专利名称：鸡白细胞介素18禽类疫苗免疫增强剂及应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术，涉及一种禽类疫苗的免疫增强剂，尤其涉及鸡白细胞介素18禽类疫苗免疫增强剂及其应用。
背景技术：
白细胞介素18(interleukin 18，IL-18)是Okamura等1995年首次从痤疮丙酸杆菌(Propioibacteriumacnes)和脂多糖联合处理过的中毒性休克小鼠肝脏提取液中分离并克隆出来的一种新型细胞因子，由于这种因子具有强烈的IFN-γ诱生能力，因此最初将其命名为IFN-γ诱生因子(IFN-γ inducingfactor，IGIF)。随后的研究进一步发现IL-18不仅能够诱生IFN-γ，而且具有多种生物学功能，如促进Th1细胞增殖，诱导GM-CSF、IL-2及TNF-α等Th1类细胞因子的产生，并促进T淋巴细胞的分化增殖，增强Fas介导的Th1型细胞的细胞毒性和NK细胞、CTL细胞的细胞毒作用等多种生物学功能，所以IL-18是一种多效细胞因子。1996年Usbio等以鼠IGIF为探针克隆了人IGIF的cDNA，随后，其他一些哺乳动物，如大鼠、猪、马、牛、羊、狗的IL-18也相继被成功克隆。但在这方面有关以鸡为代表的禽类IL-18研究却远远滞后于人及哺乳动物，原因有两个(1)对鸡细胞因子和调节基因结构知之甚少，而且至今未发现鸡CD4+Txibao的Th1和Th2的亚型存在；(2)鸡IL-18与哺乳动物IL-18的差异较大，并且IL-18具有很强的种属特异性，使得在哺乳动物细胞中使用的许多技术和方法都无法有效地应用于禽类IL-18的研究。
随着规模化集约化养禽业的迅速发展，目前我国已成为世界上最大的鸡蛋和鸡肉生产国。在养禽业的发展过程中，传染病的成功控制与否已成为制约养禽业发展的关键因素。同时某些人畜共患病如禽流感在给养禽业造成巨大损失的同时也严重危害着人类的健康，预防和控制家禽传染病的发生对于切断人畜共患病的传播，促进人类健康意义重大。疫苗接种是目前预防家禽传染病发生的主要手段，但是该方法并不能完全控制某些传染病的发生，集约化鸡场免疫失败时有发生，给养禽业造成巨大的经济损失。使用免疫增强剂是提高疫苗免疫效果、控制传染病发生的有效途径，但目前广泛使用的免疫增强剂为人工合成，价格昂贵，限制了其使用的范围，因此，研制一种廉价的禽类免疫增强剂势在必行。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种鸡白细胞介素18禽类疫苗免疫增强剂，是鸡白细胞介素18真核表达质粒(pCI-IL-18)的水溶液，其浓度为1-20μg/μl，该真核表达质粒为以pCI作为真核表达载体，含有SEQ No 1编码序列的白细胞介素-18(IL-18)基因的重组载体，该重组载体的保存号为CGMCCNo.1599，保存日期为2006年1月25日，该序列全长591个核苷酸，类型为核苷酸，拓扑结构为线型，链性为单链，全长为编码区。
直至2000年Kirsten Schenider等人才首次克隆到鸡IL-18 cDNA，目前对于鸡IL-18的研究比较滞后。本发明对鸡IL-18的分子生物学进行了研究，成功地克隆出鸡IL-18基因、构建了该基因的真核表达质粒，不仅有助于了解传染病包括免疫抑制性疾病的发病机制以及疫苗的免疫机制，而且对新型基因工程疫苗及新型禽用免疫增强剂的研制等都具有十分重要的理论和应用价值。
本发明真核表达质粒以pCI作为表达载体，除了带有CMV的早期启动子/增强子以外，还含有来源于β球蛋白基因的内含子序列，此序列的存在可明显增强基因的表达效率，比无此内含子序列等载体表达能力强10-40倍。
本发明公开了一种鸡白细胞介素18免疫增强剂的制备方法，步骤为1)鸡白细胞介素18的诱导方式、RNA的抽提及其cDNA全长的克隆；2)包含鸡白细胞介素18全长基因的表达质粒的构建；3)重组鸡白细胞介素18蛋白的获得方式；4)重组鸡白细胞介素18表达质粒及蛋白免疫增强剂的制备。
本发明提供的禽类疫苗免疫增强剂可应用于包括鸡传染性法氏囊病病毒DNA疫苗、传染性支气管炎病毒DNA疫苗、新城疫病毒DNA疫苗、传染性喉气管炎病毒DNA疫苗、禽流感病毒DNA疫苗、鸡贫血因子DNA疫苗、鸡球虫DNA疫苗等疫苗。
本发明提供的禽类疫苗的免疫增强剂还可以为含有上述真核表达质粒在真核细胞或动物体内所表达的鸡白细胞介素-18蛋白，鸡白细胞介素18蛋白所占重量比为1-20％。
该禽类疫苗的免疫增强剂可应用于鸡传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、禽流感病毒、鸡贫血因子、鸡球虫等弱毒疫苗、基因工程疫苗和DNA疫苗。
本发明提供的鸡白细胞真核表达质粒pCI-IL-18和重组鸡白细胞介素18蛋白作为禽类疫苗的免疫增强剂的优势表现在(1)真核表达系统生产的重组及白细胞介素18蛋白，不仅具有生物学活性，而且比其他的人工佐剂廉价；(2)能增强疫苗诱导机体的细胞免疫应答和体液免疫应答阿，延长免疫力和持续时间，也可减低疫苗的使用剂量，从而可降低成本；(3)鸡白细胞介素18具有天然抗病作用，可增强禽类对传染病的抵抗力。(4)本发明提供了一种鸡白细胞介素18诱生的方法，同时提供了鸡白细胞介素18作为免疫增强剂的制备方法，该方法制备简单、成本低廉、使用方便、便于推广应用。
图1本发明使用RT-PCR扩增出591bp的鸡白细胞介素-18基因的条带图。
图2本发明提供的鸡白细胞介素-18(IL-18)重组质粒T-IL-18的酶切鉴定图。
图3本发明提供的鸡白细胞介素-18(IL-18)重组质粒T-IL-18的构建图。
图4本发明使用RT-PCR扩增出鸡白细胞介素-18标码基因的条带图。
图5本发明提供的的鸡白细胞介素-18(IL-18)基因真核表达质粒pCI-IL-18酶切鉴定图。
图6本发明提供的鸡白细胞介素-18(IL-18)基因真核表达质粒pCI-IL-18的构建图。
图7本发明提供的鸡白细胞介素-18(IL-18)基因原核表达质粒pGEX-4T-2-IL-18的构建图。
图8本发明提供的鸡白细胞介素-18(IL-18)基因原核表达质粒pGEX-4T-2-IL-18的酶切鉴定图。
图9本发明提供的的鸡白细胞介素-18(IL-18)在Vero细胞中表达的SDS-PAGE和Western blot分析图。
图10本发明提供的鸡白细胞介素-18(IL-18)在原核细胞中表达的SDS-PAGE和Western blot分析图。
图11本发明采用MTT法对重组鸡白细胞介素-18(IL-18)活性的检测图。
图12本发明提供的的鸡白细胞介素-18(IL-18)蛋白增强鸡体的免疫功能数据图。
图13本发明提供的的鸡白细胞介素-18(IL-18)真核表达质粒增强鸡体的免疫功能数据图。
具体实施例方式
本发明结合实施例和附图作进一步的说明。
实施例1
本实施例描述了本发明提供的鸡白细胞介素-18(IL-18)基因的获得方法，包括以下步骤(1)鸡脾淋巴细胞悬液的制备无菌分离14日龄浙江地区品种萧山雏鸡新鲜脾脏，用组织研磨器研磨后加入无Ca2+、Mg2+的Hank’s液，1300g离心20min洗涤两次，再以RPMI1640培养液洗涤两次。用台盼蓝(1％Trypan blue)染色活细胞计数后，用RPMI1640(含有10％小牛血清、1％青霉素和1％链霉素)培养液将细胞稀释成一定浓度的单细胞悬液。
(2)RT-PCR合成鸡IL-18cDNA按筛选的体外诱导的IL-18最佳条件培养脾脏淋巴细胞，分别经终浓度为10μg/ml的LPS刺激5h，10h，24h，48h提取细胞，Trizol试剂盒一步法提取淋巴细胞总RNA。设计一对引物P1(5’-ATGAGCTGTGAAGAGATCG-3’)P2(5’-TCATAGGTTGTGCCTTTCA-3’)引物由上海生物工程有限公司合成。不同培养时间抽提的总RNA，分别用superscriptTMPreamplification System反转录试剂盒(可购自Gibco公司)进行反转录。反转录产物按Expand High Fidelity PCR System(可购自Gibco公司)进行PCR，经优化的循环条件为94℃预变性2min，94℃变性45s，52℃退火1min，72℃延伸45s，72℃延伸10min，共30个循环。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
结果表明鸡脾淋巴细胞经LPS刺激不同时间后，抽提总RNA进行RT-PCR，结果表明在LPS刺激10小时左右，即可扩增出大约600bp的特异性片段(参见附图1，附图1中1表示600bp大小的鸡IL-18基因条带；2表示DNA MarkerDL2000)，PCR产物回收后，直接克隆于pGEM-T easy Vector(可购自Promega公司)，将重组质粒命名为T-IL-18(参见附图2，附图2中1表示EcoR I单酶切重组质粒T-IL-18结果，2显示Not I单酶切重组质粒T-IL-18结果，3表示PCR鉴定结果，4表示DNA Marker)，用EcoR I和Not I分别进行单酶切，可见大小分别为3.0kb和600bp左右的条带，PCR鉴定能扩增出600bp左右的条带(参见附图2中3泳道)。
(3)鸡IL-18基因的克隆和序列获得低熔点胶回收目的片段，利用T-A克隆策略直接连接于pGEM-T easy Vector(参见附图3)，连接产物转化E.coli Dh5α感受态细胞，培养于含有Amp、IPTG和X-gal(均可购自Gibco公司)的LB平板，挑取白色菌落进行PCR鉴定和酶切鉴定。序列鉴定由上海博亚生物技术公司进行。
序列测定结果表明克隆的萧山鸡IL-18cDNA全长共591个核苷酸，编码196个氨基酸，其氨基酸序列参见SEQ No 1。
实施例2本实施例描述了鸡白细胞介素18(IL-18)基因真核表达质粒pCI-IL-18的获得方法，其步骤包括(1)鸡IL-18cDNA的扩增 在上述鸡IL-18基因的两端重新设计引物(全长共591bp，编码196个氨基酸)P3(5’-CGGAATTCATGAGCTGTGAAGAGATCG-3’)P4(5’-CCGTCGACTCATAGGTTGTGCCTTTCA-3’)引物两端分别引入酶切位点EcoR I(P3划线处)和SalI(P4划线处)，引物在上海博亚生物技术公司合成。以T-IL-18为模版，P3和P4为引物，按以下PCR循环程序扩增鸡IL-18的cDNA94℃预变性2min，94℃变性45s，55℃退火1min，72℃延伸45s，72℃延伸10min，共30个循环。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
(2)鸡白细胞介素18(IL-18)基因真核表达质粒pCI-IL-18的构建 低熔点胶回收591bp的鸡IL-18基因，EcoRI和SalI双酶切后，直接克隆入pCI的EcoRI和SalI多克隆位点处。
结果表明将包括591bp的鸡IL-18基因(参见附图4，附图4中1、2表示591bp的目的条带，3表示DNA Marker)克隆入pCI，构建成pCI-IL-18真核表达质粒(参见附图6)，EcoR I和SalI双酶切能切出4.0kb和600bp左右的条带，PCR能扩增出600bp的条带(参见附图5，附图5中1表示EcoRI和SalI双酶切的目的片段，2表示DNA Marker)。
(3)鸡白细胞介素18(IL-18)基因原核表达质粒pGEX-4T-2-IL-18的构建在上述鸡IL-18基因的两端重新设计引物(全长共591bp，编码196个氨基酸)P5(5’-CGCGGATCCGCCTTTTGTAAGGATAAAAC-3’)P6(5’-CCCCTCGAGTCATAGGTTGTGCCTTCATT-3’)引物两端分别引入BamHI(P5划线处)和XhoI(P6划线处)酶切位点，进行PCR。
引物在上海博亚生物技术公司合成。以T-IL-18为模版，P5和P6为引物，按以下PCR循环程序扩增鸡IL-18的cDNA94℃预变性2min，94℃变性45s，55℃退火1min，72℃延伸45s，72℃延伸10min，共30个循环。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
低熔点胶回收591bp的鸡IL-18基因，BamHI和XhoI双酶切后，直接克隆入pGEX-4T-2的BamHI和XhoI多克隆位点处。
结果表明将包括591bp的鸡IL-18基因(参见SEQ No 1)克隆入pGEX-4T-2，构建成pGEX-4T-2-IL-18原核表达质粒(见附图7)，BamHI和XhoI双酶切能切出4.0kb和600bp左右的条带，PCR能扩增出600bp的条带(见附图8，1是pGEX-4T-2空质粒，2和3pGEX-4T-2重组质粒BamHI/XhoI双酶切结果，4是PCR结果，5是DNA Marker)。
实施例3本实施例描述了重组鸡白细胞介素18(IL-18)蛋白的获得方法。包括以下步骤(1)鸡白细胞介素18(IL-18)基因真核表达质粒pCI-IL-18在哺乳动物Vero细胞中的表达脂质体介导鸡pCI-IL-18在哺乳动物Vero细胞中的表达的操作步骤如下在6孔细胞培养板上接种2×105个细胞于2ml含有胎牛血清的培养基；37℃5％CO2培养箱培养18-24h至40-60％的细胞汇合在Eppendorf管中准备一下液体Slolution A将8μg DNA稀释到100μl不含血清的OPTI-MEM I ReducedSerum Medium培养基(可购自Gibco公司)中；Solution B稀释10μl LipofectinReagent(可购自Life Technology公司)到100μl不含血清的OPTI-MEM IReduced Serum Medium培养基中。为了达到最佳转染的转染效果，DNA不能超过20μg/ml和Lipofectin Reagent不能超过200μg/ml；将Slolution A和Solution B轻轻混匀，室温放置10-15min，溶液可能会出现混浊，但不会影响随后的转染效果；用2ml不含血清的OPTI-MEM I Reduced Serum Medium培养基洗涤培养的Vero细胞，加0.8ml不含血清的OPTI-MEM I Reduced Serum Medium培养基到DNA-Lipofectin混合物种，混匀后，将混合物轻轻铺在Vero细胞上，在整个过程中不能加抗生素；37℃5％CO2培养箱培养6h；倾去DNA-Lipofectin混合物，加2ml含5％胎牛血清的OPTI-MEM I Reduced Serum Medium培养基继续培养48-72h，检测活性。表达产物进行SDS-PAGE电泳鉴定。
结果参见图9，重组质粒pCI-IL-18经纯化后，在脂质体的介导下转染Vero细胞72h后，收集细胞上清液和细胞裂解液，进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析，结果发现体外表达的重组鸡IL-18的分子量大小为19.5Kda(见附图9，左侧为SDS-PAGE电泳，右侧为Western blot分析。1表示蛋白marker；泳道2和5是pCI-ChIL-18-F转染的淋巴细胞沉积物；泳道4和7是pCI-ChIL-18-M转染的淋巴细胞沉积物；泳道3和5是pCI转染的对照细胞)。
(2)鸡白细胞介素18(IL-18)基因原核表达质粒pGEX-4T-2-IL-18大肠杆菌中的表达(1)ChIL-18融合蛋白的小量表达1)将pGEX-4T-2-ChIL-18阳性克隆以及对照组pGEX-4T-2接种于5ml含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基，置37℃摇床，以300rpm转速摇过夜。
2)将过夜的培养物以1∶100比例加入含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基，置37℃摇床，以250rpm转速培养。
3)待细菌生长至OD600＝0.4-1.0，加入IPTG，使终浓度为0.1mM-1mM。
4)28-37℃培养1h-5h，收集细菌。
5)5000×g，离心15min。
6)弃上清，用适量1×PBS重悬细菌沉淀。
7)5000×g离心15min，弃上清，完全除去培养液。
8)用200μl PBS重悬沉淀。用超声波裂解细菌，直至溶液变为半透明。
收集上清液与细菌沉渣一起进行SDS-PAGE，观察蛋白表达情况。
(2)SDS-PAGE及Western-blot分析融合蛋白表达情况结果参见图10，SDS-PAGE电泳和Western-blot分析，结果发现体外表达的重组融和鸡IL-18的分子量大小约为45Kda(附图10中，左侧为SDS-PAGE电泳，右侧为Western blot分析，1是蛋白marker，2和4是SDS-PAGE分析ChIL-18融合蛋白表达情况，3是pGEX-4T-2阴性对照，5和7western-blot分析ChIL-18融合蛋白表达，6是pGEX-4T-2阴性对照的western-blot分析)。
(3)重组鸡白细胞介素18活性的检测重组鸡IL-18活性检测按MTT法进行，将脾脏淋巴细胞稀释成8×106个/ml，加入10mg/L的ConA培养24h后，收集淋巴细胞，用PBS洗两次，再用含0.05mol/Lα-Metnylamannoside(可购自sigma公司)的RPMI 1640培养30min，PBS洗涤三次，重悬于RPMI 1640中，活细胞计数后，加入待检IL-18样品，每个样品重复5个重复孔，继续培养48小时，加入5g/L MTT溶液(可购自sigma公司)10μl，继续培养4小时，每孔加入10％SDS 100μl，反应2小时，测定λ＝570nm处的OD值的算术平均数表示。
结果参见附图11MTT法检测鸡IL-18活性结果表明在pCI-IL-18转染组的Vero细胞裂解液中检测到的IL-18活性明显高于ConA诱导的T淋巴细胞上清液；pCI-IL-18转染组的Vero细胞上清液中也能检测到IL-18活性，说明表达的鸡IL-18是分泌型蛋白；阴性对照组的细胞裂解液和细胞上清液均无特异性的IL-18活性(附图11中1表示ConA诱导的T淋巴细胞上清液；B pCI-IL-18转染Vero细胞后的上清液；C pCI-IL-18转染Vero细胞裂解物；D阴性对照；E pCI转染Vero细胞上清液；F pCI转染Vero细胞裂解物)。
实施例4本实施例描述了本发明提供的鸡白细胞介素18(IL-18)蛋白和鸡白细胞介素18真核表达质粒pCI-IL-18增强鸡体的免疫功能，进而增强了各种禽类疫苗的免疫效果和鸡体对各种病原的抵抗能力。这些禽类疫苗包括鸡传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、马立克氏病病毒、传染性喉气管炎病毒、禽流感病毒、鸡贫血因子、鸡球虫等弱毒疫苗、基因工程疫苗和DNA疫苗。
(1)鸡白细胞介素18(IL-18)蛋白增强了鸡体的免疫功能14日龄非免疫来杭鸡40只，共分两组，每组20只，即注射鸡白细胞介素18(IL-18)的蛋白组和正常对照组，各组鸡在注射后4周剖杀，无菌采集脾脏、胸腺、法氏囊、外周血液制成单淋巴细胞悬液，MTT法测定脾脏、胸腺、外周血液T淋巴细胞的增殖反应和法氏囊B细胞的增殖反应，并与正常对照组比较。取50μl上述制备的淋巴细胞分别加入50μl ConA溶液(40μl/ml)，5％CO2培养箱40℃培养48小时；上述培养物均加入10μl MTT(5mg/ml)，继续培养3小时后加入10％SDS-0.01％HCl溶液100μl，混匀，继续培养2小时后，以对照孔调零，测定λ＝570nm处的OD值，每个样品设5个重复孔。某个时间内的淋巴细胞增殖反应以5只鸡的OD570平均数表示。按方差分析法对细胞增殖反应数据进行统计学处理，显著水平为P＜0.05。
结果参见图12，在附图12中A表示注射鸡IL-18蛋白4周后的脾脏T淋巴细胞的增殖反应；B表示正常对照鸡(未注射鸡IL-18蛋白)4周后的脾脏T淋巴细胞的增殖反应；C表示注射鸡IL-18蛋白4周后的胸腺T淋巴细胞的增殖反应；D表示正常对照鸡(未注射鸡IL-18蛋白)4周后的胸腺T淋巴细胞的增殖反应；E表示注射鸡IL-18蛋白4周后的外周血液T淋巴细胞的增殖反应；F表示正常对照鸡(未注射鸡IL-18蛋白)4周后的外周血液T淋巴细胞的增殖反应；G表示注射鸡IL-18蛋白4周后的法氏囊B淋巴细胞的增殖反应；H表示正常对照鸡(未注射鸡IL-18蛋白)4周后的法氏囊B淋巴细胞的增殖反应。参见附图12鸡体注射鸡白细胞介素18(IL-18)的蛋白后的脾脏、胸腺、外周血液T淋巴细胞的增殖反应和法氏囊B细胞的增殖反应均显著高于正常对照组(P＜0.05)，说明鸡白细胞介素18(IL-18)蛋白具有增强鸡体免疫功能功的作用。因此，鸡白细胞介素18(IL-18)蛋白可以提高禽类弱毒疫苗、灭活疫苗和基因工程疫苗的苗裔效果，这些禽类疫苗包括鸡传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、马立克氏病病毒、传染性喉气管炎病毒、禽流感病毒、鸡贫血因子、鸡球虫等弱毒疫苗、基因工程疫苗和DNA疫苗。
(2)鸡白细胞介素18(IL-18)质粒增强了鸡体的免疫功能14日龄非免疫来杭鸡40只，共分两组，每组20只，即注射鸡白细胞介素18(IL-18)的质粒组和正常对照组，各组鸡在注射后4周剖杀，无菌采集脾脏、胸腺、法氏囊、外周血液制成单淋巴细胞悬液，MTT法测定脾脏、胸腺、外周血液T淋巴细胞的增殖反应和法氏囊B细胞的增殖反应，并与正常对照组比较。取50μl上述制备的淋巴细胞分别加入50μl ConA溶液(40μl/ml)，5％CO2培养箱40℃培养48小时；上述培养物均加入10μl MTT(5mg/ml)，继续培养3小时后加入10％SDS-0.01％HCl溶液100μl，混匀，继续培养2小时后，以对照孔调零，测定λ＝570nm处的OD值，每个样品设5个重复孔。某个时间内的淋巴细胞增殖反应以5只鸡的OD570平均数表示。按方差分析法对细胞增殖反应数据进行统计学处理，显著水平为P＜0.05。
结果参见附图13，附图13中A表示注射鸡IL-18质粒4周后的脾脏T淋巴细胞的增殖反应；B表示正常对照鸡(未注射鸡IL-18质粒)4周后的脾脏T淋巴细胞的增殖反应；C表示注射鸡IL-18质粒4周后的胸腺T淋巴细胞的增殖反应；D表示正常对照鸡(未注射鸡IL-18质粒)4周后的胸腺T淋巴细胞的增殖反应；E表示注射鸡IL-18质粒4周后的外周血液T淋巴细胞的增殖反应；F表示正常对照鸡(未注射鸡IL-18质粒)4周后的外周血液T淋巴细胞的增殖反应；G表示注射鸡IL-18质粒4周后的法氏囊B淋巴细胞的增殖反应；H表示正常对照鸡(未注射鸡IL-18质粒)4周后的法氏囊B淋巴细胞的增殖反应。参见附图13鸡体注射鸡白细胞介素18(IL-18)的质粒后的脾脏、胸腺、外周血液T淋巴细胞的增殖反应和法氏囊B细胞的增殖反应均显著高于正常对照组(P＜0.05)，说明鸡白细胞介素18(IL-18)质粒具有增强鸡体免疫功能功的作用。因此，鸡白细胞介素18(IL-18)蛋白可以提高禽类弱毒疫苗、灭活疫苗和基因工程疫苗的苗裔效果，这些禽类疫苗包括鸡传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、马立克氏病病毒、传染性喉气管炎病毒、禽流感病毒、鸡贫血因子、鸡球虫等弱毒疫苗、基因工程疫苗和DNA疫苗。
SEQ No 1<110>浙江大学<120>鸡白细胞介素18免疫增强剂的制备<130>1<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>591<212>DNA<213>脾脏<400>1atgagctgtg aagagatcgc tgtgtgtgca gtacggctta gagaaaacct ctgcctctat60tttgaagagc tggaatgcga tgccttttgt aaggataaaa ctatcaaacg attctttcga120aacgtcaata gccagttgct tgtggttcgt ccagatttaa acgtggcagc ttttgaagat180gtaacagatc aggaggtgaa atctggcagt ggaatgtact tcgacattca ctgttacaaa240accaccgcgc cttcagcagg gatgcctgtt gcattcagcg tccaggtaga agataagagt300tactacatgt gttgtgagaa agagcatggg aaaatggttg ttcgatttag ggaaggagaa360gttcccaaag acattcctgg tgaaagtaac atcatatttt tcaaaaagac atttacatct420tgcagctcca aggcttttaa gttcgagtac tcacttgaac aaggaatggt cttggccttt480gaggaagaag actccttaag aaaactaatt ttaaagaaac tgccgagaga agatgaagtt540gatgaaacca caaaattcgt aacaagtcat aatgaaaggc acaacctatg a 59权利要求
1.鸡白细胞介素18禽类疫苗免疫增强剂，其特征是它为鸡白细胞真核表达质粒的水溶液，其浓度为1～20μg/μl，该真核表达质粒含有SEQ No 1的编码序列的白细胞介素-18基因的重组载体，该重组载体的保存号为CGMCCNo.1599，该基因的长度为591个核苷酸，类型为核苷酸，拓扑结构为线型，链性为单链，全长为编码区。
2.根据权利要求1所述的鸡白细胞介素18禽类疫苗免疫增强剂，其特征是该真核表达质粒为以pCI作为真核表达载体，含有权利要求1所述的鸡白细胞真核表达质粒的水溶液。
3.根据权利要求1或2所述的鸡白细胞介素18禽类疫苗免疫增强剂，其特征是它含有所述的真核表达质粒在真核细胞或动物体内所表达的鸡白细胞介素18蛋白，鸡白细胞介素18所占重量比为1-20％。
4.根据权利要求1所述的鸡白细胞介素18禽类疫苗免疫增强剂在制备鸡传染性法氏囊病病毒DNA疫苗的免疫增强剂中应用。
5.根据权利要求1所述的鸡白细胞介素18禽类疫苗免疫增强剂在制备传染性支气管炎病毒DNA疫苗的免疫增强剂中应用。
6.根据权利要求1所述的鸡白细胞介素18禽类疫苗免疫增强剂在制备新城疫病毒DNA疫苗的免疫增强剂中应用。
7.根据权利要求1所述的鸡白细胞介素18禽类疫苗免疫增强剂在制备传染性喉气管炎病毒DNA疫苗的免疫增强剂中应用。
8.根据权利要求1所述的鸡白细胞介素18禽类疫苗免疫增强剂在制备禽流感病毒DNA疫苗的免疫增强剂中应用。
9.根据权利要求1所述的鸡白细胞介素18禽类疫苗免疫增强剂在制备鸡贫血因子DNA疫苗的免疫增强剂中应用。
10.根据权利要求1所述的鸡白细胞介素18禽类疫苗免疫增强剂在制备鸡球虫DNA疫苗的免疫增强剂中应用。
全文摘要
本发明提供一种鸡白细胞介素18免疫增强剂，为真核表达质粒的水溶液，其浓度为1－20μg/μl，该真核表达质粒为以pCI作为真核表达载体，含有SEQNo 1编码序列的白细胞的白细胞介素－18基因的重组载体。本发明提供的鸡白细胞真核表达质粒pCI－IL－18和重组鸡白细胞介素18蛋白作为禽类疫苗的免疫增强剂不仅具有生物学活性，而且比其他的人工佐剂廉价；能增强疫苗诱导机体的细胞免疫应答和体液免疫应答，延长免疫力和持续时间，也可减低疫苗的使用剂量，从而可降低成本；鸡白细胞介素18具有天然抗病作用，可增强禽类对传染病的抵抗力。
文档编号A61P31/20GK1861195SQ20061005023
公开日2006年11月15日 申请日期2006年4月10日 优先权日2006年4月10日
发明者于涟, 许健, 李龙, 由振强, 万旺军 申请人:浙江大学