专利名称：一种从人胚胎干细胞诱导肝细胞的方法
技术领域：
本发明涉及发育生物学、细胞生物学和组织工程学领域，更具体地涉及人胚胎干细胞的体外定向分化。本发明提供了在体外将胚胎干细胞诱导为肝细胞的新方法，由所述方法获得的肝细胞，以及所述肝细胞在肝脏及肝细胞移植、体外人工肝及生物肝脏构建、药物鉴定和筛选、药物毒性测定和毒理研究以及肝病预防、诊断和治疗中的用途。
背景技术：
肝脏是人体中的一个十分重要的器官，它不仅是最大的消化腺，而且还是进行物质代谢以及产生多种生物活性物质的重要器官。肝脏疾病在我国的发病率很高，尤其是乙型肝炎病毒感染所导致的肝脏疾病发病率远远高于西方国家。乙型肝炎病毒感染所造成的急性肝坏死，使肝脏在短时间内丧失功能，导致肝衰竭，死亡率极高。虽然肝脏具有很强的再生能力，但是对于急性和慢性肝脏衰竭，除了器官移植之外，目前尚无理想的治疗方法。由于可以应用于肝脏器官移植的供体来源有限，很多病人在等待肝脏移植的过程中死亡；另一方面肝脏器官移植具有一定的技术难度，花费大，风险高，因此这些因素极大地限制了对这些肝脏衰竭患者的治疗。
最近三十多年的动物实验和少量的临床实验表明，肝细胞替代疗法(肝细胞移植、生物人工肝等)因其方法简单、疗效可靠而成为肝功能衰竭的又一种治疗方法。肝细胞移植有可能为等待肝脏移植的肝功能衰竭患者提供一段时间的功能代偿，甚至可以使部分患者最终免于肝脏移植(Fausto等，Hepatol.2000，3219-31；Ouyang等，World J Gastroenterol.2001，7324-330)。肝细胞移植的前提是需要充足有效的肝细胞来源。在临床上最有可能运用的是成熟的肝细胞(Watanab等，Transplant Proc.2004，362457-2461；Horslen等，Transplantation.2004，771481-1486)，但是很难获得足够的成熟的人肝细胞用于肝细胞移植治疗。成熟肝细胞的供源的缺乏限制了其进一步的临床实验和应用，获得大量有效的肝细胞是肝细胞移植面临最大的难题。
胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES cell)是由囊胚内细胞团(innercell mass，ICM)起源的全能(pluripotent)干细胞，具有自我更新和分化的多能性，并且能够在体外无限传代(Thomson等，Science.1998，2821145-1147)。目前已经建立起鼠(Evans等，Nature.1981，292154-156)、猴子(Thomson等，Proc Natl Acad Sci.1995，927844-7848；Suemori等，Dev Dyn.2001，222273-279)和人(Thomson等，Science 1998，2821145-1147)的胚胎干细胞系。这种胚胎干细胞在体内以及体外都具有分化成机体三胚层的潜能，胚胎干细胞作为个体发育之初的原始干细胞，理论上，它可以无限地提供特异性细胞类型。这些特点使胚胎干细胞成为临床细胞治疗的理想候选者(Brivanlou等，Science 2003，30013-916)。控制ES细胞分化成为某种成熟的细胞，进而为各种细胞疗法提供理想的细胞来源甚至器官的克隆，是众多研究者共同关注的问题。
从理论上讲，使用胚胎干细胞，既可满足细胞量的要求，又可以提供所需要的细胞类型，用人胚胎干细胞(hESCs)分化得到的肝细胞作为移植细胞，可以提供近乎无限的供体细胞来源。然而，肝细胞功能复杂，从肝前体细胞到成熟肝细胞还有许多分化阶段，体外不但要诱导生成肝前体细胞，还必须诱导肝前体细胞继续分化成为成熟的功能肝细胞，只有成熟的有功能的肝细胞才能考虑用来替代正常肝细胞用于治疗。由于原始内胚层的细胞和成熟的肝细胞具有类似的功能，它们在蛋白和mRNA水平上的标记物具有很大的相似性，使得肝细胞的鉴定十分困难。
现在鼠的ES细胞已经用于多种细胞诱导分化研究，如造血细胞、肌细胞、神经细胞、骨细胞等并取得了许多成果。已有许多报导从鼠的胚胎干细胞分化得到肝样细胞(Chinzei等，Hepatology 2002，3622-29Yin等，Stem Cells 2002，20338-346；Hamazaki等，FEBS Lett.2001，49715-19；Ishizaka等，Faseb J.2002，161444-1446；Ogawa等，Stem Cells 2005，23903-913；Ishii等，Exp Cell Res.2005，30968-77；Teratani等，Hepatology2005，41836-846；Yamamoto等，Hepatology 2005，42558-567)；还有一些研究证明通过细胞移植，一些由胚胎干细胞分化得到的肝样细胞可以提高受损的鼠的肝脏的功能(Yamamoto等，Hepatology 2003，37983-993)。
然而，这些诱导方法大多需要陆续添加若干诱导剂，这样就必须严格控制诱导剂的添加时机和用量，操作较为复杂，不易成功。而且，最终获得的肝样细胞与成熟的鼠肝细胞还是有很大区别的。另外，出于伦理以及移植排异反应的考虑，诱导得到的鼠源肝样细胞也根本无法在人类中应用。
关于人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)的体外定向肝细胞分化，目前仅有少量报导通过化学试剂诱导分化(Rambhatla等，Cell Transplant.2003，121-11)或者自然分化(Lavon等，Differentiation.2004，72230-238)获得肝样细胞，这些肝样细胞具有一些原代肝细胞的特征。
其中，2003年Rambhatla等报道了第一例hESCs体外分化为肝细胞的研究，他们用丁酸钠通过类胚体诱导，以及DMSO加丁酸钠直接诱导hES细胞的方式进行实验，并且主要是通过基因表达的模式对分化得到的肝样细胞进行鉴定，这样诱导的肝样细胞只表达部分肝细胞相关分子，不表达成熟肝细胞的许多功能蛋白，也不具有成熟肝细胞的形态和亚细胞结构，因此只能称为肝样细胞(hepatocyte-like cells)。而且，他们的诱导方法必须使用丁酸钠，一种细胞周期阻抑化合物(组蛋白脱乙酰化酶抑制剂)，因此在诱导过程中细胞大量死亡，不仅需要大量的hESCs细胞才能诱导出少量的“肝样细胞”，而且所得的少量“肝样细胞”即使贴壁生长，相互之间也不形成细胞间连接，更不会形成毛细胆管等肝组织特征性结构。
可见，本领域迫切需要能够成功地将人胚胎干细胞诱导为成熟肝细胞的方法。
发明概述本发明提供了一种在体外将人胚胎干细胞诱导为肝细胞的方法。所述方法是以二甲基亚砜(DMSO)作为分化诱导剂，联合包括尼克酰胺在内的肝细胞营养因子，通过类胚体(EB)途径实现的。
所述诱导方法可以包括如下步骤(a)类胚体的形成；(b)类胚体的贴壁；和(c)肝细胞的生成。
在本发明的诱导方法中，肝细胞是以集落方式生成的。
优选地，本发明的诱导方法还包括步骤(d)肝细胞集落的纯化和/或富集。
其中，所述纯化和/或富集可以通过人工挑选或抗原识别的方法实现。
优选地，本发明的诱导方法还包括步骤(e)肝细胞的继续培养。
在本发明的诱导方法中，诱导剂DMSO可以在前述步骤(a)类胚体形成时，和/或(b)类胚体的贴壁阶段，和/或(c)肝细胞的生成阶段加入。优选在步骤(a)类胚体形成时即加入。
在本发明的诱导方法中，DMSO诱导剂的浓度范围在0.5％-2％之间，优选1％。
在本发明的诱导方法中，所用尼克酰胺的浓度为10mM。
在本发明的诱导方法中，肝细胞营养因子还可以包括生长因子。例如，它们可以选自表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF)或它们的任意组合，优选表皮生长因子。所用生长因子的浓度为10ng/ml。
本发明也提供了由前述诱导方法所获得的肝细胞，其具有与正常肝细胞相同的细胞和亚细胞形态结构特征、与正常肝细胞相同的基因表达模式，且具有正常肝细胞的功能。例如，所述肝细胞至少具有如下特征之一(1)至少具有以下亚细胞结构之一胆小管、细胞间紧密连接和桥粒以及丰富的细胞器；或(2)至少表达以下蛋白之一白蛋白、α-甲胎蛋白、α-抗胰蛋白酶、角蛋白18和IX因子；或(3)至少表达以下血清蛋白基因之一AFP、ALB、TTR、AAT和FIX，和/或以下代谢酶基因之一TAT、CYP7A1、LST、CPSI、TDO和G6PC；或(4)至少执行以下功能之一肝糖原的生产和积累、低密度脂蛋白的代谢和异生物质代谢。
本发明涉及所得肝细胞在体外人工肝脏及生物肝脏的构建中的用途。
本发明涉及所得肝细胞在制备用于肝脏移植或肝细胞移植的移植物中的用途。
本发明涉及所得肝细胞在制备用于治疗、预防和诊断肝脏疾病的试剂、试剂盒、疫苗或药物中的用途。所述疾病包括但不限于急慢性肝功能衰竭和/或遗传代谢性肝脏疾病。所述疫苗包括但不限于抗病毒、抗细菌或抗其它微生物的疫苗。
本发明涉及所得肝细胞在药物鉴定和筛选、药物毒性测定和毒理研究中的用途。
本发明还涉及所得肝细胞在接种、扩增、筛选和制备病毒中的用途。
本发明的有益效果在于提供了一种有效和大量制备肝细胞的方法1.易于操作，在本发明的方法中，所述诱导剂DMSO添加时机灵活，不受严格的时间限制，因此操作简便。
2.无细胞毒性，与丁酸钠诱导剂所造成的细胞大量死亡的事实相反，本发明所用诱导剂DMSO无毒，因此无需大量hESCs细胞就能诱导出丰富的肝细胞。
3.肝细胞容易鉴别，在本发明的方法中，肝细胞以集落方式生成，和背景细胞之间存在着明确界限，易于剥离，因此可首先用人工剥离的方法进行挑选，或者通过抗原识别等其它方法纯化/富集所得肝细胞，进而可通过基因表达和功能分析予以验证；与现有技术中必须通过大量基因表达分析进行鉴定的方法相比，不仅省时省力，而且通过形态学的观察与标志基因的表达和功能验证相结合，可靠性和准确度高。
4.与现有技术中报道的“肝样细胞”不同，本发明方法诱导出的这些肝细胞集落彼此连接，形成毛细胆管等典型肝组织结构，可生长数月并依然保持其形态和生物学特征；这些肝细胞能够表达成熟肝细胞特有的一系列标志蛋白和功能分子，如G6PC、LST、CPS1、CYP7A1、FIX等；并且这些肝细胞能够执行正常肝细胞的功能。
发明详述人胚胎干细胞在培养过程中，当细胞悬浮方式生长时，它们会聚集成为球状的细胞团，被称之为类胚体(embryoid body，EB)。人们发现EB细胞的发育分化过程与正常胚胎的发育状况惊人的相似(Keller等，CurrOpin Cell Biol.1995，7862-869；Loebel等，Dev.Biol.2003，2641-14)。因此，这被视为一个在体外模拟胚胎发育的模型，可以此为基础，深入地研究胚胎干细胞向各种不同类型细胞发育分化及其过程的可能性。本发明中胚胎干细胞向肝细胞分化的研究正是建立在这个基础上的。
二甲基亚砜(DMSO)是一种分子式为C2H6OS的化合物。在细胞体外分化体系中，据报道DMSO有促进向中胚层分化的作用(Mummery等，Exp Cell Res.1986，165229-242)。
然而，在前文提到的Rambhatla等报道hESCs体外分化为肝样细胞的实验中，他们指出DMSO本身对于诱导hES细胞形成肝样细胞没有明显的作用。而且还认为，EB形成对于hES细胞分化成肝样细胞并非是必须的(参见Rambhatla等，Cell Transplant.2003，121-11)。
在一定程度上，本发明正是克服了这种偏见，提供了一种以DMSO作为分化诱导剂，联合包括尼克酰胺在内的肝细胞营养因子，通过类胚体(EB)途径在体外将人胚胎干细胞诱导为肝细胞的方法。
在本发明中，我们发现，在hESCs的EB形成途径中加入DMSO可以促使EB向肝细胞方向的分化。EB的形成和DMSO诱导剂都是完成本发明所必须的，二者缺一不可，相互作用，共同促成了肝细胞的诱导分化。
在本发明中诱导hESCs分化形成肝细胞的过程中，一个很重要的因素是EB的形成。在hESCs的分化过程中，当细胞以悬浮状态培养时会形成多种细胞的混合体，即EB，它们彼此间的表面接触及分泌的因子形成诱导作用。在本发明过程中，经EB形成途径诱导得到的分化细胞，接种到添加了有利于肝细胞维持和生长的营养因子的介质中，使其进一步生长和成熟，大约一个月后，可以观察到有肝细胞集落出现。若未能形成结构良好的EB，则很难观察到肝细胞集落的出现；同样，若直接在hES细胞单层培养体系(二维体系)中利用完全相同的诱导和营养条件，也无法得到相同形态的肝细胞集落。尽管我们不愿束缚于任何理论，理论上是因为EB的三维空间是诱导肝细胞形成的环境因素，在该环境中，可能发生多细胞间分化过程的互作，如同正常肝发育的过程需要周围其他种类的细胞的诱导一样。例如，我们在该系统中观察到了跳动的心肌细胞，而且肝细胞集落经常发生在其附近，这和体内肝芽的形成很相似体内肝芽生成在心脏始基的附近，依赖心脏始基的诱导信号。所以我们认为在本发明的EB环境中出现的心肌可能也间接诱导了hES-肝细胞集落的生成。
另一方面，若不添加诱导剂DMSO，即使利用完全相同的EB形成和肝细胞营养因子条件，也只能得到所谓的“肝样细胞”，这些“肝样细胞”只表达肝细胞的部分标志，如AFP、ALB、AAT、TAT和TDO等，但是不表达许多肝细胞的功能分子如F9和G6PC等。
本发明所述诱导方法具体包括如下步骤(a)类胚体的形成，即向hESCs细胞中加入EB培养液进行悬浮培养，直至EB形成；(b)类胚体的贴壁，即将形成的EB移入铺有基质的培养皿中，使其贴壁；和(c)肝细胞的生成，即从出现肝细胞前体的集落到生成肝细胞的阶段，期间可以加入包括尼克酰胺在内的肝细胞营养因子。
在本发明的诱导方法中，肝细胞是以集落方式生成的。最初，呈集落生长的肝细胞前体的集落在类胚体中形成并爬出来，随之逐渐长大，增多，细胞间形成毛细胆管等典型肝组织结构，生成肝细胞集落。由于这些hESCs起源的细胞集落中含有肝前体细胞，这些肝前体细胞会继续生长为成熟的有功能的肝细胞(见实施例)，为了叙述方便起见，我们将这些集落称为hES起源的肝细胞(hESCs-derived hepatocytes，hES-肝细胞)集落。所述hES-肝细胞集落和背景细胞有明确界限，易于剥离。
因此，本发明的诱导方法还可以包括步骤(d)肝细胞集落的纯化和/或富集。可用人工挑选的剥离方法将hES-肝细胞集落挑出来，以达到富集和纯化的目的。或者，也可通过抗原识别的方式，即加入肝细胞特异表面抗原的荧光抗体，然后用荧光流式细胞分选仪(FACS)分选出来，这也可以达到纯化和富集hES-肝细胞的目的。
优选地，本发明的诱导方法还可以包括步骤(e)肝细胞的继续培养。继续培养阶段可以采用与步骤(c)肝细胞生成阶段相同的培养基，即在细胞基本培养基的基础上补充营养成分如尼克酰胺等，也可以直接采用可商购获得的肝细胞培养液，如HCM培养液(Clonetics)。本发明诱导方法所得集落中的hES-肝细胞可生长数月并依然保持其形态和生物学特征。
本发明人令人惊讶地发现，在本发明的诱导方法中，诱导剂DMSO可以在前述步骤(a)类胚体形成时，和/或(b)类胚体的贴壁阶段，和/或(c)肝细胞的生成阶段加入。
DMSO可以选择在EB形成的早期，即在EB刚形成的悬浮培养阶段加入，或在EB刚贴壁时，或者一直到EB贴壁生长后两周阶段的这段时期内加入，结果只是形成hES-肝细胞的速度上略有差异，而形成的hES-肝细胞形态结构、基因表达和功能方面没有任何差异。一般而言，希望在EB形成时就加入。换言之，诱导剂DMSO既可以与包括尼克酰胺在内的肝细胞营养因子同时添加在肝细胞培养液中，又可以相对独立地在其前后大约2周的时间段内加入。可使用的DMSO的浓度范围在0.5％-2％之间，优选1％。
另外，在本发明的诱导方法中，所用尼克酰胺的浓度为10mM。
而且，在本发明的诱导方法中，肝细胞营养因子还可以包括生长因子。例如，它们可以选自表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF)或它们的任意组合，优选表皮生长因子。所用生长因子的浓度为10ng/ml。
本发明也提供了由前述诱导方法所获得的肝细胞，其具有与正常肝细胞相同的细胞和亚细胞形态结构特征、与正常肝细胞相同的基因表达模式，且具有正常肝细胞的功能。例如，所述肝细胞至少具有如下特征之一(i)至少具有以下亚细胞结构之一胆小管、细胞间紧密连接和桥粒以及丰富的细胞器及内涵物如线粒体、高尔基复合体、内质网、核糖体、溶酶体及各种吞噬小体等等，这可以通过电镜分析证明；(ii)至少表达以下蛋白之一白蛋白、α-甲胎蛋白、α-抗胰蛋白酶、角蛋白18和IX因子，其中前两个为早期肝细胞的标志蛋白，而后三个为成熟肝细胞的标志蛋白，这可以通过免疫细胞化学染色证明；(iii)至少表达以下血清蛋白基因之一AFP、ALB、TTR、AAT和FIX，和/或以下代谢酶基因之一TAT、CYP7A1、LST、CPSI、TDO和G6PC，这与正常肝细胞的基因表达谱相同，可采用RT-PCR分析来证明；(iv)至少执行以下功能之一肝糖原的生产和积累、低密度脂蛋白的代谢和异生物质代谢，这与正常肝细胞的功能相同，可以分别通过PAS(Periodic Acid Schiff，过碘酸雪夫反应)染色、Dil-Ac-LDL(乙酰化低密度脂蛋白)染色及EROD(7-乙氧基-异吩恶唑酮-脱乙基酶)检测确认。
如前所述，鉴于在基因表达方面，原始内胚层与肝有一些共同表达的基因；在肝脏中表达的一些转录因子和血清蛋白，例如ALB，AFP，TTR，GATA4和HNF3β同样也在原始内胚层中表达(Abe等，Exp Cell Res.1996，22927-34)。所以，在诱导hESCs向肝分化的实验中，结合标志基因的表达、形态学的观察和功能验证来区分诱导出来的细胞究竟是肝细胞还是属于原始内胚层的细胞是更为可靠的，其中形态学是作为区分这两者的可靠指标之一(Yoshitomi等，Stem Cells Handbook.Totowa，Humana Press 2003，345-352)。
在本发明中，分化得到的肝细胞不仅具有肝细胞的光镜形态特点，而且也表现出肝细胞的超微结构特征，这些结构特征都是原始内胚层细胞所不具有的。同时这些细胞也表达很多成熟肝细胞功能所需的蛋白酶，在一些检测中也表现出肝细胞的功能。因此，本发明的诱导方法无论是就方法本身(操作简便、无细胞毒性)而言，就所诱导的肝细胞(不同于“肝样细胞”的成熟肝细胞)而言，还是就所述肝细胞的鉴定(集落形态观察结合基因表达和功能验证，准确可靠)而言，都取得了长足的进步和预料不到的技术效果。
而且，本发明所得的hES-肝细胞具有许多潜在的用途，例如体外肝脏学研究肝脏及肝脏的体内生成是个复杂的、多步骤的过程，需要许多调控因子、转录因子、生长激素和生长因子等参与。对于该过程我们至今了解甚少，这是我们对许多肝脏疾病还无法治愈的根本原因。由于我们体外生成hES-肝细胞集落的过程和体内过程非常相似，可以利用该体外诱导系统作为模型，通过加入或减少某些培养液成分，转入或去除某些基因产物等各种手段来分析各种因子在肝细胞生成过程中的作用，用于测定肝脏形成和代谢过程中的各种信号和调节分子。
体外人工肝脏及生物肝脏的构建hES-肝细胞可以用于构建生物人工肝脏如生物透析设备，在体外为危重肝损害病人排除血液中的毒素；重型肝炎和肝衰竭患者时常有严重的代谢紊乱及毒性物质积聚，反过来促进肝脏损伤和抑制肝细胞再生，形成恶性循环，通过hES-肝细胞可以构建生物透析设备进行辅助治疗代偿肝的代谢功能，期望在内环境改善情况下肝脏能够自发恢复，或为肝脏移植和其他特效治疗进行准备。
在未来，hES-肝细胞也可以注入动物肝脏内，使得动物肝脏细胞部分或全部地替换为人的细胞，这种生物肝脏将为临床移植提供大量的宝贵的肝脏。
药物鉴定和筛选、药物毒性测定和毒理研究在新药研发过程中，一个很重要的指标是确定待测化合物或其代谢物是否具有潜在的肝毒性，即测量其对肝细胞存活、形态、表型或功能的影响，这就需要大量均一的成熟肝细胞作为靶细胞。hES-肝细胞可用作药物筛选的靶细胞来筛选和评价各种药物或药物组分对肝细胞、某条肝细胞代谢通路或某种肝细胞功能的影响。由于hESCs可以在体外无限扩增，可以无限分化出hES-肝细胞，从而可以得到大量的均一的成熟肝细胞用于药物筛选和毒理学实验。这种hES-肝细胞也可以用来测定其它非药物化学试剂或生物物质的毒性。
病毒培养和分离以及抗病毒疫苗的制备某些嗜灵长类肝细胞的病毒只存活和繁殖于人或非人灵长类肝脏内(如乙肝病毒)。它们在小鼠等动物的肝脏内都很难繁殖。这就导致很难得到研究这些病毒的动物模型和细胞载体。由于hES-肝细胞具有人肝细胞的典型特征和功能，因此可用作为细胞载体来繁殖嗜灵长类肝细胞的病毒。hES-肝细胞将提供一个繁殖和研究这类病毒的体外系统来促进病毒学的研究。此外，在hES-肝细胞中生长繁殖的病毒还可以用来制备病毒或病毒抗体，用以生产疫苗，这将是hES-肝细胞的一个重要用途。
肝脏移植或肝细胞移植在临床上经常有病人在等待肝脏移植的过程中死亡，他们需要肝细胞移植来至少暂时性的维持他们的肝脏功能。许多具有先天性疾病的病人，例如糖原累积症，常具有部分肝功能缺失和肝损害，早期移植肝细胞会补偿其缺失的肝细胞功能并避免肝损害。由于hES-肝细胞具有人成熟肝细胞的功能，它们有可能可以输入病人体内，暂时或永久性地，部分或全部替代病人损坏的肝细胞。
本发明不仅涉及所得肝细胞的上述用途，而且还涉及所得肝细胞在制备用于的试剂、试剂盒、疫苗或药物中的用途。其中所述疾病包括但不限于急慢性肝功能衰竭和/或遗传代谢性肝脏疾病。此外，本发明hES-肝细胞也可批量标准化生产后保存在密封的培养皿中，这种细胞可以作为诊断试剂或者诊断试剂盒的一个部分投放入市场，用以繁殖病毒、诊断病毒感染、测试肝脏毒性等目的。
图1是hESCs悬浮培养形成EB的照片。
图2是EB贴壁生长后，细胞呈辐射状向外生长的照片。
图3是hES-肝细胞不同时期的形态照片。A，分化28天后形成的肝细胞集落；B，分化的早期(30天)，集落内的细胞是单核的，核质比较高；C，分化后70天左右，肝细胞中细胞质的含量增加，核质比降低；D，培养7天的大鼠肝细胞。
图4是hES-肝细胞的透射电镜照片。A，箭头指向胆小管样结构；B，细胞质内的一些细胞器；C，细胞间的紧密连接结构；D，桥粒。
图5是hES-肝细胞的免疫细胞化学染色的照片(200X)。A、B、C、D、E和F分别是AFP、ALB、AAT、CK18、FIX和HNF3β。
图6是hES-肝细胞的RT-PCR分析结果的照片。1、2和3分别是未分化的hESCs，hES-肝细胞，胎肝组织。
图7是hES-肝细胞功能检测的照片。A，EROD染色的结果；B，PAS染色的结果；C，低密度脂蛋白染色的结果；D，与C对应的显微照片。
具体实施例方式
以下将结合附图，参照具体实施例详细描述本发明。
本发明所用细胞材料和试剂说明如下A.人胚胎干细胞(hESCs)以任何方式获得的hESCs都可以用于本发明，例如，各种文献中已公开的经确立的hESCs，从保藏机构如美国典型培养物保藏中心ATCC或商家购买得到的hESCs，从自然形成的流产胚胎或胎儿分离到的hESCs，自体外受精的处于不同发育阶段的囊胚如桑椹胚的内细胞团分离得到的hESCs，或者通过核移植技术获得的hESCs。作为非限制的实例，本发明采用了如下的人胚胎干细胞系H1购自WiCell Research Institute，Madison WI，U.S.A.，NIH编号WA01，参见http://wicell.org/。
SH5公开在Zhen Fu FANG等，Cell Research 2005 15(5)394-400中，见申请人提供的生物材料发放证明。
B.培养液及试剂本发明所用培养液可在常用的细胞基本培养基的基础上补充一种或多种成分而得到的。可用于本发明的细胞基本培养基可以包括但不限于DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)、MEM(Minimal EssentialMedium)BME(Basal Medium Eagle)、RPMI 1640、F-10、F12、αMEM(αMinimal Essential Medium)、G-MEM(Glasgow’s Minimal EssentialMedium)以及IMDM(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)。这些培养基的配方是本领域公知的，不仅在普通教科书和试验手册中有详细描述，而且还可直接以成品的形式从诸如Gibco、Life Tchnologies等公司商购获得。
作为补充物的成分可以是任何维持或促进细胞生长的成分，例如，它们可以包括但不限于氨基酸、维生素、蛋白、激素、金属离子、微量元素、核苷酸、核酸、糖、脂类、脂肪酸、盐等等。
特别地，用于本发明的肝细胞培养液也可以通过直接将尼克酰胺等成分添加到可商购获得的肝细胞培养基中获得，例如，已知Clonetics公司的HCM培养基中包含EGF、胰岛素、转铁蛋白、BSA-FAF等组分。
作为举例，本发明可使用包含如下成分组合的培养基，除非另外指出，本申请所用试剂均购自Gibco公司。
(1)ES细胞培养液基本培养基DMEM/F-12；补充物血清替代物(20％)，β-巯基乙醇(0.1mM)，谷氨酰胺(2mM)，非必需氨基酸(1％)，人重组碱性成纤维生长因子bFGF(4ng/ml)。
(2)EB培养液基本培养基DMEM；补充物胎牛血清(FBS)(10％，Hyclone)，2-巯基乙醇(0.1mM)，谷氨酰胺(2mM)，非必需氨基酸(1％)。
(3)肝细胞培养液(hepatocyte medium，HM)基本培养基90％DMEM；补充物FBS(10％，Hyclone)，1×ITS(Insulin-Transferrin-Seleium)，地塞米松(1×10-8M，Sigma)，表皮生长因子(10ng/ml，Sigma)，尼克酰胺(10mM，Sigma)。
(4)诱导剂DMSO购自Sigma公司。
C.用作对照的鼠肝细胞及其培养取4周龄的Wistar大鼠的肝脏，在含有1mg/ml胶原酶I(Gibco BRL)的磷酸缓冲液(PBS)中，37℃消化30分钟。离心洗涤和收集细胞，用HM培养液悬浮细胞接种于铺有明胶的培养皿。其在本发明中用作肝细胞形态发育的参照，并在功能分析中用作阳性对照。
实施例1.hESCs的体外扩增培养在进行诱导前，首先需将冻存的hESCs细胞系进行体外扩增培养。
复苏将冻存的hESCs细胞系H1和SH5从液氮中取出后迅速投入37℃水浴中，震荡直到细胞悬液融化，用10ml PBS稀释细胞悬液，1000rpm，离心5min，弃上清，用ES细胞培养液将细胞重悬后加到铺有小鼠成纤维细胞(Gibco BRL)饲养层的培养皿中，在37℃，5％的CO2培养箱中培养。
培养每24小时更换培养液一次，并在倒置相差显微镜下观察细胞的生长状况。
传代细胞接种后6-7天传代。吸弃旧培养液，加入1ml 1mg/ml胶原酶IV，置37℃，消化10min。弃去酶，用PBS洗去残余的酶，加入2ml新鲜培养液，然后用5ml的移液管轻轻吹打细胞集落数次，使其从培养皿的底部脱落下来，并被吹打成小片。将细胞悬液按照1∶3或1∶4分到新的预铺有饲养层的培养皿中，并补足培养液，37℃ CO2培养箱中培养。
冻存当hESCs扩增到需要的数目时，多余的细胞可以冻存。一般在hESCs生长了5-6天后，用1ml 1mg/ml胶原酶IV将其消化，用ES细胞培养液重悬细胞集落后，缓慢的加入10％DMSO(冰上操作)，混匀后，4℃平衡30min，放入冻存盒，置-70℃冰箱，第二天移入液氮中长期保存。
实施例2.hESCs的体外诱导分化(步骤(a)中加入DMSO)取实施例1中培养了6-7天的hESCs进行诱导(a)EB的诱导形成用1mg/ml胶原酶IV将hESCs集落消化成小细胞团，加入EB培养液重悬，并将细胞悬液转入10cm细菌培养皿中，进行悬浮培养至EB形成，即大大小小的细胞团，折光性好，边缘通常比较光滑(见图1)。此时，加入1％浓度的诱导剂DMSO，继续悬浮培养。
(b)EB的贴壁生长在步骤(a)中形成的EB悬浮培养4-6天后，将EB移入铺有1％明胶的培养皿，至其贴壁。
(c)肝细胞的诱导形成EB贴壁后，加入肝细胞培养液(HM培养液)。
步骤(c)持续大约一周左右，可见各种形态的细胞从EB中向外呈辐射状生长，其中可见肝细胞前体的集落出现(图2)。这些肝前体细胞集落与周围细胞有明显的界限，其下方有一层扁平细胞(图3A)。
在分化的早期(20-30天)，集落内的细胞是单核的，含有由一个或者两个明显的核仁组成的大细胞核，含有少量的细胞质(图3B)。
随着分化过程的继续进行，这些细胞的细胞质体积增加，核质比下降，它们的形态与成熟肝细胞越来越相似。
在培养50-70天后，这些集落会逐渐出现越来越多的双核细胞(图3C)，说明在发育过程中肝细胞融合现象在培养体系中也出现了。
定期取样，对其进行实施例5-8中所述的形态结构观察以及基因表达和功能的试验。
实施例3.hESCs的体外诱导分化(步骤(b)中加入DMSO)与实施例2中的操作类似，不同之处在于在步骤(a)中不添加任何DMSO，而待步骤(b)EB贴壁时再添加，浓度在0.5％-2％之间。
我们观察到步骤(c)持续大约两周左右，开始出现hES-肝细胞集落。之后，我们借助于人工挑选的剥离方法进行了步骤(d)肝细胞集落的纯化和/或富集，即在倒置相差显微镜的观察下，用无菌细玻璃将hES-肝细胞集落挑出来，继续用肝细胞培养液(HM)培养。定期取样，进行如实施例2以及实施例5-8中所述的形态结构观察以及基因表达和功能的试验。
实施例4.hESCs的体外诱导分化(步骤(c)中加入DMSO)与实施例2中的操作类似，不同之处在于在步骤(a)中不添加任何DMSO，而待步骤(c)加入HM培养液后一周(即EB贴壁后大约一周)再添加，浓度在0.5％-2％之间。
我们发现，在添加DMSO后大约15-20天左右，开始出现hES-肝细胞集落。之后，我们以抗原识别的方式进行了步骤(d)肝细胞集落的纯化和/或富集，即用1mg/ml胶原酶IV将出现的hES-肝细胞集落中的全部细胞消化成单个细胞，加入肝细胞特异表面抗原的荧光抗体即荧光标记的小鼠抗人CK18单克隆抗体(1∶100；DAKO)，然后用荧光流式细胞分选仪(FACS)分选出来，继续采用肝细胞培养液(HM)培养。定期取样，进行如实施例2以及实施例5-8中所述的形态结构观察以及基因表达和功能的试验。
实施例5.hES-肝细胞形态的透射电镜观察在明显的hES-肝细胞集落出现的2-3周内，在倒置相差显微镜的观察下，用无菌细玻璃针，挑取前述实施例2-4中的hES-肝细胞集落，接种在涂有collagen I(Sigma)的小圆玻片上，3-5天后细胞贴壁并伸展成单层时，弃去培养液，置于2.5％戊二醛溶液中，室温固定3-4小时，然后用1％锇酸固定2-3小时后，用环氧树脂进行包埋。LKB-I型超薄切片机切片50-60nm，3％醋酸铀-枸橼酸铅双染色，PHILIPS CM-120透射电镜观察，拍片。
透射电镜分析的结果表明，在用实施例2-4中任一方法获得的肝细胞之间经常可见膨大的细胞间隙，相邻细胞表面的微绒毛伸入到间隙中，两侧有紧密连接封闭形成毛细胆管结构(图4A)。细胞内含有丰富的细胞器及内涵物，包括线粒体、高尔基复合体、粗面和滑面内质网、游离核糖体、溶酶体及各种吞噬小体，细胞核大而圆，常染色质丰富，异染色质以小点状分散在核中(图4B)。此外，在电镜标本中可看到相邻细胞之间的连接面有桥粒、紧密连接等上皮细胞的特化性结构(图4C，4D)。
实施例6.hES-肝细胞的免疫细胞化学检测(标志蛋白的检测)在起始诱导分化30天以内至有肝细胞集落出现的时候，在倒置相差显微镜的观察下，用无菌细玻璃针，挑取前述实施例2-4中的hES-肝细胞集落，接种在涂有collagen I(Sigma)的小圆玻片上，3-5天后细胞贴壁并伸展成单层时，弃去培养液，加入1ml 4％PFA室温固定20分钟，用PBS洗3遍，加入3％过氧化氢室温作用10分钟。用3％BSA/PBS阻断30分钟后(HNF3β抗体用10％驴血清封闭，或者不封闭)，加入已稀释的第一抗体，置湿盒中4℃孵育过夜。PBS洗3次，再加入二抗，室温孵育1小时。PBS洗3次，DAB显色。所用的一抗分别为兔抗人多克隆抗体Albumin(ALB，1∶1000；DAKO)，alpha-fetoprotein(AFP，1∶500；DAKO)，alpha-antitrypsine(AAT，1∶1000；DAKO)，Factor IX(F9，1∶300；DAKO)，小鼠抗人单克隆抗体CK18(1∶100；DAKO)，羊抗人HNF3β抗体(1∶50；Santa Cruz Biotechnology，Inc.)。阴性对照使用BSA替代特异性的第一抗体(HNF3β抗体的阴性对照用10％驴血清或PBS代替一抗)。二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，羊抗小鼠抗体，及驴抗羊抗体(Jacksonimmunoresearch)，抗体稀释度均为1∶100。免疫印迹用含0.01％过氧化氢的3，3-二氨基-联苯胺四盐酸盐(3，3-diamino-benzidinetetrahydrochloride)观察。
对hES-肝细胞进行免疫细胞化学染色显示，对于用实施例2-4中任一方法获得的肝细胞而言，早期肝细胞的标志蛋白白蛋白(albumin，ALB)和alpha-甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)、成熟肝细胞的标志蛋白alpha-抗胰蛋白酶(alpha-antitrypsin，AAT)、角蛋白18(cytokerytin18，CK18)以及IX因子(Factor IX，FIX，F9)均表达。此外，hES-肝细胞还表达肝细胞核转录因子3β(HNF3β)，它的表达在体内胚胎发育及ES细胞分化过程中促使细胞向肝细胞方向分化(图5)。
实施例7.hES-肝细胞基因表达谱的检测(RT-PCR)挑取实施例2-4中诱导分化得到的hES-肝细胞集落选用Qiagen的One-Step RT-PCR试剂盒进行RT-PCR反应，反应条件参照说明书。挑取未分化的人的胚胎肝细胞集落按照同样的体系及方法进行反应，作为阴性对照。流产的胎儿肝组织(来自上海新华医院)用Trizol(Invitrogen，USA)提取总RNA，经DNase(Promega，USA)处理后作为阳性对照。RT-PCR所用引物序列见表1。
RT-PCR的结果显示，对于用实施例2-4中任一方法获得的肝细胞而言，hES-肝细胞同胎肝细胞一样，既表达一系列胎肝相关血清蛋白，如FIX、AFP、ALB、AAT、TTR(甲状腺运载蛋白)，也表达与肝进行代谢活动相关的特异性酶，例如，酪氨酸氨基转移酶(TAT)，肝特异性有机阴离子转运(LST)，葡萄糖6-磷酸酶(G6PC)，氨甲酰磷酸合成酶-I(CPS1)，细胞色素P450 7A1(CYP7A1)，色氨酸2，3-二氧合酶(TDO2)等。此外，肝细胞中还检出GATA结合蛋白-4(GATA4)的表达，这是一种主要在原始内胚层及肝脏表达的转录因子。以上这些基因均在胎肝组织(见阳性对照，流产的胎儿肝组织)和分化得到的肝细胞中表达，而没有在未分化的人ES细胞(阴性对照)中检测到(图6)。
其中TAT主要存在于肝细胞的线粒体内，催化由L-酪氨酸向羟苯丙酮酸转化的过程；LST介导不依赖钠离子的有机离子转运，在肝脏中有机离子及胆酸的清除中起重要作用，仅在成熟的肝细胞中表达；G6PC催化水解葡萄糖6-磷酸，是维持葡萄糖水平在体内稳定的关键酶；CPS1是肝脏尿素合成的关键酶；CYP7A1存在于肝脏内，参与胆酸合成，胆固醇代谢及氧化磷酸化中电子链传递，仅在成熟的肝细胞中表达；TDO2是色氨酸分解代谢中的限速酶。这说明，hES-肝细胞具有与正常肝细胞相同的基因表达谱。
实施例8.hES-肝细胞功能的检测(1)肝糖原染色过碘酸雪夫反应(Periodic Acid Schiff，PAS)由PAS染色试剂盒(BosterInc.)进行。固定分化得到的肝样细胞和培养的大鼠肝细胞，并按照试剂盒的操作手册进行染色，观察。
肝糖原染色的实验结果表明，实施例2-4中任一方法获得的肝细胞集落都可以被PAS染色，而集落周围的细胞不能被染色(图7B)。这说明hES-肝细胞能够合成和储存肝糖原。
(2)乙酰化低密度脂蛋染色低密度脂蛋白(LDL)是一种脂蛋白，把胆固醇从肝脏运送到全身组织，可以被多种细胞利用，大部分的低密度脂蛋白代谢是发生在肝脏中的。乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)染色试剂盒购自Biomedical Technologies(Stoughton，MA，USA)。按照试剂盒的操作手册进行实验，采用激光共聚焦显微镜(FV1000，Olympus，Japan)观察被染色的Dil-Ac-LDL。
实验结果表明，实施例2-4中任一方法获得的hES-肝细胞可以摄取Dil-Ac-LDL并且在细胞质中积累这种物质，而在周围的细胞中没有检测到Dil-Ac-LDL的存在(图7C)。这说明hES-肝细胞具有代谢低密度脂蛋白的功能。
(3)EROD(7-乙氧基-异吩恶唑酮-脱乙基酶)检测为了评估hES-肝细胞的异生物质代谢(xenobiotic metabolism)功能，按照文献描述(Rambhatla等，Cell Transplant.2003，121-11)的方法，采用新鲜分离的大鼠肝细胞作为阳性对照，以未分化的人ES细胞和分化的成纤维细胞作为阴性对照，通过7-乙氧基-异吩恶唑酮-脱乙基酶(EROD)的检测，对hES-肝细胞进行CYP1A2活性测定。
EROD检测的结果表明，实施例2-4中任一方法获得的hES-肝细胞具有CYP1A2诱导表达活性，而未分化的人ES细胞和分化的成纤维细胞没有表现出诱导表达的活性(图7A)。
实施例9.hES-肝细胞的继续培养为研究本发明获得的hES-肝细胞的生长能力以及形态功能稳定性，我们还利用前述的HM培养液，对实施例2-4中获得的成熟hES-肝细胞进行了步骤(e)肝细胞的继续培养。隔天更换培养液，换液之前可以在显微镜下将大部分成纤维样细胞用玻璃针划掉，培养温度为37℃，pH 7.0，发现根据本发明方法所得的hES-肝细胞可以持续生长至少两个月。
期间，我们也进行了如实施例5-8中所述的形态结构观察以及基因表达和功能的试验。观察到继续培养的hES-肝细胞依然能够保持其所具有的与正常肝细胞相同的形态、基因表达和功能方面的生物学特征。
应当理解，上述实施例只是实施本发明的优选方式而非唯一方式，也并不旨在以任何方式限制本发明。而且，在不偏离本发明精神和实质的前提下，本领域技术人员可以对其中的技术方案进行修饰和调整。例如，对于本发明具体的诱导方法、细胞材料和试剂而言，经过等同替换后所得的技术方案也落在本发明的范围内。
例如，本发明完全可以通过采用其它hESCs材料或采用具有相似功能的它试剂或营养因子实现。而且对具体试剂或营养因子的用量进行调整也属于本领域技术人员的公知常识。另外，本领域技术人员能够预见到，本发明的肝细胞体外诱导方法稍加改动即可推广应用到其它动物的胚胎干细胞的体外定向诱导分化中，例如，包括但不限于非人灵长类动物、其它哺乳动物或脊椎动物等。
表1 RT-PCR所用的引物
权利要求
1.一种从人胚胎干细胞诱导肝细胞的方法，特征在于其是以DMSO作为分化诱导剂，联合包括尼克酰胺在内的肝细胞营养因子，通过类胚体途径实现的。
2.如权利要求1所述的方法，其包括步骤(a)类胚体的形成；(b)类胚体的贴壁；和(c)肝细胞的生成。
3.如权利要求2所述的方法，其中肝细胞是以集落方式生成的。
4.如权利要求3所述的方法，还包括步骤(d)肝细胞集落的纯化和/或富集。
5.如权利要求4所述的方法，所述纯化和/或富集是通过人工挑选或抗原识别的方法实现的。
6.如权利要求2所述的方法，还包括步骤(e)肝细胞的继续培养。
7.如权利要求2-6中任一项所述的方法，其中所述诱导剂DMSO是在所述步骤(a)类胚体形成时，和/或(b)类胚体的贴壁阶段，和/或(c)肝细胞的生成阶段加入的。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述诱导剂DMSO在步骤(a)类胚体形成后即加入。
9.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中DMSO诱导剂的浓度范围在0.5％-2％之间，优选1％。
10.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中尼克酰胺的浓度为10mM。
11.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述肝细胞营养因子还包括选自表皮生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子或它们的任意组合的生长因子，优选表皮生长因子。
12.如权利要求11所述的方法，其中生长因子的浓度为10ng/ml。
13.由前述权利要求中任一项所述方法所获得的肝细胞，其至少具有如下特征之一(i)至少具有以下亚细胞结构之一胆小管、细胞间紧密连接和桥粒以及丰富的细胞器；或(ii)至少表达以下蛋白之一白蛋白、α-甲胎蛋白、α-抗胰蛋白酶、角蛋白18和IX因子；或(iii)至少表达以下血清蛋白基因之一AFP、ALB、TTR、AAT和F9，和/或以下代谢酶基因之一TAT、CYP7A1、LST、CPSI、TDO和G6PC；或(iv)至少执行以下功能之一肝糖原的生产和积累、低密度脂蛋白的代谢和异生物质代谢。
14.如权利要求13所述的肝细胞在体外人工肝脏及生物肝脏的构建中的用途。
15.如权利要求13所述的肝细胞在药物鉴定和筛选、药物毒性测定和毒理研究中的用途。
16.如权利要求13所述的肝细胞在病毒培养和分离中的用途。
17.如权利要求13所述的肝细胞在制备用于肝脏移植或肝细胞移植的移植物中的用途。
18.如权利要求13所述的肝细胞在制备用于治疗、预防和诊断肝脏疾病的试剂、试剂盒、疫苗或药物中的用途。
19.如权利要求18所述的方法，所述疾病为急慢性肝功能衰竭和/或遗传代谢性肝脏疾病。
全文摘要
本发明提供了一种以DMSO作为分化诱导剂，联合包括尼克酰胺在内的肝细胞营养因子，通过类胚体(EB)途径在体外将人胚胎干细胞诱导为肝细胞的方法。本发明也提供了由所述方法获得的肝细胞，这些从人胚胎干细胞起源的肝细胞具有正常肝细胞的形态和亚细胞结构如毛细胆管等，表达肝细胞特异的基因产物如G6PC、LST、CPS1、CYP7A1、FIX等，并且可以执行成熟肝细胞的功能。本发明还提供了这些肝细胞在诸如肝细胞或肝脏移植、肝病治疗、人工肝构建、药物鉴定和筛选，以及毒性测定和毒理研究等领域中的用途。
文档编号C12N5/08GK101037669SQ20061005700
公开日2007年9月19日 申请日期2006年3月13日 优先权日2006年3月13日
发明者王茜, 李瑞珍, 盛慧珍 申请人:上海交通大学医学院附属新华医院, 盛慧珍