，但不局限于这些范例。
[0022] 实施范例1 :
[0023] 我们和国外农业高校、科研院所合作，以优良亲本构建了瓠瓜的重组自交系群体， 含有165个单株；以这些单株为试验材料提取DNA，根据获得的抗病毒病基因序列设计特异 引物，进行PCR扩增，根据特异DNA片段在群体单株中分离情况，依据瓠瓜病毒病抗病性鉴 定结果，获得与瓠瓜抗病毒病紧密连锁的DNA片段。
[0024] 实施范例2 :
[0025] 在种质资源创制过程中，以感病亲本和抗病亲本杂交获得的后代个体为对象，提 取各自的基因组DNA，根据实施范例1获得的与病毒病基因紧密连锁的DNA片段设计引物， 对上述获得的瓠瓜基因组DNA进行PCR扩增，凡是扩增产物出现DNA特异片段的杂种材料， 抗病毒病杂种植株，或者是抗病毒病基因的携带者，这些材料科研进一步用于抗病品种培 育的亲本和育种种质，实现了分子标记辅助选择。
[0026] 实施范例3 :
[0027] 我们采用人工接种和田间接种鉴定相结合的方法，对上述的重组自交系群体进行 接种鉴定，根据实施范例1获得的与病毒病紧密连锁的DNA片段，设计特异引物，对上述单 株个体进行PCR扩增；结合广泛的分子标记如AFLP、SRAP等，分析这些标记在单株群体中的 分离情况，结合人工接种和田间接种鉴定结果，利用MAPMARKER软件进行瓠瓜抗病毒病基 因的分子作图，获得病毒病抗病区段的遗传图谱，为后续克隆抗病基因奠定基础。
[0028] 实施范例4 :
[0029] 应用北京天根公司RNA提取试剂盒提取抗病毒病亲本Al叶片总RNA，利用cDNA 合成试剂盒合成cDNA第一链；将实施范例1获得的瓠瓜抗病毒病基因片段DNA序列，设计 特异引物，结合cDNA末端快速扩增技术（RACE技术）试剂盒所带的引物相结合，分别进行 5' RACE和3' RACE PCR扩增，PCR产物分别在1 %的琼脂糖凝胶电泳获得5' RACE和3' RACE 全长序列。分别回收PCR产物，进行T克隆，获得全长序列后进行基因全长的连接；从而克 隆了瓠瓜抗病毒病基因全长，为通过基因工程改良瓠瓜品种的抗病性提供了基因资源。
【主权项】
1. 瓠瓜抗病毒病基因片段或者基因标记，其特征在于选自下列基因片段或者基因标记 之一： I GCGGGTATGG GGAAAACTAC CATTGCAAAA GCACTTTACA ATCAACTTTA TCACAACTTT 61 GAAGCCAAAT GTTTCCTTTC CAATATCAAA CAAACCTCCA ACCAACCCAA TGCCCTAATT 121 CACTTACAAC AACAACTCCT CTCTTCTATC ACAAAATCCA CCAACATCAA TCTCGAAAAC 181 GTCGACCGAG GAATCGCCGT GTTGCAAGAA AGACTTCGTC GCAAAAAGCT TCTTTTGATA 241 TTAGACGACG TAGACGAAAT AAGTCAGTTA AATGCACTAG CAAGAAGTCG TGAATGGTTC 301 GGTACAGGTA GTAGAATTAT CATAACAACT CGAGATCGAC ATTTACTAAA TCAGCTTGAA 361 GTAGACGGAC TTTGTTCCAT TGATGAAATG AATGACGCTG AAGCGCTCGA ACTCTTTAGT 421 TGGCATGCCT TCCGCAATAG TTATCCATCG GAAACTTTTC ATCCACTTTC GAAACTCGTT 481 GTCAATTATT GTCAAGGGTT CCCTCTAGCG I GCAGGCATGG GTAAAACTAC CATTGCAAAA GCACTTTACA ATCAACTTTA TCACAACTTT 61 GAAGCCAAAT GTTTCCTTTC CAATATCAAA CAAACCTCCA ACCGACCCAA TGCCCTAATT 121 CACTTACAAC AACAACTCCT CTCTTCTATC ACAAAATCCA CCAACATCAA TCTCGAAAAC 181 GTCGACCGAG GAATCGCCGT GTTGCAAGAA AGACTTCGTC GCAAAAAGCT TCTTTTGATA 241 TTAGACGACG TAGACGAAAT AAGTCAGTTA AATGCAATAG CAAGAAGTCG TGAATGGTTC 301 GGTTCAGGTA GTAGAATTAT CATAACAACT CGAGATCGAC ATTTACTAAA TCAGCTTGAA 361 GTAGACGGAC TTTGTTCCAT TGATGAAATG AATGACGCTG AAGCGCTCGA ACTCTTTAGT 421 TGGCATGCCT TCCGCAATAG TTATCCATCG GAAACTTTTC ATCCACTTTC GAAACTCGTT 481 GTCGATTATT GTAAAGGGTT TCCTCTAGTA I CCAGGTTCAG GTAAAACTAC GCTAGCACAT GAAATTTTAA AAAGAATCGT GGAGAGTAAG 61 TCATTTGATG AAGTGGTAAT GTCCACGGTC AGCCAAACAC CAGATGTGAA AAATATTCAA 121 GGACAACTAG CTGAAAAGCT GGGTTTGAAA CTCGAAGAAG AAACAATAGA AGGAAGGGCA 181 GTGATGCTAC AAAAGAGGTT GAAGGGGACG AAAAGTATCC TAGTTTTGTT GGATGATGTA 241 TGGGATTATG ATGAGTTGAA AAAAATAGGA CTTCCAAGTG TTAAATATCA CATAGGATGC 301 AAAACCTTGT TTACCTCTAG GGATAGACAT TTGTTCTCAA ATGAAATGTG CATCAATAAA 361 ATCTTTGAGA TAAAAGTTTT AGAAGAAGAT GAGTCGTGGA ATTTATTTGA GGCAACAATG 421 GGAGGTAAAA TAATTGATGA AGCATGTGAT CTGAAGCCTA CAGCTAGTCA AGTAGTAAGA 481 GAATGTCAAG GGCTCCCTCT AGCA。
2. 权利要求I所述快速鉴定瓠瓜病毒病的应用，包括： 1) 携带有上述3个基因的育种材料的创制或者新品种创制：利用权利1所给出的基因 源为亲本材料，在杂交、回交后代中，可以获得转育有病毒病抗性基因的育种材料。 2) 抗病毒病基础理论研究：对权利1的3个病毒病基因进行分子标记分析；对该基因 进行分子作图或者基因定位；对该基因进行克隆以及基因间互作分析。 3) 抗病毒病转基因研究：利用权利要求1所给出的3个基因进行转基因研究。
【专利摘要】本发明主要涉及到瓠瓜抗病毒病基因片段或基因标记及应用；主要是采用抗病基因同源序列法，快速分离瓠瓜抗病毒病基因片段或基因标记3个，通过测序，这些基因片段或基因标记的核苷酸长度分别为510bp、510bp、504bp。该发明有效的缩短了瓠瓜抗病毒病基因挖掘周期，有利于病毒病基因的快速鉴定；通过鉴定的病毒病基因开发相应的共分离功能性标记(SNP、SCAR等)，还可以快速的用于抗病毒病基因的分子标记辅助选择，准确性高；结合其它抗病基因分子标记可进行多抗性育种材料的创制，缩短育种年限，提高育种效率；为阐述瓠瓜抗病毒病基因分子机制奠定了基础。
【IPC分类】C12N15-29, C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104561029
【申请号】CN201310524812
【发明人】钱孝英, 钱春桃
【申请人】常熟市智林蔬果专业合作社
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月28日