专利名称：：人胚胎干细胞方法与podxl表达的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于鉴定样品中的未分化胚胎干细胞并从样品中分离它们的方法；以及用于去除样品内这种细胞的方法。本发明还涉及在这种方法中有作用的组分试剂盒(kitofparts)。
背景技术：
：未分化的人胚胎干细月包在医学中具有多种用途，例如用于组织再生和修复，且人们相信其在今后将变得越发重要。目前，捐献的器官和组织常常用来*#换患病或受损组织，^f旦对可移4直组织和器官的需求已大大超过了有效供给量。干细胞尤其是人胚胎干细胞可定向分化为特定的细胞类型，提供了可更新性^,换细胞和组织来源的可能性，用来治疗帕金森和阿尔茨海默病、脊髓损伤、中风、烧伤、心脏病、津唐尿病、骨关节炎及类风湿'f生关节炎。目前，用来鉴定人胚胎干细胞的试验包括培育并再次培养所述干细胞几个月。这确保了细胞能够长期自我更新。通过显纟敬镜观察该培养物，以判断细胞看上去健康且保持未分化。利用特殊技术来确定仅在未分化细胞上所发现的表面标志物的存在。另一个重要的试验是检测通常由未分化细胞生成的称为Oct-4蛋白的存在。Oct-4是一种转录因子，即其有助于基因在恰当的时间开启或关闭，是细月包分化和胚胎发育过程中的重要部分。检测人胚胎干细胞是否为多能性，通过1)允许细胞在细胞培养基中自发分化；2)处理细胞使其分化形成特定细胞类型；或者3)将该细胞注射入免疫抑制的小鼠体内，4企测称为畸胎瘤的良性肿瘤的形成。畸胎瘤通常包含多种分化或部分分化的细胞类型-表明胚胎干细l包能够分化为多种细月包类型。尽管未分4匕人胚胎干细月包本身可用于细月包疗法中，^f旦人们^人为，相比于人胚胎干细力包，采用已开始分化或已经分4b的细胞比4交有好处。促进未分化人胚胎干细胞分化为特殊细胞谱系的方法在本领域中为人熟知。一旦该分化过程已经开始或继续，则去除或破坏未分化人胚胎干细胞则比较有益，否则其可能形成不需要的畸胎瘤。因此，可以看出鉴定或分离未分化人胚胎干细胞非常有利(因为其本身可用于治疗中或经促进可分化为可用于治疗中的特定细胞谙系)。从细胞混合物中去除或破坏未分化人胚胎干细胞也非常有利，细胞混合物中的部分细胞已经开始分化或已分化，因为这些分化细胞在治疗中比较有利。现在仍然需要其他鉴定未分化人胚胎千细力包的方法。本发明者已经发现足糖萼蛋白样蛋白1前体是未分化人胚胎干细胞的一个标志物。本说明书中对之前所发表文献的罗列和讨论不必认为是承认该文献为本领域现状的一部分或是共有的常识。
发明内容本发明的第一方面提供鉴定样品中未分化人胚胎干细胞的方法，样品可能包含这种细胞，该方法包括鉴定表达足糖萼蛋白样蛋白l前体(PODXL)的才羊品内表面上细月包。该方法可用来评估特殊样品是否包含未分化人胚胎干细胞以及如果包含这种细胞，则评估包含多少这种细胞。因此，本发明包，括未分化人胚胎干细力包的定量。本发明的第二方面提供从包含这种细胞的样品中分离未分化人胚胎干细胞的方法，该方法包括分离样品内表达其表面上的PODXL的细胞。本方法用来^是供富集(enriched)的或基本分离的未分化人胚胎千细胞的组合物。这种组合物可用于多种方法中，例如其本身可用于细胞疗法中，如下文将更详细讨论的，或者其可用作细胞来源，其经促进可分化为用于特定治疗的特定细胞谱系，或者其可用来(体外或体内)研究可使人胚胎干细胞分化为其他细胞的因素。通常，该人胚胎干细力包的富集组合物所包含细力包的至少50%为未分化人胚胎干细胞，优选至少70%或至少90%或至少95%。优选的，该组合物中的所有细胞均为所述未分化人胚胎干细胞。本发明的第三方面提供从包含这种细胞的样品中去除未分化人胚胎干细月包的方法，该方法包括V人才羊品中去除表达其表面上的PODXL的纟田月包。所去除的细胞可能形成如本发明第二方面中人胚胎干细胞的组合物。此外，已经从中去除人胚胎干细胞的样品在治疗中可能非常有利，如下文将更详细讨i仑的。10本发明的第四个方面提供破坏包含这种细胞的样品中未分化人胚胎干细胞的方法，该方法包括破坏样品内表达其表面上的PODXL的细月包。石皮坏或杀死样品中的未分化人胚胎干细胞非常有利，因为如下文所讨论的，从未分化和分化细胞混合物中去除未分化人胚胎干细胞有时非常有利。样品可以为任何包含或怀疑包含一种或多种未分化人胚胎干细胞的样品。恰当的样品包括人胚胎或人胚胎组织。其他恰当样品包括体外培养的样品。关于本发明的第三和第四方面，特别优选样品中的未分化人胚胎干细胞经促进已分化为特定细胞谱系，因此该样品可包含未分化和分化细胞的混合物(因为目前分化不是一个高效的过程)。通常，在这种样品中，所述未分化人胚胎干细胞构成细胞总数的百分之几。通常，样品中的分化细胞可以为(通过分化)起源于人胚胎干细胞的心月几细J包、月夷岛、神经元祖细月包或间质干细胞。在临床应用包含分化细胞的样品之前，从该样品中去除(或在其中石皮坏)未分化人胚胎干细i包将非常有利，因为所述未分化细刀包可能形成不需要的畸胎瘤。通常，应去除或破坏未分化细胞的至少95%。优选的，去除或-皮坏所述全部细胞。相对于去除，更倾向于石皮坏或杀死才羊品中的未分化细月包，以将细胞处理或分离的额外步骤降到最少。此外，人们相信杀死可能是一种更"纯粹"形式的细胞去除。足糖萼蛋白样蛋白1前体的氨基酸序列在图9B中给出(SEQIDNO:1),也可在通过EntrezPubMed在NCBI蛋白序列翁:据库的登陆号No000592中查到(还可参见Kershaw"a/(1997)乂^o/.C77em.272，15708-15714)。也称为PCLP1和PODXL。为了方1^更，下文3夸4尔为PODXL。应该理解，用在本发明所述方法中的标志物是在未分化人胚胎干细胞中天然存在的PODXL。因此，PODXL可能具有图9B中给出的精确序列，还可以是其天然存在的变异体。例如，根据000592,R是残基62处T的变异体，而S是残基196处L的变异体。在本发明第一、第二和第三方面的特别优选实施例中，使样品与结合部分4妄触，该结合部分结合PODXL,通过其结合于该结合部分所述人胚胎干细胞可在样品中鉴定，或者从样品中分离或去除。才艮据000592，PODXL是528残基糖基化的细月包表面多肽，其残基1-22是单肽，而残基23-528代表成熟蛋白。人们认为残基23-431是蛋白的胞外部分，而残基432-452是3,膜区。残基23-304代表Ser/Thr富集区。如果结合PODXL的结合部分结合PODXL的月包外区，例如在Ser/Thr富集区内部或该区域之外，则是优选的。合适的，该结合部分是抗体，该术语包括其片,殳或书f生物，或者合成的抗体或合成的抗体片段。结合PODXL的抗体已经为人所知。例如，特异于人足糖萼蛋白的山羊IgG(该多克隆4元血清结合到月包外i或)可从R&DSystems,Inc购得，目录号是AF1658。此外，单克隆抗人足糖萼蛋白抗体(小鼠IgG2A)可乂人R&DSystems,Inc购4寻，目录号是MAB1658。在<壬何情形下，通过目前与单克隆抗体技术相关的技术，可制备针对大多数抗原的抗体。抗原结合部分可为抗体的一部分(例如Fab片段)或者合成的抗体片段(例如单链Fv片段[ScFv])。针对选定抗原的恰当单克隆抗体可通过已知技术制备，例如那些在"Mo"oc/o"a/y^/6ot//esvj附朋i/a/fec/2m々wW,HZola(CRCPress,1988)和JGRHurrell(CRCPress，1982)中所4皮露的。Neuberger等人讨论了嵌合抗体(1988，8,//w^"a"o加/5/c^ec/2wo/ogy5y^2/os7'm柳Part2,792-799)。多克隆抗体在本发明所述方法中非常有利。优选单特异性多克隆抗体。恰当的多克隆抗体可利用本领域中熟知的方法进4亍制备。抗体片段例如Fab和Fab2片段还可应用作为一般的基因工程抗体和抗体片l史。在抗体识别中涉及抗体的重《连可变区(VH)和轻链可变区(VL),该事实最初是通过早期的蛋白酶消化试验而认识到的，并通过啮齿类抗体的"人源化"而得到进一步确认。啮齿动物源抗体的可变区可融合于人源抗体的恒定区，使得所得到的抗体保留啮齿动物源抗体的抗原特异性(MorrisonW"/(1984)尸rac.A^"81，6851-6855)。该抗原特异性由可变区赋予，且依赖于恒定区，这一点是从涉及抗体片段的细菌表达的实验而得知的，所述抗体片段均包含一个或多个可变区。这些分子包4舌Fab才羊分子(Better""/(1998)5Wewce240，1041);Fv分子(Skerraetal(1988)5W潔e240,1038);单链Fv(ScFv)分子，其中Vh和VL的伴侣结构域通过柔性寡肽而连4妄(Bird"a/(1998)242，423;Huston"c/(1988)胸/.JcadSc/.6^485,5879)并且包含独立V区的单链抗体(dAbs)(Ward"a/(1989)A^w"341，544)。对保留其特异结合位点的抗体片段合成中所涉及才支术的综述可在Winter&Milstein(1991)A^fwre349，293-299中查到。13通过"ScFv分子"表示其中Vh和VL的伴侣结构域通过柔性寡肽连4妄的分子。Fab、Fv、ScFv和dAb抗体片,殳均可在co//中表达并乂人其中分泌出来，^v而易于生成大量所述片l殳。全抗体和F(ab，)2片l殳为"二^介"。通过"二fT表示所述抗体和F(ab，)2片段具有两个抗原结合位点。相反，Fab、Fv、ScFv和dAb片段为单价，仅具有一个抗原结合位点。结合PODXL的合成抗体还可利用噬菌体显示技术制备，如本^页i或中为人熟^口的。特别优选用于本发明所述方法和试剂盒中的抗PODXL抗体在下文i举细4苗述。通常，在鉴定未分化人胚胎干细胞的方法中，结合部分进行可检测性标记或者可以检测。例如，结合部分用放射性原子或有色分子或荧光分子或易于以<壬4可其他方式^:测的分子进4于标记。结合部分可直4妄用可才企测性标记物进4亍标记或间4妻标记。例如，结合部分可以是可通过另一种抗体(其本身可加以标记)进4于;险测的未标记抗体。可替代的，第二抗体可已结合于生物素，带标记的抗生物素蛋白链菌素结合于生物素可用来间接标记第一抗体。在优选的实施例中，本发明包4舌鉴定才羊品中未分化人胚胎干细胞的方法，样品可能包含这种细胞，该方法包括使样品与结合部分(例如抗体)接触，而该结合部分结合所述细胞表面上的PODXL，使得结合部分(例如抗体)结合细胞表面上的PODXL并确定哪些细胞具有在该位置结合的结合部分(例如抗体)。通常，在分离未分化人胚胎干细胞的方法中，将结合部分固定于固体载体上，因此可通过亲和性结合而分离人胚胎干细胞。方便的，固体载体包括任何恰当的基质例如琼脂糖、丙烯酰胺、Sepharose(商标)和Sephadex(商标)。该固体载体还可以为固态基底如凝:量滴定^反等。方便的，将结合部分进行磁性标记(直接或间接)，使得发生结合后，一旦提供合适的磁场即可将人胚胎干细胞与样品的其余部分分开。用于f兹性细胞分选的孩O朱常常命名为MACS月交体超顺^兹微珠。以这种方式标记的人胚胎干细胞可通过^兹性激活的细胞分选(MACS)进行分选。恰当的，结合部分用荧光分子标记(直接或间接)，并利用荧光活化的细胞分选仪(FACS)分离人胚胎干细胞。在优选的实施例中，本发明包括从包含这种细胞的样品中分离未分化人胚胎千细胞的方法，该方法包括以下步骤使样品接触可结合所述细胞表面上PODXL的结合部分(例如抗体)，4吏结合部分(例如抗体)结合于细胞表面上的PODXL，将结合的部分-细胞复合物与样品的剩余部分分开，且可选的，将所述细胞从结合部分释放。在本发明第四方面的特別优选实施例中，通过结合于可结合PODXL的结合部分而破坏所述未分化人胚胎干细胞。方便的，结合部分是抗体。抗体本身可导致杀伤未分化人胚胎干细胞。例如，抗体结合细胞表面上的PODXL可引起细胞通透性增加(如对染料如石爽化丙啶/台盼蓝的明显高通透性)和细胞皱缩。可替代的，抗体(或其他结合部分)可进一步连4妻于细月包毒性部分，当所连4妄的抗体结合于细月包时，该细力包毒性部分可^皮坏所述细月包。可连接于抗体或其他结合部分的恰当细胞毒性部分包括放射性原子、细胞毒性药物、细胞毒性蛋白以及将前药转化为细胞毒性药物的酶系统。这些部分在本々页i或中均为人熟知。在优选的实施例中，本发明包括破坏包含这种细胞的样品中未分化人胚胎干细胞的方法，该方法包括以下步骤使样品接触对所述细胞有毒的结合部分(例如抗体)，使结合部分(例如抗体)结合所述细力包表面上的PODXL，并4吏该结合部分杀伤所述细力包。该结合部分可以是本身对所述细胞有细胞毒性的抗体，或者包括另一种乂于细力包有毒的部分。从上文应该理解，本发明还包括结合PODXL的部分用于鉴定含这种细胞的样品中的未分化人胚胎干细胞；结合PODXL的部分用于/人含这种细胞的样品中分离未分化人胚胎干细胞；结合PODXL的部分用于从含这种细胞的样品中去除未分化人胚胎干细胞；结合PODXL的部分用于破坏含这种细胞的样品中的未分化人胚胎干细胞.优选的，该结合部分是抗体。本发明还提供进一步包含可检测标记物的结合PODXL的部分。本发明还l是供进一步包含细胞毒性部分的结合PODXL的部分。优选的，该结合部分是抗体。本发明的另外一方面提供包含结合PODXL的部分的组分试剂盒(kitofparts)以及另外的4企测另一种人胚胎干细胞标志物的试剂。优选的，所述另一种人胚胎干细胞标记物是Oct4、SSEA-4、Tra-l-60、Tra-1-81和GCTM2中的4壬4可一种。更fiL选的，所述另一种人胚胎干纟田月包才示i己净勿进一步包4舌mAb5、mAb8、mAb14、mAb63、mAb84、mAb85、mAb95、mAb375、mAb432和mAb529中的任何一种。通常，试剂盒包4舌抗PODXL的抗体以及抗Oct4、SSEA-4、Tra-l-60、Tra-1-81和GCTM-2中一种或多种的抗体。通常，试剂盒还可包括用于免疫化学的试剂；固定与支持物的抗体；用于标记抗体的方法；用于将^:体连4妄于细力包毒性部分的方法。应该理解，对于本发明的所有实施方式，优选抗体是选择性的。因此，优选抗PODXL的抗体选择性结合PODXL,即以比其他人类蛋白更大的亲和力结合PODXL。通常，抗PODXL抗体基本上不结合其他蛋白。下文将4交详细阐述其他在本发明的实施中非常有利的抗PODXL抗体。本发明还提供利用本发明第二方面分离的未分化人胚胎干细胞(或富集这种细胞的组合物)。本发明还包括表达其表面上的PODXL的分离的未分化人胚胎干细胞。通常，所述分离的人胚胎干细力包或富集人胚胎干细力包的纟且合物作为药物纟且合物而冲是供。因此，本发明4是供通过实施本发明第二方面的方法生成人胚胎干细胞的药物组合物并通过例如恰当的无菌无致热原的试剂将其制备入药物组合物的方法所述分离或富集的未分化人胚胎干细月包可用来治疗需要细月包疗法的患者。通常在执业医师的监督下将有效量的细胞给予患者。本发明还提供包含未分化细胞的组合物(其已通过促进未分化人胚胎干细胞分化而制备)，但其通过本发明第三或第四方面所述方法耗尽了未分化人胚胎干细胞。本发明还提供包含从未分化人胚17胎干细胞分化而来的细胞的组合物，该组合物基本不包含表达其表面上的PODXL的未分化人胚胎干细胞。这些组合物通常作为药物组合物而l是供。因此，本发明包4舌通过如上文所述提供包含分化细胞(但耗尽了未分化人胚胎干细胞)的组合物并将其制备入药物组合物而制备药物组合物的方法。包含分化细胞但耗尽了未分化人胚胎干细胞(且优选没有这种细胞)的组合物对于治疗需要细胞疗法的患者非常有利。通常在执业医师的监督下将有效量的组合物给予患者。利用该细力包或组合物进4亍治疗的合适疾病包4舌帕金森和阿尔茨海默病、脊髓损伤、中风、烧伤、心脏病、骨关节炎及类风湿性关节炎。已经确定了mAb84的Vh和VL链的氨基酸序列(且编码其的多核苷酸序列)，如图11和12中所示。因此，本发明的另外一方面提供抗PODXL的抗体，包含氨基酸序列i)至iii)或氨基酸序列iv)至vi)或优选包含氨基酸序列i)至vi)DS細SVNYMY卿ff>NO:2)i0OTSMAS(,B>NO:3)鄉QQ，SYFYT(S1QIDNO:4》的IfTWMN,ID藍5)v)BIRLKSNNYATHyABSVKG(SEQIDNO:6)WERA卿丽0:7)或其变异体，其中所述序列i)至Vi)的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸用另一种氨基酸取^。优选的，抗体包含已给出的特殊氨基酸序列。通常，如果所给出的氨基酸序列存在变异，则该变异是所述序列i)至Vi)中一个或两个或三个或四个中一个或两个氨基酸的取^。通常，变异体在所述序列i)至vi)中一个或两个中具有一个或两个氨基酸取^。方i"更的，在所述序列i)至vi)中一个或两个中存在一个氨基酸取代。在任何情形下，抗体均保留结合PODXL的能力。优选的，抗体选才奪性结合PODXL的胞夕卜区域，所述与PODXL的选择性结合由这些氨基酸序列的存在而赋予。伊G选的，^L体具有至少一个结合下列CDR的轻链可变区CDR1:SASSSVKYM1f(SBQIDNO:2)ODE2:DTS>ttAS,fl>NO:3》OTE3:QQ鄉SYPYT卿H>M>:4)專交优选的，抗体具有至少一个包含图ii中所示出氨基酸序列(SEQIDNO:8)的45链可变区。优选的，抗体具有至少一个结合下列CDR的重链可变区CDRl:MYWMN(SEQID:N0:5)ODR2:E10XSHNYMHY細VK:G卿IB微6)CDR3:BRA(犯QBDNO:7)專交优选的，抗体具有至少一个包含图12中所示出氨基酸序列(SEQIDNO:IO)的重链可变区。更加优选的，抗体具有如上文所确定defined的至少一种轻链可变区以及力o上文所确定defined的至少一种重链可变区。最优选的，抗体具有至少一个包含如图11中所示出氨基酸序列(SEQIDNO:8)的轻《连可变区和至少一个包含如图12中所示出氨基f复序列(SEQIDNO:IO)的重链可变区。然而，应该理解上文所列出mAb84的轻《连和重链CDRsl-3与除图11和12中所示之外的才匡架区结合也可能特別有利。因此，在一种实施方式中，上文所列出mAb84的具有CDRsl-3的轻《连或重链可具有替代性框架区。恰当的框架区在本领域中为人熟知，且可在例如M.Lefranc&G.Lefranc(2001)"TheImmunoglobulinFactsBook"，AcademicPress,结合于此供参考。抗体可进行可检测性标记或者其可利用如上文所述细胞毒性部分进行标记。抗体可用于本发明第一、第二、第三或第四方面所述方法中的任何一种，且其可用于组分试剂盒中。应该理解，CDR序列可用于生成如上文所讨i仑的合成抗体和抗体片段。本发明的另一方面4是供编码上文所4是及抗体或包含这种抗体Vl或VH链其中之一(或二者均包含)的分子的多核苷酸。编码mAb84轻链和重链的多核普酸分别在图11(SEQIDNO:9)和图12(SEQIDNO:ll)中示出。本发明包4舌包含表达抗体所需的一种或多种多核苷酸的宿主细胞。通常，该宿主细胞是细菌、酵母或哺乳动物细胞。中华仓鼠卵巢(CHO)细月包特别适于4元体生成。现在，将参照下列图形和实施例而进行描述，其中恩丄柳」A与末^y么^E^C^9應系^"合的就式^9應;^^f。HES-3细胞的单细胞悬液用抗hESC上细胞表面抗原制备的不同mAb克隆或抗Tra-1-60的mAb进4亍染色。结合于细月包的抗体则用辄合FITC的抗小鼠抗体进行检测。阴影直方图表示利用隐性对照进行染色，空白直方图则表示利用第一抗体进行染色。激2^/^A瘦鈿應化夢为、浙/i"A与/^E^C^虔丄鈿應表面拔j的潜合。在饲养细胞上培养的HES-3克隆用抗hESC上细胞表面抗原制备的不同mAb克隆进行免疫染色。随后克隆用辄合FITC(mAb5、14、63和95)或PE(mAb84和mAb85)的抗小鼠才企测抗体进行染色。阴性染色利用同种型对照SSEA-1进行观察(数据未示出)。图像以40倍》丈大进行拍才聂，比例条表示200jum。激义对以不/^7的A^^C錄合附JA;^拔Ocf的附J6染悉的好ES-3进^f"双悉滅^C勿應为、^f。hESC的单细胞悬液依次用不同的hESC结合mAb克隆染色，随后用抗Oct-4的mAb染色。结合于细胞的抗体同时用抗小鼠IgG特异性抗体(轭合FITC)和抗小鼠IgM抗体(轭合PE)进行4企测。定位该plot的标志物以表示左下象限中恰当的FITC或PE轭合的同种型对照中>95%的荧光。激4附^W对^E"51(7和五C细應的^9應毒性^t应。细月包悬液(2x105)与5jugmAb84或mAb85(同种型只于照)在4。C一起孵育45min。其后，收集细胞用于在流式细胞仪上进行PI排除分析。散点图中的门区表示存活细胞群。激5.^M微^"^^f与附^W—趟/承f的/^ESC和五C细應。细月包悬'液(2x105)在24孑14反中与5jugmAb84或mAb85(同种型只于21照)在4。C一起孵育45min,并在显微镜下进行分析。图像以100倍放大进行拍摄，比例条表示100jum。激6.附」W^f^S^A五SC杀務64和丑j时/^^^^^f^:的在在。HES-3细月包与5jugmAb84(A)或mAb85禪，同种型对照)在4。C一起孵育。加入mAb后15、30和45min收集细J包，并通过PI排除或台盼蓝排除试-验分析存活性。(C)mAb84剂量对hESC的杀伤岁丈应。HES-3细月包与5mgmAb84(血)或mAb85(翻)在4。C一起孵育。45min后，收集细胞，并通过PI排除试验分析存活性。(D):HES-3细胞与纯化或未纯化(培养液上清)(■)mAb84在37。C一起孵育45min,随后收集细胞用于在流式细胞仪上通过PI排除试验进行分析。与mAb85—起孵育作为同种型对照《0。慰7.时河对/MJW^V^^^E^C杀仿的影询。HES-3细胞与纯化mAb84或mAb84的培养液上清在4。C和37°C—起粹育45min。随后收集细胞用于在流式细胞仪上通过PI排除试验进行分析。与mAb85—起將育作为同种型只于照。戽&A五5^,潜維'胜与wJ6W杀i^炎芈之河的^杀。未分化和分化HES-3细月包的单细胞悬液为(A):用抗Tra-1-60的mAb染色。结合于细胞的抗体用轭合FITC的抗小鼠抗体进行检测。阴影直方图表示利用隐性对照进行染色，空白直方图则表示利用抗Tra-1-60的mAb进4亍染色。(B):与5jugmAb84在4。C一起孵育45min。其后，收集细胞用于在流式细胞仪上进行PI排除分析。散点图中的门区表示存活细胞群。激9.尸(9Z)JVX为附J6^/在A五SC丄的乾^f;jo(A)对利用mAb84免疫沉淀的草巴抗原进4亍蛋白印迹分析。利用PhyTip柱乂人包含mAb84的hESC裂解物中亲和纯4b的革巴:沆原在SDS-PAGE上分离，进4亍蛋白印迹并用mAb84(泳道1)、抗人PODXL的mAb(泳道2)和抗人PODXL的pAb(泳道3)才全测。(B)利用LC-MS/MS鉴定PODXL。从蛋白数据库搜索获得的人PODXL(SEQIDNO:l)氨基酸序列以及从MS分析中对应于PODXL的6个胰蛋白酶肽(下划线及并H体)。激/汰^"耆戎尸ODAX拔体;^化:f附^A^/对的^9應毒#。HES-3细月包与5ygmAb84、mAb-PODXL、pAb-PODXL或mAb85(同种型对照)在4。C一起孵育45min。在某些实-验中，hESC进一步与羊抗鼠(GAM)抗体发生超高交联。其后，收集细胞用于在流式细胞仪上进行PI排除分析。散点图中的门区表示存活细胞群(A)。结果也以表^^各形式示出(B)。Ki链的^j^^f(/f^^核茅^/^y义未加下划线的氨基酸对应于冲匡架区。力口下划线的氨基酸则只寸应于互#卜决定区(CDRs)。氨基酸序列是SEQIDNO:8，核普酸序列是SEQIDNO:9。^//链的^^^^^/f^^核夯^^,i/义未加下划线的氨基酸对应于框架区。力口下划线的氨基酸则对应于互补决定区(CDRs)。氨基酸序列是SEQIDNO:IO，核苦酸序列是SEQIDNO:ll。具体实施例方式实施例i:抗;ut萼蛋白样蛋白的单克隆抗体结合并杀伤未分化>^胎干细胞引言人胚胎干细胞(hESC)起源于胚泡内细胞团，是多潜能干细胞，具有以未分化状态在体外无限增殖的能力。在恰当条件下，hESC还可在体外和体内分化为代表所有三种胚层(中胚层、内胚层和外胚层)的细胞类型。形态上，该细胞具有较高的核/质比，且作为不同的克隆而生长。它们还表达高水平的碱性磷酸酶、端粒酶和转录因子Oct-4和Nanog[l-4]。hESC常^见通过细胞表面标志物的表达进行表征，包括特殊期胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4、肺瘤排斥抗原(Tra)-l-60和Tra-l-81。然而，这些表面抗原并非hESC特有的，之前曾在人胚胎性癌(EC)细胞中表征过[5，6]。此外，针对这些抗原的单克隆抗体(mAb)均抗人EC细胞和小鼠胚胎而制备。迄今为止，仅Son和同事描述过利用hESC作为免疫原生成抗细月包表面标志物的mAb[7]。生成特异于hESC表面4示志物的mAb很重要，因为其能用来鉴定表达限于未分化hESC的新抗原。阐明这些不同的细胞表面抗原在发育和多潜能性中的作用/机制将有助于理解干细胞调节。具有hESC表面特异性mAb的另一个好处将是能够在治疗前将其结合入细胞分离过程中。hESC分化为特殊i普系的细胞后，将残存未分化hESC从细胞群中消除非常关键，因为这些细胞可能在移植后f1起体内畸胎瘤的形成[8,9]。在本研究中，用活hESC免疫BALB/C小鼠后生成了一《且共10个mAb。这些mAb对未分化hESC细胞系表现出强烈的反应性，然而，在hESC起源的拟胚体、小鼠胚胎干细胞、小鼠饲养细胞、人EC细胞和其他人细胞系中，反应性减弱或消失。有趣的是，所述克隆的其中之一mAb84，其可与足糖萼蛋白样蛋白1(PODXL)发生反应，不仅结合且能在15-30分钟的孵育期内以浓度依赖及补体不依赖性方式杀伤未分化hESC。细胞毒性限于未分化表型，而hESC分化引起该mAb杀伤效率的下降。由于对未分化hESC的选择性，mAb84可用来在移植分化的细胞类型之前去除或杀伤残余hESC。据我们所知，这是首份关于特异性针对未分化hESC的细胞毒性mAb的报道。材料&方法人胚月台干细月包系HES-2(46，X，X)、HES画3(46，X,X)和HES誦4(46，X，Y),人ESCellInternational获4寻。细月包于37°C/5%C02在明胶涂布器官培养皿内的丝裂霉素-C灭活的饲养细胞(~7xio4细胞/cm2)上(共同培养)或者在补充了来自永生化小鼠饲养细胞的条件培养基E-MEF(无祠养细胞培养基)的基质"交涂布器官培养亚上培养[l]。用于培养HES细胞的培养基是HES培养基或KNOCKOUT(KO)培养基。HES培养基包含80%高#唐DMEM和20%FBS(Hyclone)、10ml月夷岛素-转4失蛋白-石西溶液/L培养基、25U/ml青霉素、25jug/ml链霉素、2mML-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸(NEAA)和O.lmM2-巯基乙醇；而KO培养基包含85%KO-DMEM和15。/。KO血清^齐^物、lmML-谷氨酰胺、0.1mMNEAA以及0.1mM2-巯基乙醇和4ng/ml石咸性成纤维生长因子(Invitrogen)。对于共同培养，hESC克隆通过机械剥离利用手拉玻璃毛细管而传代[2];对于无饲养细胞培养，hESC按照之前描述的酶处理而传代[2]。小鼠胚月台干细月包系(mESC)、CS-1和E14分别为DrChyuan-ShengLin(CollegeofPhysiciansandSurgeons,ColumbiaUniversity[3])和DrBingLim(GenomeInstituteofSingapore[4]惠赠，并按之前所述进行培养[5]。人胚胎性癌(EC)细胞系2102Ep为ProfPeterAndrews(UniversityofSheffield)惠赠，并4要之前所述进4亍i告养[6]。人EC禾口癌细月包系NTERA-2cL.Dl(CRL-1973)、NCCIT(CRL-2073)和Hela(CCL-2)从美国标准培养收集所购买并按25照ATCCi兌明书进4亍培养。人胚肾细月包系293-HEK(GibcoBRL,LifeTechnologies)按照所提供的方案进行培养。为了乂人HES-3细胞i秀导形成拟胚体(EB)(即在体外从HES-3细胞诱导hESC分化)，以团块形式收集hESC,并在非黏附性悬浮培养亚(Corning)中以聚集体(即作为拟胚体)形式于EB培养基(80%KO-DMEM、20%FCS、25U/ml青霉素、25jug/ml《连霉素、2mML-谷氨酰胺、0.1mMNEAA和O.lmM2-巯基乙醇)中培养8天。随后，利用胰蛋白酶分离EB并铺种于明胶化培养亚内，在EB培养基中再培养14天[16]。卓^謦我沐的兰成两只6周大的雌性Balb/C小鼠接受连续5周的腹膜腔内接种，每次均4妄种悬浮于PBS+或MPL+TDM佐剂(Sigma)中的5x106HES-3细胞/小鼠。利用ClonaCellTM-HY杂交瘤克隆试剂盒(StemCellTechnologiesInc)4吏小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合。简单而言，利用试剂盒提供的聚乙二醇(PEG)和介质B使脾细胞的单细月包悬液(1x108细月包)与2x107SP2/0细月包发生融合。37。C过夜孵育后，利用甲基纤维素基介质D铺种杂交瘤。铺种10-14天后分离杂交瘤的单克隆并在含介质E的96孔^反随后在24孔组织i咅养板中培养。收集来自每一个杂交瘤的培养液上清，并通过流式细胞仪评估对hESC的反应性。利用ClonaCellTM-InstantCHEKIsotypingKit(StemCellTechnologies)进4亍抗体的分型。谅式勿y^为^^f利用流式细月包4义通过免疫荧光评估与不同细月包群上表面标志物的抗体反应性。利用胰蛋白酶以单细胞悬液的形式收集细胞，按2x105/10|u1体积的密度重悬于1%BSA/PBS中，并与每一种mAb克隆(150ju1i咅养'液上清或5iug纯化的mAb/200ju11%BSA/PBS)或针对SSEA國4(neat，DevelopmentalStudiesHybridomasBank)、Tra誦l-60、Tra-1國81(2.5jag/200ju11%BSA/PBS,Chemicon,MAB4360/4381)、人足糖萼蛋白(PODXL,R&Dsystems,MAB1658)和抗人足净唐萼蛋白的多克隆4元体(pAb)(5jug/200ju11%BSA/PBS:R&Dsystems)—起孵育45min。随后用冷1%BSA/PBS洗涤细月包，且进一步用1:500稀释的羊抗鼠FITC轭合抗体(DAKO)孵育15分钟。脬育后，再次洗涤细l包并重悬于1。/。BSA/PBS和1.25jug/ml石典4匕丙卩定(PI)中，用于在FACScan(BectonDickinsonFACSCalibur)上进行分析。除非另有指明，所有的孵育均在4。C进行。细胞用恰当的同种型对照染色作为阴性对照。为了共表达研究，用第一抗体孵育hESC，并如上所述用1%BSA/PBS洗涤。其后，将细月包固定、透4匕(CaltagLaboratories)并用抗Oct-4的小鼠mAb(SantaCruzsc-5279)以1:20的稀释度进4亍孵育。随后用1%BSA/PBS洗涤细胞，并在暗处用1:500稀释的FITC轭合的羊抗鼠IgG(K链特异性)抗体(Sigma)和PE辄合的兔抗鼠IgM抗体(OpenBiosystems)孵育。孵育后，再次洗涤细月包并重悬于1%BSA/PBS中进行分析。除第一抗体外，所有的孵育均在室温下进行，各15min。细胞用恰当的同种型对照染色作为阴性对照。名瘦细/S化学3寻细月包在4%多聚甲醛中室温固定45min，并用每一种mAb的培养液上清室温孵育lh。用辄合异石克氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)(1:500稀释；DAKO)的羊抗鼠抗体显示抗体的定位。细應毒'/4试验细胞上mAb84的细胞毒性利用PI排除试验和流式细胞仪进行评估。如上所述，1%BSA/PBS中的单细胞悬液(2x10Vl0jul体禾口、)与mAb84(150ju1i备养液上;青或5jug纟屯^f匕的mAb/200ju11%BSA/PBS)、抗人PODXL的mAb或抗人PODXL的pAb(5|ug/200iul1%BSA/PBS，R&Dsystems)于4。C一起孵育45min。其后，洗涤细胞并重悬于1。/oBSA/PBS和1.25jug/ml石典化丙啶(PI)中，用于通过FACS进行分析。为了剂量研究，将HES-3细胞与0.1、0.5、1、5和15jug纯化的mAb84/200ju11%BSA/PBS—起孵育。为了时间进程研究，将HES-3细胞与5jug纯化的mAb84/200ju11%BSA/PBS一起孵育，并在加入mAb后15、30和45min后收集细月包进4亍分牙斤。为了超高交耳关实-验，洗涤第一mAb孵育后的HES-3细月包并用羊抗鼠第二抗体(5jug/200ji11%BSA/PBS，DAKO)孵育45min。细月包用同种型对照mAb85孵育作为阴性对照。除非另有指明，所有的孵育均在4匸进行。为了—睑证利用PI排除试—验得到的结果，还利用台盼蓝排除法确定每一个样品的生存能力。为了鉴定mAb84的革巴抗原，将hESC的无饲养细胞培养物在6cmPetri皿(Falcon)中i咅养至融合、用PBS+洗涤并通过在20/0Triton/PBS+中刮除而裂解。通过离心而4吏细月包裂解物澄清并立即用于免疫^^定(IP)。抗原的IP利用自动化MEA系统(PhynexusInc)而实施。简单而言，通过直接捕获于ProteinAPhyTip柱(5p1树脂床，Phynexus,Inc)上而/人杂交瘤i咅养液上清中分离mAb84(~100|ug)。用洗涤纟爰沖液I(10mMNaH2PO4/140mMNaClpH7.4)洗去上清中的未结合蛋白后，使来自约5x106细胞的澄清细胞裂解物通过由捕获的mAb84功能化的柱子。将柱子进一步用洗涤緩沖液II(140mMNaClpH7.4)洗涤，并在低pH下将结合的蛋白用洗脱緩冲液(200mMNaH2PO4/140mMNaClpH2.5)乂人柱子上洗脱下来并立即28用1mMTris-ClpH9.0中和。将洗脱物4呆存于4。C用于进一步的分析。SDS-PAGE和蛋白印迹分斗斤SDS-PAGE和蛋白印迹分析基本上分别4安照Laemmli[7]和Towbin[8]的方法实施。筒单而言，在还原性条件下通过SDS-PAGE(NuPAGE4-12%gradientgel，Invitrogen)分离来自IP的;先脱4勿，随后进行蛋白印迹或凝胶的银染色。对于蛋白印迹，将分离的蛋白通过100V电泳2h转移至PVDF月莫(Millipore)上。随后将月莫用mAb84培养液上清(用1%BSA/PBS/0.1%Tween-201:1稀释)、抗人PODXL的小鼠mAb或抗人PODXL的羊pAb(200ng/ml，R&Dsystems)随后用HRP辄合的羊抗鼠或兔抗羊抗体(1:10000稀释，分别为DAKO和Pierce)进4亍免疫印迹。HRP專厄合的第二抗体的结合通过ECL4企观'J(AmershamBiosciences)显影。4艮染色利用SilverQuest4艮染色试剂盒(Invitrogen)4安照生产商的步骤而实施，并手工切割对应于蛋白印迹上条带的蛋白条带。l漆縱还j、處差化和蛋冷术席将切割下来的凝胶在洗涤液(2.5mM碳酸氢铵/50%含水乙腈)中4。C浸泡过夜，随后更换洗涤緩冲液再于37。C孵育20min。随后将凝月交干燥并还原和烷基化。简单而言，将20ju110mMDTT/100mM石友酸氢4妄加至每一个凝力交斑点并于56。C孵育lh。其后，加入20jul55mM石典乙酰胺LAA/100mM碳酸氩铵并于暗处室温孵育45min。随后洗涤凝月交斑点并分别在100mM碳酸氢铵和100%乙腈中洗涤两次。为了蛋白水解，每一个凝胶斑点内的蛋白用改良胰蛋白酶(0.02jug/jul,溶于25mM石灰酸氢铵中，Promega)于37。C才展荡消化过夜。胰蛋白酶消化后，向样品中加入1%曱酸和2%曱醇至终体积9/al，用于LCMS/MS分析。将已消化的样品利用纳米级流速(Nano-flow)高效液相色谱(HPLC)系统(LCPackings)分离。将每份9ju1的样品以25ju1/min注射并;农缩至处于0.1%曱&臾/7&中的Trapcartridge(|uPrecolumn,300jumx5mm，C18PepMap励，LCPackings)上。洗涤5min后，将液流调为流线型至含10cmC18反相填塞材料(ColumnEngineering)分离4i(内《圣75|um的PicotipEmitter,NewObjective),流速减为100nl/mim。在60min内梯度乂人0发展为60%乙腈/0.1%曱酸。利用柱子远端的液体连^妻引入2300v的电压，以在柱子尖端形成喷雾，尖端则指向四极-飞行时间(Qq-tof)混合串联质谱仪(QSTAR-XL，AppliedBiosystems)的进气孑L。以InformationDependentAcquisition(IDA)才莫式运4亍质"i普4义，以4甫获并自动断裂带双电荷和三电荷的聚集离子(massion)。分离最^/[言号8个/sec的选定聚集离子，并用氮气将其断裂。所采用的碰撞能量与肽的质量成比例，在分才斤过禾呈中利用Analyst-QS库欠4牛(AppliedBiosystems)进4亍计算。通过利用MASCOT(MatrixScience)4叟索引擎乂于照UniProt(EBI)蛋白数据库搜索MS艇S谱图文件而鉴定蛋白。结果为了制备一组抗未分化hESC上细胞表面标志物的mAb，在无佐剂的PBS或在MPL+TDM佐剂中，用存活HES-3细月包免疫Balb/C小鼠。共从融合物中分离114个杂交瘤。首次利用流式细胞仪筛选其对HES-3细胞的反应性后，发现一组共10个抗体可结合hESC表面标志物(图1)。此外，mAb与HES-3克隆的结合通过免疫细胞化学而确定(图2)。通过分型，发现其中9个mAb是IgM，而剩余的一个则为IgM2a(mAb8)。用其他hESC细胞系HES-2和HES-4筛选，发现反应性不仫f又限于免疫原HES-3(表1)。此外，当细胞经-秀导形成拟胚体(EB)后，抗体结合减弱，表明在分化过禾呈中抗原表达下调。对这IO种克隆进行第二次筛选，以确定mAb与其他细胞系的交叉反应性，所述其他细胞系即小鼠饲养细胞(E-MEF)、小鼠胚胎干细胞(mESC)、人胚胎性癌细胞(EC)和混杂人细胞系(HEK-293、HeLa)(表I)。结果观察到mAb与小鼠饲养细胞无反应性，而hESC在免疫接种前在小鼠饲养细胞上培养。另外，mAb的反应性(即靶抗原表达)限于hESC细胞系，在所4企测的2种mESC细胞系则未才企测到反应性(除了CS-1上的mAb14)。当我们比專交Tra-l-60、Tra-1-81和SSEA-4与我们的mAb组在人EC细月包上的反应性时，如所预期的，在所冲企测的EC细月包系上，所有三种抗体(Tra-1-60/81和SSEA-4)均观察到强反应性。相反，我们的mAb组中大多数与三种EC细月包系中至少2种无反应性或l又有孩i弱反应性。有趣的是，mAb84、95、375、432和529与NTERA、2102Ep或NCCIT无反应性或4又有纟效弱反应性。该结果表明在hESC与EC之间甚至不同的EC细胞系之间抗体谱/表达存在差异。此外，当筛选对其他人类细月包系的抗性时，mAb克隆中的7个(包4舌mAb84、95、14和85)不结合HEK-293或HeLa细月包。然而，对于mAb5和mAb63，与这两种细胞系的反应性相比hESC有所增加，暗示随着细胞终末分化出现抗原表达上调。为了进一步表征mAb组，我们比较了hESC多潜能标志物Oct-4与该组中IgMmAb所4f"^j"抗原的共表达情况。图3示出了HES-3细胞系的2色流式细胞分析。从散点图，超过95%的mAb阳性HES-3细胞对Oct-4卩曰性，表明靶抗原表达与Oct-4表达之间的强相关性。细應毒遂我沐附^,的衷在在对抗体组的筛选过程中，发现相比于与其^也IgMmAb(例如mAb85)—起孵育的细月包，与mAb84—起孵育的HES-3细月包在生存能力方面有显著增强(图4,柱1)。才艮据PI排除试-睑，相比于mAb85,在与mAb84—起孵育(4°C，45min)后<又7%细月包4呆持存活。与mAb84—起卵孚育后，在2种其他hESC细胞系、HES-2和HES-4以及EC细月包系NCCIT(图4，4主2-4)上也乂见察到了mAb84对hESC的细胞毒性效应，分别存活8%、40%和9%。相反，另一种EC细胞系2102Ep在孵育后保持94%存活(图4,柱5)。当在相差显微镜下观察细胞时，很明显，相比与mAb84—起孵育的NTERA和2102Ep细月包或者与mAb85—起孵育的NCCIT细月包，与mAb84—起孵育的HES-3和NCCIT细胞表现出显著凝集(图5)。才艮据这些结合和细胞毒性数据，可理解为mAb84的细胞毒性效应依赖于该mAb与细月包系的结合(表I)。mAb只于不结合该mAb的细胞未表现出细胞毒性效应。在时间进禾呈研究中，HES-3细月包与5mgmAb84或mAb85—起孵育，且每隔15分钟收集一次细胞，用于通过PI排除和台盼蓝排除试-验进4亍分析(图6A和B)。在PI^卜除试-验中，mAb84对HES-3细月包的细月包毒性岁文应快至在与该mAb—起孵育15min后即可7见察到，生存能力降到33%。这些结果通过台盼蓝排除试验得以确认。有趣的是，才艮据该试-验，生存能力的下降发生在孵育后15-30min之间，然而，孵育45min后的最乡冬生存能力也相当于~20%。当mAb84的浓度在0.1-15jug的范围内逐步增加时，发现mAb84对HES-3细胞的细胞毒性效应呈剂量依赖性(图6C)。大约ljug(lpmol)的纯化mAb84即能够导致hESC生存能力降到30%以下(即生存能力下降70%)。直至该阶段，细胞毒性试验一直在4。C进行，以将抗原-抗体复合物内化入细胞内的效应降到最低。为了研究温度对细胞毒性的影响，将hESC与纯化和未纯化(培养液上清)mAb84在4。C和37°C一起孵育(图6D)。通过PI排除试验，发现温度未影响mAb对hESC的细胞毒性(用未纯化mAb84可杀伤75%以上的hESC细胞)。此外，图7表明在37。C时mAb84也对hESC具有细月包毒性。从散点图可^见察到对于纯化的mAb84和mAb84i咅养液上清，4。C和37°C时mAb84介导的HES-3细力包杀伤不存在差异。此外，在通过蛋白A纯化后，mAb84对hESC具有同等细胞毒性(4。C孵育后，纯化和未纯化mAb84均，见察到77%以上的杀伤)。该结果表明mAb84诱导的对hESC的毒性不是补体介导的，因为在培养基中存在或不存在胎牛血清时，细胞杀伤效率是同等的。之前我们已经7见察到mAb84与hESC的结合在8天大的拟胚体内下调(表1)。为了确定mAb84的细胞毒性是否特异于未分化表型，通过去除培养基中的FGF2或通过EB形成而诱导hESC分化(图8A)。才艮据多潜能标志物Tra-l-60的表达评估分化。4敬消FGF2后12天，观察到hESC的部分分化，相比未分化hESC培养物(〉95%Tm-l-60+ve),细月包群中^f叉49%仍然表达Tra-l-60。通过EB途径的分化得到〉99。/。Tra-l-60+ve细月包。当来自3种条件的细月包与mAb84一起孵育时，细力包杀伤效率几乎相当于Tra-l-60+ve细胞的百分比(图8B)。对于未分化hESC，4又~1%的细月包在与mAb84—起孵育后保持存活。对于FGF2々几饿的培养物和EB培养物，该百分比分另'J增力口至69%和99%。乂,/z五SCJ:m^M4拔^乾4^的蒌定和-验证为了鉴定hESC上与mAb84细胞毒性效应有关的靶抗原，实施了免疫沉淀实验。使细胞总裂解物通过包含蛋白A树脂和mAb84的PhyTip柱。通过亲和相互作用而捕获的蛋白在蛋白凝胶上分离并用mAb84检测。根据分子重量标志物，^r测到〈190kDa的抗原条带(图9A,泳道1)。由第二抗体在~25kDa处才全测到的4交j氐条带已鉴定为还原后的mAb84轻链。分离银染色凝胶上的相应条带并通过质镨法进行鉴定。对所获得的肽进行蛋白数据库搜索，将该蛋白条带鉴定为足糖萼蛋白样蛋白1前体(PCLP1或PODXL;登陆号000592)。PODXL和相应肽匹配的氨基酸序列在图9B中示出。为了马全证该抗原靶标是PODXL,重复进行与mAb84的免疫沉淀，并用抗PODXL的市售抗体4会测来自柱子的洗脱物(图9A;永道2和3)。从蛋白印迹的3个泳道中均检测到了同等分子量的条带，从而确认了PODXL的身份。利用RT-PCR，发现在hESC内有两种PODXL的变异体(变异体1和2的登陆号分别为NP—001018121和000592)发生转录(凝:据未示出)。鉴定了mAb84的抗原靶标，我们继续研究抗PODXL的市售抗体是否对hESC表现出类似的细胞毒性效应。从图10A和B,很明显，虽然3种来源的抗体(mAb和pAb)均特异于人PODXL,仅mAb84观察到了细胞毒性，而两种商品化来源的抗PODXL抗体则未观察到。之前已经报道了结合于细胞上抗原(例如细胞上的CD19、20和22)的第一抗体的超高交联可诱导凋亡[19,20]。由于mAb84是IgM(五聚体)而mAb-PODXL和pAb-PODXL均为IgG(二<介)，我们研究了mAb-PODXL或pAb-PODXL与羊抗鼠(GAM)抗体的超高交联是否类似mAb84介导的hESC杀伤。将hESC与第一抗体随后与GAM抗体一起孵育，未能诱导与mAb84类似的细胞毒性效应(图IOB)。讨论鉴定细胞表面抗原对于hESC研究非常重要，因为hESC是一种在分化过程中监测多潜能性和特殊细胞种群发育的非常有价值的工具。此外，因为其为非4曼入性，因此特异于细月包表面抗原的抗常规用来表征多潜能hESC的几种这样的细胞表面抗原是SSEA-3、SSEA-4、Tra-l-60和Tra-l-81。遗憾的是，这些抗原也存在于人EC细胞上，DraperWa/.[21]近期的研究发现分化过程中hESC内这些抗原表达的变化非常类似于人EC细J包。因此，为了更好的理解hESC内自我更新和多潜能性的调节，需要鉴定在hESC上独特表达的新型细胞表面抗原，其将能够区分hESC与人EC细胞。在本文描述的研究中，活hESC用于免疫小鼠，首次筛选杂交瘤中结合hESC表面标志物的mAb后，鉴定出了一组共10个mAb。与SSEA-4和Tra-1-60/81(其与hESC和人EC细月包均强烈反应)不同的是，我冇]的4元体中有5种(mAb84、95、375、432、529)仅与hESC发生强烈反应，而对人EC细胞则为阴性或有孩支弱反应。此夕卜，抗体结合与Oct-4表达相关，且当hESC分化形成EB时结合下调。这些数据强烈支持存在某些独特存在于未分化hESC上的抗原。而且，当筛查整个组mAb对HlhESC细胞系的抗性时(数据未示出)，我们发现其反应谱类似于HES-2、3和4的反应谱，表明该mAb结合在不同hESC细月包系之间4呆守的4元原。独特的，mAb84不4又结合hESC，且在15-30min孵育期内即对细胞会有细胞毒性。与其他细胞毒性mAb(其需要活化补体或超高交联而诱导细胞死亡[20,22])不同的是，mAb84介导的hESC杀伤不依赖于这两种机制。通过IP和MS分析，我们鉴定足糖萼蛋白样蛋白1(PODXL)为mAb84在hESC上的耙抗原。PODXL是属于CD34唾液粘蛋白家族的高度糖基化I型《争膜蛋白，该家族包4舌CD34和Endoglycan[23,24]。PODXL最初描述为肾小球足细胞上的大唾液蛋白[25],后来发现其在血管内皮细胞和早期造血祖细胞上表达[26,27]。最近，研究显示PODXL在乳腺癌、肺癌和前列腺癌中是肿瘤侵袭力的指示剂[28-30]。人PODXL定位35于染色体7q32-q33上，编码528个氨基酸的成熟蛋白[31]。然而，由于PODXL的胞外区利用唾液酸化O连接的糖类而广泛糖基化以及5个可能的N-连接糖基化，因此PODXL的恰当分子量是160-162kDa[32]。功能方面，已经报道PODXL依赖于其在其中表达的细胞类型而具有极为不同的作用。在足细胞内，PODXL作为抗黏附分子而保持在利用电荷排斥的足细胞足突之间开放的过滤位点[33]。然而，在高内皮樣i静脉内，PODXL作为黏附分子结合L-选择素且介导淋巴细胞的圈合与滚动[23]。在hESC中，PODXL在转录水平鉴定为在未分化hESC中高表达的基因之一[34，35]。通过EST频度分析，PODXL的表达水平在第7-8天的EB中下调几乎2.5倍，在神经外胚层样细胞和干细胞样细胞内分别下调约7和12倍[34]。该结果得到hESC和第8天EB的免疫组化的支持，染色在后者中显著减弱[36]。在一个独立研究中，Wei""/.比4交了hESC与mESC的转录谱，且观察到相比于hESC,利用MPSS未能在mESC细胞系E-14中检测到PODXL的表达[37]。总之，这些关于PODXL在ESC中表达的报道与我们利用流式细胞仪得到的mAb84观察结果相一致，其中相比于未分化hESC，结合反应性在第8天的EB中有所下降，而在mESC中反应性缺失。同时，在FGF2饥饿的hESC和第22天的EB中mAb84介导的杀伤性下降或缺失可归因于由于分化引起的PODXL表达下调。然而，尽管已有这些关于PODXL在未分化hESC中表达的报道，其功能尚未阐明。与mAb84结合PODXL后杀伤hESC的机制也4艮吸引人。在Zhang"a/.[38]的净艮道中，4十对细月包表面受体Porimin(i秀导细月包月莫损伤的前力长亡受体)的IgMmAb，可通过称为"长亡的过程而i秀导Jurkat纟田月包内的细月包死亡[39]。Porimin例如PODXL是粘蛋白家力矣的成员，因为其在蛋白胞外区上具有多个O-和N-连接的糖基化位点[40]。Jurkat细月包与抗Porimin—起孵育引起悬液中的快速细胞聚集，且在孵育仅20分钟后即引起75%以上的细胞的膜通透性增加。细胞杀伤也不依赖于补体和温度。区别于凋亡的是，与mAb—起孵育后未观察到DNA断裂或凋亡小体。通过电子显孩i镜扫描，发现抗Porimin所处理细胞的膜孔隙、空泡和表面铍缩增加。将该结果与我们的凄t据进行比H令人吃惊的是mAb84与抗Porimin共有多个类似的细胞杀伤标志物。此外，我们研究组的初步结果发现mAb84处理的细胞未表现出caspases水平上升(凋亡的特征)。因此，我们-假设但不限于理i仑mAb84介导的hESC杀伤是由于与月长亡类似的才几制。将hESC用作分化为体内任何细胞类型的初始材料来源，对于再生医学具有显著的优势。然而，分化后最大的关心之一是在移柏:前消除残留的未分化hESC，因为这些细胞具有致瘤性。前期工作表明少至2个ESC植入棵鼠体内可引起畸胎瘤的形成，而移植体外分化的ES细胞也未能緩解疾病[41，42]。此外，CookeW"/.报道移才直入hESC的位置影响所形成畸胎瘤的结局。在肝移才直物中，表达多潜能标志物SSEA-3的未成熟细胞的较大肿瘤占优势，而在皮下植入物中则以分化组织的较小肿瘤占优势[9]。已经开发了几种不同的策略以克服该问题。在两个独立的研究中，ChungWa/.[8]和FukudaWa/.[43]证实携带soxl-GFP才艮告子基因的重组小鼠ESC细胞系可用来通过荧光活化细胞分选(FACS)从ESC中纯化soxlVGFP+的分^匕神经前体细胞。移才直纯4匕出来的细月包未引起畸胎瘤形成，而移植soxlVGFP+细胞则引起了畸胎瘤形成。在hESC中，Hewitt"a/.设计了在hTert启动子控制下表达a1，3半乳糖基转移酶(GalT)的细胞系[44]。未分化hESC将表达GalT,其随后催化并在细胞表面上提呈cc-gal表位。该表位的存在将使细胞易感于人血清内的循环抗体，引起体外细胞死亡。虽然这些策略取得了成功，但它们均需要生成携带可选择性基因的重组ESC细胞系。相反，我后迅速清除。目前，体内研究正在进行中，以证实mAb处理后由hESC引起的肿瘤形成消失或耗尽。此外，我们还建议将我们组内的几种其他hESC特异性mAb与mAb84联合应用，以确保彻底去除在m,总之，本发明是首份关于选择性结合并杀伤未分化hESC的细月包毒性mAb的净艮道。可以在细胞移才直前应用mAb84，以消除残存hESC,从而增加移植的成功率和安全性。参考文献1.ThomsonJA^Itsfcovitz-迈dorJ,ShqiiroSSetaiEmbryonicstemcdllinesderivedftomhumanblastocysts.Sci咖el卿;282:ll45-1147.2.ReubiaoffBE,P鄉MF,'FongCYetal.:fe^biyoidcst咖cdlUn切fi:啤hom姐blastocysts:soma(io碰erentiatiocLinvitro.Nal3iotecibnol-,2000;18:3效<404.3'..Chamb敏IColbyD,RobatsoaM祐al.Functionalexpr坊咖ac)o血g:ofltoio&'apluripotetiGy.sustainingfectorinembryonicst咖cells.Cell2003;113:643-655,4,MitsiriKjTokuzawaY，ItoltHetal.HiehomeoprotdnN咖gisrequired&r:ma^aianceofpluripotaicyin咖鹏epibkstandES邻Us,Cell2003;"3:631-642.5.■■KannagiR>CochranNA^IsMgaMFetal.Steg&"Spec迅cembryonicantigens(SSEA-3and-4)areepitopesofauniquegciboseriesgan^Uosideisolatedftomh咖anteratocarciao咖cells,EMBOJ,1983;2:2355-2361.6.AndrewsPW,BantingG，Damj咖vIetal.Threemonoclonalantibodiesdefiningdistinctdifferentiationantigensassociated邻ithdifferent,hi^hmolecularwei扭tpolypeptideson(hesurfaceofhumanembryonal咖cino边acells,Hybridoma1984;3:347-361.7.SonYS,Park取KangYKetal.HeatShock70-kDaProtein8Isofoim1isex|iressedonthesiafaceofhumanembryoniostemcellsand.downregulated邵ondifferaitiati(瓜StemCells加05;23:1502-1513,8.ChungS,ShinBS,Hedl加dEetal.GeneticselectionofsoxlGFP-eqaressingneuralprecursorsremovesresidualtumorigenicpluripotentstemcellsandattenuatestumorfotmationaftertransplantation.J^Neurochem,2006;97:1467-1480,9.CookeMJ，StojkovicM,PrzjborskiSA,Gro她ofteratomasderivedfiomhumanpluripot節tstemcellsiinfl卿cedbythegraftsite.StemCellsDev.2006;15:254-259.!0.ChooA3PadmanabhanJT，ChinAetal.immorializedfeed鄉forthesoale~upoflmman咖kyonicstoncellsinfeeder抑dfeeder-fi:eeconditions.J.Biotedhnol.加06;122:13(M41.■11,ChooAB，Padm咖bhanJ>ChinACetal.Expansionofpluripotenthumanembryonicst鹏cellsonhumanfeeders..Biotechnol.Bioeng.2004;88:321-331.12,YiaY,timYK;Salto-Tell抵Metal.AFP(+),ESOderivedcellsengraftanddifferentiateintoh邻atocyt切invivo.StemCdls2002;20:338-346.13*Doetschm姐T,GreggRG，MaedaNal.TaigettedcoireclionofamutantHPRTgeneinmouseembryonicstemcells.Nature1987;330:576-578,14:OhSKFong^WJ,TeoYetal.Hi扭densityculturesofembryonicstemcells.Biotechnol,Bio加g.2005;91:523-533.15.AndrewsFW，BronsonD3L，BenhamFetal.Acomparativestudyofei-tcelllinesderivedfi:omhumantesticularteratocarcinoma^.Int丄Cancerl卿邻2砂2肌16..HeinsN,LindahlAKadssonUetal.Clonalderivationandcharacterizationofh咖姐embryonicstemcelllines*J.Biotedmol,2006;122:511-520.17,LaemmliUKCleavageofstructuralp加teins'tiuringtheassemblyoftheheadofbacteriopliageT4.Nature1970;227:咖-685.■18.TcwbiiiH,StaehelinT,GordonJ.Electrophoretictransferofproteins'frompolyacrylamidegelstodtrocelMosesheets:procedureandsomeapplications.卩^(;^汰11厶0348<11;.8丄1979;76:43504354.19.ChacrachiN，VazquezA>GalanaudPe*aLBcellantigeareceptor-mediatedapoptosis.ImportanceofaccessorymoleculesCD19andCD22,ando《surfaceIgMcross-!iiaking.J,Imm加ol.1995;154:3096-3104.20.ShanD，LedbetterJAPressOW,Apoptosisof边aUgoanthumanBcellsby狂辟tionofCD20满咖加clonalantibodies.Bloodl卿;91:1644-1652.21.Dt^erJS,Pigo扰C，ThomscmJAetal.Sutfaceantigensofb咖aneoibryonic'stemcells:changesupond近ereatiationinculture.J,Anat.2002;200:249-258,22.BallED，KadusHnJM，ScihacterBetal.Studiesonthe必ililyofmo加olonalantibodiestoselectivelymediatecomplemeat"d邻etidaitcytotoxicityofhumanmyebgenousleukemiaMastcells.JJimmmol.1982;128:1476-1481,23.SassettiC，T旭g鄉咖KSingerMSetal.Identificationofpodocalyxin-likeprotdnasahi^iendothelialvetraleligandforL-selectiiuparallelstoCD34.J.Exp.Med19卵;187:1965-197,5.24.SassetiiC,VanZanteRosenSD,Identificationofendo浙can，amemberoftheCD34/podo.calyxinfamiiyofsialomudns-J,Biol.Cii加，2000;275:9001-卯10.25.KeijaschkiD，SharkeyDJ，FarqtiliarMG,Identification旭iicharacterizationofpodooalyxln—majordabproteinoftherenalj^omeralarepithelialcell.J.CellBioL1984;98:1591-1596.26*K^rsha邻DB,ThomasPE，Wharr咖BLetal.Molecularcloning,expressioDjandcharactorizatiottofpodocalyxin-likeprotein1ftomrabbitasatransmembraneproteinofglo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的重链可变区。40.根据权利要求35所述的抗体，具有至少一个根据权利要求36或37所述的轻链可变区以及至少一个4艮据4又利要求38或39所述的重链可变区。41.一种选择性地结合PODXL表位的抗体，其中所述表位已由具有至少一个才艮据斥又利要求37所述的轻《连可变区和至少一个才艮据一又利要求39所述的重链可变区的抗体结合。42.—种编码才艮据片又利要求35至41中任何一项所述的抗体的多核苷酸，或一种包含本文中的Vh或VL链的分子。43.—种包含才艮据片又利要求42所述多核苷酸的宿主细月包。44.根据权利要求9或14中任何一项所述的方法或者根据权利要求20或23所述的应用，其中所述抗体是片又利要求35至41中4壬一项所述的抗体。全文摘要本发明涉及一种鉴定样品中未分化人胚胎干细胞的方法，样品可能包含这种细胞，该方法包括鉴定样品内表达其表面上的足糖萼蛋白样蛋白(PODXL)的细胞。本发明还涉及一种从包含未分化人胚胎干细胞样品中分离这种细胞的方法，该方法包括分离样品内表达其表面上的PODXL的细胞。通常，所述方法利用结合PODXL的抗体。利用所述方法分离的未分化人胚胎干细胞在细胞疗法中可以是非常有利的。此外，特别的，本发明还提供从人胚胎干细胞分化而来的细胞的组合物，但该组合物已经耗尽了未分化人胚胎干细胞，该组合物在细胞疗法中非常有利。文档编号C12N5/0735GK101454441SQ200780008235公开日2009年6月10日申请日期2007年3月6日优先权日2006年3月6日发明者徐文华申请人:新加坡科技研究局