瓠瓜抗病毒病基因片段或基因标记及应用
【技术领域】
[0001] 本发明是利用抗病基因同源序列法，克隆瓠瓜抗病毒病基因片段或者将其转化为 分子标记等，主要涉及瓠瓜常规杂交育种，分子标记辅助育种，抗病毒病基因的定位和分子 作图，抗病毒病基因的克隆以及抗病基因的调控机理分析等方面，属于植物生物技术科学 领域。
【背景技术】
[0002] 瓠瓜是长江中下游重要的蔬菜作物之一。病毒病是瓠瓜生产上最重要的病害。主 要在定植初期发病，造成植株矮小，叶片皱缩，植株无法正常生长，严重时后期叶片枯黄或 死亡。成株期发病，叶片上呈现深绿色和浅绿色斑驳，往往植株顶部连续几张新叶发病，造 成植株生长缓慢。重病株上部叶片畸形皱缩，病株结瓜数减少，瓜面出现黑色小斑点且畸 形，失去商品性。主要表现为：①花叶型：在新抽的幼叶上症状最为明显，老熟叶片症状不 明显，主要表现为在新叶上出现黄绿相间的花叶症状，叶片成熟后变小、皱缩、边缘卷曲。在 果实上表现为瓜条出现深浅绿色相间的花斑，染病后瓜条生长缓慢甚至停止，畸形。发病严 重时，植株矮小，茎节间缩短，使植株萎蔫。②皱叶型：多出现在成株期，叶片出现皱缩，产生 暗绿色斑驳隆起，边缘难于开展，同时叶片变厚、叶色变浓，引起植株矮化。③蕨叶型：黄瓜 植株生长点新叶无法正常开展，而后变细皱缩成蕨叶状，叶缘向内卷曲，多变成鸡爪状，植 株生长点受到严重抑制，达不到正常的生长高度。病毒病影响了瓠瓜植株的正常的生长发 育过程，给生产带来极大的经济损失。抗病基因的利用及抗病育种是瓠瓜病害防治最有效 的方法。
[0003] 二十世纪四十年代，Flor提出了经典的"基因对基因"理论模型，即植物和病原 菌体内各自存在一个显性基因，植物抗病基因或病菌无毒性（Avr)基因的缺失或改变都能 引起病害的产生。这个模型适用于大多数活体营养型病原菌，包括病毒、细菌、真菌和线虫 类。"基因对基因"抗病性一般是受体被作为模型：植物抗病蛋白能够直接或间接的识别源 自病菌的Avr产物。一旦这种识别发生，就会引起防御反应。大多数抗病基因 （Resistance gene ;R)触发的抗性与快速防御反应相关，称为过敏性反应（hypersensitive response ; HR)。而目前，大多数抗病基因的产物都含有蛋白识别的结构域，如富含亮氨酸的重复单位 (LRR)的结构域或卷曲螺旋（CC)的结构域；信号转导结构域，如核苷酸结合部位（NBS)或 蛋白激酶（PK)结构域。一些抗病基因产物被预测为细胞质蛋白，而另一些通过一个跨膜结 构域（TM)贯穿细胞膜。这些结构域组合能够产生不同类型的R蛋白。根据结构的特性已 经鉴定出至少六种不同类型的 R 基因：1) NBS-LRR，2) LRR-TM-PK，3) LRR-TM，4) CC-TM，5) PK， 6)PK-PK。其中，NBS-LRR类抗病基因是植物体内存在的最大一类抗病基因；这些抗病基因 在结构上的保守性为我们利用抗病基因同源序列法克隆其他作物的抗病基因带来了潜在 可能。在已知分离获得的抗病基因中，小麦抗叶锈病基因 LrlO和马铃薯抗马铃薯X病毒基 因 Rx2就是利用抗病基因同源序列法克隆抗病基因的经典例子，说明利用该法克隆抗病基 因是可行的。
【发明内容】
[0004] 技术问题
[0005] 本发明的目的是利用抗病基因同源序列法快速鉴定瓠瓜病毒病基因片段或者将 其转化为分子标记。结果一方面可用于瓠瓜抗病毒病分子标记辅助选择育种，另一方面也 为抗病毒病基因的克隆提供参考依据。
[0006] 技术方案
[0007] 本发明前期对大量瓠瓜种质资源进行抗病性筛选，在获得1份高抗瓠瓜病毒病抗 病种质的基础上，应用抗病基因同源序列法克隆抗病毒病基因片段，通过与已知抗病基因 同源性及序列比对分析等方法确认；为开发相应的分子标记和利用cDNA末端快速扩增技 术获得抗病基因的全长奠定基础。
[0008] 为了实现上述目标，本发明采用抗病基因同源序列法对瓠瓜抗病毒病基因进行克 隆，获得了抗病毒病基因片段或者基因标记3个，片段大小分别为510bp，510bp和504bp。 以该基因片段序列为基础，开发相应的分子标记，可以进行瓠瓜抗病毒病分子标记辅助选 择育种；同时利用基因片段或者基因标记进行新的种质资源的创新；结合已有的分子标记 可以实现瓠瓜抗病毒病基因的分子作图；利用这些基因片段，通过设计基因特异引物，采用 cDNA末端快速扩增技术分离瓠瓜抗病毒病基因，为通过基因工程改良瓠瓜的抗病性奠定基 础；也为最终解析瓠瓜抗病毒病基因的分子机理提供了基因资源。
[0009] 本发明的积极效果：
[0010] 1)有利于快速开发与抗病基因紧密连锁的分子标记。通过鉴定的瓠瓜病毒病基 因，开发相应的共分离功能性标记（SNP、SCAR等），可以快速的用于抗病基因的分子标记辅 助选择，准确性高。
[0011] 2)缩短了瓠瓜抗病毒病基因的挖掘周期，有利于病毒病基因的快速鉴定。采用常 规方法（图位克隆、转座子标签等）挖掘抗白粉病基因不仅耗时耗力、效率低，且难以成功。 本发明基于抗病基因同源序列方法快速挖掘瓠瓜抗病毒病基因，不仅可以缩短时间，还可 以提高病毒病基因鉴定效率。
[0012] 3)有利于多抗性育种材料的创制。基于新鉴定的病毒病基因开发的功能性分子标 记，结合已经定位的其他抗病基因的分子标记，进行多抗性育种材料的创制，可以缩短育种 年限，提1?育种效率。
[0013] 4)为阐述瓠瓜抗病毒病分子机制奠定了基础。鉴定的瓠瓜抗病毒病基因，通过转 基因技术、RNAi、病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS)技术等研究 抗病毒病的分子机制提供了基因资源，有利于快速阐述瓠瓜抗病毒的作用机理。
【附图说明】
[0014] 图1是瓠瓜Al抗病毒病基因序列；
[0015] 图2是瓠瓜A2抗病毒病基因序列；
[0016] 图3是瓠瓜A4抗病毒病基因序列；
【具体实施方式】
[0017] 抗病基因的鉴定在作物抗病遗传理论研究和抗病品种选育中具有重要的作用。本 方法可以快速鉴定出瓠瓜抗病毒病基因。具体实施过程如下：
[0018] 1、DNA的提取：取适量的瓠瓜的幼嫩叶片硅胶干燥后研磨成粉状，用CTAB法提取 总基因组DNA。提取的DNA用紫外分光光度计检测，选取0D260/0D280值在1. 8?2. 0的样 品于-20 °C保存备用。
[0019] 2、抗病基因同源片段的扩增和克隆：根据已知的NBS-LRR型抗病基因的保守 区的氨基酸序列GG (L/I/V/M/S) GKTT和G (L/N) PL (A/T/S) (L/V)，设计了 1对简并引物： NBS15，-GKTT GGIGGIWSIGGIAARACIACG-3'和 NBS25，-GCIGCIIARIGGRTTICC-3 '。取 瓠瓜基因组DNA50ng为模板，按下列程序进行PCR扩增反应：94°C预变性3min ;94°C 30s， 55 °C 30s，72 °C 30s，共30个循环；最后72 °C延伸5min。PCR产物经琼脂糖胶电泳检测，切 下含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶块，用天根生物公司的胶回收试剂盒，按操作说明回收 纯化目的DNA片段，回收产物用pMD-18T CloningKit (TAKARA公司）连接。将连接产物转 至DH5 α感受态细胞，涂于含IPTG和X-Gal的LB固体培养基上（含100mg/LAMP)，37°C培 养过夜，挑取白色单菌落，通过PCR检测确定含有目的片段。筛选后随机选取10个克隆进 行测序（上海生工生物工程技术服务有限公司）。
[0020] 3、序列分析将测序结果去除PMD18-T载体，得到插入片段的DNA序列。用ORF finder分析这些序列的开放阅读框，然后通过互联网用BLAST软件（网址：http ://www. ncbi. nlm. nih. gov)与GenBank中登记的序列进行同源性比较，继而推断这些扩增产物是 否与已知的抗病基因相关。：
[0021] 以下是发明人给出的实施范例