专利名称：一种获得孤雌胚胎干细胞系的方法
技术领域：
本发明涉及一种获得孤雌胚胎干细胞系的方法。
背景技术：
孤雌生殖(Parthenogenesis)是指在没有精子参与的情况下，由卵细胞直接发育 为一个胚胎的过程。孤雌生殖是自然界正常的繁殖方式，在昆虫较为普遍，爬行类、鱼类、鸟 类动物也可见孤雌生殖现象，但是哺乳动物的孤雌胚胎如果不经过基因校正修饰将无法出 生，通常在胚胎种植后不久，由于胚外组织发育不良，无法形成正常的胎盘而夭折。虽然哺 乳动物孤雌生殖的胚胎无法发育到正常出生，但是孤雌细胞与正常细胞形成的嵌合胚胎能 够活产。小鼠的孤雌嵌合体试验(Thomson，1998)，把孤雌细胞注入到正常受精的胚胎，可以 观察到孤雌细胞整合到胚胎三个胚层的组织器官中，并参与相应器官组织的发育。1995年， Nature Genetics还报道了一个存在孤雌细胞嵌合的14岁小男孩，他的皮肤中含有部分孤 雌来源的细胞，外周血白细胞则完全由孤雌细胞构成，核型表现为46，XX (Strain，1995)。这 些现象说明了孤雌细胞能够参与到机体内器官的发育，在部分器官还能明确发挥功能。随着体外受精和胚胎培养技术的成熟，在体外操作卵子和胚胎成为现实。在 IVF-ET过程中，B超引导下经阴道穿刺取卵及随后的短暂培养过程也偶然引起卵细胞被孤 雌激活的现象(Muechler，1989 ；Sultan, 1995 ；Chen，2009)，从而形成孤雌胚胎，并进一步 从中分离孤雌胚胎干细胞系。2007年本实验室分离的世界上第一株纯合型人类孤雌胚胎干 细胞系(parthenogenetic embryonicstem cells, pESCs)即来自于 IVF 过程中的 1PN 胚胎 (Lin，2007)。除了自然情况，利用人工激活的方法也可以获得孤雌胚胎。有文章报道在未 受精的冷冻卵子中，86. 的卵子能够被人工激活，激活的胚胎中又有96. 8%能够发育成 孤雌胚胎，最终有16. 7%能够发育到囊胚阶段(De Fried，2008)。目前，有许多物种利用人 工激活的方法得到孤雌囊胚，并最终分离获得孤雌胚胎干细胞系，如小鼠、大鼠、兔、猪、山 羊、牛、猴等(Cibelli，2006)。2007年，本实验室与其他一些研究组也先后利用人工孤雌激 活的方法获得了人类孤雌胚胎干细胞系(Revazova，2007，2008 ；Lin, 2007 ；Mai, 2007) 孤雌胚胎干细胞系是构建患者自身特异性多能干细胞的方法之一，pESCs的遗传 物质(包括细胞核和线粒体的基因组)全部来自于卵细胞，其HLA与供卵者完全匹配，分化 后得到的功能细胞移植到供卵者体内，相当于自体移植，不会激起免疫排斥反应，相当于育 龄女性患者的“克隆”。目前孤雌人工激活的方法多为阻止第二极体的排出，从而维持细胞 的二倍体状态。这种情况下，由于存在同源染色体之间的联会以及非姐妹染色单体之间遗 传物质的交换，70. 9%细胞系的HLA表现为杂合状态(Kim，2007)，只能为供卵者或者HLA完 全匹配的人群服务。另外一种人工激活的方式，即联合应用A23187和puromycin，允许第二 极体的排出，形成的单倍体在有丝分裂之前DNA复制一次恢复二倍体状态，从而得到纯合 的孤雌胚胎干细胞系。如果在胚胎干细胞库中能够多储存这样常见HLA单倍型纯合甚至全 基因组纯合的细胞系，有利于提高胚胎干细胞库的应用价值，降低胚胎干细胞库需要的细 胞系数量。并且由于pESCs来自于没有发育潜能的孤雌胚胎，相对于破坏正常胚胎的hESCs而言，伦理争议更少，是胚胎干细胞库的重要细胞系来源。导致孤雌胚胎发育缺陷的关键原因就在于基因组印记的异常，由于缺乏父源性基 因组印记，胚胎外组织不能正常发育，孤雌胚胎最多能够存活到怀孕中期，胚胎本身发育滞 缓，但是形态正常。在小鼠嵌合体实验中观察到孤雌细胞能够整合到正常胚胎中参与各个 组织器官的发育，但是在滋养外胚层和胚外内胚层等胚外组织中未见孤雌细胞，而孤雄细 胞则基本富集在胚外组织中，几乎不参与胚胎本身的发育，提示印记状态会影响细胞的分 化命运。建系过程没有改变孤雌胚胎干细胞的印记状态，其印记基因表达模式仍与孤雌胚 胎相似，即表达母源性印记基因，而父源性印记基因不表达。孤雌胚胎干细胞未来临床应用最大的安全隐患在于其印记基因表达异常。但是这 种印记异常如果被纠正，就有可能安全应用。韩国科学家的实验给予了很好的提示。他们 通过基因修饰小部分发育关键的印记基因(H19/Igf2 ；Dlkl-Gtl2)能够改善孤雌胚胎的质 量甚至得到孤雌出生的小鼠(Kono，2004 ;Wu，2006)。同样，孤雌来源的造血干细胞能够重 建致死性照射后小鼠的造血系统，达到稳定和有功能的造血干细胞移植(Eckardt，2007)， 而一个罕见的具有孤雌嵌合人类，其外周血白细胞完全来自于孤雌细胞，并能够发挥正常 功能(Strain，1995)。因此，尽管不能保证孤雌胚胎干细胞来源的所有组织器官都可以正常 发育，但是至少在某些组织器官内能够其起作用。如果能够对孤雌胚胎干细胞来源的组织 进行遗传与功能分析证明它们是安全和有效的，孤雌胚胎干细胞也可能代表一种有效的组 织替代治疗的细胞来源。
发明内容
本发明的目的在于提供一种获得孤雌胚胎干细胞系的方法，它是从1PN胚胎中分 离得到的基因组纯合型孤雌胚胎干细胞。与以往报道的人类胚胎干细胞不同，本发明所获得的孤雌胚胎干细胞系来源于 IVF过程中的1PN胚胎，SNP芯片分析发现其基因组99%以上的区域表现为纯合。该基因组纯合型孤雌胚胎干细胞系的具体获得方法可以是包括以下步骤1、在胚胎受精12小时后观察，选择单原核胚胎进一步培养至囊胚阶段；2、切取囊胚内细胞团，接种至预先准备好的饲养层细胞上，并采用抑制细胞分化 的干细胞培养基培养；3、将未分化的细胞进一步传代、扩增、冻存，并进行孤雌特征以及干细胞特征的鉴定。本发明所获得的孤雌胚胎干细胞系的孤雌来源以及全基因组的纯合状态是通过 HLA分型、STR位点分析以及SNP芯片分析来证明的HLA分型显示了孤雌胚胎干细胞的HLA-A、-B和-DR位点是和供卵者半匹配的，与 父方HLA完全不匹配(图1)。15个STR位点和Amelogenin基因均表现为纯合，且与供卵 者的等位基因半相合，与父方的等位基因基本不相同(图2)。SNP芯片总共分析了全基因 组500，447个SNP位点，结果显示99%以上的位点表现为纯合，而异质性位点在基因组范围 内散在分布(图3)。本发明所获得的孤雌胚胎干细胞系的印记基因分析包括父源性印记基因SNRPN、 IPW、KCNQ10T1、PEG3、IGF2，母源性印记基因 NES55、H19。其中 SNRPN、IPW、KCNQ10T1、PEG3均未检出，而IGF2仅有微弱表达，母源性印记基因NES55、H19的表达比正常胚胎干细胞有 所增强(图4)。这些结果为chHES-32的孤雌来源提供了进一步的证据。经过干细胞特征的鉴定，该孤雌胚胎干细胞系chHES-32表达干细胞特异性标记 (图5)以及多能性相关基因，维持正常的二倍体核型46，XX，具有强的端粒酶活性(图6)， 能够在体内外向三个胚层的细胞分化(图7)。本发明提供的这株从1PN胚胎中分离获得的基因组基本纯合型孤雌胚胎干细胞 系及其衍生物对于探讨父源性基因组和母源性基因组在遗传学和表观遗传学上对于发育 过程的影响具有重要的意义，是研究印记基因在胚胎发育过程中生物学作用的重要工具。 此外，该细胞系具有向三个胚层细胞分化的能力，且HLA位点纯合，诱导分化为特定的功能 细胞后用于HLA半相合患者的细胞替代治疗，可以避免免疫排斥反应，是干细胞库重要的 种子细胞来源，具有广阔的应用前景。
图1为孤雌胚胎干细胞系chHES-32的STR检测情况chHES_32的STR位点表现 为纯合，与供卵者半相合，而与父方基本不一致。图2为孤雌胚胎干细胞系chHES-32的SNP分析结果。基因组范围内99%以上的 区域表现为纯合，不到1 %的区域为杂合，且散在分布与基因组内。图3为孤雌胚胎干细胞系chHES-32与正常胚胎干细胞chHES_35的印记基因表 达情况chHES-35同时表达父源性和母源性印记基因，而chHES-32仅表达母源性印记基因 (NES55、H19)，而不表达父源性印记基因(SNRPN、IPW、KCNQ10T1、PEG3、IGF2)。图4为孤雌胚胎干细胞系chHES-32来源的孤雌胚胎形态及细胞特征标记染色鉴 定。A为受精12小时观察1PN胚胎的光镜下形态；B为1PN胚胎发育至第6天的囊胚形态； C为chHES-32的未分化细胞形态；D为碱性磷酸酶染色结果，表现为强阳性；E-I分别为干 细胞特异性标记SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81和0CT-4免疫细胞化学染色结果，均 显示为阳性。图5为孤雌胚胎干细胞系chHES-32的多能性相关基因、端粒酶和核型的鉴定。A 为多能性相关基因 OCT-4，NANOG, REX-1，S0X2, LEFTY A, TDGF, FGF4, TERF1, THY1 和 DPPA2 的PCR检测结果；B为端粒酶检测结果，显示为高端粒酶活性；C显示为正常的二倍体核 型-46，XX。图6为孤雌胚胎干细胞系chHES-32体内外分化能力的鉴定。A_C为chHES-32细胞 体外分化3周后进行免疫细胞化学染色结果，分别为e-tubulin(A)，SMA⑶and AFP(C)； D-I为chHES-32细胞在SCID小鼠体内形成的畸胎瘤经切片HE染色结果，可以发现有软骨 (D)，骨(E)，脂肪组织(F)，神经上皮(G)，皮脂腺(H)和消化道上皮(I)等组织。
具体实施例方式实施例一基因组纯合型孤雌胚胎干细胞系的获得一、患者的知情同意本实验严格遵守中华人民共和国卫生部的有关法规(人类辅助生殖技术规范， 2003年)。实验经医院伦理委员会的批准，全过程受伦理委员会的监督。捐赠剩余胚胎或配子供干细胞研究的IVF患者均被详细告知实验流程，包括实验的目的、意义、配子或胚胎 的使用途径、捐赠行为的自愿、无偿原则、研究者的保密、无伤害原则等，即通过完整充分的 说明和介绍，对捐赠者有关询问的必要回答和解释，使捐赠者全面了解捐赠行为的利与弊， 在完全知情的情况下，自主、自愿、理性得做出负责任的决定。保证所有胚胎仅限于科研使 用，严禁用于生殖目的。二、1PN胚胎的培养将取出的卵冠丘复合体置于1ml含有10%母体血清的B2培养基中，继续成熟培 养4 6小时等待授精。授精时按5 X 10个直线运动精子/ml的密度进行授精，平均每1ml 加入2 3个卵冠丘复合体。授精后16 18小时观察受精情况，只观测到1个原核的胚 胎(1PN)被移入预先在培养箱中平衡过夜的50ul G1. 2培养基微滴中，其上覆盖有石蜡油 进行培养。第3天上午，将发育的6 8细胞胚胎移到50ul G2. 2培养基微滴中培养至囊 胚阶段用于胚胎干细胞的分离。三、孤雌胚胎干细胞系的建立和培养囊胚被机械切割成两半，含有内细胞团的一半将种植在经丝裂霉素C有丝分裂灭 活的人胚成纤维细胞(human embryonic fibroblasts, hEFs，密度为 5，000cells/cm2)饲 养层上进一步培养，培养基为DFSR培养基，包括75% DMEM/F12U5% K0_SR、2mM左旋谷氨 酰胺、0. ImM 巯基乙醇、非必需氨基酸和50ng/ml bFGF。隔天换液，4 7天后，有平 铺生长的类胚胎干细胞团块长出，机械挑取未分化部分，分割成小块后种植于新的饲养层 上继续培养，约7天传代一次。待胚胎干细胞扩增数代并且冻存足够量的早期细胞后，转移 到添加4ng/ml bFGF的常规DFSR培养基中长期培养。实施例二 孤雌胚胎干细胞系的鉴定一、孤雌胚胎干细胞系的常规干细胞特性鉴定1.碱性磷酸酶(AKP)的检测采用Invitrogen公司提供的Fast Red Substrate Pack试剂盒对未分化的hESCs 克隆进行检测，操作步骤按试剂盒提供的方法进行，基本原理同Gomori a -萘酚磷酸法，即 碱性磷酸酶在碱性条件下将a-萘基磷酸水解出a-萘酚，然后与固红B盐在酶活性部位 偶联形成棕红色不溶于水的盐。阳性染色结果为鲜红色。周边的MEF不着色，为阴性对照。2细胞特异抗原的检测多能性干细胞特异性抗原，包括SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、0CT-4； 三胚层特异性标记，包括AFP(内胚层)、0-tubulin(外胚层)、SMA(中胚层)。均采用 间接免疫荧光法来检测，步骤如下培养的ES克隆用4%的多聚甲醛固定20分钟；0. 1% Triton-X-100透膜10分钟(此步骤针对核内抗原0CT-4，其余为胞膜抗原不需要)；正常 山羊血清室温封闭30分钟；相应的一抗4°C孵育过夜；加入Alexa Flour 488-连接二抗， 室温避光孵育1小时；DAPI复染核；荧光显微镜下观察检测结果并照相。3 hESCs的G显带核型分析将hESCs转移至用matrigel铺皿、hEFs-条件培养基培养的无饲养层体系下进一 步扩增并且去除人饲养层细胞的污染。培养3天后，在培养基中加入秋水仙碱(终浓度为 80ng/ml)，37°C处理3. 5小时。用0. 05%胰蛋白酶/0. 53mM EDTA消化收集细胞。按本实验 室常规方法制备好染色体涂片，Giemsa溶液染色，树胶封片，在油镜下观察结果。每个样本分析5-10个中期分裂相。表 1
Sample Hiuiia ^ .、 .、 _-A_-B_-DRB_r/iH.FS-32A-OlB1M 5B ^DRBl-UDRBl i^li
oocyte donorA1-!,A^02B^35B、DPUi3DRBi:H5
donorV— A”4B"60B .DRBl^lIDRBrM 5表1为孤雌胚胎干细胞系chHES-32的HLA检测情况ChHES_32的HLA位点表现 为纯合，与供卵者半相合，而与父方完全不一致。4hESCs多能性相关基因的检测收集未分化的hESCs团块，用Trizol抽提总RNA，用Fermentas公司提供的逆转录 试剂盒将lug RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板进行RT-PCR，以检测其中多能性相关基 因 0CT3/4、Nanog、REX-l、S0X2、THYl、TDGFl、TERFl、LEFTB、DPPA2 和 FGF4 的表达，β -actin 为反应体系阳性对照。PCR反应条件95°C 1分30秒；30个循环(94°C 40秒，54°C -64°C 40 秒，72 0C 40秒)；72°C延伸7分钟。5hESCs分化潜能的检测5. 1体内实验-畸胎瘤的制备收集未分化hESCs克隆，约1-2 X 106cells，注射入6_8周龄雄性SCID小鼠的后肢 肌肉中，观察畸胎瘤的形成情况。8-12周后取出肿瘤，常规石腊包埋切片后，HE染色观察。5. 2体外实验_拟胚体的制备将hESCs克隆机械切割成大小基本一致的团块，收集hESCs团块于60mm细菌培养 皿中悬浮培养。培养基为EB培养基，即不含bFGF的DFSR培养基，每天换液，悬浮培养7天 后，接种到预先用0. 明胶处理的六孔板中贴壁培养14天，然后进行三胚层标记的免疫 组化染色。二、本发明孤雌胚胎干细胞系及其衍生物的特异性鉴定1全基因组的单核苷酸多态性(SNP)分析胚胎干细胞转移至Matrigel铺皿、hEFs-条件培养基培养的无饲养层体系下进 一步扩增，同时去除人饲养层细胞的污染。0.05%胰酶消化收集细胞，用DNeasy Blood & Tissue kit 抽提全基因组DNA。我们采用 GeneChip Human Mapping SNP Array 5.0 对 2 个 正常受精hESCs系和2个pESCs系进行全基因组SNP分型分析，根据全基因组SNP位点的 基因分型来帮助判断细胞系的来源。分析方法是Y染色体以外的所有染色体从着丝粒位 置开始，每1Mb作为一个单位，向染色体两端分区，然后计算每个单位区间SNP的杂合频率 (杂合的SNP位点数/总的SNP位点数目)。我们规定如果单个区间内SNP的杂合频率低 于5%，那么判定该区域为纯合，反之，如果杂合频率高于5%，则判定该区域为杂合。由于 chHES-8核型为46，XY,其X染色体应该表现为纯合，而芯片结果显示该X染色体有0. 5% 的区域为杂合，我们将这条染色体总的杂合频率作为SNP芯片的系统误差，以此控制整个 基因分型分析的误差概率。2印记基因的RT-PCR检测用Trizol抽提总RNA，用Fermentas公司提供的逆转录试剂盒将lug RNA反转录 为cDNA，再以cDNA为模板进行RT-PCR，检测印记基因的表达，β -actin为反应体系阳性对照。PCR 反应条件95°C 1 分 30 秒；25-30 个循环(95 °C 40 秒，54°C -64°C 40 秒，72°C 40 秒)；72°C延伸7分钟。3DNA指纹分析胚胎干细胞转移至Matrigel铺皿、hEFs-条件培养基培养的无饲养层体系下 进一步扩增，同时去除人饲养层细胞的污染。0.05%胰酶消化收集细胞，用DNeasyBlood & Tissue kit抽提全基因组DNA，3130基因分析仪进行DNA指纹分析。采用powerpiex 16system,总共分析15个STR位点以及Amelogenin，操作步骤参见试剂盒说明书。4HLA分型的检测对胚胎干细胞均进行人类白细胞抗原HLA-A、-B、-DR位点的DNA分型。胚胎干细 胞转移至Matrigel铺皿、hEFs-条件培养基培养的无饲养层体系下进一步扩增，同时去除 人饲养层细胞的污染。0.05%胰酶消化收集细胞，用DNeasy Blood & Tissue kit抽提全 基因组DNA。采用Invitrogen公司提供的AB/DR SSP UniTray进行HLA分型的检测，运用 PCR-SSP的方法，具体步骤参见试剂盒说明书。
权利要求
一种获得孤雌胚胎干细胞系的方法，其特征在于该孤雌胚胎干细胞是从1PN胚胎中分离得到的。
2.根据权利要求1所述的获得孤雌胚胎干细胞系的方法，其特征在于它包括以下步骤(1)在胚胎受精12小时后观察，选择单原核胚胎进一步培养至囊胚阶段；(2)切取囊胚内细胞团，接种至预先准备好的饲养层细胞上，并采用抑制细胞分化的干细胞培养基培养；(3)将未分化的细胞进一步传代、扩增、冻存，并进行孤雌特征以及干细胞特征的鉴定。
全文摘要
本发明涉及一种获得孤雌胚胎干细胞系的方法。该细胞系从IVF废弃的1PN胚胎中分离得到，通过SNP芯片分析发现其基因组99％以上的区域表现为纯合状态，而DNA指纹则证明其遗传物质完全来源于母方，无父方基因组的参与。本发明证明了IVF过程中废弃的1PN胚胎是分离纯合型孤雌胚胎干细胞系的一种来源，由此得到的纯合型孤雌胚胎干细胞系遗传背景简单，HLA位点纯合，不仅能够满足供卵者，而且能够满足更多HLA分型相同人群的器官移植要求，是细胞替代治疗的重要种子细胞来源。此外，该孤雌胚胎干细胞系还是研究单性生殖发育以及印记基因作用的良好工具。
文档编号C12N5/0735GK101914491SQ20101026677
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者卢光琇, 林戈, 欧阳琦 申请人:湖南光琇高新生命科技有限公司