一种内切葡聚糖酶及其编码基因与应用的制作方法

专利名称：：一种内切葡聚糖酶及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种内切葡聚糖酶及其编码基因与应用。技术背景纤维素是多个葡萄糖残基以P-1，4-糖苷键连接而成的多聚物，其基本重复单位为纤维二糖。天然纤维素的基本结构是由原纤维构成的微纤维束集合而成。原纤维是由15-40根有结晶区和非结晶区构成的纤维素分子长链所组成。纤维素的结晶部分是由纤维素分子进行非常整齐规划地折迭排列形成。在天然纤维素中，木质素和半纤维素形成牢固结合层，紧密地包围纤维素。纤维素主要是植物利用二氧化碳和水在太阳能作用下通过光合作用合成的地球上最丰富的可再生的生物质(biomass)资源。据报道，全球每年通过光合作用产生的纤维素高达1.55><109吨，其中89%尚未被人类禾ll用(DunlapC,ChiangGC.Utilizationandrecycleofagriculturewastesandresidues.ShulerML.BocaRaton,Florida.USA:CRCPressInc.1980.19)。纤维素酶是能将纤维素转化成葡萄糖的一系列酶的总称，包括三类酶即内切一卩一1,4一葡聚糖酶(endo-p-l,4-glucanase,EC3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase,又叫纤维二糖水解酶cellobiohydrolase,EC3.2丄91)禾卩卩一葡萄糖苷酶((3-glucosidase,EC3.2丄21)，这三种酶协同作用能将纤维素转化成葡萄糖。内切葡聚糖酶作用于纤维素长链分子的内部将长纤维切成短纤维，外切葡聚糖酶作用于纤维素分子的一端，以两个葡萄糖残基为单位进行切割生成纤维二糖，P—葡萄糖苷酶切割纤维二糖生成葡萄糖(TommeP，WarrenRAJ,GilkesNR.1995.Cellulosehydrolysisbybacteriaandfungi.Adv.Microbiol.Physiol"37:1-81.1995;BhatMK,BhatS.1997.Cellulosedegradingenzymesandtheirpotentialindustrialapplications.BiotechnologyAdvances,15:583-620)。葡萄糖可作为重要的工业原料生产酒精、丙酮等化工产品。纤维素的利用与转化对于解决世界能源危机、粮食和铜料短缺、环境污染等问题具有重要意义。纤维素酶可广泛应用于酿酒、饲料、食品、纺织、造纸等行业。如纤维素酶作为饲料添加剂可增加饲料的可消化性，减少排泄的粪便量。纤维素酶可取代浮石进行水牛仔裤的"石洗"处理，也可处理其它含纤维织物以降低粗糙度和增加光亮。纤维素酶可添加到洗漆剂中以提高洗涤剂的清洁能力(BhatMK.2000.Cellulasesandrelatedenzymesinbiotechnology.BiotechnologyAdvances,18:355-383)。由于纤维素酶的广泛用途以及针对不同的用途需要使用不同性质的纤维素酶，更由于纤维素酶的效率低、价格高而使以纤维素为原料生产燃料酒精的成本太高以至于无法真正实现产业化，因此，需要新的纤维素酶。纤维素酶属于糖基水解酶类(glycosylhydrolases),许多糖基水解酶由一个催化功能域和一个或更多个其它的功能域如碳水化合物结合组件(carbohydrate-bindingmodules,CBMs)组成，根据催化功能域的氨基酸序列相似性，糖基水解酶类被划分成不同的家族(families)(DaviesG.,HenrissatB.1995.Structuresandmechanismsofglycosylhydrolases.Structure3:853-859;HenrissatB.1991.Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities.Biochem.J.280:309-316;HenrissatB.,BairochA.1993Newfamiliesintheclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities.Biochem.J.293:781-788;HenrissatB.，BairochA.1996.Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases.Biochem.J.316:695-696)。根据Cazy服务器(server)(http:〃afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/)上所列糖基水解酶类的最新清单，目前糖基水解酶类有108个家族，纤维素酶分属于糖基水解酶类家族l、3、5、6、7、8、9、10、12、26、44、45、48、51、61、74。将未知的纤维素酶与己知的纤维素酶做序列同源性比较可对其进行分类。人类所克隆的大部分纤维素酶基因都是从纯培养的微生物中来的，但并不是自然界中所有微生物都是可以被分离、培养的，一般认为可培养的微生物种类只占自然界中微生物种类的1%(AmannRI，LudwigW，SchleiferKH.1995.Phylogeneticidentificationandinsitudetectionofindividualmicrobialcellswithoutcultivation.Microbiol.Rev.59:143-169)，那么剩余的99%的不可培养的微生物中蕴藏着大量的基因资源。近年来从环境样品未培养微生物提取基因组DNA然后构建混合基因组DNA文库以分离基因已是成熟技术(LorenzP,SchleperC.2002.Metagenome-achallengingsourceofenzymediscovery.JournalofMolecularCatalysisB:Enzymatic19-20:13-19)。目前世界上已克隆得到来源于不同环境的未培养微生物的纤维素酶基因，其中包括Healy等(HealyFG，RayRM,AldrichHC，WilkieAC,IngramLOand.ShanmugamKT.1995.Directisolationoffunctionalgenesencodingcellulasesfromthemicrobialconsortiainathermophilic,anaerobicdigestermaintainedonlignocellulose..ApplMicrobiolBiotechnol.43:667-74.)报道从厌氧高温木头堆里克隆到了一个纤维素酶基因；Rees等(ReesHC,GrantS，JonesB,GrantWD,HeaphyS.2003.DetectingcellulaseandesteraseenzymeactivitiesencodedbynovelgenespresentinenvironmentalDNAlibraries.Extremophiles.7(5):415-421)报道从湖水和湖床沉积物未培养微生物中克隆到2个纤维素酶基因CRATCEL和HKCEL，Voget等(VogetS，LeggewieC,UesbeckA，RaaschC，JaegerKE,StreitWR.2003.Prospectingfornovelbiocatalystsinasoilmetagenome.ApplEnvironMicrobiol"69(10):6235-6242;VogetS,SteeleHL,andStreitWR.2006.Characterizationofametagenome-derivedhalotolerantcellulase丄Biotechnol.126:26-36)报道从土壤未培养微生物中克隆到3个纤维素酶基因gnuB、uvs080和ce/5A;Ferrer等(FerrerM,GolyshinaOV,ChernikovaTN,KhachaneAN,Reyes-DuarteD,SantosVA,StromplC，ElboroughK,JarvisQNeefA,YakimovMM,TimmisKN,andGolyshinPN.2005.Novelhydrolasediversityretrievedfromametagenomiclibraryofbovinerumenmicroflora.EnvironMicrobiol.7:1996-2010)从牛瘤胃未培养微生物中鉴定了9个纤维素酶基因。Feng等(FengY,DuanCJ,PangH,MoXC,WuCF,YuY,HuYL,WeiJ,TangJL,andFengJX.2007.Cloningandidentificationofnovelcellulasegenesfromunculturedmicroorganismsinrabbitcecumandcharacterizationoftheexpressedcellulases.Appl.Microbiol.Biotechnol.75:319-328)从兔子盲肠未培养微生物中克隆和鉴定了11个纤维素酶基因。这些来源于未培养微生物宏基因组的纤维素酶基因从序列上来说都是新的，说明宏基因组方法是得到新基因的好方法。反刍动物的瘤胃是纤维素降解的主要场所，植物的纤维状物质是由共生于瘤胃的纤维素降解微生物来完成的。瘤胃微生物包括有真菌、细菌、原生动物和古细菌。目前研究认为瘤胃中有85%的微生物是未培养的(KmuseDO,DenmanSE，MackieRI,MorrisonM,RaeAL,AttwoodGT,andMcSweeneyCS,2003.Opportunitiestoimprovefiberdegradationintherumen:microbiology,ecology,andgenomics.FEMSMicrobiolRev27:663-693)，可以推测这些未培养微生物中一定含有大量的基因资源如纤维素酶基因资源，通过构建水牛瘤胃未培养微生物的宏基因组DNA文库，极有可能从中筛选得到比目前已知的最好的纤维素酶还要好的酶的基因。
发明内容本发明的目的是提供一种内切葡聚糖酶及其编码基因与应用。本发明所提供的内切葡聚糖酶，名称为Umcd5E，来源于水牛瘤胃未培养细菌，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)自序列表中的SEQID的氨基端第28-546位氨基酸残基序列；2)将自序列表中的SEQIDW2.2的氨基端第28-546位氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质。其中，序列表中的序列2由546个氨基酸残基组成。自N端的第1一20位氨基酸为信号肽(signalp印tide)，自N端的第40_334位氨基酸为家族5糖基水解酶(glycosylhydrolase)功能域。Umcel5E同来源于瘤胃未培养微生物的内切葡聚糖酶(GenBank索引号ABX76045)的同源性最高，两者的相似性为79%、相同性为67%。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。为了使(a)中的Umcel5E便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。表l.标签的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>上述(b)中的Umcel5E可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的Umcel5E的编码基因可通过将序列表中SEQIDWs:1的自5'端第206-1762位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个编码氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。为了便于蛋白的分泌表达，还可在所述Umcel5E的氨基末端添加上信号肽序列。如添加由序列表中2的自氨基末端第1至20位氨基酸残基组成的多肽，得到由序列表中2所示的氨基酸序列组成的蛋白。上述内切葡聚糖酶编码基因(wmce/5E)也属于本发明的保护范围。上述内切葡聚糖酶的基因组基因，可具有下述核苷酸序列之一1)自序列表中SEQIDW2:1的5'端第206-1762位核苷酸序列；2)序列表中SEQIDWe:l的核苷酸序列；3)编码序列表中SEQIDW:2蛋白质序列的多核苷酸；4)在高严谨条件下可与序列表中SEQIDW:1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。上述高严谨条件可为在0.1xSSPE(或O.lxSSC)，0.P/。SDS的溶液中，在65°C下杂交并洗膜。其中，序列表中的SEQIDW:1由2273个脱氧核苷酸组成，自5'端的第125至1765位核苷酸为"mce/5E的开放阅读框(OpenReadingFrame,ORF),自5'端的第125—127位核苷酸为画ce/5E基因的起始密码子ATG,自5'端的第1763—1765位核苷酸为wmce/5E基因的终止密码子TAA，序列表中序列1编码序列表中序列2的核苷酸序列。自序列表中SEQIDM:1的5'端第206-1762位核苷酸序列编码自序列表中的SEQIDJV2.2的氨基端第28-546位氨基酸残基序列。含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。本发明通过构建水牛瘤胃未培养微生物的宏基因组DNA文库和文库克隆的内切葡聚糖酶活性平板检测筛选法，得到了新的内切葡聚糖酶基因，该内切葡聚糖酶基因可在宿主细胞中大量表达该基因以生产该内切葡聚糖酶，用于纤维素的降解，实验证明本发明的内切葡聚糖酶具有很高的羧甲基纤维素酶活性(达36780u/g)，而且该酶适宜的pH值范围和温度范围非常广。本发明所提供内切葡聚糖酶及其编码基因可广泛应用于纤维素的降解。图1为从水牛瘤胃内容物样品中提取的未培养微生物的宏基因组DNA。图2为水牛瘤胃未培养微生物基因文库克隆的限制性内切酶5"mHI酶切分析图。图3为瘤胃未培养微生物基因文库中表达内切葡聚糖酶活性克隆的筛选，阳性克隆EPI100/pGXNC67所在的平板图。图4为能降解羧甲基纤维素的文库克隆质粒pGXNC67的^mHI酶切带型。图5为初筛获得的重组质粒pGXNC67转化大肠杆菌后得到的转化子对羧甲基纤维素降解水解圈照片。图6为表达质粒pET-umcel5E重组质粒经BamHI和双酶切后电泳图。图7为重组大肠杆菌RosettaTM(DE3)/pET-umcel5E和大肠杆菌RosettaTM(DE3)/pET-30a羧甲基纤维素降解检测。图8訓ce/M基因的表达、表达产物Umcel5E的纯化及活性胶检测。图9Umcel5E在不同pH值条件下的酶相对活力曲线。图10Umcel5E在不同温度条件下的酶相对活力曲线。图11Umcd5E的pH耐受性检测结果。图12Umcel5E的温度耐受性检测结果。具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。在本发明的实施例中所用到的材料包括大肠杆菌(^^c力en'c力^CW力株系EPI100(购自Epicentre公司)；表达菌株Rosetta(DE3)(购自Novagen公司)；柯斯质粒载体pWEB::TNC(购自Epicentre公司)；文库制备试剂盒(购自Epicentre公司，pWEB::TNCcosmidcloningkit,目录号WEBC931);表达载体pET-30a(购自Novagen公司)；限制性内切酶、修饰酶、聚合酶及羧甲基纤维素(Carboxymethylcellulose,CMC)等试剂购自Promega、TAKARA、SIGMA或MBI。实施例l、内切葡聚糖酶Umcel5E及其编码基因的获得一、水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库的构建1、水牛瘤胃未培养微生物宏基因组的提取取50g水牛瘤胃内容物(样品的来源为南宁市肉联厂刚屠宰的水牛的瘤胃，采集的样品立即用液氮保存)，悬浮在200ml的0.18M磷酸钾缓冲液(p朋.5)中，轻轻震荡均匀，放置10分钟，让瘤胃内容物中的纤维素颗粒自动沉淀，弃上清液，再加入200ml的0.18M磷酸钾缓冲液(p朋.5)洗沉淀块两次，最后一次的沉淀块用直接提取法提取吸附于纤维素颗粒的微生物的宏基因组DNA。在沉淀块中加入100ml提取缓冲液(100mMsodiumphosphatepH8.0;100mMTirs誦HClpH8.0;100mMEDTApH8.0;1.5MNaCl;1%CTAB;2。/。SDS)混合均匀，在液氮和65。C水浴中反复冻融三次后，加入2ml的溶菌酶(20mg/ml)溶液(溶菌酶终浓度为0.4mg/ml)37"水浴1小时，期间每IO分钟颠倒混匀一次，然后加入2ml的蛋白酶K(50mg/ml)溶液(蛋白酶K终浓度为lmg/ml)37。C水浴1小时，期间每10分钟颠倒混匀一次。加入40mlPVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮，polyvinylpolypyrrolidone)溶液(购自Sigma公司，目录号P-6755)(PVPP溶液:每100mgPVPP与lml0.18M磷酸钾缓冲液(pH7.2)混匀)，振荡30秒，再加入2ml3MCaCl2溶液，振荡30秒后，在BeckmanCoulterAvantiJ-E离心机(购自BeckmanCoulter公司，目录号369003)JA-10转头用8,000g室温离心20分钟，上清液转移到另一个干净的离心管。在沉淀物中再加入100ml提取缓冲液，混合均匀，在65。C放置60分钟，期间每10分钟颠倒混匀一次，8,000g离心20分钟，合并两次的上清液。在上清液中加入等量的氯仿，上下颠倒离心管混匀，8,000g离心10分钟，取上清入另一个离心管，加入0.6倍体积的异丙醇，充分混匀后即见DNA絮状沉淀析出，用灭菌的Tip头挑出絮状DNA，用70%乙醇洗两次，于室温中晾干，用5mlTE溶解。2、水牛瘤胃未培养微生物宏基因组的纯化获得30kb以上的DNA将DNA粗提物加到S印hadexG200(购自Pharmacia公司，目录号17-0080-01)的层析柱(200mmX10mm，含有2XPVPP(购自Sigma公司，目录号P-6755)上，用TE缓冲液洗脱，按每组分lml分段收集洗脱液，每一组分加入100)^1的3M醋酸钠溶液(pH5.2)及lml异丙醇沉淀DNA，把沉淀物溶于TE中，合并所得DNA溶液，0.7%琼脂糖凝胶电泳后切下含30kb以上的DNA的凝胶，用电洗脱法回收纯化DNA，回收纯化的DNA电泳图如图1所示，其中泳道1为ADNA(48.5kb);泳道2为入DNA用EcoRI酶切(片段大小从大到小依次为:21.2kb，7.4kb，5.8kb，5.6kb，4.9kb，3.5kb);泳道3为从水牛瘤胃内容物提取的DNA粗提物；泳道4为经过S印hadexG-200凝胶初步纯化的DNA;泳道5为经过电洗脱法回收得到的30kb以上的DNA。3、纯化获得30kb以上的水牛瘤胃未培养微生物宏基因组的末端补平为了用上述电洗脱法回收纯化的DNA制作基因文库，首先对这些DNA进行末端补平，以产生平头末端而和文库制备试剂盒(购自Epicentre公司的文库制备试剂盒pWEB::TNCcosmidcloningkit,目录号WEBC931)中已处理好的同样具平头末端的pWEB::TNC载体相连，具体方法为依次在冰上向一个新的灭过菌的微量离心管中加入6^1IOX末端修补缓冲液(330mMTris—醋酸(pH7.8)，660mM醋酸钾，IOO函醋酸镁，5raMDTT)，6|al2.5函dNTP混合物(每种dnNTP2.5raM)，6|^110mMATP，10ug30kb以上的DNA，2^1末端修补酶混合物(T4DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶)(购自Epicentre公司的文库制备试剂盒pWEB::TNCcosmidcloningkit,目录号WEBC931)，加灭菌的去离子水补充到总体积60ul。25。C下放置45分钟，再转移到7(TC水浴锅放置10分钟以终止酶反应，1.0%低熔点琼脂糖凝胶电泳后切下含30kb—45kb的DNA的凝胶进行DNA回收。4、末端补平后的水牛瘤胃未培养微生物宏基因组与pWEB::TNC的连接反应将上述末端补平后回收的DNA片段与文库制备试剂盒中已处理好的具平头末端的pWEB::TNC载体在T4DNA连接酶的作用下连接起来，具体方法为依次在冰上向一个新的灭过菌的微量离心管中加入12jil无菌水，2[llIO倍快速连接缓冲液(10XFast-LinkLigationBuffer),lpllOraMATP,pWEB::TNC载体(O,5fig),3pl低熔点琼脂糖凝胶回收的30kb—45kb的DNA(0.1，快速连接DNA连接酶(Fast-LinkDNALigase，2单位/fil)(购自Epicentre公司的文库制备试剂盒pWEB::TNCcosmidcloningkit,目录号WEBC931)，混匀后在25。C下放置2个小时，再在70'C放置10分钟以终止酶反应。5、水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库的获得及质量检验连接反应产物用人包装蛋白包装，具体方法为将在冰上刚刚溶化的入包装提取物(购自Epicentre公司的文库制备试剂盒pWEB::TNCcosmidcloningkit,目录号WEBC931)的一个组分，总共50ul/管)25jil立即转移到一个新的灭过菌的微量离心管中并快速置于冰上，再往其中加入IOpl连接反应产物，充分混匀后置于30°C90分钟后，再往其中加入另外25pl溶化的X包装提取物，充分混匀后置于3CTC90分钟，向其中加入500iil噬菌体稀释缓冲液(10mMTris-HC1(pH8.3),100mMNaCl,10mMMgCl2)，得到560nl包装反应产物。再将上述得到的560^1包装反应产物加入到5.6mL的OD,二l.0的宿主大肠杆菌EPI100培养液(培养基为LB(每升含胰蛋白胨(Oxoid)，10g;酵母浸出粉(Difco)，5g;NaCl，5g;pH7.0)+10mMMgS04)中，25。C下放置20分钟让上述得到的包装的X噬菌体吸附和侵染宿主细胞f.co"EPIIOO，在含氨苄青霉素(终浓度为100ug/mL)和氯霉素(终浓度为12ug/ul)的LA平板(每升含胰蛋白胨(Oxoid)，10g;酵母浸出粉(Difco)，5g;NaCl，5g;琼脂粉，15g，pH7.0)上筛选转导子。结果共获得约15，000个转导子，任意提取14个克隆的质粒DNA,限制性内切酶^mH工酶切后用0.7%琼脂糖凝胶进行电泳分析，结果所有质粒除都有一个5.8kb的载体片段外，都含有插入片段，且没有发现有两个质粒具有相同的酶切带型，酶切结果如图2所示，其中泳道1为入DNA用fcoRI酶切片段(片段大小从大到小依次为21.2kb，7.4kb，5.8kb，5.6kb，4.9kb，3.5kb);泳道2为lkbladder(片段大小从大到小依次为10.Okb，8.Okb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb，2.5kb，2.0kb，1.5kb);其它泳道分别为使用限制性内切酶万a/rfil酶切的文库克隆质粒。结果表明文库含有非常随机的插入DNA片段，插入片段最大的为42kb，最小的为22kb,平均大小为35kb。说明文库的克隆容量也是相当大的，文库的质量相当好。二、内切葡聚糖酶及其编码基因(咖c^5E)的获得1、从水牛瘤胃未培养微生物的宏基因组文库中筛选表达内切葡聚糖酶活性的克隆用平板影印法将步骤一中在含氨苄青霉素和氯霉素的LA平板上得到的文库(每平板约200个菌落左右)分别影印到含0.5%羧甲基纤维素(carboxylmethylcellulose，CMC)(购自Sigma公司，目录号C-5678)、氨节青霉素(终浓度100ng/mL)和氯霉素(终浓度12ug/ml)的LA平板上，将平板倒置于37'C培养箱培养36小时后，将培养好的含羧甲基纤维素的LA平板用质量百分含量为0.5%刚果红溶液染色15分钟，用1M的NaCl溶液脱色15分钟，然后检测菌落周围有无水解圈。结果如图3所示，箭头所指的菌落为周围有水解圈的克隆。结果表明筛选到l个菌落周围有水解圈的克隆(EPI100/pGXNC67)，进一步提取该克隆的质粒DNA并将其命名为pGXNC67,用限制性内切酶&MlI完全酶切pGXNC67后，进行0.7%琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图4所示，pGXNC67除有一个5.8kb的载体片段外，还有另外2条"3/sHI片段，大小分别为21.0kb和18kb。结果表明pGXNC67含有39kb的插入片段。其中，图4中，泳道l为A用v5boRI酶切后的片段(片段大小从大到小依次为21.2kb，7.4kb，5.8kb，5.6kb，4,9kb，3.5kb);泳道2为lkbladder(片段大小从大到小依次为10.0kb，8.0kb，6.0kb，5,0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb，2.5kb，2.0kb，1.5kb，lkb);泳道3为pGXNC67的"3^1酶切产物(从上至下分别为21.0kb和18kb)。为了证实pGXNC67的插入片段确实含有内切葡聚糖酶基因，用pGXNC67质粒DNA和空载体pWEB::TNC分别转化Ecoh'EPI100，在含氨苄青霉素(100ug/raL)的LA平板上筛选转化子，随机挑取由每个质粒转化得到的10个转化子点接到含质量百分含量为0.5。/。羧甲基纤维素的LA平板上，37。C培养24小时后，用0.5%刚果红溶液染色15分钟，用1M的NaCl溶液脱色，然后观察菌落周围有无水解圈，结果表明所有10个由空载体pWEB::TNC转化得到的转化子周围都没有水解圈，所有10个由pGXNC67转化得到的转化子周围都有水解圈，其中一个转化子的检测结果如图5所示。结果表明重组质粒pGXNC67的插入片段上确实含有内切葡聚糖酶基因。图5中，右边的菌落为初筛获得的重组质粒pGXNC67转化大肠杆菌后得到的转化子(能降解羧甲基纤维素)，左边的菌落为空载体pWEB::TNC转化大肠杆菌后得到的转化子(不能降解羧甲基纤维素)。2、内切葡聚糖酶及其编码基因(咖ce巧E)的获得为了测定重组质粒pGXNC67上内切葡聚糖酶基因的DNA序列，采用亚克隆的方法对该基因进行定位。依次使用限制性内切酶^coRI和尸WI对重组质粒pGXNC67进行了亚克隆。亚克隆的步骤取质粒pGXNC67用￡coRI完全酶切后加入连接酶在25。C连接一个小时(在pGXNC67完全酶切后，该重组质粒含有的载体pWEB::TNC的3.0kb的部分可以利用来克隆各个外源五coRI片断)。连接产物用化学法转化大肠杆菌XLl-Blue,在含质量百分含量为0.5%羧甲基纤维素的LA培养基平板上筛选有活性的克隆。在任意挑选24个表达羧甲基纤维素酶活性的克隆，提取质粒做五coRI酶切分析，其中一个质粒克隆有最少的外源片段7.0kb、3.5kb和3.0kb，将此质粒命名为pGXNC67E-4。pGXNC67E-4用尸"I酶切后、加入连接酶，连接产物转化大肠杆菌XLl-Blue,在含质量百分含量为0.5%羧甲基纤维素的LA培养基平板上再次筛选表达有羧甲基纤维素酶活性的克隆，提取表达羧甲基纤维素酶活性的克隆的质粒作尸"I酶切分析。克隆pGXNEP57有最小的外源片段插入。最后将目的基因定位在5.7kb的fcoRI和尸WI片段上(将含有该5.7kb片段的重组质粒命名为pGXNEP57)。将该重组质粒pGXNEP57寄送大连宝生物工程公司采用双脱氧核苷酸法对该亚克隆进行双向双链测序。测序结果用软件DNAStar(DNASTAR公司，版本5)及NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation,http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上的软件对DNA序列进行分析，如Blast(http:〃ww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST),得到内切葡聚糖酶的编码基因，该基因具有序列表中序列1的核苷酸序列，命名为鹏ce75E。自序列表中序列1的5'端的第125至1765位核苷酸为鹏ce75E的开放阅读框(OpenReadingFrame,0RF)，由1641个核苷酸组成，自序列1的5'端的第125—127位核苷酸为"/^W5E基因的起始密码子ATG，自序列1的5'端的第1763—1765位核苷酸为鹏c^5E基因的终止密码子TAA。内切葡聚糖酶基因咖c^5E编码一个含546个氨基酸的蛋白质Uracel5E，具有序列表中序列2的氨基酸残基序列，用DNAStar软件预测该蛋白质的理论分子量大小为60674.41道尔顿，等电点pl为8.53。用简单组件结构研究工具(SimpleModularArchitectureResearchTool,SMART,http:〃smart.erabl-heidelberg.de)分析内切葡聚糖酶Umcel5E的组件结构，结果是自序列2的氨基端的第1一20位氨基酸为信号肽(signalp印tide)，自序列2的氨基端的第40—334位氨基酸为家族5糖基水解酶(glycosylhydrolase)功能域。Umcel5E同来源于瘤胃未培养微生物的内切葡聚糖酶(GenBank索引号ABX76045)的同源性最高，两者的相似性为79%、相同性为67%。实施例2、鹏ce冗E在大肠杆菌中的表达1、可表达mceJ5E的重组载体(pET-wzce75F)的构建带有编码信号肽的基因在体内表达后很有可能将表达产物分泌到细胞外。为避免表达产物分泌到细胞外，只需要人工合成序列1的自5'端第206位至1762位碱基(即咖ce25E基因中除编码信号肽功能域和终止密码子外的DNA序列)，共1557bp，预计其编码蛋白的分子量为57.78585KDa，等电点pl为8.15。人工合成咖c^5E基因除了信号肽和终止密码子以外的全部序列(即自序列1的5'端第206-1762位核苷酸序列)，合成鹏ce75E基因两端带有勘/zffll和历77f/TI1酶切位点，将合成后并测序表明正确的腿ce兀E基因片段用AaaHII和酶切后，插入载体pET-30a(+)(购自Novagen公司)的AsMIII和^2't7qTI1位点间，得到重组表达载体，将该重组载体进行酶切和测序鉴定，将酶切和测序表明含有咖ce75E基因编码序列的正确的重组载体命名为pET-^/7ce^5F。起始密码子和终止密码子由表达载体pET30a(+)提供。表达产物的N端有一个由表达载体提供的His标签(6XHisTag)。其中，pET-鹏ce75F重组质粒的酶切电泳图谱如图6所示，图6中可以看到重组质粒经vfe/zHII和AV^EII双酶切后释放出一条5.3kb的载体带和一条与人工合成wzceJ5E基因经和酶切后同样大小的1.557kb的片段。图6中，泳道1为lkbladder(片段大小从大到小依次为10.0kb，8.Okb，6.0kb，5.Okb，4.Okb，3.5kb，3.0kb，2.5kb，2.0kb，1.5kb);泳道2为重组质粒经^mHI1和^/77oni双酶切后结果。2、wmce/5E基因在￡.co//Rose加TM(DE3)中的表达把pET-咖ce25"A转化至Acoh'RosettaTM(DE3)中得到含有pET-咖ce^5^的转化子RosettaTM(DE3)/pET-娜ce〗5《挑取RosettaTM(DE3)/pET-咖ceJ5^单菌落于含质量百分含量为0.5%羧甲基纤维素的LA平板上(含氯霉素34yg/mL，卡那霉素25yg/ml，IPTG1.0mmol/L)，同时用RosettaTM(DE3)/pET-30a(转入pET-30a的R0SettaTM(DE3))作为空白对照，37"培养24小时。菌体经氯仿破壁后用0.5%刚果红溶液染色15分钟，用lmol/L的NaCl溶液脱色，然后观察菌落周围有无水解圈。结果如图7所示，结果表明重组菌RosettaTM(DE3)/pET-鹏ceJ5^周围有水解圈，而空白对照RosettaTM(DE3)/pET-30a周围无水解圈，说明靶基因wmce/5E在ARosettaTM(DE3)中已经高效表达出了有纤维素(羧甲基纤维素)降解活性的蛋白质产物。图7中右边的菌落为重组大肠杆菌RosettaTM(DE3)/pET-umcel5E(能降解羧甲基纤维素)，左边的菌落为含有空载体的大肠杆菌RosettaTM(DE3)/pET-30a(不能降解羧甲基纤维素)。3、Umcel5E的表达和纯化1)RosettaTM(DE3)/pET-umcel5E菌体发酵接种RosettaTM(DE3)/pET-umcel5E到10ml含有34ug/ml氯霉素(CAM)与25ug/ml卡那霉素LB培养液中，37°C200rpm培养过夜。取5ml过夜培养物到100ml含有34ixg/ml氯霉素(CAM)与25ug/ml卡那霉素的LB培养液中，在37。C培养200rpm培养至0D6。。为0.6。加入IPTG至终浓度为lmM，继续培养5个小时，5，000g离心收集菌体。共作2瓶样品，收集200ml的培养液的菌体。2)Umcel5E的提取与纯化在步骤l)收集获得的菌体中，按每克菌体重量加入5ml的裂解缓冲液(50mMNaH2P04,3OOmMNaCl,10mMimidazole(咪唑)，lmMPMSF(苯甲基磺酰氟)，pH8.0)，悬浮菌体，加入溶菌酶至终浓度lmg/ml，置冰上30分钟。用超声波破碎细胞，400w作用20次，每次作用时间IOs，每次作用间隔12s。12，000g离心20分钟，收集上清得到Umcel5E粗酶液。取5ul用SDS-PAGE检测蛋白质的纯度。Umcel5E的纯化使用Qiagen公司的TheQIAexpressionistkit试剂盒(方法参照试剂盒说明书)。按每4ml上述获得的裂解上清液加入lml质量百分含量为50%的NI-NTA胶体，在4'C用200rpm摇60分钟，混合物灌注到TheQIAexpressionistkit试剂盒附带的柱子。力tl4ml洗涤缓冲液(50mMNaH2PO4，300mMNaCl，20mMimidaz0le，lmMPMSF,pH8.0)到柱子里，缓慢搅拌，重复冲洗6次。加入0.5ml的洗脱缓冲液(50mMNaH2PO4,300mMNaCl，250mMimidazole,lmMPMSF,pH8.0)，收集流出物，重复洗脱8次。合并8管蛋白质，即为镍柱纯化后的Umcel5E，取5ul用SDS-PAGE检测蛋白质的纯度。SDS-PAGE结果如图8所示，结果表明，咖cel5E基因在大肠杆菌中得到了高效表达，表达产物Umcel5E分子量为61kDa左右，与预计的分子量基本一致，粗酶液经镍柱纯化后，已去掉绝大部分杂蛋白，Umcel5E已达到SDS-PAGE单条纯蛋白条带。为了检测纯化的Umcel5E是否还有内切葡聚糖酶活性，用活性胶染色法进行了检测，过程如下。首先Uracel5E在聚丙烯酰胺变性胶上进行蛋白质电泳(SDS-PAGE)，然后对电泳后在变性胶中已变性的Umcel5E进行复性处理。复性处理把电泳后的变性胶浸入在50ml的复性缓冲液中(复性缓冲液的配制Tris3.025g，0.5MEDTA(pH8.0)5ml，P-巯基乙醇0.173ml，加水至总体积500ml)，4。C下浸泡30分钟，更换复性缓冲液，重复三次，前两次在复性缓冲液中添加0.5ml的异丙醇。再用10raMpH7.0的磷酸钾缓冲液洗胶两次。把复性胶贴在含质量百分含量为0.5%羧甲基纤维素的LA培养皿上，用塑料袋包裹培养皿，在37。C中保温l小时。取出平板用质量百分浓度为0.5%刚果红溶液染色15分钟，用lmol/L的NaCl溶液脱色。活性胶检测纯化的Umcel5E具有CMCase(内切葡聚糖酶)活性，说明咖cel5E是按正确的阅读框架表达的。图8中1为分子量标准(marker);2为镍柱(NI-NTA)纯化后Umcel5E的SDS-PAGE凝胶电泳；3为Umcel5E的活性胶检测。4、Umcel5E酶学特性的研究内切葡聚糖酶的酶活测定采用DNS法，具体操作如下1)配制DNS试剂称取10克NaOH用约400mlddH20溶解，再称取10克二硝基水杨酸、2克苯酚、0.5克无水亚硫酸钠、200克四水酒石酸钾钠，将其溶解于约300mld胆2O中，两种溶液混合，定容到1升，避光保存。2)葡萄糖标准曲线的绘制取9只薄壁试管，按下表加入溶液<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>混匀后在沸水中反应5分钟，室温冷却，用酶标仪测As30。3)酶活测定取10(il步骤3中的步骤2)中获得的Uracel5E酶液(Umcel5E浓度为0.06mg/ml)，加入190^1特定pH值(4.5)的0.1M柠檬酸一0.2M磷酸氢二钠缓冲液中，再加入30(Hil质量百分含量为1%CMC(羧甲基纤维素)(溶剂为pH值相同的0.1M柠檬酸一0.2M磷酸氢二钠缓冲液)溶液反应，在特定温度下(45°C)反应10分钟，待反应结束后加入lml步骤1)制备的DNS试剂置于沸水中水浴5分钟，室温冷却，用酶标仪测A53。。酶活(IU)定义为1U为每分钟催化产生lpmol还原糖所需的酶量。比活力的定义每g蛋白质所含的酶活力(U/g)。结果表明，Umcel5E对羧甲基纤维素在最适pH值(4.5)最适温度(45°C)下的比活力为36780U/g。4)酶的最适pH值的测定测定Umcel5E在37。C，pH范围为3.08.0的0.1M柠檬酸一0.2M磷酸氢二钠缓冲液中的酶活，梯度为0.5。具体方法为分别取10pl步骤3中的步骤2)中获得的Umcel5E酶液，分别加入190^1pH值为2.58.0(梯度为0.5)的0.1M柠檬酸一0.2M磷酸氢二钠缓冲液中，再分别加入30(Hi1质量百分含量为1%CMC(羧甲基纤维素)(溶剂为与之前相同pH值的0.1M柠檬酸一0.2M磷酸氢二钠缓冲液)溶液，在37°〇反应10分钟后，立即加入lml步骤l)制备的DNS试剂置于沸水中水浴5分钟，室温冷却，用酶标仪测A53Q。酶活(IU)定义为lU为每分钟催化产生lpmol还原糖所需的酶量。在37T:的反应条件下，Umcel5E在pH4.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中的比活力最高，以此为100%，换算各pH值下的相对酶活力，结果如图9所示，结果表明Umcel5E的最适pH为4.5。5)酶的最适温度的测定在最适pH4.5条件下测定不同温度下(20。C8(TC)的Umcel5E酶活。具体方法为分别取1(^1步骤3中的步骤2)中获得的Umcel5E酶液，加入19(^1pH值为4.5的0.1M柠檬酸一0.2M磷酸氢二钠缓冲液中，再加入300^1质量百分含量为1%CMC(羧甲基纤维素)(溶剂为pH值为4.5的0.1M柠檬酸一0.2M磷酸氢二钠缓冲液)溶液，分别置于20。C7(TC(梯度为5。C)进行反应10分钟后，加入lml步骤1)制备的DNS试剂置于沸水中水浴5分钟，室温冷却，用酶标仪测A，。酶活(IU)定义为lU为每分钟催化产生lpmol还原糖所需的酶量。在pH值为4.5的0.1M柠檬酸一0.2M磷酸氢二钠缓冲液中反应条件下，Umcel5E在45'C时比活力最高，以此为100%，换算各温度下的相对酶活力，结果如图10所示，结果表明Umcel5E的最适温度为45'C6)酶的pH耐受性测定将步骤3中的步骤2)中获得的Umcel5E酶液保存于不同pH值(pH2.0-10.0，梯度为0.5)的缓冲液中，于4'C放置24小时后在最适pH值4.5和最适温度4(TC下测定酶活(方法同步骤3))。其对照(即100%的活力)是未处理的步骤3中的步骤2)中获得的Umcel5E酶液在pH4.5，45。C下所测得的活力。结果如图ll所示，结果表明Umcel5E在pH5.010.0之间保持24小时后仍具有80%以上的活力，这说明该酶具有较好的pH耐受性。7)酶的温度耐受性测定将步骤3中的步骤2)中获得的Umcel5E酶液保存于最适pH值的缓冲液中，置于不同温度下(20°C75°C，梯度为5'C)放置l小吋后在该酶的最适pH值和最适温度下测定酶活(方法同步骤3))。其对照(即100%的活力)是未处理的步骤3中的步骤2)中获得的Umcel5E酶液在pH4.5，45"C下所测得的活力。结果如图12所示，结果表明Umcel5E在45°C以下能保持80%以上的相对活力，说明该酶在相当大的温度范围内比较稳定。序列表〈160〉2<210〉1〈211〉2273〈212>DNA〈213〉未知〈220〉〈223〉〈400〉1aaaatacgcagtttttatttgggC组SLCggggacagccccatccgcgtgUggatgaagcgtgaacgtt:ctacaacagtggactacgacgtgg獄gagtgtcactaccctactcggccccatatcatcggagatcgactatcggtgagtcgcaaggtacggcacgttcccaggccgacgtttccctcgtgaggcctttcatccgcgtgcgccaaggscgtcttcaggtcaaagtgtgcgtacctttgctttgagtcggctcgatgccagtcaccaagccccgtgacctcgtgtacacgcatcacgacaaacaaggcaacagaagctgccctaaagcccgtgcgcaataagcagtaccctt:ccagctgcaacctg已ttatacgccacctgccctctatgtactggatggctggccgagaagctcgtxcactctttggcgg卿tggccgggca卿3cgtcagccaccaccctttctgtactttataatttgctttagtccaa3gatgcacagtggaagctgaactcctggtacaaccaaggtggtggacgggcgacggagttcgaeiaattttcgaggcaggacggctacaggcggcaaccaatgcgatatacctatccgc^c3tca^tcaccacatgccatggactagcctctccgacactcatcaaCg3g犯tCgtactggaaccgctgacggaagc卿ggtgtttaatttaacgga^cga^cgaaggaatgcttcgtcaagaactgcacagggaga卿tgatgcatggacaagctatgtcatcc^aca3"tgggctctgg犯gctataatgagtaaggccatccaactcgtcgg鄉gcactgcaactggcagatcgaacctggccctctg已ctcttgtgaagcggatcttcaagcctactacttacacggtgtacggccgtgtgc鄉c鄉cgacaagttcgtttgacacccttgaaagcgcaaagttaca60aataatgata120ctcatggcgaaccatgcagg180"gggtgtgggttggaatct240ctggaatccgagacttactg300aaggaagccggcttcaaagc360gacggt^tgtgaatgccgc420gaccagggcctgtactgcat480ctgcacgccagtacgacgac540cagattgctacggaattcaa600atgctcgacgacaacaacca660a^cagct8"tgccaagagctt720cgtaacctgattgtcaacac780gagttgcctga^ctactgg840atgccaagag■ctg犯cagggctcctgtgat960attgactattacactacgaa1020caggcca^肌■tcgccggtat1080cgttctctgccggtcttcaa1140ggcagcacgtcgggctataa1200aaatacaaccaggagtgggc1260ascctgsgcggctataaggg1320gtgC3ggtg3aagtgtatgg1380犯ggsgctgtatgtgccatt1440tccatcctcggctctacctt1500<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>AsnAlaAlaTrp100Leu85MetTyrLysCys90GluValValAspAspGinGly115GinTrpLeuHisArgValHis105AsnValHisHislieGlyLys130AlaLysPheGluLys145TyrAspGinLysVal120SerThrThrThrAla135TrpLysGinlieAsp125AsnTyr110ThrSerLeu150LeuPheGluAlaTyr140ThrGluPheAsnAsnGinTrp180AlaLeu165AsnGluProLysTyr170GinAla155AsnGluMetLeuAsnSerTyr195SerSerAsnAsn210ThrProAsnAlaMet225lieliePheGinLysSerPheArgAla185ThrThrValAspGlyTyrAsnVal200lieValAsnThrGlyArg95VallieGlyAspAsnLysLysAsp160AspAsp175AlalieLys190ThrGlyGlyLeu215AlaLeuGluLeuAsn205SerAlaSerSerLys230HisThrTyrProLeu245lieAspAsnLeuPro235TrpTyr220GluThrThrAlaLysArgGlu260AlaProVallieAsn250SerAsnlieLysLeuAsnArg275Serlie265GlyGluTyrAlaGlyHis240GinAsnGluSerAsn255AsnLeuTrpPro290TyrAla305ThrPheMetTyrAsplieAspAspTyrTrplie280TyrThrThrAsnSer270PheThrThrTyr295ValLysGinAlaThr285LysValAlaLeuLeu310GlyLeuSerAspLys315SerArg300lieAlaGlySerArgSerMetGlyLeuSerAspGlySerSerArg325330ValPheAsnGinAlaAspLeuAlaGluThrLeulieLysAlalieGly320LeuPro335TyrTyrGlySerThr355Thr340SerValTyr370GlyAsp385ArgValGluMetGlyLysTrpAsnArgValValTyrLysGluAla405LysTyrTyrThr390AspLysPhe360GinGluTrp345ProSerSerSerAsn375AlaValAsnLeuAspGlyLysGlyAla420TyrValProLeuAspSerTyrGlyAlaGlu380SerGlyTyrLys395GlyLysValGin350SerThrArglie365AlaPheLeuPheAla410AlaAspGlySerLeu435AspThrSerlieAsn425SerGlySerAlaLeuPhe450GinThrAsnAlaGly465lieLysAlaAspLeu455LeuSer440GlySerThrPro470ThrGluGluGluGlyCysAspVal500SerGly485SerSerGluLeuPheTrp460ThrAlaLysValAsn475ThrValAlaValGinAsn530LysGin545Pro515ProThrGlyGinLysGlyAsplie535lie520TyrAla505TyrlieLeu490ThrLysLysGlylieArgAspLeuSerLysAsnGly540Glylie400ValLys415LysPheAsp430ThrGluValThr445GlylieThrLeuAlaSerThrLeu■AlaTrp495ThrLysSer510ArgArgValGly525LysLysPheVal权利要求1、一种内切葡聚糖酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)自序列表中的SEQID№.2的氨基端第28-546位氨基酸残基序列；2)将自序列表中的SEQID№.2的氨基端第28-546位氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质。2、根据权利要求l所述的内切葡聚糖酶，其特征在于所述内切葡聚糖酶具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。3、权利要求1或2所述的内切葡聚糖酶的编码基因。4、根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于所述内切葡聚糖酶的编码基因具有下述核苷酸序列之一1)自序列表中SEQIDW2:1的5'端第206-1762位核苷酸序列；2)序列表中SEQIDW:1的核苷酸序列；3)编码序列表中SEQIDW:2蛋白质序列的多核苷酸；4)在高严谨条件下可与序列表中SEQIDW:1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。5、含有权利要求3或4所述的内切葡聚糖酶编码基因的重组表达载体。6、含有权利要求3或4所述的内切葡聚糖酶编码基因的转基因细胞系。7、含有权利要求3或4所述的内切葡聚糖酶编码基因的宿主菌。8、权利要求1或2所述的内切葡聚糖酶在纤维素降解中的应用。9、权利要求3或4所述的内切葡聚糖酶编码基因在纤维素降解中的应用。全文摘要本发明公开了一种内切葡聚糖酶及其编码基因与应用。本发明提供的一种内切葡聚糖酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQID№2；2)将序列表中SEQID№2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质。实验证明本发明的内切葡聚糖酶具有很高的羧甲基纤维素酶活性(达36780U/g)，而且该酶适宜的pH值范围和温度范围非常广。本发明所提供内切葡聚糖酶及其编码基因可广泛应用于纤维素的降解。文档编号C12N9/42GK101225376SQ200810056688公开日2008年7月23日申请日期2008年1月23日优先权日2008年1月23日发明者冯家勋,唐子君,唐纪良,旭曹,段承杰,赵广存申请人:广西大学