脯氨酸171由组氨酸替换，丝氨酸627由异亮氨酸替换而衍生的。含有氨基酸序列SEQ ID NO6的突变ALS蛋白被称为“P171H/S627I突变ALS蛋白”或“P171H/S627I突变体”。
氨基酸序列SEQ ID NO8是由野生型ALS蛋白的氨基酸序列中的脯氨酸171由组氨酸替换，色氨酸548由亮氨酸替换，丝氨酸627由异亮氨酸替换而衍生的。含有氨基酸序列SEQ ID NO8的突变ALS蛋白被称为“P171H/W548L/S627I突变ALS蛋白”或“P171H/W548L/S627I突变体”。


图1A和1B显示出四种突变体ALS蛋白和野生型ALS蛋白氨基酸序列的对比结果。此外在图1A和1B中，第一排氨基酸序列代表野生型ALS蛋白，第二排氨基酸序列代表P171H/R172S突变ALS蛋白，第三排氨基酸序列代表P171H/W548L突变ALS蛋白，第四排氨基酸序列代表P171H/S627I突变ALS蛋白，第五排氨基酸序列代表P171H/W548L/S627I突变ALS蛋白。
和野生型ALS蛋白相比，这些突变ALS蛋白不仅对PC除草剂有良好抗性，而且对磺酰脲除草剂和咪唑啉酮除草剂都有良好的抗性。这是通过将编码突变ALS蛋白的基因亚克隆到pGEX2T，用pGEX2T转化大肠杆菌等，然后检测表达的突变ALS蛋白对除草剂的敏感性来证明的。
PC除草剂的例子包括双嘧苯甲酸钠、嘧硫苯甲酸钠、2-[(4，6-二甲基氧基嘧啶-2基)氧]-6-[1-(甲氧基亚氨基)乙基]苯甲酸，如下列化学式1所示 双嘧苯甲酸钠 嘧硫苯甲酸钠 2-[(4，6-二甲基氧基嘧啶-2基)氧]-6-[1-(甲氧基亚氨基)乙基]苯甲酸磺酰脲除草剂的例子是绿黄隆，如下列化学式2所示
绿黄隆咪唑啉酮除草剂的例子是灭草喹，如下列化学式3所示 灭草喹特别要指出的是，P171H/R172S突变ALS蛋白显示出对某些的除草剂在一定水平上的抗性，其不仅优于单独具有P171H或R172S的突变ALS蛋白，而且优于预期的使用单独具有P171H或R172S的突变ALS蛋白的组合抗性。此外，单独具有R172S的突变ALS蛋白没有显示出对任何除草剂有抗性，因此R172S突变是一个沉默突变。换句话说，在P171H/R172S突变ALS蛋白中，R172S突变本身是一个沉默突变，改善了P171H突变ALS蛋白的抗性。
此外，P171H/W548L突变ALS蛋白显示出对某些的除草剂在一定水平上的抗性，其不仅优于单独具有P171H或W548L的突变ALS蛋白，而且优于预期的使用单独具有P171H或W548L的突变ALS蛋白的组合抗性。换句话说，P171H/W548L突变ALS蛋白显示出的抗性要远远大于预期的P171H突变蛋白和W548L突变蛋白抗性的协同作用。
此外，特别要指出的是，P171H/S627I突变ALS蛋白显示出对某些的除草剂在一定水平上的抗性，其不仅优于单独具有P171H或S627I的突变ALS蛋白，而且优于预期的使用单独具有P171H或S627I的突变ALS蛋白的组合抗性。换句话说，P171H/S627I突变ALS蛋白显示出的抗性要远远大于预期的P171H突变蛋白和S627I突变蛋白抗性的协同作用。
此外，特别要指出的是，P171H/W548L/S627I突变ALS蛋白显示出对某些的除草剂的抗性要优于单独具有P171H，W548L或S627I的突变ALS蛋白。
而且，本发明中突变ALS蛋白由对任何一个SEQ ID NO2、4、6和8氨基酸序列进行替换、缺失或添加至少一个或多个氨基酸得到的氨基酸序列组成，只要该序列具有对PC除草剂的抗性和乙酰乳酸合酶的活性。在此，“一个或多个氨基酸”优选是指1到30个氨基酸，更优选1到20个氨基酸，更优选1到10个氨基酸。
特别的是，在氨基酸序列SEQ ID NO2中，“至少一个或多个氨基酸”优选为除了第171和172氨基酸以外的一个或多个氨基酸。在氨基酸序列SEQ ID NO4中，“至少一个或多个氨基酸”优选为除了第171和548氨基酸以外的一个或多个氨基酸。在氨基酸序列SEQ IDNO6中，“至少一个或多个氨基酸”优选为除了第171和627氨基酸以外的一个或多个氨基酸。在氨基酸序列SEQ ID NO8中，“至少一个或多个氨基酸”优选为除了第171、627和548氨基酸以外的一个或多个氨基酸。
本发明中突变ALS基因没有被特别限定，只要它含有编码上述突变ALS蛋白的核苷酸序列。核苷酸序列的例子包括任何一个SEQ IDNO1、3、5和7中的核苷酸序列。核苷酸序列SEQ ID NO1编码氨基酸序列SEQ ID NO2，核苷酸序列SEQ ID NO3编码氨基酸序列SEQID NO4，核苷酸序列SEQ ID NO5编码氨基酸序列SEQ ID NO6，核苷酸序列SEQ ID NO7编码氨基酸序列SEQ ID NO8。突变ALS基因可以含有来源于通过用简并密码子替换编码特定氨基酸的密码子而得到的SEQ ID NO1、3、5和7中任何一个的核苷酸序列。
图2A、B、C和D显示出编码这四种突变ALS蛋白的核苷酸序列和编码野生型ALS蛋白的核苷酸序列的对比结果。在图2A、B、C和D中，第一排核苷酸序列代表野生型ALS蛋白，第二排核苷酸序列代表P171H/R172S突变ALS蛋白，第三排核苷酸序列代表P171H/W548L突变ALS蛋白，第四排核苷酸序列代表P171H/S627I突变ALS蛋白，第五排核苷酸序列代表P171H/W548L/S627I突变ALS蛋白。
此外，本发明中突变ALS基因由一个核苷酸序列组成，它可以在严格的条件下与任何一个SEQ ID NO1、3、5和7中的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交，其能够编码具有乙酰乳酸合酶活性的氨基酸序列。“严格条件”是指其中所谓的特异性杂交形成，而非特异性的杂交不能形成的条件。具有这样严格条件的例子包括彼此之间具有高度同源性的DNA(例如DNA彼此之间有50％或者更多的同源性)杂交，彼此之间具有低同源性的DNA不杂交的条件。可能进行杂交的严格条件的特定例子包括在常规的60℃Southern杂交中的漂洗条件，以及相应的1×SSC，0.1％SDS，或优选的0.1×SSC，0.1％SDS的盐浓度。
编码这些突变ALS蛋白的基因可通过将上述的突变引入到编码野生型ALS蛋白的基因中获得，后者存在于日本产水稻品种Kinmaze的基因组DNA中。任何已知的技术都可以用于引入突变。例如，可以使用定点诱变。定点诱变可以使用一种商业化的试剂盒来完成，例如，Mutan-K(Takara Shuzo)、Gene Editor(Promega)或ExSite(Stratagene)。
此外，编码突变ALS蛋白的基因可以通过在有PC除草剂存在时培养对PC除草剂敏感的野生型培养细胞，然后从显示出具有对PC除草剂有抗性的突变培养细胞中得到基因。然后，编码具有新的突变组合的ALS蛋白的基因可以根据已有的突变，通过PCR方法和SPR(自体聚合酶反应)方法用酶合成。
特别要指出的是，首先，mRNA是从抗PC除草剂的突变培养细胞中制备的，接着合成cDNA，然后构建了λgt 11噬菌体的cDNA文库。然后，利用含有编码野生型ALS蛋白的基因部分的核酸探针筛选此文库。接着，将由此得到的阳性克隆的插入DNA亚克隆到pBluescriptII SK+来测定核苷酸序列。对于已显示出有突变的cDNA插入片段来说，含有突变的片段可以利用保留有插入DNA的pBluescript II SK+作为模板，通过PCR和SPR方法合成，引物是根据野生型水稻ALS基因而设计的。同时，由PC除草剂抗性水稻培养细胞制备基因组DNA，根据水稻ALS基因设计各种不同的引物。然后，采用引物步移法使存在于制备好的基因组DNA中的ALS基因序列得到测定，从而找到突变位点。当突变被发现时，利用PCR和SPR方法合成含有突变的片段。将由克隆到pBluescript II SK+中的突变ALS cDNA(包括含有这些突变的片段)合成的含有突变的片段亚克隆到pGEX2T，然后利用此载体转化大肠杆菌。
随后筛选含有编码由SEQ ID NO2、4、6和8所表示的氨基酸序列的插入DNA的克隆，从而得到编码突变ALS蛋白的基因。此外，在2002年3月8日，根据布达佩斯条约，这样得到的编码含有SEQ IDNO2中表示的氨基酸序列的突变ALS蛋白的基因整合入pGEX2T中的质粒作为水稻突变ALS cDNA1(FERM BP-7944)而被保存，编码含有SEQID NO4中表示的氨基酸序列的突变ALS蛋白的基因整合入pGEX2T中的质粒作为水稻突变ALS cDNA2(FERM BP-7945)而被保存，编码含有SEQ ID NO6中表示的氨基酸序列的突变ALS蛋白的基因整合入pGEX2T中的质粒作为水稻突变ALS cDNA3(FERM BP-7946)而被保存，含有编码SEQ ID NO8中表示的氨基酸序列的突变ALS蛋白的基因整合入pGEX2T中的质粒作为水稻突变ALS cDNA4(FERM BP-7947)而被保存在国立高级工业科学和技术研究所专利和生物资源中心(Chuo-6，1-1-1，Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki，JAPAN)。
另一方面，利用编码突变ALS蛋白的基因转化靶植物，可以使植物对各种不同的除草剂产生抗性，例如PC除草剂。可以使用任何已知的的技术来转化植物。举例来说，一个外源基因可以通过使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)而被导入到靶植物细胞中。
更具体而言，将编码突变ALS蛋白的基因插入到含有农杆菌的一个Ti质粒T-DNA序列的二元载体中。将此Ti质粒转化入大肠杆菌等。然后，将通过如大肠杆菌复制的保留了编码突变ALS蛋白的基因的二元载体转化到含有辅助质粒的农杆菌中。用农杆菌感染靶植物，然后鉴定转化的植物。当鉴定的转化植物是一个培养细胞时，植物细胞可通过任何已知的技术再生成完整的植株。
为了用编码突变ALS蛋白的基因转化靶植物，基因可利用已知的标准技术引入。转化含有编码突变ALS蛋白的基因的表达载体的方法的例子包括聚乙二醇方法，电穿法和基因枪法。
编码突变ALS蛋白的基因可被转化到任何一种类型的植物中，例如单子叶植物和双子叶植物。编码突变ALS蛋白的基因可以转化到的靶农作物例子包括水稻，玉米，小麦，大麦，大豆，棉花，油菜籽，糖用甜菜和烟草。此外，也可以通过引入编码突变ALS蛋白的基因转化草坪用草，树木等。
在上述任何一个例子中，将编码突变ALS蛋白的基因转化植物可以给予植物对PC除草剂、磺酰脲除草剂和咪唑啉酮除草剂的抗性。
此外，在转化植物的实验中，编码突变ALS蛋白的基因可以作为筛选标记使用。例如，利用靶基因转化植物时，带有编码突变ALS蛋白的基因和靶基因的载体被引入到植物细胞中，接着在PC除草剂或者其它除草剂的存在下培养植物细胞。如果植物细胞在除草剂的存在下能存活，表示此植物细胞含有编码突变ALS蛋白的基因和引入到那里的靶基因。此外，可以通过观察植物的表型，然后利用基因组southern杂交或PCR检查基因组上这些基因的存在，来证实靶基因和编码突变ALS蛋白的基因是否被插入到植物细胞的染色体上。
附图简述图1A显示突变ALS蛋白和野生型ALS蛋白之间的氨基酸序列的比较。
图1B续图1A，显示突变ALS蛋白和野生型ALS蛋白之间的氨基酸序列比较。
图2A显示突变ALS基因和野生型ALS基因之间的核苷酸序列的比较。
图2B续图2A，显示突变ALS基因和野生型ALS基因之间的核苷酸序列的比较。
图2C续图2B，显示突变ALS基因和野生型ALS基因之间的核苷酸序列的比较。
图2D续图2C，显示突变ALS基因和野生型ALS基因之间的核苷酸序列的比较。
图3是显示Rb系对双嘧苯甲酸钠的敏感性特征图。
图4是显示Sr系对双嘧苯甲酸钠的敏感性特征图。
图5是显示Ga系对双嘧苯甲酸钠的敏感性特征图。
图6是显示Vg系对双嘧苯甲酸钠的敏感性特征图。
图7是显示野生型对双嘧苯甲酸钠的敏感性特征图。
图8是显示野生型对绿黄隆的敏感性特征图。
图9是显示Rb系对绿黄隆的敏感性特征图。
图10是显示Sr系对绿黄隆的敏感性特征图。
图11是显示Ga系对绿黄隆的敏感性特征图。
图12是显示Vg系对绿黄隆的敏感性特征图。
图13是显示用阴离子交换柱色谱分离抗性突变ALS蛋白时，组分编号和525nm下OD吸收值之间的关系的特征图。
图14是显示用阴离子交换柱色谱分离抗性野生型ALS蛋白时，组分编号和525nm下OD吸收值之间的关系的特征图。
图15是野生型ALS蛋白和突变ALS蛋白对双嘧苯甲酸钠的敏感性特征图。
图16是野生型ALS蛋白和突变ALS蛋白对绿黄隆的敏感性特征图。
图17是野生型ALS蛋白和突变ALS蛋白对灭草喹的敏感性特征图。
图18A显示Nippon-bare EST和玉米ALS基因之间的核苷酸序列比较。
图18B续图18A，显示Nippon-bare EST和玉米ALS基因之间的核苷酸序列比较。
图19A是来自于Sr系和来自于野生型cDNA1的全长cDNA之间的核苷酸序列比较。
图19B续图19A，显示来自于Sr系和来自于野生型cDNA1的全长cDNA之间的核苷酸序列比较。
图19C续图19B，显示来自于Sr系和来自于野生型cDNA1的全长cDNA之间的核苷酸序列比较。
图20显示合成单独带有G1643T(W548L)突变或G1880T(S627I)突变的ALS cDNA的过程，以及构建带有ALS cDNA的质粒pGEX 2T的过程。箭头表示引物，星号表示突变位点。
图21显示制备C512A(P171H)突变DNA片段和C514A(R172S)突变DNA片段的过程。箭头表示引物，星号表示突变位点。
图22显示合成单独带有G512A(P171H)突变或C514A(R172S)突变的ALS cDNA的过程，以及构建带有ALS cDNA的质粒pGEX 2T的过程。星号表示突变位点。
图23显示制备具有C512A(P171H)/C514A(R172S)DNA片段的过程。箭头表示引物，星号表示突变位点。
图24显示合成P171H/W548L突变ALS cDNA和P171H/S627I突变ALS cDNA的过程，以及构建带有ALS cDNA的质粒pGEX 2T的过程。星号表示突变位点。
图25显示合成带有P171H/W548L/S627I突变的ALS cDNA的过程，以及构建带有ALS cDNA的质粒pGEX 2T的过程。星号表示突变位点。
图26显示由1点突变ALS基因编码的突变ALS蛋白和野生型ALS蛋白之间对双嘧苯甲酸钠的敏感性的比较。
图27显示由2点和3点突变ALS基因编码的突变ALS蛋白和野生型ALS蛋白之间对双嘧苯甲酸钠的敏感性的比较。
实施本发明的最好方式现在，通过下列实施例对本发明进行进一步说明，但这些例子不限定本发明的技术范围。
实施例1抗PC除草剂的水稻(Kinmaze)培养细胞的制备除去水稻种子上的谷壳(品种Kinmaze，学名Oryza sativa var.Kinmaze)。将种子在70％乙醇中浸泡5分钟，然后在5％安替佛民中浸泡20分钟，接着用无菌蒸馏水洗涤几次。然后将种子在含有表3中所显示的组成的培养基中静置培养。
表3
在上述培养基组成中，2，4-D是合成的生长素。为了制备培养基，首先将含有上述组成的培养基放到一个1升的烧杯中，将蒸馏水加到此烧杯中至1000毫升。接着，将此溶液调节至pH 5.7，补加3克脱乙酰吉兰糖胶。通过将此溶液在微波炉中加热以使脱乙酰吉兰糖胶充分溶解，然后每次用移液器将30毫升混合物加入到培养烧瓶中。接着，将三张铝箔覆盖到培养烧瓶上，接着，在高压灭菌器中121℃加热杀菌15分钟到20分钟。最后，将溶液冷却至室温以制备静置培养上述种子的培养基。
接着，将培养基上诱导的愈合组织中移去胚乳部分，然后进行传代培养。然后将得到的愈伤组织部分进行传代培养，即在液体培养基(组成和表3中所示相同，但不补加脱乙酰吉兰糖胶)中每2周补加1μM双嘧苯甲酸钠(一种PC除草剂)进行连续培养。2到6周后培养的细胞开始衰退。大约2个月后，从培养细胞群体中得到被认为是进行细胞分裂的许多不褪色的细胞团，此培养细胞群体中大多数细胞已死亡并变成褐色。将这些细胞团分离，进行培养，以得到在2μM双嘧苯甲酸钠存在时可以增殖的许多细胞系。将得到的细胞系分别命名为Rb系，Sr系，Ga系和Vg系。
接着，将产生的许多细胞系进行培养，并以有序的方式提升双嘧苯甲酸钠浓度。结果，得到在100μM双嘧苯甲酸钠存在时可以增殖的细胞系。双嘧苯甲酸钠抗性的培养细胞(此后称为“抗性突变体”)在补加1到10μM双嘧苯甲酸钠的MS-2，4-D固体培养基中进行传代培养。将传代培养的抗性突变体部分取样，加入不补加双嘧苯甲酸钠的MS-2，4-D液体培养基中，然后在8到10天的周期中进行悬浮细胞培养。
将大约1.5克(湿重)抗性突变体移植至一个200毫升的锥形瓶中，其中已补加了50毫升MS-2，4-D液体培养基和一定浓度的双嘧苯甲酸钠，接着在约27℃下培养一定时间。定期测量愈合组织的湿重。相对的增加量可根据移植的抗性突变体的湿重来测定。此外，将实验以不同的双嘧苯甲酸钠浓度做三次，计算标准误差。图3到6显示双嘧苯甲酸钠浓度变化和第8天或12天时抗性突变体的相对重量之间的关系。利用野生型(Kinmaze)做相似的实验作为对照。图7显示对双嘧苯甲酸钠浓度变化和第8天野生型(Kinmaze)相对重量之间的关系进行测定的结果。
如图7所示，在补加1nM双嘧苯甲酸钠的一组中，野生型的生长不受抑制，但在补加10nM或更多的双嘧苯甲酸钠的一组中，野生型的生长受到抑制。另一方面，如图3至6所示，除了Vg系外，即使在补加10μM双嘧苯甲酸钠的一组中，几乎没有一种抗性突变体(Rb系，Sr系，Ga系和Vg系)的生长受到影响。即使在Vg系中，双嘧苯甲酸钠对生长的影响也要比野生型的还要小。
在使用绿黄隆代替双嘧苯甲酸钠的实验中，野生型和抗性突变体的生长率也如上所述方法测定。图8显示绿黄隆浓度变化和第9天野生型的相对重量之间的关系。此外，图9至12显示绿黄隆浓度变化和第8天或第10天抗性突变体，即Rb系，Sr系，Ga系和Vg系的相对重量之间的关系。
如图8所示，在加入1nM绿黄隆时野生型的生长被抑制，表明野生型对绿黄隆的敏感度要比对双嘧苯甲酸钠高。然而，如图9至12所示，Rb系，Sr系，Ga系和Vg系在敏感度方面不同，但其生长并不因加入绿黄隆而受到显著的抑制，显示出它们对绿黄隆有抗性。野生型和抗性突变体对双嘧苯甲酸钠和绿黄隆的敏感度在甚至更长的培养时间内几乎保持不变。野生型和抗性突变体的生长率几乎是相同的。
这些结果表明抗性突变体对双嘧苯甲酸钠有高的抗性。此外，和野生型相比，抗性突变体对绿黄隆的抗性有所提高。
实施例2从抗性突变体中部分纯化的ALS蛋白对除草剂敏感性在该实施例中，从实施例1中所得到的抗性突变体(Rb系，Sr系和Vg系，Ga系除外)中部分纯化突变ALS蛋白，然后测定得到的突变ALS蛋白对除草剂的敏感性。如下所示部分纯化突变ALS蛋白。
首先，使用表3所示但不包括脱乙酰吉兰糖胶的组合物，通过液体培养的方法制备200克或更多的抗性突变体(不补加双嘧苯甲酸钠)。然后，使用Hiscotron在比组织体积大3倍的缓冲溶液-1[100mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)，其中含有20％(v/v)的甘油，0.5mM硫胺素焦磷酸(TPP)，10μM黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，0.5mM氯化镁和十分之一组织体积的的聚乙烯聚吡咯烷酮]中将约150克的抗性突变体匀浆。将此匀浆用尼龙纱布过滤，然后在15000×g的转速下离心20分钟。在离心上清液中加入硫酸铵至50％的饱和，然后冰浴大约1小时。将混合物再次在15000×g的转速下离心20分钟。然后将沉淀部分在大约30毫升缓冲溶液-2[10mMTris盐酸缓冲液(pH7.5)，其中含有20％(v/v)的甘油，0.5mM TPP，0.5mM氯化镁]中溶解。将此混合物再次在15000×g的转速下离心20分钟，然后将上清部分加载于SephadexG-25(Amersham Bioscience)。大约40ml通过柱的组分被作为粗酶溶液收集。
接着，根据Bio-Rad蛋白测定的手册用Bradford方法对粗酶溶液的蛋白浓度进行测定。然后将粗酶溶液经Whatman过滤器(Whatman)过滤，然后将适当的蛋白量的粗酶溶液(10到15毫升)加载于使用FPLC装置(Amersham Bioscience)的3个垂直相连的HiTrap Q柱中(Amersham Biosccience)。在蛋白组分用HiTrap Q吸附后，没有吸附的组分用比多于3至5倍柱床体积的缓冲溶液-2洗出。然后，用多于10倍柱床体积(150毫升)的洗脱溶液将吸附的蛋白组分洗脱下来。在此洗脱液是将氯化钾以线性浓度梯度(0至0.4M)溶解到缓冲溶液-2中制备的。将含有洗脱蛋白组分的洗脱液以每份5毫升分配到多个试管中。此外，为了使洗脱蛋白组分中的ALS蛋白保持稳定，事先在每个分配用的试管中加入0.5毫升含有20mM丙酮酸钠的缓冲溶液-2。
分配到每个分配用试管中的洗脱组分所含有的突变ALS蛋白的ALS活性通过下述方法测定。将要测定的洗脱组分和含有20mM丙酮酸钠，0.5mM TPP，0.5mM MgCl2，10μM FAD和20mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)的溶液混合，制得用于测定反应的反应溶液。此反应液的用量为1毫升。在加入要测定的洗脱组分后，测定反应在30℃下进行40到60分钟。然后，加入0.1毫升6N硫酸(或0.25N氢氧化钠)终止反应。
在反应终止后，将反应溶液在60℃下温育10分钟，从而将反应溶液中含有的乙酰乳酸转变成3-羟基丁酮。
然后为了确定反应液中的3-羟基丁酮的量，在反应液中加入在2.5N氢氧化钠中溶解的1毫升0.5％(w/v)肌氨酸和1毫升5％(w/v)α-萘酚，接着在37℃下温育10分钟。通过比色法对比反应液的吸收值(在525nm)而对3-羟基丁酮定量，从而评价ALS活性。此外，由于反应液含有少量的丙酮酸钠，将反应时间为0作为对照。
结果，每0.2毫升反应液在525nm处的OD吸收值约为7。然而，当用氢氧化钠终止上述测定反应，且测定的是归因于除ALS活性之外的活性产生时，将近80％的表观ALS活性来自于直接的3-羟基丁酮的产生活性，而该活性不归因于突变ALS蛋白的活性。因此，可根据3-羟基丁酮的产生活性，通过FPLC使用阴离子交换树脂将突变ALS蛋白和其它蛋白分离。图13显示利用Sr系作为抗性突变体得到的结果。如图13所示，结果检测到3个活性峰。
为了确定3个活性峰中与突变ALS蛋白相对应的峰，测定了每个峰的3-羟基丁酮的产生活性。这样发现初始洗脱峰所示的组分与突变ALS蛋白相应。
利用含突变ALS蛋白的酶溶液测定了突变ALS蛋白对双嘧苯甲酸钠、绿黄隆和灭草喹的敏感性。除了在加入酶溶液之前要加入一定浓度的除草剂之外，采用和上述测定反应同样的方式测定ALS活性以评价其对这些除草剂的敏感性。作为对照，野生型ALS蛋白也以同样的方式进行分离和纯化(图14)并用于实验。此外，将双嘧苯甲酸钠制成水溶液，将绿黄隆和灭草喹制成丙酮溶液。反应混合物中的丙酮终浓度为1％。
图15显示ALS活性抑制率和双嘧苯甲酸钠浓度之间的关系。图16显示ALS活性抑制率和绿黄隆浓度之间的关系。图17显示ALS活性抑制率和灭草喹浓度之间的关系。在图15至17中，虚线表示野生型ALS蛋白，长短划双点虚线表示突变ALS蛋白的Sr系，实线表示突变ALS蛋白的Rb系，长短划点虚线表示突变ALS蛋白的Vg系。
根据概率分析计算得到抑制50％ALS活性(I50)的除草剂浓度，从而计算突变ALS蛋白I50对野生型ALS蛋白I50的比率。表4显示结果。
表4
此外，根据表4的结果，抗每种除草剂的突变体的I50除以野生型的I50计算出RS。结果如表5所示。
表5
如图15至17、表4和表5所示，和野生型ALS蛋白相比，突变ALS蛋白即使在除草剂的存在下也显示出相对高的ALS活性。特别是，来源于Rb系和Sr系的突变ALS蛋白显示出对双嘧苯甲酸钠的敏感性要比对其它除草剂的敏感性显著提高。即，Rb系和Sr系拥有特别对双嘧苯甲酸钠良好的抗性。
实施例3野生型和突变ALS基因的克隆在本实施例中，编码野生型ALS蛋白的基因(野生型ALS基因)从野生型克隆，而编码突变ALS蛋白的基因(突变ALS基因)从抗性突变体克隆。
用于克隆野生型ALS基因和突变ALS基因的探针通过如下所述的方法制备。从水稻(Nippon-bare)得到的部分cDNA显示出与玉米ALS基因的高度同源性，并将其作为本实施例的探针。
(1)显示出与玉米ALS基因高度同源性的来自于水稻(Nippon-bare)部分cDNA的核苷酸序列的测定作为农业、林业和渔业的技术创新学会和国家农业生物学科学研究所实施的水稻基因组计划的一部分，水稻(Nippon-bare)的部分cDNA的核苷酸序列已经测定，已经建立起cDNA的部分核苷酸序列数据库。在这个数据库中一个已知的大约350bp的核苷酸序列的cDNA克隆(登记号C72411)显示出与玉米ALS基因的高度同源性。玉米ALS基因序列已经被完全测定。
这个cDNA克隆(登记号C72411)从国家农业生物学科学研究所获得，核苷酸序列如下所述的方法测定。在此，cDNA克隆含有一个ALS同系物基因插入到pBluescript II SK+，它可以在大肠杆菌中自主复制。
首先，将保留有ALS同系物的质粒载体转化入大肠杆菌(DH5α)。将平皿上的白色克隆在液体培养基中培养，然后，用标准技术从细胞中提取质粒。由于插入DNA已被插入到Sal I和Not I(在质粒载体中多克隆位点的限制性内切酶)之间，将此载体用这两个酶消化。通过琼脂糖凝胶电泳确定插入片段。然后用如RNaseA、PEG和LiCl的标准技术将得到的保留有ALS同系物的质粒载体进行纯化，接着用引物和ABI BigDyeTerminator循环测序试剂盒进行测序反应。PCR反应条件遵循生产厂商的说明书。在此使用的引物是M13引物和根据测定的核苷酸序列设计的合成引物。得到的PCR产物用乙醇沉淀纯化，然后其中的核苷酸序列通过ABI PRISM310测序仪来确定。
已知保留有ALS同系物的质粒载体含有长1.6kb的插入DNA。得到的保留有ALS同系物的质粒载体用限制性内切酶Sal I和Not I消化，然后进行电泳。结果，检测到对应于pBluescript II SK+的约3kb的条带和对应于插入DNA片段的约1.6kb的条带(没有显示数据)。测定了插入DNA部分的全部核苷酸序列，并检查其与玉米的核苷酸序列的同源性。如图18A和18B所示，发现84.7％的同源性。由于ALS同系物确定为Nippon-bare变种的ALS基因的部分cDNA，所以用Sal I和Not I消化后的插入DNA作为探针。此外在图18A和18B中，第一排是Nippon-bare变种的ALS基因的cDNA核苷酸序列；第二排是玉米的ALS基因的cDNA核苷酸序列。
(2)抗性突变体和野生型的mRNA的制备首先，用液氮冷冻的抗性突变体用研钵和杵压碎，然后用混合器充分碾碎30秒。将碾碎的粉末用提取缓冲液[(100mM Tris-HClpH9.0，100mM NaCl，1重量％SDS，5mM EDTA)∶(β-巯基乙醇)∶(Tris饱和酚)＝15∶3∶20]悬浮，然后充分搅拌。将此溶液在12000×g转速下离心15分钟，然后收集上清液。将200毫升PCI[(Tris饱和酚)∶(氯仿)∶(异戊醇)＝25∶24∶1]加入到上清液中，4℃振摇10分钟，12000×g转速下离心15分钟，然后收集上清液。重复上述步骤2次。将1/20体积的5M NaCl和2.2倍体积的乙醇加入到所得到的上清液中，将此混合物在-80℃下放置30分钟。12000×g转速下离心5分钟收集沉淀。将沉淀用70％乙醇洗涤，干燥，然后溶解在10mM β-巯基乙醇溶液中。接着，将此溶液在27000×g转速下离心10分钟除去不溶组分。将1/4体积的10M LiCl加入到此溶液中，然后冰浴1小时。接着将溶液在27000×g转速下离心10分钟收集沉淀，溶解在4毫升水中，然后测定260nm下的吸收值来确定RNA浓度。将1/20体积的5M NaCl和2.2倍体积的乙醇加入到溶液中，在-80℃下放置30分钟。接着将溶液在27000×g转速下离心10分钟收集沉淀，将沉淀用70％乙醇洗涤，干燥。将得到的产物溶解到适量的水中获得总RNA溶液。在此离心都是在4℃进行。
mRNA是根据下列方法从总RNA中分离和纯化的。将与提取的总RNA体积相同的2X结合缓冲液(20mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM EDTA，1M NaCl)加入到提取的总RNA溶液中。用0.1克寡脱氧胸苷酸纤维素(Amersham Bioscience)填充的柱子用1X结合缓冲液洗涤，然后将总RNA溶液加入到此柱中。在柱子用1X结合缓冲液洗涤以后，加入洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl(pH7.5)，5mM EDTA)，每次收集0.5毫升洗脱液。将过柱的组分加入到另一个寡脱氧胸苷酸纤维素(Amersham Bioscience)柱，以同样的方式处理。在根据每组分的吸收值计算洗脱的mRNA的浓度后，1/10体积的10MLiCl和2.5倍体积的乙醇加入到产物中，然后将混合物在-80℃下放置30分钟。接着，将混合物离心，干燥沉淀组分，在100μl水中溶解。这样得到的mRNA进行蔗糖密度梯度离心按大小分级分离。
将分离纯化后的mRNA放入到由25％蔗糖溶液和5％蔗糖溶液形成的密度梯度的离心管中，用旋转转子在4℃下以27000rpm转速超高速离心15小时。离心后，按密度梯度的顺序，每组分收集0.5毫升。测定每组分的吸收，计算收集的mRNA浓度，ALS mRNA的存在通过应用ECL试剂盒(ECL直接核酸标记检测系统，Amersham Bioscience)的杂交来确定。使用上述(1)中制备的探针在42℃下杂交16小时。杂交后，用试剂盒中提供的基本洗涤缓冲液在42℃下洗涤5分钟，洗涤两次后用2X SSC溶液在42℃下洗涤5分钟，洗涤一次。洗涤过的膜用一个透明的塑料膜包裹使之浸没在试剂盒提供的附带的发光试剂中，然后在X射线胶片上曝光。
当Sr系用作为抗性突变体时，经过上述过程，提取了大约35毫克总RNA和约4毫克mRNA。接着，在蔗糖密度梯度离心中，在一个预期阳性的组分中发现了一个杂交阳性的点。
当使用野生型时，除了7毫克mRNA以外，提取了大约95毫克总RNA。当从野生型提取mRNA时，除了使用野生型代替抗性突变体以外，都应用上述方法进行提取。
(3)从抗性突变体和野生型构建cDNA库用2微克的上述(2)中纯化的mRNA和cDNA合成试剂盒(AmershamBioscience)，合成cDNA，以此构建抗性突变体的cDNA库。
首先，用试剂盒提供的RTase进行逆转录反应；随后用试剂盒提供的T4 DNA聚合酶进行互补链延长反应。在互补链进行延长反应时，加入32P-dCTP来计算cDNA合成的产量。加入接头后，合成的cDNA通过体外包装方法整合入到λ噬菌体中。
cDNA上加入的接头是一个Eco RI-Not I-BamH I接头(TakaraShuzo)。将摩尔浓度比cDNA大50倍的接头加入到含有cDNA的溶液中。然后，在混合液中加入T4 DNA连接酶(Pharmacia)之后在4℃下连接过夜。将反应液用一个AsahiPak GS710柱(Asahi ChemicalIndustry Co.，Ltd.)进行HPLC，接着用波长为260nm的紫外线监控洗脱液。洗脱液分级分离成25个组分，每个组分0.5毫升。每个组分用一个Cerenkov计数器测定，收集3到4份显示高计数的组分。用T4多核苷酸激酶(Takara Shuzo)将组分中含有的接头5’端磷酸化，然后加入λgt 11Eco RI臂进行连接反应。将GigaPack GoldIII(Stratagene)加入到溶液中，然后在室温进行2小时连接反应。反应后，将200μl的SM缓冲液和8μl氯仿加入到反应液中，从而制备噬菌体溶液。将此噬菌体溶液稀释10倍。1μl稀释的溶液用大肠杆菌(Y-1088)感染，加入0.7％顶层琼脂，然后将此溶液在一个LB平板上接种。4到8小时后将出现在平板上的噬菌斑计数，从而测定滴度。
大约74纳克的来自Sr系的cDNA的合成通过DE81paper和Cerenkov计数结果而确定。载体和加入到那里的接头连接后的Cerenkov计数结果显示从Sr系得到大约22纳克含有插入片段的λDNA。将λDNA包装入噬菌体中，从而制备抗性突变体细胞的cDNA库。文库溶液的滴度是16600pfu/μl。
当使用根据上述方法从野生型提取的mRNA构建cDNA文库时，显示合成了大约38纳克来自野生的型cDNA。此外，从野生型得到大约5纳克含有插入片段的λDNA。另外，野生型cDNA文库的滴度时18160pfu/μl。
(4)含有ALS基因的cDNA的筛选为了在平板上形成约20,000个噬菌斑，将上述(3)中制备的文库溶液稀释，然后来自于野生型的噬菌体和来自于Sr系的噬菌体各自分别在10个平板上接种。然后将噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上(Schleicher & Schnell，PROTORAN BA85，孔径0.45μm)，将硝酸纤维素膜用变性溶液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)浸泡，然后在中和溶液(1.5M NaCl，0.5M Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA)中放置大约20秒。用滤纸将硝酸纤维素膜上多余的水除去，然后将硝酸纤维素膜在80℃下烤2小时。在此，当使用Hybond-N+(Amersham Biotech)代替硝酸纤维素膜时，可省略烘烤步骤，并用0.4M NaOH固定20分钟。
上述(1)中制备的插入DNA用两种方法标记，RI和非RI法，然后当作DNA探针使用。通过以下方法进行RI标记和杂交。首先，将大约200到500纳克的探针DNA进行热变性，然后用一个BcaBEST DNA标记试剂盒(Takara Shuzo)标记。在该标记反应进行时，加入试剂盒提供的缓冲液，随机引物和32P-dCTP。接着，加入BcaBEST，接着在65℃下温育30分钟。随后，加入EDTA终止反应。将反应液加入到硝酸纤维素膜上，这样8张膜含有大约100纳克探针。在42℃轻微振摇的条件下杂交过夜。杂交后，用2X SSC，0.1％的SDS溶液洗3次膜，接着在一个BAS2000成像分析器(Fuji Photo Film)的成像板上曝光约1个小时。曝光后用成像分析器检测阳性克隆。
用下列方法进行非RI的标记。大约200到500纳克的探针DNA进行热变性后，加入一种ECL直接DNA/RNA标记和检测系统(AmershamBioscience)提供的DNA标记试剂(过氧化物酶)和戊二醛，接着在37℃下温育。在此实验中，将标记好的探针DNA加入到硝酸纤维素膜上，这样的8张膜含有大约100纳克探针。在42℃轻微振摇的条件下杂交过夜。杂交后，在室温下用基本洗涤缓冲液洗涤膜3次，每次10分钟，然后在室温下用2X SSC洗涤一次达10分钟。将膜浸没在一个ECL试剂盒提供的发光溶液中，然后在一个X射线胶片上曝光30分钟到3小时。
用无菌牙签将杂交所得的阳性噬菌体(初次筛选)和顶层琼脂一起刮下来，然后在200μl的SM缓冲液中悬浮，从而获得噬菌体溶液。每个克隆的噬菌体溶液都进行适当稀释，用大肠杆菌Y-1088感染，然后在LB平板上接种。使用这些新鲜制备的平板，进行类似的杂交(二次筛选)。将阳性噬菌体在200μl的SM缓冲液中悬浮，从而获得单个噬菌体。如果通过二次筛选没有分离到单个噬菌体，则再进行稀释，接着在LB平板上接种。随后进行杂交(三次筛选)，这样得到单个噬菌体。
接着，用下述方法从单个噬菌体制备λDNA。用竹叉或牙签从阳性克隆的噬菌斑中收集λ噬菌体，将其在200μl的含有5μl新鲜的大肠杆菌宿主(Y1088)悬浮液的2×YT培养基(含有10mM MgCl2和0.2％麦芽糖)中接种。将产物在42℃下静置培养过夜。然后，将此培养液在1毫升含有25μl宿主大肠杆菌(Y1088)的悬浮液的2×YT培养基(含有10mM MgCl2和0.2％麦芽糖)中再次接种，然后振摇培养过夜(这些步骤包括一个预培养过程)。将预培养溶液(10至50μl)在12毫升含有10mM的MgCl2和0.5毫升大肠杆菌Y1088悬浮液的2×YT培养基中接种。然后，在42℃下以较强的振摇培养过夜，直到裂解后浊度增加。培养后，加入50μl氯仿和1.2毫升5M的NaCl，然后在42℃下振摇培养10分钟。将产物在27000×g转速下离心10分钟，然后将上清液重新转入到离心管中。在上清液中加入5毫升50％PEG，然后在冰上放置1个小时或更多时间。将产物在27000×g转速下离心10分钟，然后将上清液弃去。接着，在27000×g转速下再次离心，弃去液体部分。将沉淀组分用300μl含有4μg的DNaseI，20μg的RNase A和10mM的MgCl2的30mM Tris盐酸缓冲液(pH7.5)悬浮。将悬浮液转移至一个1.5毫升的试管。在37℃下将此悬浮液培养30分钟后，向悬浮液中加入7.5μl的20％SDS，3μl蛋白酶K(10毫克/毫升)和12μl的0.5M的EDTA，接着在55℃下进一步培养15分钟。紧接着，在产物中加入150μl酚，然后剧烈搅拌。然后用TOMYMicrocentrifuge MR-150(TOMY DIGITAL BIOLOGY)将混合物在15000rpm下离心3分钟，收集水层。在收集的水层中加入800μl乙醚(加入蒸馏水以除去过氧化物)。将混合物剧烈搅拌，然后在15000rpm下离心10秒，弃去乙醚层。重复乙醚提取步骤，之后用氮气除去水层中残留的乙醚。在水层中加入30μl的5M的NaCl和875μl乙醇，这样快速收集沉淀的λDNA。将收集的λDNA用大约1毫升70％乙醇漂洗，然后在减压条件下干燥约1分钟，从而除去乙醇。将产物在20μl至50μl的TE缓冲液(pH8.0)溶解，从而制备λDNA溶液。
通过下述方法对获得的λDNA进行插入DNA的亚克隆和测序。将获得的λDNA溶液(1μl)用Not I消化以剪切插入DNA。反应液(用于切割反应)的组成根据限制酶所附的手册上的步骤进行。在37℃下反应大约2小时后，通过用1％琼脂糖凝胶电泳确定插入片段大小。含有插入DNA的λDNA(10μl到20μl)用Not I消化以剪切插入DNA。用分配琼脂糖凝胶分离插入DNA，将相应的条带从凝胶上切下来，然后通过标准技术纯化插入DNA。将插入DNA以摩尔比为1∶1和经BAP处理(用来源于虾的碱性磷酸化酶去磷酸化)的载体混合，接着用T4DNA连接酶在16℃下连接2小时或更多的时间。在此，由于用Not I剪切的插入DNA作为材料，Not I剪切的载体用BAP处理。连接后，部分溶液和感受态细胞(DH5α)混合，然后在冰上静置30分钟。接着，将混合物在42℃下热激30秒，然后在冰上再次静置2分钟。然后，向混合物中加入SOC，在37℃下培养1小时，接种在事先均匀加入100μl的2×YT(含有50微克/毫升氨苄青霉素)、30μl的3％X-Gal和3μl的1M的IPTG混合物的LB培养基平板上，然后在37℃下培养10小时或更长时间。将每个转化的白色克隆接种到2毫升含有氨苄青霉素的LB培养基或2×YT培养基中，然后在37℃下培养过夜。根据常规技术从培养液中制备质粒溶解到水中。定量测定其中的DNA浓度，然后将此质粒进行PCR反应来测序。根据上述方法进行PCR反应和测序反应。
上述实验的结果显示，从每个野生型和Sr系培养细胞获得了约2.2kb长的不完全长度的ALS cDNA。由于距DNA的5’端约250bp处的位置上有一个Sma I位点，所以通过下列方法制备新的探针。保留有来自野生型约2.2kbp长的不完全长度的ALS cDNA的pBluescriptII SK+用宿主大肠杆菌JM109扩增，然后用一个自动分离系统(KURABO PI-100)提取质粒。将质粒直接用Sma I消化。将产生的大约250bp的片段用1％琼脂糖凝胶电泳分离纯化，然后计算浓度，从而制备探针。利用探针，用上述方法利用上述RI再次筛选文库。从由此得到的单个噬菌体中制备λDNA，用Eco RI消化λDNA溶液(1μl)，通过电泳确定大小，然后其被固定在一个硝酸纤维素膜上。电泳后，将胶浸入含有1.5M NaCl的0.5M NaOH溶液中，然后轻微摇晃15分钟。然后将胶用水洗涤，浸没在含3M NaCl的0.5M Tris-HCl(pH7.5)中，然后边摇边中和约15分钟。将大约5张厚的工业用的滤纸叠起来作为底座。将底座放在不锈钢棒上涂布的20×SSC。紧接着，将中和的凝胶，硝酸纤维素膜(已被剪成一定大小，在蒸馏水中浸没，然后在20×SSC中浸没10分钟)，二层滤纸依次放在底座上，接着又将3厘米到4厘米厚的纸巾塔放到上面。先将一个玻璃板再将一个轻质物体放到上述物品上，接着印迹约5分钟。确认胶和膜之间没有气泡后，印迹约10分钟。印迹后，将膜用透射照明器进行紫外处理，然后在80℃下烘烤约15到30分钟。烘烤后，用上述32P标记的250bp探针DNA进行杂交(杂交缓冲液组成5×SSPE，0.5％SDS，5×Denharlts，solum精子DNA，50％甲酰胺)。将杂交后条带的放射性转移至一个成像板上，用BAS-2000分析结果。在杂交中，将显示相对大分子量的阳性插入片段大量制备，然后亚克隆到用EcoRI消化然后用上述方法进行BAP处理的pBluescript II SK+中。将产物转化大肠杆菌(JM105)。将得到的转化体进行液体培养，然后用标准技术制备质粒。这样可通过上述方法测定核苷酸序列。
结果，全长ALS cDNA基因可从野生型和Sr系的培养细胞中获得。野生型和突变ALS基因间的同源比对结果如图19A、B和C显示。如图19A、B和C显示，和野生型相比，在Sr系中观察到2点突变，这2点是从作为转录起始密码子ATG的起始点的第一个碱基A起的第1643和1880位。在Sr系，野生型中第1643位的G突变为T(用G1643T表示)，野生型中第1880位的G突变为T(用G1880T表示)。当转变为氨基酸时，这些突变表现为在Sr系的突变ALS蛋白的氨基酸序列中由野生型ALS蛋白中第548位的色氨酸突变为亮氨酸(即，“W548L突变”)，野生型ALS蛋白第627位的丝氨酸突变为异亮氨酸(即“S627I突变”)。
(5)将克隆到pBluescript II SK+中的野生型ALS cDNA亚克隆到pGEX2T在含有上述(4)中获得的全长的野生型ALS cDNA的质粒pBluescript II SK+用Eco RI消化，含有野生型ALS基因的cDNA被剪切下来。然后，cDNA被整合到pGEX-2T(Amersham Bioscience)的Eco RI位点，pGEX-2T是一个大肠杆菌表达载体。在下文中，含全长的整合到pGEX-2T的Eco RI位点的野生型ALS cDNA的表达载体被称为“pGEX-2T(ALS-野生型)。”将pGEX-2T(ALS-野生型)转化大肠杆菌(JM109)。将转化所得的克隆进行液体培养，提取质粒，然后通过测序确定插入DNA的插入方向。这样，制备了pGEX-2T(ALS-野生型)转化的大肠杆菌(JM109)。
实施例4抗PC除草剂的水稻培养细胞的ALS基因中突变位点的说明(1)从抗性突变体(Sr，Rb，Vg，和Ga系)提取基因组DNA使用一个植物DNA提取试剂盒ISOPLANT II(Nippon Gene)，根据试剂盒附带的手册从0.1克每个Sr，Rb，Vg，和Ga系的培养细胞中提取基因组DNA。在用上述试剂盒提取基因组DNA后，将RNA变性并用RNaseA除去。然后，进行琼脂糖凝胶电泳确定基因组DNA。
(2)用基因组DNA为模板对ALS基因进行PCR如下所示用每个基因组DNA为模板，一个“ALS-Rsp3”引物和一个“4-83-3”引物进行PCR。用Ready to Go PCR Beads(AmershamBioscience)在25μl的终体积中进行PCR。反应进行40个循环，每个循环条件由一个初始在94℃下5分钟的变性步骤，接着在94℃下30秒的变性步骤，在55℃下1分钟的退火步骤和在72℃下2分钟的延伸步骤组成。此外，最后一个循环的延伸步骤是在72℃下延伸9分钟。
接着，PCR反应溶液进行2％的琼脂糖凝胶电泳(100V，1×TBE缓冲液)。切下含PCR产物的胶，然后将切下的胶切成小片段。将所得的凝胶片段用无菌离子交换水漂洗两到三次，加入500μl无菌离子交换水，然后重复冷冻和溶解3次。这样，PCR产物可以洗脱在水中。
接着，用溶解PCR产物的洗脱液再次进行PCR。特别要指出的是，这次是在100μl的终体积中，以溶液中的PCR产物为模板，以相同的一套引物或嵌套引物进行PCR。反应后，反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳(1％)分离。切下含有目标条带的胶，然后，用一个GEX PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Bioscience)进行纯化。最后，用75μl无菌去离子水将PCR产物洗脱下来。
(3)测序用PCR扩增的DNA片段为模板和ABI PRISM BigDye ver.2(Applied Biosystem)进行测序反应。在测序反应中，将11μl模板DNA，1μl引物(3.2皮摩尔/微升)和8μl预混合物混合起来，这样总体积为20μl。测序反应进行40个循环，每个循环条件包含一个初始在96℃下5分钟的变性步骤，接着在96℃下5秒的变性步骤，在50℃下5分钟的退火步骤和在60℃下4分钟的延伸步骤。此外，最后一个循环的延伸步骤是在60℃下延伸9分钟。测序反应之后，用AutoSeq G-50柱(Amersham Biotech)进行凝胶过滤除去反应液中的荧光核苷酸。然后用ABI PRISM 310 DNA测序仪读出核苷酸序列。
(4)在此使用的引物和核苷酸序列的名称上述(2)中使用的引物以及下列例子中使用的引物的名称核苷酸序列等在表6中列出。
表6
在表6中，相应的ALS位点是转录起始密码子ATG作为开始位点时相应的碱基序号。此外，ALS-Rsp1的核苷酸序列如SEQ ID NO9中所示，ALS-Rsp2的核苷酸序列如SEQ ID NO10中所示，ALS-Rsp3的核苷酸序列如SEQ ID NO11中所示，ALS-Rsp4的核苷酸序列如SEQID NO12中所示，ALS-Rsp6的核苷酸序列如SEQ ID NO13中所示，ALS-Rsp7的核苷酸序列如SEQ ID NO14中所示，ALS-RspA的核苷酸序列如SEQ ID NO15中所示，ALS-RspB的核苷酸序列如SEQ IDNO16中所示，ALS-RspC的核苷酸序列如SEQ ID NO17中所示，ALS-RspD的核苷酸序列如SEQ ID NO18中所示，ALS-RspF的核苷酸序列如SEQ ID NO19中所示，ALS-RspE的核苷酸序列如SEQ IDNO20中所示，3-1-1的核苷酸序列如SEQ ID NO21中所示，3-1-2的核苷酸序列如SEQ ID NO22中所示，3-1-3的核苷酸序列如SEQ IDNO23中所示，3-1-4的核苷酸序列如SEQ ID NO24中所示，4-83-1的核苷酸序列如SEQ ID NO25中所示，4-83-3的核苷酸序列如SEQ IDNO26中所示，83-10的核苷酸序列如SEQ ID NO27中所示，83-15的核苷酸序列如SEQ ID NO28中所示，ALS-DG7的核苷酸序列如SEQID NO29中所示。
(5)作为测序结果揭示的每个系的突变作为上述(3)中确定的核苷酸序列分析的结果，显示了Rb，Vg，Ga，和Sr系中的突变。每个系的突变位点在表7中列出。
表7
如图7所示，在Rb系的核苷酸序列中，第512位C突变成A(同型)，第1643位G突变成T(异型)。这就意味着在氨基酸水平上，第171位脯氨酸和第548位色氨酸(W)分别突变成组氨酸(H)和亮氨酸(L)。在Vg系细胞株的核苷酸序列中，第1643位G突变成T(异型)，这就意味着在氨基酸水平上，第548位色氨酸(W)突变成亮氨酸(L)。在Ga系细胞株中的核苷酸序列中，第512位和第514位C突变成A(同型或异型)(这些型根据获得的PCR产物不同而不同)，第1643位G突变成T(异型)。这就意味着在氨基酸水平上，第171位脯氨酸(P)，第172位精氨酸(R)和第548位色氨酸(W)分别突变成组氨酸(H)，丝氨酸(S)和亮氨酸(L)。此外，在Sr系细胞株的核苷酸序列中，第1643位和第1880位G突变成T(异型)。
当通过上面的方法从Sr系的cDNA文库中筛选分离ALS基因时，不仅分离到2个位点的突变基因而且也分离了一个野生型的基因。这样，可以设想在基因组DNA水平上，发生了异源的突变，基因组PCR获得的结果也支持了这一设想。
如上所述，在所有抗性突变体中，第548位色氨酸(W)突变成亮氨酸(L)(异型)，且只发生在Vg系中。如上所述，Vg系显示出对高达10μM的双嘧苯甲酸钠具有敏感性，而Sr、Rb和Ga系显示出对高达100μM的双嘧苯甲酸钠具有相同的敏感性。因此，这表明随选择压力的强度增加，从Vg系开始获得抗性，然后再分支到其它系并且发生突变。
例5单独含有G1643T(W548L)突变或G1880T(S627I)突变的ALScDNA的合成，保留有ALS cDNA的pGEX2T的构建以及用载体转化大肠杆菌首先，单独含有G1643T(W548L)突变或G1880T(S627I)突变的ALScDNA的合成，保留有ALS cDNA的pGEX2T的构建用图20描述。
用1μl(分别用585纳克/微升和554纳克/微升)pBluescript IISK+(ALS-2位点突变体)或pBluescript II SK+(ALS-野生型)为模板，和1μl的LA Taq DNA聚合酶(Takara)在100μl的终反应体积中进行PCR。反应进行25个循环，每个循环条件包括在95℃下30秒，在55℃下30秒和在72℃下2分钟。此外，pBluescript II SK+(ALS-2位点突变体)含有2位点突变的ALS基因，G1643T(W548L)和G1880T(S627I)。pBluescript II SK+(ALS-野生型)含有没有突变的野生型ALS基因。在PCR中，组合使用了ALS-Rsp6和ALS-RspF引物以及ALS-RspE和M13R引物。用ALS基因为模板扩增的片段和特定的引物组合的名称在表8中列出。此外，引物M13R是在pBluescriptII SK+T3启动子附近的反义引物。此外，M13R的核苷酸序列是5’-GGAAACAGCTATGACCATG-3’(SEQ ID NO30)。
表8
通过PCR得到的PCR-1、PCR-2、PCR-3和PCR-4分别进行琼脂糖凝胶电泳分离，然后以上述方法类似的方式从琼脂糖凝胶中收集产物，然后将产物用50μl无菌水洗脱。
接着，用一套PCR-1和PCR-4、一套PCR-2和PCR-3进行SPR(自身聚合酶反应)。加入23.5μl的PCR-1和PCR-4组合或PCR-2和PCR-3组合、1μl的LA Taq DNA聚合酶至终体积为75微升进行SPR反应，反应25次循环，每个循环由在95℃下1分钟的变性步骤，在55℃下30秒的退火步骤和在72℃下2分钟的延伸步骤组成。利用一套PCR-1和PCR-4通过SPR获得的DNA片段作为SPR-1，利用一套PCR-2和PCR-3通过SPR获得的DNA片段作为SPR-2。
此外，在本实施例中，为确保得到足够量的SPR-1和SPR-2，分别在100μl的终反应体积中用纯化的SPR-1或SPR-2作为模板，再加入ALS-Rsp6，M13R和LA Taq DNA聚合酶进行PCR。在此实验中，PCR重复25次，每个循环由在95℃下30秒的变性步骤，在55℃下30秒的退火步骤和在72℃下2分钟的延伸步骤组成。PCR后，将反应液进行琼脂糖凝胶电泳。从琼脂糖凝胶中收集了大约2kbp的单一条带(PCR产物)，然后用100μl无菌水洗脱。
接着，由PCR扩增的SPR-1和SPR-2分别用Acc I和Eco RI消化，从而得到SPR-1(Acc I/Eco RI消化片段)和SPR-2(Acc I/Eco RI消化片段)。特别指出的是，将50μl含有溶解的PCR产物的无菌水(总体积100μl)在10×M缓冲液(Takara)存在时与1μl Acc I(12u/μl)、1μl Eco RI(12u/μl)混合，接着在60μl终体积中在37℃下温育1小时。之后，将反应溶液总体积进行琼脂糖凝胶电泳，然后用一个GFXPCR和凝胶纯化试剂盒收集1.5kbp的靶片段。收集的1.5kbp片段用50μl无菌水洗脱，这样制备了含有SPR-1(Acc I/Eco RI消化片段)的溶液和含有SPR-2(Acc I/Eco RI消化片段)的溶液。
同时，150μl含有野生型ALS基因插入的蛋白表达载体，pGEX-2T(ALS-野生型)质粒(浓度大约为50纳克/微升)在10×M缓冲液存在时与1μl Acc I(12u/μl，Takara)混合，接着在37℃下温育2小时。反应后，通过1％琼脂糖凝胶电泳确定7.2kbp的线性条带。根据GFX PCR和凝胶纯化试剂盒手册，从琼脂糖凝胶收集相应于7.2kbp条带的DNA，然后将产物在180μl无菌水中洗脱。将89μl洗脱的产物和10μl的10×H缓冲液(Takara)，1μl Eco RI(12u/μl)混合，然后在37℃下反应1分钟，从而用Eco RI部分消化收集的DNA。反应后，加入10×加样缓冲液，然后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。4.9kbp，5.7kbp和6.5kbp条带以及没有切割的7.2kbp条带都个别地出现了，然后从凝胶中切下5.7kbp的靶条带。包括在切下的凝胶中的大约5.7kbp的DNA片段用GFX PCR和凝胶纯化试剂盒收集，然后用50μl无菌水洗脱产物。
紧接着，3μl用Acc I消化和Eco RI部分消化pGEX-2T(ALS-野生型)获得的片段和3μl SPR-1(Acc I/Eco RI消化片段)或SPR-2(Acc I/Eco RI消化片段)分别在6μl Takara连接缓冲液中(ver.2，溶液I)于16℃下反应过夜。
然后，根据所附的手册将反应液转化大肠杆菌感受态细胞(菌株JM109，Takara)。将细胞接种在含有50ppm的氨苄青霉素的LB培养基上，然后在37℃下培养过夜。结果，挑选了几个出现的克隆。用这些克隆为模板，以及表6中列出的一组ALS-RspE和PGEX-3(5’-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-3’SEQ ID NO31)，一组PGEX-5(5’-GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG-3’SEQ ID NO32)和PGEX-3，一组PGEX-5和表6列出的ALS-RspA，直接进行PCR。此外，PGEX-3具有一个与位于用作载体的pGEX-2T 3’端的反义链的一部分相同的序列。PGEX-5有一个与用作载体pGEX-2T的5’端的有义链的一部分相同的序列。ALS-RspE/PGEX-3组合的反应条件包括，每1μM引物和1个PCR珠子溶解在25μl的总体积中，反应通过重复40次来完成，每个循环由在95℃下30秒的变性步骤，在55℃下1分钟的退火步骤和在72℃下2分钟的延伸步骤组成。在PGEX-5/PGEX-3组合，PGEX-5/ALS-RspA组合的实验中，由于在上游部分有大约75％的GC含量的区域，所以在上述溶液中进一步加入终浓度为5％的DMSO。此PCR结果证实了想得到的插入片段的插入。
挑选出一个证实了的想得到的插入片段的插入的菌落，然后在含有50ppm氨苄青霉素的LB液体培养基(每个菌落3毫升，共10个)中在37℃下振摇培养12小时。培养后，用一个质粒提取系统(TOMYDP-480)从培养基提取质粒(400到500μl)，然后通过离心浓缩到约200μl。然后，将此浓缩液用GFX PCR和凝胶纯化试剂盒纯化和脱盐，最后用约130μl无菌水洗脱。
用ABI PRISM BigDye ver.2对这些质粒进行测序反应，这样分析了质粒中插入片段的核苷酸序列。在测序反应中，通过将11μl模板DNA，1μl引物(3.2皮摩尔/微升)和8μl预混合液混合制备了总体积为20μl的反应液。测序反应进行40个循环，每个循环条件由一个初始在96℃下5分钟的变性步骤，在96℃下5秒的变性步骤，在50℃下5秒的退火步骤和在60℃下4分钟的延伸步骤组成，以及在60℃下9分钟的最后一个循环的延伸步骤。测序反应结束后，用AutoSeq G-50柱进行凝胶过滤除去反应液中的荧光核苷酸，然后用ABI PRISM 310DNA测序仪确定核苷酸序列。
此外，表6中列出测序反应中的引物，PGEX-5，ALS-RspC，ALS-Rsp3，ALS-Rsp1，3-1-4和ALS-RspB作为有义引物使用，4-83-3，PGEX-3，ALS-Rsp2，4-83-10和ALS-Rsp7作为反义引物使用。
分析结果证实得到了包含了具有W548L突变的突变ALS基因的pGEX 2T载体(在图20中被描述为“pGEX 2T(ALS-W54L突变体)”)和包含了具有S627I突变的突变ALS基因的pGEX2T载体(在图20中被描述为“pGEX 2T(ALS-S627I突变体)”)。接着，将这些pGEX 2T(ALS-W548L突变体)和pGEX 2T(ALS-S627I突变体)转化大肠杆菌。
例6单独含有通过Rb系基因组PCR发现的C512A(P171H)突变或通过Ga系基因组PCR发现的C514A(R172S)突变的ALS cDNA的合成，保留有ALS cDNA的pGEX 2T的构建，用该载体对大肠杆菌的转化首先，单独含有C512A(P171H)突变或C514A(R172S)突变的ALScDNA的合成，保留有ALS cDNA的pGEX 2T的构建如图21和图22所述。
为了得到C512A(P171H)突变DNA片段，用Rb系基因组DNA为模板，表6中列出的一组ALS-Rsp6和ALS-Rsp4引物进行PCR反应。特别指出的是，使用Ready to Go PCR Beads，加入5μl基因组DNA模板和每个引物1μl(25皮摩尔/微升)在一个25μl的终体积中进行PCR。反应条件由一个初始在95℃下5分钟的变性步骤，接着一个循环(重复40次)包括在95℃下30秒的变性步骤，在55℃下1分钟的退火步骤和在72℃下2分钟的延伸步骤组成。此外，最后一个循环的延伸步骤是在72℃下延伸9分钟。
PCR反应后，反应溶液进行2％琼脂糖凝胶电泳，从琼脂糖胶中切下PCR产物条带(在图21中描述为“PCR-5”)，然后，用一个GEXPCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒进行纯化。接着，纯化的PCR-5被整合到pT7Blue T-载体(Novagen)，此载体(TA克隆载体)用来克隆PCR产物。特别的是，将1μl纯化的PCR产物和1μl的pT7 Blue T-载体(50纳克/微升)，3μl无菌去离子水和5μl连接缓冲液(ver 2，溶液I，Takara Shuzo)混合，然后，在16℃下反应过夜。
反应后，根据标准方法将反应液总体积转化大肠杆菌(菌株JM109)。在含有50ppm的氨苄青霉素的LB固体培养基中培养大肠杆菌后，从培养基上出现的单个克隆以与实施例5类似的方式挑选含靶序列的菌落。将挑选的单个菌落在含有50ppm氨苄青霉素的LB液体培养基溶液(每个菌落3毫升，共10个)中37℃振摇培养12小时。培养后，用一个质粒提取系统(TOMY DP-480)提取(400到500μl)质粒。将质粒通过离心浓缩到约200μl，将此浓缩液用GFX PCR和凝胶纯化试剂盒纯化和脱盐，然后用约80μl无菌水洗脱。
将55μl洗脱液在10μl的10×T缓冲液和10μl的0.1％BSA存在时与1μl Acc I(12u/μl)和1μl Sma I(10u/μl)混合，总体积为100μl，然后将混合物在37℃下温育2小时。反应后，反应液进行琼脂糖凝胶电泳，切下并且收集靶条带，然后根据GFX PCR和凝胶纯化试剂盒手册收集DNA片段。这样，获得了末端带有Sma I位点和AccI位点的C512A(P171H)突变DNA片段。
另一方面，由于C514A和C512A突变彼此接近，利用提取的Gb系的基因组DNA为模板进行的PCR不能获得只带有C514A(R172S)突变的DNA片段。这样，如图21所示，只带有C514A(R172S)突变的DNA片段用一对事先引入突变位点的引物来制备。即，分别应用了引入突变位点的引物ALS-M1(5’-CCCCAGCCGCATGATCGGCACCGACGCCTT-3’SEQ ID NO33，下划线A是一个突变位点)和ALS-M2(5’-CGGTGCCGATCATGCGGCTGGGGACCT-3’SEQ ID NO34，下划线T是一个突变位点)，用带有插入的野生型ALS cDNA的pBluescript II SK+作为模板；以及应用一组引物ALS-Rsp6和ALS-M2，一组引物ALS-M1和ALS-Rsp4进行PCR。此外，互补部分是ALS-M1的核苷酸序列(第1至23位核苷酸)和ALS-M2的的核苷酸序列(第1至23位核苷酸)。当使用一组引物ALS-Rsp6和ALS-M2时，扩增了图21中描述的“PCR-6”DNA片段；当使用一组引物ALS-M1和ALS-Rsp4时，扩增了图21中描述的“PCR-7”DNA片段。
通过将1μl的LA Taq DNA聚合酶(5单位/微升，TAKARA)，10μ1 10×LA缓冲液、10μl的25mM MgCl2、16μl的dNTPs(分别由25mM的dATP，dGTP，dCTP和dTTP组成)、1μl模板DNA 及各4μl的有义和反义引物(分别为25皮摩尔/微升)溶解，制备总体积为100μl PCR反应溶液。反应重复进行25次，每个循环由一个初始在95℃下5分钟的变性步骤，在95℃下30秒的变性步骤，在55℃下1分钟的退火步骤和在72℃下2分钟的延伸步骤组成，最后一个循环的延伸步骤是在72℃下延伸9分钟。
反应后，反应溶液进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，切下213bp(PCR-6)和377bp(PCR-7)的靶条带，用一个GEX PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒进行纯化，然后分别将得到的DNA片段用100μl无菌去离子水洗脱。
接着，用这样得到的PCR-6和PCR-7进行SPR。SPR时，通过将30μl得到的洗脱液与1μl的LA TaqDNA多聚酶(5单位/微升)、10μl的10×LA缓冲液，10μl的25mM的MgCl2以及16μl的dNTPs(分别25mM dATP，dGTP，dCTP和dTTP组成)混合制备总体积为100μl的反应液。重复40次进行SPR，每个循环由一个初始在95℃下5分钟的变性步骤，在95℃下30秒的变性步骤，在55℃下1分钟的退火步骤和在72℃下2分钟的延伸步骤组成，最后一个循环的延伸步骤是在72℃下延伸9分钟。
反应后，反应溶液进行(1.5％)琼脂糖凝胶电泳分离，切下560bp的靶条带(在图21中所述“SPR-3”)的胶，用GEX PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒进行纯化，然后将得到的DNA片段(SPR-3)用100μl无菌去离子水洗脱。和上述方法类似，将洗脱的片段整合到pT7BlueT-载体，然后转化大肠杆菌(JM109)。培养大肠杆菌，然后由其提取的质粒用Sma I和Acc I消化，这样获得了末端带有Sma I位点和Acc I位点的C514A(R171S)突变DNA片段。
同时，大肠杆菌(菌株JM109)用带有野生型ALS基因插入的质粒pGEX-2T(ALS-野生型)转化，并在含有50ppm的氨苄青霉素的LB液体培养基(2毫升×15份)中在37℃下振摇培养过夜。在用一个质粒提取体系(DP-480)提取质粒后，用真空离心浓缩器将提取物(约750μl)浓缩至约200μl。然后用GEX PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒对浓缩物进行脱盐，最后再将质粒用200μl无菌去离子水进行最终洗脱。
接着，将这样得到的质粒pGEX-2T(ALS-野生型)用AccI消化。特别指出的是，将75μl洗脱液与9μl的10×M缓冲液、3μl Acc I(12u/μl)和3μl无菌去离子水混合，然后将此混合液在37℃下反应3小时。反应后，反应溶液进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，切下并收集靶条带，然后用GEX PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒进行纯化，最后再将得到的DNA片段用100μl无菌去离子水进行最终洗脱。
紧接着，用Acc I消化的质粒pGEX-2T(ALS-野生型)再用Sma I部分消化。特别指出的是，将79μl洗脱液与10μl的10×T缓冲液、10μl的0.1％BSA和1μl的Sma I(10u/μl)混合，其总体积为100μl，然后将混合物在30℃下温育1分钟。此外，由于pGEX-2T(ALS-野生型)含有位于分离的3个位置的Sma I识别序列(在pGEX-2T中与Thrombin切割位点相邻的多克隆位点上，ALS基因的第276位和第430位序列)，所以可在短时间内进行部分消化。反应后，将溶液进行琼脂糖凝胶电泳，只有其中ALS基因中第430位的Sma I识别序列被消化的质粒相应的条带被切下并收集，然后用GEX PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒进行纯化以除去酶和蛋白。最后，将纯化的产物用50μl无菌去离子水洗脱。将这个Acc I消化/Sma I部分消化的pGEX-2T-野生型ALS cDNA片段、通过上述方法得到的末端带有SmaI位点和Acc I位点的C512A(P171H)突变DNA片段和C514A(R172S)突变DNA片段通过标准方法连接。在图22中，仅单独含有由此方法得到的C512A(P171H)突变的突变ALS基因的质粒被称为“pGEX-2T(ALS P171H突变体)”，仅单独含有由此方法得到的C514A(R172S)突变的突变ALS基因的质粒被称为“pGEX-2T(ALS R171S突变体)”。
之后，用总体积的反应溶液转化大肠杆菌(菌株JM109)。将在含氨苄青霉素的LB培养基上出现的单个菌落用PCR以上述方法中类似的方式进行筛选，这样挑选出带有pGEX-2T(ALS P171H突变体)的大肠杆菌转化体和带有pGEX-2T(ALS R172S突变体)的大肠杆菌转化体。
例72-位点突变(C512A(P171H)/C514A(R172S))ALS cDNA的合成，保留有ALS cDNA的pGEX-2T的构建，用该载体对大肠杆菌的转化2-位点突变(C512A(P171H)/C514A(R172S))ALS cDNA的合成，保留有ALS cDNA的pGEX-2T的构建用图23所述。
根据上述实施例6中描述的方法，以Ga系中提取的基因组DNA为模板利用PCR合成2-位点突变(C512A(P171H)/C514A(R172S))ALS cDNA。特别的是，PCR是使用Ga系中提取的基因组DNA为模板，一组引物ALS-Rsp6和ALS-Rsp4而进行的，扩增的DNA片段在图23中被称为“PCR-8”。然后，将扩增的DNA片段连接入pT7B1ue-T-载体，接着用Acc I和Sma I消化，因此得到C512A(P171H)/C514A(R172S)突变DNA片段。接着，如图22所示，将Acc I消化/SmaI部分消化的pGEX-2T-野生型ALS cDNA片段和C512A(P171H)/C514A(R172S)突变DNA用标准方法连接。这样，构建了pGEX-2T(ALSP171H，R172S突变体)质粒。此外，和实施例6相似的是，制备了用pGEX-2T(ALS P171H，R172S突变体)转化的大肠杆菌转化体。
例82-位点突变(C512A(P171H)/G1643T(W548L)和C512A(P171H)/G1880T(S627I))ALS cDNA的合成，保留有ALS cDNA的pGEX-2T的构建，用该载体对大肠杆菌的转化2-位点突变(C512A(P171H)/G1643T(W548L)和C512A(P171H)/G1880T(S627I))ALS cDNA的合成，保留有ALS cDNA的pGEX-2T的构建如图24所述。
首先，根据实施例6中的方法，将实施例5中获得的pGEX-2T(ALS-W548L突变体)用Acc I消化，然后用Sma I部分消化，这样可以使ALS基因中第430位Sma I识别序列到Acc I的识别序列间的部分缺失。接着，将此产物和实施例6中制备的C512A(P171H)突变片段连接，这样构建了含有2-位点突变(C512A(P171H)/G1643T(W548L)ALS cDNA的质粒(在图24中被称为pGEX-2T(ALS-P171H，W548L突变体))。
同时利用实施例5中得到的pGEX-2T(ALS-S627I突变体)代替pGEX-2T(ALS-W548L突变体)，同样构建了含有2-位点突变(C512A(P171H)/G1880T(S627I))ALS cDNA的质粒(在图24中被称为pGEX-2T(ALS-P171H，S627I突变体))。
此外，以例6中相似的方式，用这些pGEX-2T(ALS-P171H，W548L突变)和pGEX-2T(ALS-P171H，S627I突变)转化大肠杆菌。
例93-位点突变(C512A(P171H)/G1643T(W548L)/G1880T(S627I))ALS cDNA的合成，保留有ALS cDNA的pGEX-2T的构建，用该载体对大肠杆菌的转化3-位点突变(C512A(P171H)/G1643T(W548L)G1880T(S627I))ALS cDNA的合成，保留有ALS cDNA的pGEX-2T的构建用图25所述。
首先，实施例5中得到的pGEX-2T(ALS-S627I突变体)用XhoI消化后，根据标准方法进行BAP处理。接着，根据上述方法，从琼脂糖凝胶分离纯化靶基因片段(载体一侧的)。此外，实施例5中得到的pGEX-2T(ALS-W548L突变)用Xho I消化，然后根据上述方法从琼脂糖凝胶分离纯化含突变的片段。
其次，为了构建含2-点突变，G1880T(S627I)和G1643T(W548L)的构建体“pGEX-2T(ALS-W548L，S627I突变体)”，将分别获得的DNA片段进行连接反应。反应后，将总体积反应液转化大肠杆菌(菌株JM109)。根据上述方法，在含氨苄青霉素的LB培养基上出现的单个克隆用PCR进行筛选，然后挑选出带有靶质粒(pGEX-2T(ALS-W548L，S627I突变体))的大肠杆菌转化体。
将筛选的大肠杆菌培养后，根据上述方法构建了质粒pGEX-2T(ALS-W548L，S627I突变体)。将pGEX-2T(ALS-W548L，S627I突变)用Acc I消化，然后用Sma I部分消化，从而可以构建pGEX-2T(ALS-W548L，S627I突变体)，其中ALS基因的第430位Sma I识别序列到Acc I的识别序列间的部分缺失。接着，将此pGEX-2T和实施例6中得到的C512A(P171H)突变片段连接，这样构建了含有3-位点突变(C512A(P171H)/G1643T(W548L)/G1880T(S627I))ALS cDNA的质粒(在图25中被称为“pGEX-2T(ALS-P171H，W548L，S627I突变体”))。
此外，以与实施例6中相似的方式，用pGEX-2T(ALS-P171H，W548L，S627I突变体”)转化大肠杆菌。
实施例10突变ALS蛋白的表达用实施例3(5)中构建的pGEX-2T(ALS-野生型)转化的大肠杆菌，实施例5中构建的pGEX-2T(ALS-W548L突变体)转化的大肠杆菌，实施例5中构建的pGEX-2T(ALS-S627I突变体)转化的大肠杆菌，实施例6中构建的pGEX-2T(ALS-P171H突变体)转化的大肠杆菌，实施例6中构建的pGEX-2T(ALS-R172S突变体)转化的大肠杆菌，实施例7中构建的pGEX-2T(ALS-P171H，R172S突变体)转化的大肠杆菌，实施例8中构建的pGEX-2T(ALS-P171H，W548L突变体)转化的大肠杆菌，实施例8中构建的pGEX-2T(ALS-P171H，S627I突变体)转化的大肠杆菌，实施例9中构建的pGEX-2T(ALS-P171H，W548L，S627I突变体)转化的大肠杆菌，分别在27℃下含氨苄青霉素的2毫升LB液体培养基中进行振摇培养(预培养)。取1毫升预培养液，将这些种类的大肠杆菌分别在含氨苄青霉素的的250毫升LB液体培养基中培养。培养过夜后，在培养基中加入1mM的IPTG，然后进一步培养3到4小时，来诱导GST融合蛋白的表达。此外，细胞在洗涤后于-80℃下贮藏。
通过下述方法由大肠杆菌制备和纯化ALS。首先，将在-80℃下贮藏的转化的大肠杆菌细胞沉淀在ALS提取缓冲液(磷酸钾缓冲液(pH7.5)，含30％甘油和0.5mM的MgCl2)中悬浮。特别的是，向从50毫升培养液中获得的沉淀中加入2.5毫升上述缓冲液。将悬浮液进行超声波处理(Heat Systems-Ultrasonics，超声仪W-225R，微芯片，输出控制8，间隔约1秒，两次(每次40秒))，并在4℃下进行15000×g离心20分钟，由此得到的上清作为粗酶溶液。
这样制备了含任何一个GST融合的野生型ALS蛋白，GST融合W548L突变ALS蛋白，GST融合S627I突变ALS蛋白，GST融合P171H突变ALS蛋白，GST融合R172S突变ALS蛋白，GST融合P171H/R172S突变ALS蛋白，GST融合P171H/W548L突变ALS蛋白，GST融合P171H/S627I突变ALS蛋白，GST融合P171H/W548L/S627I突变ALS蛋白的9种粗酶溶液。
实施例11突变ALS蛋白的除草剂敏感性用实施例10中获得的9种粗酶溶液检查野生型ALS蛋白和突变ALS蛋白对除草剂的敏感性。根据实施例2中几乎一样的步骤进行除草剂敏感性实验。然而，在此实施例中，反应温度是37℃，反应时间是30分钟，在反应液中加入10mM缬氨酸以抑制大肠杆菌中的ALS活性。此外，在三种除草剂中，双嘧苯甲酸钠，嘧硫苯甲酸钠和2-[(4，6-二甲基氧基嘧啶-2基)氧]-6-[1-(甲氧基亚氨基)乙基]苯甲酸用作PC除草剂；绿黄隆用作磺酰脲除草剂；灭草喹用作咪唑啉酮除草剂。在加入突变ALS蛋白之前，将一定浓度的这些除草剂溶液(双嘧苯甲酸钠和嘧硫苯甲酸钠是水溶液，其它除草剂为丙酮溶液)加入到反应液中。丙酮的终浓度是1％。
对于9种粗酶溶液，图26和图27以及表9中显示双嘧苯甲酸钠的抑制活性，表10中显示嘧硫苯甲酸钠的抑制活性，表11显示2-[(4，6-二甲基氧基嘧啶-2基)氧]-6-[1-(甲氧基亚氨基)乙基]苯甲酸的抑制活性，表12显示绿黄隆的抑制活性，表13显示灭草喹的抑制活性。
在表9到13中，当在测试浓度获得50％抑制时，每一种除草剂的抑制活性由造成50％抑制的除草剂浓度(I50)表示。当没有得到50％抑制时，由测试浓度中在最高浓度的抑制百分比表示每一种除草剂的抑制活性。此外，在表9至13中，预期的RS比率指的是带有多重突变的突变ALS蛋白的RS比率，这通常是从每个单独带有一个突变的突变ALS蛋白的RS比率中预期的组合RS比率。即，预期的RS比率通常指从单独带有一个突变的突变ALS蛋白的组合RS比率中预期的协同效应。特别的是，带有多重突变的突变ALS蛋白的预期RS比率是通过选择各自仅带有一个突变的突变ALS蛋白的RS比率(相应于这个蛋白多重突变的所有突变)，然后乘以选择的RS比率而计算的。当一个带有多重突变的突变ALS蛋白实际的RS比率超过预期RS比率，这个蛋白的抗性要超过从单独带有一个突变的突变ALS蛋白的组合抗性所预期的协同效应(抗性)。
表9
表10
表11
表12
表13
上述表9到13中的数据在下面依次进行说明。
首先，双嘧苯甲酸钠的抑制活性(表9)说明如下在由1点突变基因(P171H，R172S，W548L和S627I)编码的突变ALS蛋白中，W548L突变ALS蛋白显示出最高的对双嘧苯甲酸钠的抗性(RS比率520)。S627I突变ALS蛋白或P171H突变ALS蛋白也显示出高的抗性(RS比率分别为41和8.7)，但R172S突变ALS蛋白仅显示出相当于野生型ALS蛋白的抗性(RS比率0.98)。这些结果表明在ALS蛋白中P171H突变，W548L突变和S627I突变是增强对双嘧苯甲酸钠抗性的有效突变。此外，在ALS蛋白中R172S突变显示出是一个沉默突变。
另一方面，在由2点突变基因编码的突变ALS蛋白中，P171H/W548L突变ALS蛋白显示出最强的对双嘧苯甲酸钠抗性(在100μM时为5.5％抑制率，RS比率为＞15000)。P171H/S627I突变ALS蛋白也显示出对双嘧苯甲酸钠强的抗性(RS比率为3700)。P171H/R172S突变ALS蛋白的抗性程度和P171H突变ALS蛋白的几乎相同。此外，由3点突变基因编码的P171H/W548L/S627I突变ALS蛋白也显示出具有对双嘧苯甲酸钠强的抗性(在100μM时为1.1％抑制率，RS比率大于15000)。此外，在图26和27中显示作为上述结果基础的除草剂剂量反应的实际结果。
对于2点突变和3点突变，比较了预期的RS比率和实际的RS比率。P171H/W548L突变ALS蛋白和P171H/S627I突变ALS蛋白的RS比率要比预期的RS比率高的多(RS比率和预期的RS比率的比值远远大于1)。这些结果显示这些两个2点突变基因(编码P171H/W548L突变ALS蛋白的基因和编码P171H/S627I突变ALS蛋白的基因)赋予ALS蛋白的对双嘧苯甲酸钠的抗性要强于预期的每个1点突变基因得到的抗性程度的加和结果。
接着，对嘧硫苯甲酸钠的抑制活性(表10)的说明如下在由1点突变基因(P171H，R172S，W548L，S627I)编码的突变ALS蛋白中，W548L突变ALS蛋白显示出最高的对嘧硫苯甲酸钠的抗性(在100μM时为41％抑制率，RS比率大于9100)。S627I突变ALS蛋白也显示出抗性(RS比率200)，但P171H突变ALS蛋白的抗性程度很低(RS比率3.4)。R172S突变ALS蛋白仅显示出相当于野生型ALS蛋白的抗性(RS比率0.85)。这些结果表明在ALS蛋白中P171H突变，W548L突变和S627I突变是增强对嘧硫苯甲酸钠耐受的有效突变。此外，在ALS蛋白中R172S突变显示出是一个沉默突变。
另一方面，在由2点突变基因编码的突变ALS蛋白中，P171H/W548L突变ALS蛋白给予了最强抗性(在100μM为2 0％抑制率，RS比率大于9100)，其次是P171H/S627I突变ALS蛋白(RS比率为850)。和表9显示的双嘧苯甲酸钠抑制活性数据不同的是，对于嘧硫苯甲酸钠，P171H/R172S突变ALS蛋白显示出的抗性程度比P171H突变ALS蛋白要高(RS比率为13)。这样，证实了R172S突变本身是一个沉默突变，但可增强P171H突变ALS蛋白的抗性程度。
此外，对于2点突变ALS蛋白，当把从每个1点突变ALS蛋白的RS比率而预期的组合RS比率和实际的RS比率比较时，发现P171H/R172S突变ALS蛋白的RS比率要比预期的RS比率高的多(实际RS比率和预期的RS比率的比值远远大于1)。这些结果揭示P171H/R172S突变ALS蛋白显示出对嘧硫苯甲酸钠的抗性要强于由1点突变基因预期的抗性程度。
接着，对2-[(4，6-二甲基氧基嘧啶-2基)氧]-6-[1-(甲氧基亚氨基)乙基]苯甲酸的抑制活性(表11)的说明如下
在由1点突变基因(P171H，R172S，W548L和S627I)编码的突变ALS蛋白中，W548L突变ALS蛋白显示出最高的对2-[(4，6-二甲基氧基嘧啶-2基)氧]-6-[1-(甲氧基亚氨基)乙基]苯甲酸的抗性(RS比率为4500)。S627I突变ALS蛋白也显示出高的抗性(RS比率2800)，但P171H突变ALS蛋白的抗性程度低(RS比率5)。R172S突变ALS蛋白仅显示出相当于野生型ALS蛋白的抗性(RS比率1.2)。这些结果表明在ALS蛋白中P171H突变，W548L突变和S627I突变是增强对2-[(4，6-二甲基氧基嘧啶-2基)氧]-6-[1-(甲氧基亚氨基)乙基]苯甲酸耐受的有效突变。此外，在ALS蛋白中R172S突变显示出是一个沉默突变。
在由2点突变基因编码的突变ALS蛋白中，P171H/W548L突变ALS蛋白给予了最强抗性(在100μM为11％抑制率，RS比率大于13000)，其次是P171H/S627I突变ALS蛋白(在100μM为21％抑制率，RS比率大于13000)。对于这些P171H/W548L突变ALS蛋白和P171H/S627I突变ALS蛋白，比较了预期的RS比率和实际的RS比率。然而，不能证实实际的抗性是否强于从每个1点突变基因预期的抗性程度。
接着，对绿黄隆的抑制活性(表12)的说明如下在由1点突变基因(P171H，R172S，W548L和S627I)编码的突变ALS蛋白中，W548L突变ALS蛋白显示出最高的对绿黄隆的抗性(RS比率520)。P171H突变ALS蛋白显示出相对高的抗性(RS比率85)，但S627I突变ALS蛋白的抗性程度低(RS比率2.4)。R172S突变ALS蛋白仅显示出相当于野生型ALS蛋白的抗性(RS比率0.85)。这些结果表明在ALS蛋白中P171H突变，W548L突变是增强对绿黄隆抗性的有效突变。此外，在ALS蛋白中R172S突变显示出是一个沉默突变。
在由2点突变基因编码的突变ALS蛋白中，P171H/W548L突变ALS蛋白显示了最强抗性(在100μM为16％抑制率，RS比率大于7700)，其次是P171H/S627I突变ALS蛋白(RS比率为760)。和表9显示的双嘧苯甲酸钠抑制活性数据不同的是，在绿黄隆的例子中，P171H/R172S突变ALS蛋白显示出的抗性程度(RS比率为420)比P171H突变ALS蛋白要高。这样，证实了R172S突变本身是一个沉默突变，但可增强P171H突变ALS蛋白的抗性程度。此外，P171H/W548L/S627I突变ALS蛋白也显示出强的抗性(在500μM为30％抑制率，RS比率大于3800)。
对于P171H/R172S突变ALS蛋白和P171H/S627I突变ALS蛋白，比较了预期的RS比率和实际的RS比率。对于两种蛋白，实际RS比率都要比预期的RS比率高的多。这些结果表明P171H/R172S突变ALS蛋白和P171H/S627I突变ALS蛋白对绿黄隆的抗性要强于每个1点突变基因预期的抗性程度。
接着，对灭草喹(表13)的抑制活性数据的说明如下在由1点突变基因(P171H，R172S，W548L和S627I)编码的突变ALS蛋白中，W548L突变ALS蛋白显示出最高的对灭草喹的抗性(在100μM为14％抑制率，RS比率大于45)。S627I突变ALS蛋白也显示出抗性(RS比率41)，但P171H突变ALS蛋白几乎没有显示出抗性(RS比率1.5)。R172S突变ALS蛋白仅显示出相当于野生型ALS蛋白的抗性(RS比率0.98)。这些结果表明在ALS蛋白中W548L突变和S627I突变是增强对灭草喹抗性的有效突变。此外，在ALS蛋白中P171H突变和R172S突变显示出是一个沉默突变。
在2点突变基因编码的突变基因中，P171H/W548L突变ALS蛋白显示了最强抗性(在100μM为13％抑制率，RS比率大于45)，其次是P171H/S627I突变ALS蛋白(RS比率为32)。P171H/R172S突变ALS蛋白的抗性程度和P171H的1点突变基因的抗性程度几乎一样。此外，P171H/W548L/S627I突变ALS蛋白也显示出强的抗性性(在100μM为15％抑制率，RS比率大于45)。
对于2点ALS突变蛋白和3点ALS突变蛋白，比较了预期的RS比率和实际的RS比率。P171H/S627I突变ALS蛋白的RS比率要比预期的RS比率高的多(实际的RS比率和预期的RS比率的比值明显大于1)。这些结果显示P171H/S627I突变ALS蛋白显示出的对灭草喹抗性要强于预期的每个1点突变基因的抗性程度。
工业适用性如上面详细描述，本发明可提供一种编码对各种除草剂具有良好抗性的乙酰乳酸合酶基因，一种由此基因编码的乙酰乳酸合酶蛋白，一种带有此基因的重组载体，一种带有此重组载体的转化体，一种带有此基因的植物，一种培养此植物的方法，以及一种利用此基因作为选择标记选择转化体细胞的方法。
序列表无格式文本SEQ ID NO9到34代表引物。
在SEQ ID NO29中第15个n代表a，c，g或t。
序列表<110>KUMIAI CHEMICAL INDUSTRY CO..LTD国家农业生物学科学研究所<120>编码乙酰乳酸合酶的基因<130>PH-1733-PCT<150>JP 2002-95721<151>2002-03-29<160>34<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2301<212>DNA<213>水稻kinmaze品种<220>
<221>CDS<222>(48)..(1979)<400>1cccaaaccca gaaaccctcg ccgccgccgc cgccgccacc acccacc atg gct acg56Met Ala Thr1acc gcc gcg gcc gcg gcc gcc gcc ctg tcc gcc gcc gcg acg gcc aag104Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala Thr Ala Lys5 10 15acc ggc cgt aag aac cac cag cga cac cac gtc ctt ccc gct cga ggc152Thr Gly Arg Lys Asn His Gln Arg His His Val Leu Pro Ala Arg Gly20 25 30 35cgg gtg ggg gcg gcg gcg gtc agg tgc tcg gcg gtg tcc ccg gtc acc200Arg Val Gly Ala Ala Ala Val Arg Cys Ser Ala Val Ser Pro Val Thr40 45 50ccg ccg tcc ccg gcg ccg ccg gcc acg ccg ctc cgg ccg tgg ggg ccg248Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro Trp Gly Pro
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<223>人工序列描述引物<400>21gcatcttctt gatggcg17<210>22<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物
<400>22atgcatggca cggtgtac 18<210>23<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>23gattgcctca cctttcg17<210>24<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>24aggtgtcaca gttgttg17<210>25<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>25agaggtggtt ggtgatg17<210>26<211>17<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述引物<400>26gctttgccaa catacag17<210>27<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>27cagcccaaat cccattg17<210>28<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>28atgtaccctg gtagattc 18<210>29<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<220>
<221>variation<222>15<223>n代表a，c，g或t
<400>29gtttygctay ccggngg17<210>30<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>30ggaaacagct atgaccatg 19<210>31<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>31ccgggagctg catgtgtcag agg 23<210>32<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>32gggctggcaa gccacgtttg gtg 23<210>33<211>30<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>33ccccagccgc atgatcggca ccgacgcctt 30<210>34<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>34cggtgccgat catgcggctg gggacct 2权利要求
1.编码下列蛋白(a)或(b)的基因(a)由SEQ ID NOS2、4、6和8中任意一种氨基酸序列组成的蛋白；(b)由通过对SEQ ID NOS2、4、6和8中任意一种氨基酸序列进行替换、缺失或添加至少一个或多个氨基酸而衍生得到的氨基酸序列组成的蛋白，该蛋白具有对嘧啶羧基除草剂的抗性和乙酰乳酸合酶活性。
2.一种由权利要求1所述基因编码的乙酰乳酸合酶蛋白。
3.一种具有权利要求1所述基因的重组载体。
4.一种具有权利要求3所述重组载体的转化体。
5.一种植物，其具有权利要求1所述基因，并且具有对嘧啶羧基除草剂的抗性。
6.一种培养权利要求5所述植物的方法，其包括在嘧啶羧基除草剂存在下对植物进行培养。
7.一种选择具有权利要求1所述基因的转化体细胞的方法，其以所述基因作为选择标记。
全文摘要
本发明提供一个编码下列蛋白(a)或(b)的基因，该蛋白显示高水平的对PC除草剂或磺酰脲除草剂的抗性(a)由SEQ ID NOS2、4、6和8中任意一种氨基酸序列组成的蛋白；(b)由通过对SEQ ID NOS2、4、6和8中任意一种氨基酸序列进行替换、缺失或添加至少一个或多个氨基酸而衍生得到的氨基酸序列组成的蛋白，该蛋白具有对嘧啶羧基除草剂的抗性和乙酰乳酸合酶活性。
文档编号C12N15/60GK1656224SQ0381219
公开日2005年8月17日 申请日期2003年2月21日 优先权日2002年3月29日
发明者角康一郎, 清水力, 河合清, 永山孝三, 福田笃德, 田中喜之 申请人:组合化学工业株式会社, 独立行政法人农业生物资源研究所