专利名称：修饰的植酸酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及修饰的植酸酶。
背景技术：
植物含有大量的植酸盐作为磷酸盐的储藏形式。单胃动物不能从植酸盐中释出磷酸盐，因此需要在饲料中补充磷酸盐。如今可在动物饲料中补充植酸酶以自植酸盐中释出磷酸盐。
植酸酶一般在制作饲料的过程中被添加至动物饲料中。在动物饲料制备过程的某些阶段中，植酸酶会逢及较高温度及较高湿度。此类条件对于不稳定型化合物(例如酶)的活性有负面影响。源自黑曲霉(Aspergillusniger)的植酸酶，由于其有利性质而常用于饲料用途。例如，该酶具有较宽酸性范围的最适pH、宽的底物专一性、对植酸有相对的高比活性以及高亲和性，即使在低植酸浓度下该酶亦可有效地降解植酸。此外，该酶可从植酸盐中顺利地移除6个磷酸中的5个磷酸，而不会显著的堆积中间物，其活性和稳定性不需要辅因子加以维持，而且其对饲料成份及金属离子的抑制并不十分敏感。
然而，黑曲霉的植酸酶的耐热性较低。因此，需要与黑曲霉植酸酶具有相等的有利性质且在高温下具有高稳定性及活性的植酸酶。
本发明公开具有有利性质的，例如对高的温度及湿度具有抗性的修饰的植酸酶。
图1.黑曲霉活性部位残基。
图2.与植酸复合的黑曲霉植酸酶的活性部位残基IHP-S模型坐标(IHP 550H)。
图3.植酸酶生产力相对于温度的图。
发明内容
本发明中，植酸酶是可催化植酸盐(肌醇六磷酸盐)水解为一种或多种下列化合物的酶肌醇五-、四-、三-、二-以及单-磷酸盐及/或肌醇。一般已知某些植酸酶不能将肌醇单磷酸盐大量水解成肌醇。植酸酶可为3-植酸酶或6-植酸酶(分别为EC3.1.3.8或EC3.1.3.26)，这是指第一个被水解的酯键的位置。
本发明的第一方面涉及修饰的植酸酶多肽。相较于模型植酸酶，依据本发明的多肽被修饰，以致当与模型植酸酶比对时，本发明多肽含有选自如下的修改将存在于模型植酸酶中的氨基酸替代为不同的氨基酸、缺失存在于模型植酸酶中的氨基酸、或插入氨基酸。其中，依据本发明的多肽与模型植酸酶的比对将使得可以在本发明的多肽与模型植酸酶之间获得最大量的同源(一致)残基。
本发明优选的实施方案中，该修饰为替代。
修饰的数目可至少为一个，优选至少10个，更优选至少20个，更优选至少30个，更优选至少40个，更优选至少50个，更优选至少70个，更优选至少80个。
在本发明中，诸如“5QS”之类的表示法意指，相关模型植酸酶中位置5的氨基酸用Q或S替代。原本的氨基酸残基的性质可能取决于所用的模型植酸酶。诸如“Q5S”之类的表示法意指，存在于模型植酸酶中的特定氨基酸残基(例如Q)经不同氨基酸例如S替代。
优选地与模型植酸酶相比，修饰的植酸酶在至少一个下列位置被修饰5，6，13，19，21，29，31，36，39，43，53，69，78，81，85，87，99，112，113，122，125，126，128，137，147，148，157，160，163，165，169，172，176，178，180，181，182，183，189，194，197，201，203，211，213，215，218，222，223，225，232，233，242，246，247，248，249，250，251，252，254，269，291，296，310，312，315，322，330，342，346，362，365，367，368，372，374，375，382，384，395，414，417，425，428，438，440；或优选在至少一个下列位置被修饰13，19，21，29，31，36，39，43，53，69，78，81，85，87，99，112，113，122，125，126，128，137，147，148，157，160，163，165，169，172，176，178，180，181，182，183，189，194，197，201，203，211，213，215，218，222，223，225，232，233，242，246，247，248，249，250，251，252，254，269，291，296，310，312，315，322，330，342，346，362，365，367，368，372，374，375，382，384，395，414，417，425，428，438，440；或优选在至少一个下列位置被修饰13，19，21，29，36，39，43，53，69，81，85，87，99，112，113，122，125，126，128，137，147，148，157，160，165，169，172，176，178，181，183，189，197，201，203，213，218，222，223，225，232，233，246，247，248，249，250，251，252，291，296，310，312，315，322，330，342，346，362，365，367，368，372，374，375，382，384，395，417，425，438，440。甚至更优选，修饰的植酸酶相较于模型植酸酶在至少一个下列位置上被修饰31，78，163，180，182，194，211，215，242，254，269，414，428，440。
特别地，相较于模型植酸酶，修饰的植酸酶含至少一个下列修饰5QS，6SH，13G，19P，21I，29S，31FY，36D，39A，43D，53V，69S，78EA，81K，85A，87K，99T，112Q，113M，122R，125K，126A，128A，137A，147A，148E，157A，160A，163RG，165N，169A，172V，176I，178P，180AG，181A，182STG，183Y，189H，194VA，197E，201G，203D，211TL，213A，215SA，218A，222A，223H，225P，232E，233D，242SP，246V，247A，248R，249T，250S，251D，252A，254KE，269NQ，291A，296F，310Q，312H，315T，322N，330A，342M，346F，362S，365S，367E，368E，372Y，374A，375S，382A，384A，395K，414PA，417K，425D，428RKE，438N，440AE；或更优选，相较于模型植酸酶至少有一个下列修饰5QS，6SH，13G，19P，21I，29S，31Y，36D，39A，43D，53V，69S，78A，81K，85A，87K，99T，112Q，113M，122R，125K，126A，128A，137A，147A，148E，157A，160A，163G，165N，169A，172V，176I，178P，180G，181A，182G，183Y，189H，194A，197E，201G，203D，211L，213A，215A，218A，222A，223H，225P，232E，233D，242P，246V，247A，248R，249T，250S，251D，252A，254E，269Q，291A，296F，310Q，312H，315T，322N，330A，342M，346F，362S，365S，367E，368E，372Y，374A，375S，382A，384A，395K，414A，417K，425D，428E，438N，440E。
最佳地，相较于模型植酸酶，修饰的植酸酶含有至少一个下列的修饰31Y，78A，163G，180G，182G，194A，211L，215A，242P，254E，269Q，414A，428E，440E。
本发明使用的位置编号依据SEQ ID NO1的位置编号。
本发明中使用的模型植酸酶是可得自曲霉属丝状真菌的植酸酶，优选得自黑曲霉的植酸酶，或源自任何此类植酸酶的变异体植酸酶。已知在黑曲霉各菌株内植酸酶显示低程度的变异，即这些植酸酶的同源性至少为90％。还已知黑曲霉物种包括先前称作无花果曲霉(Aspergillus ficuum)以及泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的物种。最佳的模型植酸酶为可以得自黑曲霉NRRL3135的植酸酶，即如SEQ ID NO1所示植酸酶。
尤其优选的模型植酸酶为含有独特地存在于黑曲霉植酸酶中的特定氨基酸残基组合的植酸酶。
尤其优选，模型植酸酶在活性部位含有与黑曲霉植酸酶对应位置上的氨基酸残基相同的氨基酸。为此，本发明公开了一种方法，藉此可以确定位于黑曲霉植酸酶活性部位中、出现在距结合的植酸盐某一距离内的残基。
形成黑曲霉植酸酶的活性部位并在黑曲霉植酸酶降解植酸的过程与催化性质相关的氨基酸残基可以使用黑曲霉植酸酶3D结构加以确认，该3D结构可来自蛋白质数据库(PDB)，登录号1IHP(Kostrewa et al.NatureStructural Biology，1997，4，185)。黑曲霉3D结构不含底物植酸(肌醇六磷酸盐)。然而，可得到与植酸复合的大肠杆菌植酸酶的3D结构(PDB入口1DKQ，Lim et al.，Nature Structural Biology，2000，7，108)。虽然序列同源性低，但此二种植酸酶显示出实质上的结构类似性。开始时仅使用在黑曲霉植酸酶(1IHP)和大肠杆菌植酸酶中展示相似叠折模式的那些残基的α碳原子进行两种植酸酶的原子坐标叠置。其后，以迭代方法扩大叠置中包括的残基，直到这种叠置不能再得到改进为止。使用用于叠置的原子的均方根差判断叠置的品质。于最终叠置中，氨基酸片段1DKQ6-22，46-66，83-106，246-257，268-278，296-313，328-338，346-351，375-381，392-398被叠置于1IHP48-64，104-124，133-156，270-281，293-303，331-348，379-389，397-402，406-412，422-428之上。
叠置后从大肠杆菌植酸酶活性部位取出底物植酸，转移至黑曲霉植酸酶的对应位点。接着将复合植酸的黑曲霉植酸酶进行能量最小化，允许底物与活性部位残基位移而使其余的结构保持固定。用Insight & Discover程序(Accelrys，San Diego CA)，使用SGI Octane工作站应用力场CVFF进行能量最小化。产生的复合植酸的黑曲霉植酸酶的模型编码为IHP-S。计算如下氨基酸残基的溶剂可接近表面，所述氨基酸残基至少有一个原子与底物植酸的任何原子的距离在7埃内，结果发现勾划出一个可以几近理想地容纳植酸的口袋的光滑连续表面。形成此活性部位口袋的残基的原子坐标示于图1。此外，IHP-S模型被用于确认底物周围的不同区域残基。结果在图2中给出。
因此，在本发明中，黑曲霉植酸酶的活性部位氨基酸残基是与在活性部位结合的植酸相距某段距离内的那些残基。优选相距6埃，更优选7埃。
因此，尤其优选的模型植酸酶含有氨基酸Q27，Y28，R58，H59，R62，P64，T65，S67，K68，Y72，D103，S140，R142，V143，E179，D188，F243，KN277，K278，H282，S337，H338，D339，N340，F380(距离6埃以内)，优选地含有氨基酸Q27，Y28，R58，H59，G60，R62，Y63，P64，T65，DE66，S67，K68，K71，Y72，D103，S140，R142，V143，E179，D188，E196，D239，F243，Q274，KN277，K278，H282，S337，H338，D339，N340，G341，V378，F380(距离7埃以内)。
尤其优选的模型植酸酶还含有存在于黑曲霉植酸酶中的下列氨基酸A35，A46，N130，S141，G167，Q168，D174，T191，E199，E205，L220，T235，D244，1268，H306，G341，K356，A381。
对于本发明而言，未具体指明的位置上具有何种氨基酸残基并不具关键性。这些未具体指明的位置是不在黑曲霉植酸酶活性部位内的位置，而且不是以上额外地指明的黑曲霉氨基酸，也不进行如上所述的特定修饰。使用习知的比对程序比对植酸酶将可揭示在某个位置上会典型地出现哪些氨基酸。任何此类氨基酸均可存在于本发明多肽中此相应的未具体指明位置。
因此，依据本发明的优选多肽是这样的植酸酶，该酶在活性部位含有与黑曲霉植酸酶相应位置的氨基酸相同的氨基酸残基，以及额外地指明的黑曲霉氨基酸(即A35，A46，N130，S141，G167，Q168，D174，T191，E199，E205，L220，T235，D244，I268，H306，G341，K356，A381)、而且进一步地含有以上所述的修饰。
依据本发明的尤其优选的多肽为还含有至少一个下列氨基酸残基的植酸酶31Y，78A，163G，180G，182G，194A，211L，215A，242P，254E，269Q，414A，428E和/或440E。依据本发明的另一尤其优选的多肽含有至少一个下列氨基酸残基180G，182G，242P和/或440E；或优选地至少180G，182G和/或242P。
具体地，本发明公开了依据SEQ ID NO3、SEQ ID NO5或SEQ IDNO7的修饰的植酸酶多肽。
本发明多肽可包含所有以上给出的修饰。此外，本发明多肽可包含额外的修饰，这些额外修饰在该多肽中涉及的位置为修饰不会影响多肽的折叠或活性的位置。典型地，该修饰可为保守替代，即非极性的、极性不带电荷的、极性带电荷的或芳香族的氨基酸由相同类型的不同氨基酸替代。
在一个具体实施方案中，本发明多肽可包含与SEQ ID NO3、SEQ IDNO5或SEQ ID NO7的序列至少有91，优选至少92，更优选至少93，更优选至少94，更优选至少95，更优选至少96，更优选至少97，更优选至少98或最优选至少99％同源性(相同性)的多肽。
相较于模型植酸酶，依据本发明的多肽经修饰具有提高的热稳定性及/或改变的比活性及/或改变的对某些底物的专一性及/或改变的酶最适pH及/或改良的颗粒饲料成丸稳定性及/或改良的生物功效，及/或改良的在用于产生修饰的植酸酶的宿主生物体内的表达或运输等等。
在优选实施方案中，依据本发明的多肽仍保留几种黑曲霉植酸酶(尤其可以从黑曲霉NRRL 3135获得的植酸酶)的生化学性质。保留的生化学性质为Km值及/或在约5.5及2.5二个pH值的最适pH及/或比活性及/或在生理温度下的高活性。
在优选的实施方案中，依据本发明的多肽具有提高的热稳定性。相较于模型植酸酶，依据本发明的修饰的植酸酶热稳定性增加，这可以表现为在给定的升高的温度下更长的生命期及/或改良的重新折叠/再活化的特征及/或在更高的温度下解折叠的特征。
出人意外地，依据本发明的多肽在提高热稳定性后同时有多种黑曲霉植酸酶的有利性质。
对本发明多肽重要的(例如对热稳定性或活性重要的)氨基酸，并由此可作为替代的潜在对象的氨基酸可依据本领域已知的方法，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变加以确认及修饰。后一技术中在分子的每一个残基位置引入突变，测试产生的突变分子的生物活性(例如植酸酶活性)以确认对分子活性关键的氨基酸残基。亦可用核磁共振、晶体学或光亲合标记或分子建模等技术测定晶体结构，之后分析晶体结构以确定酶底物交互作用位点。
本发明多肽通常通过在适宜宿主生物体中表达编码多肽的多核苷酸序列来重组制备，但亦可用合成方法制备。
预期使用酵母及真菌宿主细胞可提供翻译后修饰作用(例如蛋白酶解加工、十四烷基化作用、糖基化作用、截短以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化作用)，这对于赋予重组表达的本发明产物最佳的生物活性可能是必需的。
本发明多肽可以以离开其天然细胞环境的形式提供。因此，其可以实质上被分离或纯化(讨论如上)、或在非天然含有其的细胞，例如其它真菌物种细胞、动物细胞、酵母或细菌中产生。
本发明多肽可用本领域技术人员习知的任何适当试验进行分析以测量其相较于本领域已知的模型植酸酶的改进。
第二方面，本发明提供(例如分离及/或纯化的)多核苷酸，其包含编码第一方面的多肽的多核苷酸序列。特别的，本发明提供多核苷酸，其包含编码SEQ ID NO3、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7中所示氨基酸序列的多核苷酸序列或包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
第二方面的多核苷酸还包括编码第一方面的多肽的多核苷酸序列的任何简并形式。例如，本领域技术人员可使用常规技术依据任何待表达本发明多肽的特定宿主生物体的密码子使用进行核苷酸替代而不影响本发明多核苷酸编码的蛋白质序列。
第二方面的多核苷酸序列可为RNA或DNA并包括基因组DNA、合成的DNA或cDNA。优选，多核苷酸为DNA序列。
本发明的多核苷酸可依据本领域已知的方法合成。其可以通过组合依据并沿着本发明多核苷酸的核苷酸序列合成的寡核苷酸而产生。
或者，其可以通过在亲本多核苷酸的任何所要位置进行诱变而合成。
例如，本发明多核苷酸可构建自一系列相互具有约20个核苷酸重叠的长度为80个核苷酸的合成寡核苷酸。用具有校对活性的聚合酶进行PCR(典型的10个步骤)，将所有80-mer的寡核苷酸退火并延伸此寡核苷酸。用具有校对活性的聚合酶以及位于所需片段的5′以及3’末端的PCR引物进行进一步的PCR，合成完整的所需片段。将完整的片段克隆入适当的载体并加以测序以检验是否得到正确的序列。可视需要，纠正序列错误，例如使用来自Stratagene的QuickChange试剂盒，依据制造商的说明进行纠正。
可使用本发明的多核苷酸获得编码进一步修饰的多肽的多核苷酸，例如以诱变技术将本发明的多核苷酸加以诱变。可使用定点诱变在一个或多个特定位置改变本发明多核苷酸。可使用基因改组技术(例如参见WO95/22625、WO98/27230、WO98/01581及/或WO00/46344)获得多核苷酸变异体，其中存在于多核苷酸起始群体的各个成员中的变异位置发生随机组合，该起始群体包括一种或多种依据本发明的多核苷酸。
本发明亦提供包含本发明多核苷酸的载体，包括克隆载体及表达载体。
其中插入了本发明表达盒或本发明多核苷酸的载体可为任何可方便地使用在重组DNA方法中的载体，载体的选择经常取决于载体将导入的宿主细胞。因此，载体可是独立自主复制的载体，即载体以染色体外实体形式存在，其复制与染色体的复制无关，例如通常具有复制起点的质粒、粘粒、病毒或噬菌体载体。或者，载体可以是引入宿主细胞后可整合至宿主细胞基因组中且与其所整合的染色体共同复制的载体。载体可为环状(例如质粒)或线性(例如表达盒)的多核苷酸。
优选，本发明多核苷酸可插入表达盒。在表达盒中，本发明多核苷酸可操作地连接至能为宿主细胞自编码序列表达多肽提供条件的调控序列上，即该载体为表达载体。本文术语“可操作地连接”意指并置，其中所描述的组分之间的位置关系使得它们可以以其预期方式起作用。调控序列例如启动子、增强子或其它的表达调控信号与编码序列“可操作地连接”，意味着调控序列的位置将允许在与调控序列相容的条件下从编码序列表达多肽。
用于给定的宿主细胞的表达盒以连续的次序从5′-端至3′-端(相对于编码第一方面多肽的序列的编码链)包含相互可操作地连接的下列元件能在给定的宿主细胞内指导编码多肽的DNA序列转录的启动子序列；任选地，能指导从给定的宿主细胞分泌多肽至培养基的信号序列；编码成熟形式的，优选活性形式的多肽的DNA序列；优选地以及在编码多肽的DNA序列下游能终止DNA序列转录的转录终止区域(终止子)。
除了编码天然原始的本发明多肽的基因的天然启动子以外，可使用其它启动子指导本发明的多肽表达。可基于启动子在期望宿主中指导本发明多肽表达的效力来选择启动子。
可选择启动子/增强子和其它表达调节信号，以便和表达盒或载体所设计用于的宿主细胞兼容。优选，启动子序列源自高度表达的基因。本发明中高度表达的基因指其mRNA占总细胞mRNA的至少0.01％(w/w)的基因(例如在诱导的条件下)，或基因产物占总细胞蛋白质至少0.2％(w/w)的基因，或对于具有分泌型基因产物的基因而言分泌量至少为0.05克/升的基因。优选用于衍生启动子和/或包含在表达盒待整合入的优选预定目标基因座内的优选高度表达基因的实例包括(但非限于)编码糖酵解酶，例如丙糖-磷酸异构酶(TPI)、甘油醛-磷酸脱氢酶(GAPDH)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、丙酮酸激酶(PYK)、醇脱氢酶(ADH)的基因，以及编码淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-半乳糖苷酶、醇(甲醇)氧化酶、延伸因子以及核糖体蛋白质的基因。适宜的高度表达基因的特定实例包括例如克鲁维酵母(kluyveromyces)的LAC4基因、汉逊酵母(Hansenula)以及毕赤酵母(Pichia)的甲醇氧化酶基因(分别地为AOX以及MOX)、黑曲霉(A.niger)以及泡盛曲霉(A.awamori)的葡糖淀粉酶(glaA)基因、米曲霉(A.oryzae)的TAKA-淀粉酶基因、构巢曲霉(A.nidulans)的gpdA基因以及里氏木霉(T.reesei)的纤维二糖水解酶基因。
为了要在细菌中进行表达，可以使用原核启动子，尤其可使用适用于大肠杆菌的原核启动子。强细菌启动子的实例为α-淀粉酶以及SPo2启动子，以及细胞外蛋白酶基因的启动子。
酵母启动子包括酿酒酵母(S.cerevisiae)的GAL4以及ADH启动子、粟酒裂殖酵母(S.pombe)的nmt 1以及adh启动子。强酵母启动子的实例为可以来自醇脱氢酶、乳糖酶、3-磷酸甘油酸激酶以及丙糖磷酸异构酶基因的启动子。
应用于真菌表达宿主的强组成型及/或诱导型启动子的优选实例为可取自真菌基因木聚糖酶(xlnA)、植酸酶、ATP-合成酶、亚基9(oliC)、丙糖磷酸异构酶(tpi)、醇脱氢酶(AdhA)、α-淀粉酶(amy)、淀粉葡萄糖苷酶(AG-来自glaA基因)、乙酰胺酶(amdS)以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)的启动子。
适用于植物细胞的启动子包括胭脂碱合酶(nos)、章鱼碱合酶(ocs)、甘露碱合酶(mas)、核酮糖小亚基(rubico ssu)、组蛋白、稻肌动蛋白、菜豆蛋白、花椰菜花叶病毒(CMV)35S以及19S以及环状病毒(circovirus)的启动子。在本领域中可容易获得所有的这些启动子。
若要将多肽制备为分泌型蛋白质，则表达盒中编码成熟多肽形式的多核苷酸序列可操作地连接至编码信号肽的多核苷酸序列。
优选，该信号序列相对于编码多肽的多核苷酸序列是天然的(同源的)。本发明的优选实施方案中信号序列得自黑曲霉植酸酶基因，尤其如公开于EP 0 420 358的信号序列。或者，信号序列可相对于编码多肽的多核苷酸序列为外来的(异源的)，在此情况中，优选信号序列是表达此DNA序列的宿主细胞的内源序列。信号序列可与驱动该信号序列所来自的编码序列表达的启动子组合以共同使用，例如组合(黑)曲霉淀粉葡萄糖苷酶(亦称为(gluco)淀粉酶)启动子与淀粉葡萄糖苷酶(AG)基因的信号序列(18以及24个氨基酸的版本均可)，信号序列也可与其它启动子组合。
本发明中亦可使用杂合的信号序列。适宜的用于酵母宿主细胞的信号序列的实例为源自酵母α-因子基因的信号序列。适宜的用于细菌的信号序列来自α-淀粉酶基因(芽孢杆菌)。
在一些案例中，多肽经由分泌路径时可在一个以上的位置发生信号序列的裂解，此意味着可产生具有可变的N-端的成熟多肽。本发明包括这些具有可变的N-端的多肽。
编码多肽的多核苷酸序列下游可为内含一个或多个转录终止位点(例如终止子)的3′非翻译区。终止子的来源并不十分重要。终止子可为例如编码多肽的多核苷酸序列的天然终止子。然而，优选在酵母宿主细胞中使用酵母终止子以及在丝状真菌宿主细胞中使用丝状真菌的终止子。更优选宿主细胞(其中表达编码多肽的多核苷酸序列)的内源终止子。
载体可含有一个或多个选择性标记基因，以使得可以从多数的未转化细胞中选出转化细胞。
优选的选择性标记包括(但非限于)那些可弥补宿主细胞缺陷或赋予药物抗性的标记。其包括例如可用于大多数丝状真菌以及酵母转化的通用标记基因，例如乙酰胺酶基因或cDNA(构巢曲霉、米曲霉、或黑曲霉的amdS、niaD、facA基因或cDNA)，或提供抗生素如G418、潮霉素、博来霉素、卡那霉素、腐草霉素或benomyl(benA)抗性的基因，或者，可使用特定选择标记，例如需要对应的突变宿主株系的营养缺陷型标记例如URA3(来自酿酒酵母或来自其它酵母的类似基因)、pyrG或pyrA(来自构巢曲霉或黑曲霉)、argB(来自构巢曲霉或黑曲霉)或trpC。在优选的实施方案中，在引入表达构建体后自转化的宿主细胞中删除选择标记以便取得不含选择标记基因的能产生多肽的转化宿主细胞。
其它标记包括ATP合成酶、亚基9(oliC)、乳清酸核苷-5′-磷酸-脱羧酶(pvrA)、细菌的G418抗性基因(此亦可用于酵母，但非真菌)、抗氨苄青霉素抗性基因(大肠杆菌)、新霉素抗性基因(芽孢杆菌)以及编码β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的大肠杆菌uidA基因。可在体外使用载体，例如用于产生RNA或用于转染或转化宿主细胞。
编码多肽的DNA序列优选作为表达盒的一部份引入适当的宿主。对于用表达盒转化适当的宿主，可使用本领域技术人员熟知的转化方法。用于转化宿主的表达盒可为携带可选择标记的载体的一部份，或表达盒可作为单独分子与携带可选择标记的载体共同进行共转化。所述载体可包含一种或多种可选择的标记基因。
对大多数的丝状真菌及酵母而言，载体或表达构建体优选整合在宿主细胞基因组中以取得稳定转化体。然而，对某些酵母而言也可获得适当的附加型载体，表达构建体可以插入其中获得稳定及高水平表达。其实例包括分别源自酵母属及克鲁维酵母属的2μ及pKD1质粒的载体，或内含AMA序列(例如曲霉属的AMA1)的载体。在表达构建体整合入宿主细胞基因组中时，构建体可使用同源重组整合在预定目标基因座或随机整合在基因组的基因座中，在前一情况中，优选目标基因座包含高度表达的基因。之前已提供许多高度表达基因的适宜实例。
本发明亦提供包含本发明多核苷酸或本发明载体的宿主细胞。多核苷酸对宿主细胞基因组而言可为异源的。本文术语“异源的”意指非天然存在于宿主细胞基因组中的多核苷酸或非该细胞天然产生的多肽。
适宜的宿主细胞优选为原核微生物例如细菌，或更优选为真核生物体，例如真菌例如酵母或丝状真菌，或植物细胞。
来自芽孢杆菌属的细菌为非常适宜的异源宿主，因为其可分泌蛋白质至培养基。其它适宜的细菌宿主来自链霉菌属(streptomyces)以及假单胞菌属(Pseudomonas)。
用于表达编码本发明多肽的DNA序列的优选酵母宿主细胞为酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属、Yarrowia、以及裂殖酵母属酵母。更优选的酵母宿主细胞选自酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)(亦称为马克斯克鲁维酵母乳酸亚种(kluyveromyces marxianus var.lactis))、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、巴斯德毕赤酵母(pichia Pastoris)、Yarrowia lipolytica、及粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
最优选丝状真菌宿主细胞。优选的丝状真菌宿主细胞选自曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、镰孢属(Fusarium)、Disporotrichum、青霉属(Penicillium)、枝顶孢属(Acremonium)、脉孢菌属(Neurospora)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、毁丝霉属(Myceliophtora)、侧孢霉属(Sporotrichum)、梭孢壳属(Thielavia)、以及Talaromyces。更佳的丝状真菌宿主细胞为米曲霉(Aspergillus oryzae)、酱油曲霉(Asperigillus sojae)、构巢曲霉，或黑曲霉组的菌种(经Raper和Fennell定义，The GenusAspergillus，The Williams & Wilkins Company，Baltimore，pp 293-344，1965)。此类菌种包括(但非限于)黑曲霉、泡盛曲霉、塔宾曲霉(Aspergillustubingensis)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、构巢曲霉、日本曲霉(Aspergillus Japonicus)、米曲霉以及无花果曲霉(Asperigillus ficcum)，以及菌种里氏木霉(Trichoderma reesei)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)、Acremonium alabamense、粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)、嗜热毁丝霉(Myceliophtora thermophilum)、嗜纤维素侧孢霉(Sporotrichum cellulophilum)、Disporotrichum dimorphosporum以及Thielavia terrestris。
本发明范围内优选的表达宿主的实例为真菌，例如曲霉属及木霉属；细菌，例如芽孢杆菌例如枯草芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌和解淀粉芽孢杆菌，假单胞菌；以及酵母例如克鲁维酵母属，例如乳酸克鲁维酵母以及酵母属，例如酿酒酵母。
依据本发明的宿主细胞还包括植物细胞，因此本发明延及含有一个或多个本发明细胞的转基因生物体，例如植物以及其部份。因此转基因的(或遗传修饰的)植物可以在其基因组中插入(例如稳定地)编码一个或多个本发明多肽的序列。可使用已知的技术，例如使用根瘤农杆菌的Ti或Ri质粒转化植物细胞。如此，质粒(或载体)可含有感染植物所必要的序列，并且可使用Ti及/或Ri质粒的衍生物。
或者，可直接侵染植物的一部份，例如叶、根或茎。在此技术中可创伤待感染的植物，例如用刀片切割植物或用针穿刺植物或用磨蚀物磨擦植物。然后在创口接种农杆菌。
然后植物或植物部份可生长在适当的培养基上并发育成成熟的植物。可使用已知技术将转化细胞再生成遗传修饰的植物，例如使用抗生素选择转化的芽并在内含适当的营养物、植物激素等的培养基上传代培养该芽。
如此本发明的另一方面提供经转化或转染包含本发明的多核苷酸或载体的宿主细胞。较佳地多核苷酸包含在用于复制多核苷酸以及表达多肽的载体中。可选择与该载体能兼容的细胞，例如原核的(例如细菌)、真菌、酵母或植物细胞。
亦可选择异源宿主，其中本发明的多肽以实质上不含有与本发明多肽具有类似活性的其它多肽的形式产生。可选择通常不产生具有类似活性的此类多肽的宿主达成此目的。
若本发明多核苷酸并入重组可复制的载体，则该载体可用于在相容的宿主细胞中复制此多核苷酸。
如此本发明进一步提供产生依据本发明的多核苷酸的方法，其中将依据本发明的多核苷酸引入可复制的载体，将载体引入兼容的宿主细胞，以及在引起载体复制的条件下生长宿主细胞。内含依据本发明的多核苷酸的载体可自宿主细胞回收。适当的宿主细胞包括细菌例如大肠杆菌。
本发明进一步提供制备依据本发明的多肽的方法，其中在允许表达(由载体表达)依据本发明的多肽的条件下培养宿主细胞(例如其转化或转染了如上所述的表达载体)以及可选地回收表达的多肽。优选将多肽制备成分泌型蛋白质，在此情况下表达构建体中编码成熟多肽形式的多核苷酸序列可操作地连接至编码信号肽的多核苷酸序列上。
依据本发明的重组宿主细胞可用本领域已知的方法培养。对于各启动子和宿主细胞的组合，可获得有助于表达本发明多肽的培养条件。达到所要的细胞密度或多肽滴度后，可停止培养，并用习知的方法回收多肽。
发酵培养基可包括习知的培养基，其中含有碳源(例如葡萄糖、麦芽糖、糖蜜)、氮源(例如硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、有机氮源，例如酵母提取物、麦芽汁、蛋白胨)、以及其它无机的营养源(例如磷酸盐、镁、钾、锌、铁、等)。可选地，可以包括诱导物。
适当培养基的选择可基于表达宿主及/或基于表达构建体的调控需求而定。该培养基为本领域技术人员习知的。培养基可视需要含有附加成份，从而使转化的表达宿主比其它可能的污染微生物更具生长优势。
发酵可进行0.5-30天。发酵可为分批、连续或补料分批法，适当地温度介于0至45℃之间，以及pH介于例如2至10之间。优选的发酵条件为温度介于20至37℃之间及/或pH介于3至9之间。通常基于选择的表达宿主以及表达的蛋白质选择适当条件。
发酵后，若必要，可使用离心或过滤自发酵培养液中移除细胞。发酵停止后或去除细胞后，可回收本发明的多肽，视需要用常规方法纯化和分离。
方便地，本发明的多肽可与适当的(固态或液体)载体或稀释剂(包括缓冲液)混合以产生多肽组合物。多肽可与载体结合或混合，例如固定于固态载体上。如此本发明进一步提供含本发明多肽的组合物。这可为适于包装、运送及/或储藏的形式，优选此时保留多肽的活性。组合物可为糊、液体、乳液、粉、薄片、颗粒、丸或其它挤出物形式。
组合物可进一步包含额外成分，例如一种或多种(额外的)酶。
一般，多肽可稳定地配制成液体或干燥形式。一般，产物可配成任选地包括例如稳定缓冲剂及/或防腐剂的组合物。
本发明还涉及包含一种或多种本发明多肽的食品或动物饲料组合物或添加剂。多肽可存在于饲料中，且其浓度不同于天然的浓度。优选的量为0.1至100，例如0.5至50，优选为1至10mg/kg饲料。
本发明亦涉及制备动物饲料组合物的方法，该方法包括将本发明的多肽添加入一种或多种可食用的饲料物质或成分中。多肽可与饲料物质或成分分开单独地或结合其它饲料添加剂添加入动物饲料组合物中。多肽可为饲料物质或成分的组成部份或之一。
本发明多肽亦可添加入动物饲料中以改良植物组份(例如植酸盐)的分解，改良动物对植物营养物的利用。有利地，本发明多肽可在体内继续降解饲料中的植酸盐。本发明的真菌多肽特别地通常具有较低的最适pH并能在诸如动物胃这样的酸性环境中释放重要的营养物。
本发明多肽亦可用于自大豆产生奶替代物(或替代品)的过程中。此类奶替代物可以供应人类及/或动物。
所述组合物可额外地包含(尤其当其配制用于动物饲料时)一种或多种离子载体、氧化剂、表面活性剂、保护瘤胃的氨基酸、酶增强物或可在进食动物的胃肠道内天然产生的酶。当添加至反刍动物或单胃动物(例如家禽或猪)饲料(包括青贮饲料)中时，饲料可包含谷类，例如大麦、小麦、玉米、黑麦或燕麦或谷类副产品，例如麸皮或玉米糠，或其它植物材料，例如大豆以及其它豆类。酶可显著地改善植物材料的降解，使动物更好地利用植物营养物。结果可提高生长速率及/或饲料转化。
由于本发明多肽在高度酸性的条件下(例如在动物胃中)仍有活性，故其尤其可用于动物饲料。
外源添加本发明多肽的一个方法为以转基因植物材料及/或(例如转基因的)种子的形式加入多肽。如此多肽可经由异源基因表达合成，例如编码所要酶的基因可克隆入植物表达载体，并由适当的植物表达信号，例如组织-特异性启动子，例如种子-特异性启动子加以控制。内含编码多肽的基因的表达载体可接着转化入植物细胞，可选择转化的细胞以再生成整个植物。可生长及收获如此得到的转基因植物，内含异源(对植物而言)多肽的植物部份可直接或经进一步的加工后包括于组合物中。异源多肽可包含于转基因植物的种子中或可包含于其它植物部份，例如根、茎、叶、木质部、花、树皮及/或果实中。适当的植物包含谷类植物，例如燕麦、大麦、小麦、玉米以及稻。
以转基因植物材料形式，例如转基因种子形式添加多肽可能需要对植物材料加工以便动物可得到多肽，或至少提高其利用率。该加工技术可包括各式各样机械性(例如磨碎及/或研磨)的技术或热机械性的处理例如挤压或延展。
如此本发明亦涉及促进单胃或非反刍型动物的生长及/或饲料转化的方法，该方法包括用本发明的多肽饲养动物。适当的动物包括农场的单胃及/或非反刍动物，例如猪(或小猪)、家禽(例如鸡、火鸡)、小牛或犊牛或水产(例如海产类)动物(例如鱼类)。
实施方式实施例1构建产生植酸酶的菌株合成具有SEQ ID NO2、SEQ ID NO4及SEQ ID NO6序列的DNA片段。证实DNA序列后，将这些合成的基因片段使用PCR融合至黑曲霉植酸酶信号序列，并克隆在葡糖淀粉酶启动子的控制下。为此，将存在于国际专利申请WO98/46772所述pGBTOPFYT1表达载体中的phyA基因用如上所述的修饰的植酸酶基因取代，分别产生载体pTHFYT2、pTHFYT4及pTHFYT6。
将表达载体pTHFYT2、pTHFYT4及pTHFYT6引入黑曲霉CBS646.97(描述于WO98/46772)。使用PCR选择内含pTHFYT2、pTHFYT4或pTHFYT6的转化株。为了测定这些转化株是否能分泌活性的植酸酶，将转化株培养在如Chen(1998，Biotechnol.Technique12，759-761)所述内含植酸盐的平板上。在此试验中，若分泌出活性植酸酶，则由于植酸盐降解，在曲霉菌落的附近可看见晕圈。使用此试验证实所有表达载体均导致可以分泌活性的植酸酶FYT2、FYT4或FYT6至培养基的转化体。
将显示清晰晕圈的转化株培养于摇瓶中。将所选择的转化株及对照菌株的107个孢子接种入摇瓶，瓶中内含20毫升的预培养液，其中每升培养液含30克麦芽糖H2O；5克酵母提取物；10克水解的酪蛋白；1克KH2PO4；0.5克MgSO4·7H2O；0.03克ZnCl2；0.02克CaCl2；0.01克MnSO4·4H2O；0.3克FeSO4·7H2O；3克Tween80；10毫升青霉素(5000IU/毫升)/链霉素(5000UG/毫升)；pH5.5。这些培养物在34℃下生长20-24小时。将10毫升的培养物接种至100毫升黑曲霉发酵培养液，每升培养液中含70克麦芽糖糊精；25克水解的酪蛋白；12.5克酵母提取物；1克KH2PO4；2克K2SO4；0.5克MgSO4·7H2O；0.03克ZnCl2；0.02克CaCl2；0.01克MnSO4·4H2O；0.3克FeSO4·7H2O；10毫升青霉素(5000IU/毫升)/链霉素(5000UG/毫升)；用4N H2SO4调至pH5.6。这些培养物在34℃下生长约6天。将发酵培养液的样品离心(10分钟，5.000rpm，swingingbucket离心机)并收集上清液。
实施例2FYT2、FYT4及FYT6的热稳定性依据实施例1在摇瓶中生产FYT2、FYT4、FYT6以及野生型无花果曲霉植酸酶(EP 0 420 358)。以适当时间间隔取样并依据van.Engelen等.(Journal of AOAC International 1994，77760-764)描述的方法测定上清液中植酸酶的活性以追踪植酸酶的产生。活性用FTU表示，1FTU的酶量在测验条件下(pH＝5.5，温度37℃，5mM植酸钠)每分钟释出1μmol的无机正磷酸盐。测量上清液中酶的热稳定性。视需要，植酸酶上清液用超滤法进一步浓缩。
用三种不同方法测量热稳定性。首先，测定植酸酶的T50。T50(℃)为样品加热20分钟后丧失50％活性的温度。实验条件压力测验在250mMHAc/NaAc/Tween20，pH＝4.0下进行。植酸酶的剂量约0.6FTU/毫升。样品加热后立刻在冰上冷却。接着在250mM HAc/NaAc/Tween20，pH＝4.0中测量残余的植酸酶活性。结果如表1。FYT2及FYT4的热稳定性高约8-9℃。
表1各种植酸酶的热稳定性
其次，于加热期间测定植酸酶的活性。改变加热温度进行实验时，得到就生产力而言的酶的最适温度(Topt)。温育进行固定的30分钟时间。底物转换的量取决于酶的活性与此失活作用。因此优选使用术语生产力而非活性。实验条件250mM HAc/NaAc/Tween20 pH＝4.0，植酸酶剂量约0.012FTU/毫升。释出的磷酸盐可依上述的标准检测方法测量。结果如图3所示。FYT2与FYT4在75℃下就催化生产力而言最有效，而野生型对照则已完全丧失其催化活性。虽然在75℃以上活性开始减少，图3显示FYT2与FYT4在高达约85℃下仍有催化能力。FYT6的行为介于野生型和FYT2或FYT4之间。
第三，除了经由适当的活性分析测量耐热性之外，植酸酶的耐热性亦藉由测定植酸酶三维结构去折叠的温度而直接确定。伴随去折叠的加热效应可用差示扫描量热法(DSC)直接测量。DSC的实验条件250mMHAc/NaAc pH＝4.0，约5毫克/毫升植酸酶，加热速率为2.5℃/分钟。结果如表1所示。可以看出，就维持天然酶结构的温度而言，修饰的植酸酶FYT2及FYT4比野生型植酸酶高出约9℃。
实施例3FYT2、FYT4及FYT6的颗粒饲料成丸稳定性以二种颗粒饲料成丸模具，及由此以不同温度设置，测试FYT2、FYT4及FYT6培养物滤液。
所有颗粒由培养过滤物及需要量的玉米淀粉(C-凝胶，来自Cerestar)及水通过混合/揉合制成。参阅表2及3的湿混合物组成。混合及揉合后，混合物用Nica E-220挤压机压出并用Fuji Paudal QJ-400G球粒机制成球粒。得到的颗粒用Glatt GPCG 1.1流床干燥器干燥。颗粒活性介于2500至3000FTU/克。
表2RDS 05颗粒混合物的组成
表3RDS Al颗粒混合物的组成
在25kg饲科(成分依据表4)中混合250克颗粒，并在临测试前与225kg的相同配方混合。此25kg饲料用Collete MP90 planetary混合器混合10分钟。此2.5kg与225kg饲料在1200升Nauta混合器中混合。用混合物的样品确定颗粒饲料成丸稳定性。在混合器/调料器中由配料螺杆以600kg/小时速度加入此250kg混合物，在此处通过直接蒸汽注入将其加热至80℃。驻留时间约10-15秒，之后将热混合物推入成丸挤压器。测试中使用的模具为5/45mm(宽度/长度；RDS05)或3/65mm(宽度/长度；RDS Al)。小丸离开成丸挤压器时的温度为82-83℃(RDS 05)或91-93℃(RDSAl)。将小丸推落至冷却带上后，从带上取样进行稳定性测试。
表4用于RDS 05以及RDS Al颗粒饲料成丸试验的家禽饲料的组成
表5热稳定植酸酶(RDS 05)的成丸产率。热粉的温度为80℃。丸温度约达到82-83℃。产率以成丸前后使用标准植酸酶分析(van.Engelen etal，Journal of AOAC International 1994，77760-764)测量的活性为基础。
表6热稳定植酸酶(RDS 01)的成丸产率。热粉的温度为80℃。丸温度约达到92-93℃。产率测定结果如表5所示。
成丸测试显示在82℃下，相较于野生型，FYT2、FYT4以及FYT6的耐热性均有类似增加，在92℃下FYT2和FYT4的稳定性高于FYT6。
实施例4植酸酶的生化特性过滤发酵培养液后，从滤液纯化植酸酶，接着测定植酸酶比活性。用离子交换层析法或亲和层析法或此二方法的组合纯化植酸酶。
使用ConA(刀豆球素A)亲和基质(HiTrap Con A，AmershamPharmacia Biotech)进行糖基化植酸酶的亲和层析。在20mM Tris/0.5MNaCl/1mM MnCl2/1mM CaCl2/pH＝7.4中将植酸酶结合于柱上。在彻底清洗柱子之后用20mM Tris/0.5M NaCl/0.5M甲基-α-呋喃葡萄糖苷/pH＝7.4洗脱植酸酶。用20mM Tris pH＝8.5再生柱子。缓冲液pH用4N HCl调节。
使用阴离子交换剂(Resource Q，Amersham Pharmacia Biotech)进行离子交换层析。使用PD-10凝胶过滤柱去盐及改变缓冲液。用50mMTris，pH＝7.5平衡柱子。上样植酸酶样本后，使用0至1M梯度NaCl在50mM Tris pH＝7.5中洗脱植酸酶。
经E280测量确定纯化植酸酶的蛋白质含量，1毫克/毫升植酸酶相当于OD280，1cm＝0.938。1毫克/毫升FYT2、FYT4及FYT6的OD280，1cm分别相当于0.995、0.995及0.963。测定的活性以FTU表示，方法描述于vanEngelen et al.(Journal of AOAC International 1994，77760-764)中。
作为底物浓度的函数测量起始反应速率以确定植酸的Km值。试验混合物内含1.0、0.5、0.2、0.1、0.05、0.025、0.015mM植酸(在250mM NaAc缓冲液pH＝5.5中)。以15％TCA(1∶1)终止酶反应。混合0.6M H2SO4-2％抗坏血酸-0.5％钼酸铵与终止的反应混合物(1∶1)，混合物在50℃下温育20分钟，测量820nm的吸收(Wyss et al.Appl Env Microbiol 1999，65367-373)，因此测定释出的无机磷酸盐。结果见表7。
表7植酸酶使用植酸作为底物的催化性质
表7显示与野生型相比，所进行的修饰并未影响比活性和对植酸的高亲和性。
在不同pH值下测量从植酸释放磷酸盐的速率，测定植酸酶活性的pH依赖性。原则上除了变化pH外使用标准植酸酶分析试验。以pH＝5.6下的活性定为100％活性。使用下列缓冲液设定实验的pH250mM甘氨酸，pH范围为2.8至3.2；250mM NaAc，pH范围为3.6至5.6；250mM咪唑，pH范围为6至7以及250mM Tris，pH范围为7.5至9。此结果见图8。
表8植酸酶活性的pH依赖性。活性表示为pH＝5.6下观察到的最大活性(设定为100％)的百分比。
修饰的植酸酶的活性的pH依赖性与野生型的非常相似。尤其是，野生型植酸酶表现出的二个最适pH，这一性质得以维持。其中一个最适pH约为pH＝2.5，而第二个最适pH约为pH＝5.5。表8显示野生型黑曲霉植酸酶的此特定特性并未受到FYT2、FYT4及FYT6中的修饰的影响。
在250mM NaAc、pH＝5.5、37℃下，植酸酶降解植酸的进展曲线以时间函数记录。反应底物浓度为0.2mM植酸，植酸酶的剂量为0.05FTU/毫升。以15％TCA(1∶1)终止酶反应。混合1400微升0.3M H2SO4-1％抗坏血酸-0.27％钼酸铵与100微升的反应混合物，接着混合物在50℃下温育20分钟并测量820nm的吸收，从而测定释出的无机磷酸盐。结果见表9。
表9植酸酶降解植酸的进展曲线
结果显示修饰的植酸酶在自植酸释出磷酸盐方面与野生型植酸酶非常相似。一小时后进展曲线到达平台，约释出80-85％的磷酸盐。所有植酸酶到达此平台的速率相似，显示野生型植酸酶自植酸释放磷酸盐的功效在修饰的植酸酶中不受修饰的影响。
结论结果显示，相较于野生型植酸酶，FYT2、FYT4及FYT6中的修饰对催化性能不产生影响。结果显示避免任何展示于图1中的氨基酸(在底物周围7埃区域内的残基)的突变以及进一步地保留所述的额外的黑曲霉氨基酸即可保持野生型黑曲霉植酸酶的功能性质。
实施例5修饰的植酸酶的生物功效液体植酸酶的试验在颗粒饲料制成后以液体制剂形式将植酸酶加入颗粒饲料，之后将其用于生物功效测验中以比较新产生的耐热植酸酶。按加入的植酸酶活性将为100、200或300FTU/kg饲料的剂量应用这些酶进行测验，其中使用肉用仔鸡(5-33天)，喂食以玉米-大豆为基础的膳食(试验的前14天喂食一种膳食，后14天喂食一种稍微不同的膳食)。基础饮食中可吸收的磷含量为2.2克/kg饲料(第5-19天)以及1.7克/kg饲料(第19-33天)。这些数值远低于估计的动物需求量。对于每种处理，动物饲养于六层的鸡笼中，各笼内有14只动物(鸡)。使用Finney(1964Statistical methodin biological assay.Charles Griffin，London.)的方法，基于分析的植酸酶含量(FTU/kg)计算结果。体重结果见表10。
表10。根据分析的植酸酶活性计算在全部实验期间(5-33天)不同植酸酶(颗粒饲料制成后以液体形式应用的)与野生型(＝100％)相比对体重产生的相对功效。
表10
所有产品的回归线的斜率显著地偏离零。从表10可见，除FYT4以外，产品间几乎没有差异。喂食此酶的动物的表现虽不如喂食其它植酸酶的动物好，但在统计学上差异不显著。
颗粒状植酸酶的试验在形成颗粒饲料前加入颗粒饲料的颗粒制剂形式的耐热植酸酶通过测验进行比较。这意即在丸粒化过程中放入植酸酶。此试验中丸粒化以大约92℃的高温进行。因为该目标在于向动物的饲料中加入100、200或300FTU/kg，因此进行制粒前试验以估计此方法中活性的丧失，并且过剂量提供产品以便达成所述活性。用相似于液体产物试验的方法进行测验，使用肉用仔鸡(5-33天)喂食玉米大豆为基础的膳食(全部时期仅用一种膳食)，该膳食中可吸收的磷含量远低于这些动物的估计需要量(1.9克/kg饲料)。每种处理，动物笼养于六层鸡笼，各笼内有14只鸡。体重增量回归线的相对斜率见表11。
表11根据分析的植酸酶活性计算在全部实验期间(5-33天)不同植酸酶与野生型(＝100％)相比对体重增量的相对功效(除了野生型以液体制剂于制粒后加入颗粒饲料中外，其它均以颗粒施用)。
此试验中以植酸酶FYT2最好，其次FYT6、FYT4以及野生型。
实施例6植酸酶FYT2以及FYT6的单一突变制备以下单一突变，对于植酸酶FYT2而言为Y31F，A78E，G163R，G180A，G182S，A194V，L211T，A215S，P242S，E254K，Q269N，A414P，E428R及E440A，以及对于植酸酶FYT6而言为E440A。
在此方面将编码FYT-2(SEQ ID NO2)或FYT6(SEQ ID NO6)的基因用PCR扩增，其总体积为50μl、使用2.5UPwo聚合酶(Rochediagnostics，GmbH，Mannheim，Germany)、100ng DNA模板、0.5mMdNTP、1xPwo缓冲液、10pmol DSM-1 F以及10pmol DSM-1R，扩增条件为94℃下5分钟、30x(94℃30秒，60℃1秒，72℃2分钟)、72℃下5分钟。将扩增片段克隆入PCR-Blunt-TOPO(Invitrogen lifetechnologies，Carlsbad，CA，USA)载体并使用Stratagene(Stratagene，La Jolla，CA，USA)的QuickChange试剂盒，依据供货商的建议引入突变。
DSM-1F以及DSM-1R引物的序列如下DSM-1F 5′GGCAGTCCCCGCCTCGAGAAAT3’DSM-1R 5′GTCATCGCGATTAATTAATCTAAGCAAAACACTCCTCCCAGTT3′使用下列引物进行诱变，其中突变的密码子用粗字体表示。
突变引物对Y31F5’-GGTCAATACTCCCCGTTCTTCTCTCTGGCAGAC-3’5’-GTCTGCCAGAGAGAAGAACGGGGAGTATTGACC-3’A78E5’-TCCGCTCTCATTGAGGAGATCCAGAAGAACGCG-3’5’-CGCGTTCTTCTGGATCTCCTCAATGAGAGCGGA-3’G163R 5’-AAGCTGGCCGATCCTCGTGCCAACCCCGGCCAA-3’5’-TTGGCCGGGGTTGGCACGAGGATCGGCCAGCTT-3’G180A 5’-GTGATCATTCCCGAGGCCGCCGGCTACAACAAC-3’5-GTTGTTGTAGCCGGCGGCCTCGGGAATGATCAC-3’G182S 5’-ATTCCCGAGGGCGCCTCATACAACAACACTCTC-3’5’-GAGAGTGTTGTTGTATGAGGCGCCCTCGGGAAT-3’A194V 5’-CACGGCACCTGCACTGTCTTCGAAGAGAGCGAA-3’5’-TTCGCTCTCTTCGAAGACAGTGCAGGTGCCGTG-3’L211T 5’-GCCAATTTCACCGCCACGTTCGCCCCCGCCATT-3’5’-AATGGCGGGGGCGAACGTGGCGGTGAAATTGGC-3’A215S 5’-GCCCTGTTCGCCCCCTCCATTCGTGCCCGTCGT-3’5’-ACGACGGGCACGAATGGAGGGGGCGAACAGGGC-3’P242S 5’-CTCATGGACATGTGCTCCTTCGACACCGTCGCC-3’5’-GGCGACGGTGTCGAAGGAGCACATGTCCATGAG-3’E254K 5’-ACCTCCGACGCCACCAAGCTGTCCCCCTTCTGT-3’5’-ACAGAAGGGGGACAGCTTGGTGGCGTCGGAGGT-3’Q269N 5’-CATGACGAATGGATCAACTACGACTACCTCCAG-3’5’-CTGGAGGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTCATG-3’A414P 5’-CCGCTGCATGGGTGTCCGGTTGATAAGTTGGGG-3’5’-CCCCAACTTATCAACCGGACACCCATGCAGCGG-3’E428R 5’-CGGGATGACTTTGTGAGGGGGTTGAGCTTTGCT-3’5’-AGCAAAGCTCAACCCCCTCACAAAGTCATCCCG-3’
E440A5’-TCCGGGGGTAACTGGGCGGAGTGTTTTGCTTAG-3’5’-CTAAGCAAAACACTCCGCCCAGTTACCCCCGGA-3’用序列分析检查产生的植酸酶DNA片段的序列。将植酸酶序列克隆入pGBTOPFYTI以及如描述于实施例1中方法制备培养物上清液。
测定FYT2及FYT6的各种单突变的T50值(参阅实施例2)。此结果见表12。
表12植酸酶突变体的T50值
得到的大多数突变体显示其T50值与植酸酶FYT2的相当。出人意外地，内含所有单突变的组合的FYT6的T50值远低于各单突变的T50值。
序列表<110>巴斯福股份公司<120>修饰的植酸酶<130>20720WO<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>444<212>PRT<213>黑曲霉(ASPERGILLUS NIGER)成熟植酸酶<400>1Ala Ser Arg Asn Gln Ser Ser Cys Asp Thr Val Asp Gln Gly Tyr Gln1 5 10 15Cys Phe Ser Glu Thr Ser His Leu Trp Gly Gln Tyr Ala Pro Phe Phe20 25 30Ser Leu Ala Asn Glu Ser Val Ile Ser Pro Glu Val Pro Ala Gly Cys35 40 45Arg Val Thr Phe Ala Gln Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro50 55 60Thr Asp Ser Lys Gly Lys Lys Tyr Ser Ala Leu Ile Glu Glu Ile Gln65 70 75 80Gln Asn Ala Thr Thr Phe Asp Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr85 90 95Asn Tyr Ser Leu Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu Gln Glu100 105 110Leu Val Asn Ser Gly Ile Lys Phe Tyr Gln Arg Tyr Glu Ser Leu Thr115 120 125Arg Asn Ile Val Pro Phe Ile Arg Ser Ser Gly Ser Ser Arg Val Ile130 135 140Ala Ser Gly Lys Lys Phe Ile Glu Gly Phe Gln Ser Thr Lys Leu Lys145 150 155 160Asp Pro Arg Ala Gln Pro Gly Gln Ser Ser Pro Lys Ile Asp Val Val165 170 175
Ile Ser Glu Ala Ser Ser Ser Asn Asn Thr Leu Asp Pro Gly Thr Cys180 185190Thr Val Phe Glu Asp Ser Glu Leu Ala Asp Thr Val Glu Ala Asn Phe195 200 205Thr Ala Thr Phe Val Pro Ser Ile Arg Gln Arg Leu Glu Asn Asp Leu210 215 220Ser Gly Val Thr Leu Thr Asp Thr Glu Val Thr Tyr Leu Met Asp Met225 230 235 240Cys Ser Phe Asp Thr Ile Ser Thr Ser Thr Val Asp Thr Lys Leu Ser245 250 255Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Asp Glu Trp Ile Asn Tyr Asp Tyr260 265 270Leu Gln Ser Leu Lys Lys Tyr Tyr Gly His Gly Ala Gly Asn Pro Leu275 280 285Gly Pro Thr Gln Gly Val Gly Tyr Ala Asn Glu Leu Ile Ala Arg Leu290 295 300Thr His Ser Pro Val His Asp Asp Thr Ser Ser Asn His Thr Leu Asp305 310 315 320Ser Ser Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Phe325 330 335Ser His Asp Asn Gly Ile Ile Ser Ile Leu Phe Ala Leu Gly Leu Tyr340 345 350Asn Gly Thr Lys Pro Leu Ser Thr Thr Thr Val Glu Asn Ile Thr Gln355 360 365Thr Asp Gly Phe Ser Ser Ala Trp Thr Val Pro phe Ala Ser Arg Leu370 375 380Tyr Val Glu Met Met Gln Cys Gln Ala Glu Gln Glu Pro Leu Val Arg385 390 395 400Val Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Pro Val Asp405 410 415
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<400>2gcc tcg aga aat tcc cac agt tgc gat acg gtc gat ggc ggg tat caa48Ala Ser Arg Asn Ser His Ser Cys Asp Thr Val Asp Gly Gly Tyr Gln1 5 10 15tgc ttc ccc gag atc tcg cat ctt tgg ggt caa tac tcc ccg tac ttc96Cys Phe Pro Glu Ile Ser His Leu Trp Gly Gln Tyr Ser Pro Tyr Phe20 25 30tct ctg gca gac gaa tcg gcc atc tcc cct gac gtg ccc gcc gga tgc144Ser Leu Ala Asp Glu Ser Ala Ile Ser Pro Asp Val Pro Ala Gly Cys35 40 45aga gtc act ttc gtc cag gtc ctc tcc cgt cat gga gcg cgg tat ccg192Arg Val Thr Phe Val Gln Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro50 55 60acc gac tcc aag tcc aag aaa tac tcc gct ctc att gag gcc atc cag240Thr Asp Ser Lys Ser Lys Lys Tyr Ser Ala Leu Ile Glu Ala Ile Gln65 70 75 80aag aac gcg acc gcc ttt aag gga aaa tat gcc ttc ctg aag aca tac288Lys Asn Ala Thr Ala Phe Lys Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr85 90 95aac tac acc ttg ggt gca gat gac ctg act ccc ttc gga gaa cag cag336Asn Tyr Thr Leu Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu Gln Gln100 105 110atg gtc aac tcc ggc atc aag ttc tac cgc cgg tac aag gcc ctc gcc384Met Val Asn Ser Gly Ile Lys Phe Tyr Arg Arg Tyr Lys Ala Leu Ala115 120 125agg aac atc gtt cca ttc atc cga gcc tct ggc tcc agc cgc gtg atc432Arg Asn Ile Val Pro Phe Ile Arg Ala Ser Gly Ser Ser Arg Val Ile130 135 140gcc tcc gcc gag aaa ttc atc gag ggc ttc cag agc gcc aag ctg gcc480Ala Ser Ala Glu Lys Phe Ile Glu Gly Phe Gln Ser Ala Lys Leu Ala145 150 155 160gat cct ggc gcc aac ccc ggc caa gcc tcg ccc gtc atc gac gtg atc528Asp Pro Gly Ala Asn Pro Gly Gln Ala Ser Pro Val Ile Asp Val Ile
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<221>CDS<222>(1)..(1335)<223>
<400>6gcc tcg aga aat caa tcc agt tgc gat acg gtc gat ggc ggg tat caa48Ala Ser Arg Asn Gln Ser Ser Cys Asp Thr Val Asp Gly Gly Tyr Gln1 5 10 15tgc ttc ccc gag atc tcg cat ctt tgg ggt caa tac tcc ccg ttc ttc96Cys Phe Pro Glu Ile Ser His Leu Trp Gly Gln Tyr Ser Pro Phe Phe20 25 30tct ctg gca gac gaa tcg gcc atc tcc cct gac gtg ccc gcc gga tgc144Ser Leu Ala Asp Glu Ser Ala Ile Ser Pro Asp Val Pro Ala Gly Cys35 40 45aga gtc act ttc gtc cag gtc ctc tcc cgt cat gga gcg cgg tat ccg192Arg Val Thr Phe Val Gln Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro50 55 60acc gac tcc aag tcc aag aaa tac tcc gct ctc att gag gag atc cag240Thr Asp Ser Lys Ser Lys Lys Tyr Ser Ala Leu Ile Glu Glu Ile Gln65 70 75 80aag aac gcg acc gcc ttt aag gga aaa tat gcc ttc ctg aag aca tac288Lys Asn Ala Thr Ala Phe Lys Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr85 90 95aac tac acc ttg ggt gca gat gac ctg act ccc ttc gga gaa cag cag336Asn Tyr Thr Leu Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu Gln Gln100 105 110atg gtc aac tcc ggc atc aag ttc tac cgc cgg tac aag gcc ctc gcc384Met Val Asn Ser Gly Ile Lys Phe Tyr Arg Arg Tyr Lys Ala Leu Ala115 120 125agg aac atc gtt cca ttc atc cga gcc tct ggc tcc agc cgc gtg atc432Arg Asn Ile Val Pro Phe Ile Arg Ala Ser Gly Ser Ser Arg Val Ile130 135 140gcc tcc gcc gag aaa ttc atc gag ggc ttc cag agc gcc aag ctg gcc480Ala Ser Ala Glu Lys Phe Ile Glu Gly Phe Gln Ser Ala Lys Leu Ala145 150 155 160gat cct cgt gcc aac ccc ggc caa gcc tcg ccc gtc atc gac gtg atc528Asp Pro Arg Ala Asn Pro Gly Gln Ala Ser Pro Val Ile Asp Val Ile165 170 175att ccc gag gcc gcc tca tac aac aac act ctc gac cac ggc acc tgc576Ile Pro Glu Ala Ala Ser Tyr Asn Asn Thr Leu Asp His Gly Thr Cys180 185 190act gtc ttc gaa gag agc gaa ttg ggc gat gac gtc gaa gcc aat ttc624Thr Val Phe Glu Glu Ser Glu Leu Gly Asp Asp Val Glu Ala Asn Phe
195 200 205acc gcc acg ttc gcc ccc tcc att cgt gcc cgt ctg gag gcc cac ctg672Thr Ala Thr Phe Ala Pro Ser Ile Arg Ala Arg Leu Glu Ala His Leu210 215 220ccc ggt gtg act ctc aca gac gag gac gtg acc tac ctc atg gac atg720Pro Gly Val Thr Leu Thr Asp Glu Asp Val Thr Tyr Leu Met Asp Met225 230 235 240tgc tcc ttc gac acc gtc gcc cgc acc tcc gac gcc acc aag ctg tcc768Cys Ser Phe Asp Thr Val Ala Arg Thr Ser Asp Ala Thr Lys Leu Ser245 250 255ccc ttc tgt gac ctg ttc acc cat gac gaa tgg atc aac tac gac tac816Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Asp Glu Trp Ile Asn Tyr Asp Tyr260 265 270ctc cag tcc ttg aaa aag tat tac ggc cat ggt gca ggt aac ccg ctc864Leu Gln Ser Leu Lys Lys Tyr Tyr Gly His Gly Ala Gly Asn Pro Leu275 280 285ggc ccg gcc cag ggc gtc ggc ttc gct aac gag ctc atc gcc cgt ctg912Gly Pro Ala Gln Gly Val Gly Phe Ala Asn Glu Leu Ile Ala Arg Leu290 295 300acc cac tcg cct gtc cag gat cac acc agt acc aac cac act ttg gac960Thr His Ser Pro Val Gln Asp His Thr Ser Thr Asn His Thr Leu Asp305 310 315 320tcg aac ccg gct acc ttt ccg ctc aac gcc act ctc tac gcg gac ttt1 008Ser Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn Ala Thr Leu Tyr Ala Asp Phe325 330 335tcg cat gac aac ggc atg atc tcc att ttc ttt gct tta ggt ctg tac1056Ser His Asp Asn Gly Met Ile Ser Ile Phe Phe Ala Leu Gly Leu Tyr340 345 350aac ggc act aag ccg cta tct acc acg tcc gtg gag tcc atc gag gag1104Asn Gly Thr Lys Pro Leu Ser Thr Thr Ser Val Glu Ser Ile Glu Glu355 360 365aca gat gga tac tcg gcc tcc tgg acg gtt ccg ttt gct gcc cgt gcc1152Thr Asp Gly Tyr Ser Ala Ser Trp Thr Val Pro Phe Ala Ala Arg Ala370 375 380tac gtc gag atg atg cag tgt cag gcg gag aag gag ccg ctg gtc cgt1200Tyr Val Glu Met Met Gln Cys Gln Ala Glu Lys Glu Pro Leu Val Arg385 390 395 400gtc ttg gtt aat gat cgc gtt gtc ccg ctg cat ggg tgt ccg gtt gat124 8Val Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Pro Val Asp405 410 415aag ttg ggg aga tgt acc cgg gat gac ttt gtg agg ggg ttg agc ttt1296Lys Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Asp Phe Val Arg Gly Leu Ser Phe420 425 430gct aga tcc ggg ggt aac tgg gag gag tgt ttt gct tag1335Ala Arg Ser Gly Gly Asn Trp Glu Glu Cys Phe Ala435 440
<210>7<211>444<212>PRT<213>从SEQID 6产生的蛋白质<4 00>7Ala Ser Arg Asn Gln Ser Ser Cys Asp Thr Val Asp Gly Gly Tyr Gln1 5 10 15Cys Phe Pro Glu Ile Ser His Leu Trp Gly Gln Tyr Ser Pro Phe Phe20 25 30Ser Leu Ala Asp Glu Ser Ala Ile Ser Pro Asp Val Pro Ala Gly Cys35 40 45Arg Val Thr Phe Val Gln Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro50 55 60Thr Asp Ser Lys Ser Lys Lys Tyr Ser Ala Leu Ile Glu Glu Ile Gln65 70 75 80Lys Asn Ala Thr Ala Phe Lys Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr85 90 95Asn Tyr Thr Leu Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu Gln Gln100 105 110Met Val Asn Ser Gly Ile Lys Phe Tyr Arg Arg Tyr Lys Ala Leu Ala115 120 125Arg Asn Ile Val Pro Phe Ile Arg Ala Ser Gly Ser Ser Arg Val Ile130 135 140Ala Ser Ala Glu Lys Phe Ile Glu Gly Phe Gln Ser Ala Lys Leu Ala145 150 155 160Asp Pro Arg Ala Asn Pro Gly Gln Ala Ser Pro Val Ile Asp Val Ile165 170 175Ile Pro Glu Ala Ala Ser Tyr Asn Asn Thr Leu Asp His Gly Thr Cys180 185 190Thr Val Phe Glu Glu Ser Glu Leu Gly Asp Asp Val Glu Ala Asn Phe195 200 205Thr Ala Thr Phe Ala Pro Ser Ile Arg Ala Arg Leu Glu Ala His Leu210 215 220
Pro Gly Val Thr Leu Thr Asp Glu Asp Val Thr Tyr Leu Met Asp Met225 230 235 240Cys Ser Phe Asp Thr Val Ala Arg Thr Ser Asp Ala Thr Lys Leu Ser245 250 255Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Asp Glu TrpIle Asn Tyr Asp Tyr260 265270Leu Gln Ser Leu Lys Lys Tyr Tyr Gly His Gly Ala Gly Asn Pro Leu275 280 285Gly Pro Ala Gln Gly Val Gly Phe Ala Asn Glu Leu Ile Ala Arg Leu290 295 300Thr His Ser Pro Val Gln Asp His Thr Ser Thr Asn His Thr Leu Asp305 310 315 320Ser Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn Ala Thr Leu Tyr Ala Asp Phe325 330 335Ser His Asp Asn Gly Met Ile Ser Ile Phe Phe Ala Leu Gly Leu Tyr340 345 350Asn Gly Thr Lys Pro Leu Ser Thr Thr Ser Val Glu Ser Ile Glu Glu355 360 365Thr Asp Gly Tyr Ser Ala Ser Trp Thr Val Pro Phe Ala Ala Arg Ala370 375 380Tyr Val Glu Met Met Gln Cys Gln Ala Glu Lys Glu Pro Leu Val Arg385 390 395 400Val Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Pro Val Asp405 410 415Lys Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Asp Phe Val Arg Gly Leu Ser Phe420 425 430Ala Arg Ser Gly Gly Asn Trp Glu Glu Cys Phe Ala435 440
权利要求
1.一种多肽，当与模型植酸酶比对时，其与该模型植酸酶相比较在至少1个下列的位置上经修饰5，6，13，19，21，29，31，36，39，43，53，69，78，81，85，87，99，112，113，122，125，126，128，137，147，148，157，160，163，165，169，172，176，178，180，181，182，183，189，194，197，201，203，211，213，215，218，222，223，225，232，233，242，246，247，248，249，250，251，252，254，269，291，296，310，312，315，322，330，342，346，362，365，367，368，372，374，375，382，384，395，414，417，425，428，438，440。
2.如权利要求1的多肽，其包含至少一个下列的修饰5QS，6SH，13G，19P，21I，29S，31FY，36D，39A，43D，53V，69S，78EA，81K，85A，87K，99T，112Q，113M，122R，125K，126A，128A，137A，147A，148E，157A，160A，163RG，165N，169A，172V，176I，178P，180AG，181A，182STG，183Y，189H，194VA，197E，201G，203D，211TL，213A，215SA，218A，222A，223H，225P，232E，233D，242SP，246V，247A，248R，249T，250S，251D，252A，254KE，269NQ，291A，296F，310Q，312H，315T，322N，330A，342M，346F，362S，365S，367E，368E，372Y，374A，375S，382A，384A，395K，414PA，417K，425D，428RKE，438N，440AE。
3.如权利要求1的多肽，其包含至少一个下列的修饰5QS，6SH，13G，19P，21I，29S，31Y，36D，39A，43D，53V，69S，78A，81K，85A，87K，99T，112Q，113M，122R，125K，126A，128A，137A，147A，148E，157A，160A，163G，165N，169A，172V，176I，178P，180G，181A，182G，183Y，189H，194A，197E，201G，203D，211L，213A，215A，218A，222A，223H，225P，232E，233D，242P，246V，247A，248R，249T，250S，251D，252A，254E，269Q，291A，296F，310Q，312H，315T，322N，330A，342M，346F，362S，365S，367E，368E，372Y，374A，375S，382A，384A，395K，414A，417K，425D，428E，438N，440E。
4.一种多肽，当与模型植酸酶比对时，其与该模型植酸酶相比较在至少1个下列的位置上经修饰31，78，163，180，182，194，211，215，242，254，269，414，428，440。
5.如权利要求1至4中任一项的多肽，其中该模型植酸酶包含下述的氨基酸Q27，Y28，R58，H59，R62，P64，T65，S67，K68，Y72，D103，S140，R142，V143，E179，D188，F243，KN277，K278，H282，S337，H338，D339，N340，F380，A35，A46，N130，S141，G167，Q168，D174，T191，E199，E205，L220，T235，D244，I268，H306，G341，K356，A381。
6.如前述权利要求中任一项的多肽，其中该模型植酸酶包含下述的氨基酸Q27，Y28，R58，H59，G60，R62，Y63，P64，T65，DE66，S67，K68，K71，Y72，D103，S140，R142，V143，E179，D188，E196，D239，F243，G274，KN277，K278，H282，S337，H338，D339，N340，G341，V378，F380，A35，A46，N130，S141，G167，Q168，D174，T191，E199，E205，L220，T235，D244，I268，H306，G341，K356，A381。
7.如前述权利要求中任一项的多肽，其中该多肽含有至少一个下列的突变31Y，78A，163G，180G，182G，194A，211L，215A，242P，254E，269Q，414A，428E，440E。
8.如前述权利要求任一项的多肽，其中该模型植酸酶具有SEQ IDNO1的氨基酸序列。
9.如权利要求1的多肽，其为SEQ ID NO3、SEQ ID NO5或SEQIN NO7。
10.一种多肽，其与权利要求9的多肽具有至少91％，优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％或最优选至少99％的序列同源性(相同性)。
11.一种多核苷酸，其包含编码前述权利要求中任一项的多肽的多核苷酸序列。
12.如权利要求11的多核苷酸，其为DNA。
13.如权利要求11的多核苷酸，其包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
14.一种载体，其包含权利要求11至13项中任一项的多核苷酸序列。
15.如权利要求14的载体，其为表达载体，诸如其中编码多肽的多核苷酸序列可操作地连接至调控序列的表达载体。
16.一种宿主细胞，其以异源蛋白质形式表达权利要求1至10项中任一项的多肽。
17.一种宿主细胞，其经权利要求11至13中任一项的多核苷酸或权利要求14或15的载体转化。
18.一种制备权利要求1至10中任一项的多肽的方法，该方法包括在允许表达该多肽的条件下培养权利要求16或17的宿主细胞。
19.一种组合物，其包含权利要求1至10中任一项的多肽。
全文摘要
本发明描述修饰的植酸酶。相较于模型植酸酶，这些植酸酶在多个位置经过修饰，从而尤其使得修饰的植酸酶与模型植酸酶相比热稳定增加。此外，尤其由于修饰后的植酸酶保留着黑曲霉植酸酶的特定氨基酸残基，所以修饰的植酸酶仍保有黑曲霉植酸酶的有利性质。
文档编号C12N15/64GK1656217SQ03812470
公开日2005年8月17日 申请日期2003年5月28日 优先权日2002年5月30日
发明者范德尔 J·M·拉恩, S·C·H·J·蒂尔克 申请人:巴斯福股份公司