专利名称：固相载体化的交联酶聚集体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及固定化酶，尤其涉及固定于固相载体上的交联酶聚集体及其制备方 法，属于酶的固定化领域。
背景技术：
从上个世纪60年代开始酶的固定化研究以来，人们从各个方面对酶的固定化 技术进行探讨和研究，已经成功地运用了物理和化学的方法对酶进行了固定化，其 中许多的技术和产品在工业生产中得到了应用。但固定的对象基本上都是游离酶， 由于游离酶是对环境要求较高，比较脆弱的可溶性蛋白质， 一般情况下，对热、强 酸、强石成均不稳定。在常用的固定化方法中，由于较强烈的化学反应，通常对蛋白 质的性质造成极大的影响，由于酶又具有一定的高级空间结构，极易受到表面活性 剂、载体表面物理性状、化学接枝等因素的影响，对酶的空间结构或活性中心造成 不可逆的破坏，使得酶活力下降、或失活，严重影响了固定化酶的效果和使用。
2002年荷兰Delft大学Sheldon小组提出用蛋白质沉淀剂沉淀酶蛋白，得到具有 稳态结构的酶聚集体,再用戊二醛交联,制备了交联酶聚集体(Cross Linked Enzymey Aggregates,CLEAs)。对七种商业化的脂肪酶进行了聚集体交联，得到了具有较好酶 活性的无载体固定化酶(P.Lopez-Serrano,L.Cao,F.van Rantwijk & R.A.Shddon et al.Cross-linked enzyme aggregates with enhanced activity: application to lipases.Biotechnology letters,2002,24:1379-1383 )。 2003年董晓毅对脲酶进行了聚集体 交联，获得了具有较好稳定性的交联脲酶聚集体(董晓毅、夏仕文交联脲酶聚集 体的制备和初步应用[J ].生物工程学报,2003，19(3):332 336 )。
聚集体交联酶(CLEAs )是继交联溶解酶(CLEs )、晶体交联酶(CLECs)后发展 起来的一种固定化的酶，属于无载体固定化的范围。由于聚集体交联酶中酶分子处 于稳态结构，所以形成的固定化酶具有热稳定性高，抗胰酶能力强等特点。但由于 聚集体交联酶是无载体固定化，具有高度的分散性，所以丢失了固定化酶的最主要 的特点反应完毕后难于回收利用；没有一定的物理形态，在工业化生产中不能用 于连续性生产。
发明内容
本发明首先所要解决的技术问题是克服聚集体交联酶所存在的不能回收再利 用的缺点，提供一种固定于载体上的交联酶聚集体，该交联酶聚集体除具有热稳定 性高，抗胰酶能力强等优点外，还具有一定的物理形态和稳定结构，可以回收利用， 能够连续应用于生产。
本发明首先所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的 一种固定于固相载体上的交联酶聚集体，其中，所述的固相载体是多孔微球。 所述的多孔微球可以由各种材质制成，例如，可以由有机材料(例如有机高分 子多孔材料等)、无机材料(多孔玻璃、多孔陶瓷等)等材料制成；用所述的多孔 微球作为交联酶聚集体的固相化载体，无需对其进行特殊处理，只要其主要孔隙大 于待固定的蛋白质分子大小的1-2倍即可。优选的，本发明所述的多孔微球的平 均孔径为10nm 300nm之间，更优选为30nm。
适用于本发明的可固定化酶的范围非常广泛，只要是能够被蛋白质沉淀剂沉淀 的酶(或者说采用现有的聚集体交联技术可将其制备成聚集体交联酶，这类的酶都 可适用于本发明)基本上均可作为本发明固定化酶的对象，例如，可以是有机磷降 解酶、乳糖酶、木聚糖酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶或植酸酶等，优选为有机磷降解 酶、乳糖酶。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种制备上述固定于固相载体上的 交联酶聚集体的方法。
本发明所要解决的另 一个技术问题是通过以下技术方案来实现的
一种制备固定于固相载体上的交联酶聚集体的方法，包括酶蛋白的沉淀、交联， 其特征在于首先让需要固定的游离态酶分散于多孔微球中；再依次在多孔微球内 进行酶蛋白的沉淀、交联，最后漂洗多孔微球，即得。
优选的，所述的分散方法包括将游离态酶溶于緩冲液中后加入多孔微球，緩 慢搅拌，让游离态酶分散于多孔微球中；更优选的，将游离态酶溶于磷酸盐緩冲液 中，配制成浓度为0.1-1.5mg/ml的酶溶液(更优选为配制成0.4-0.5mg/ml的酶溶液)， 在4 25。C温度条件下緩慢搅拌1 ~3小时，让游离态酶分散于多孔微球中。
所述酶蛋白的沉淀、交联等方法与现有的制备交联酶聚集体时酶蛋白的沉淀、 交联的方法相同；优选的，所述的酶蛋白的沉淀按照以下方法进行加入的蛋白质 沉淀剂在4 ~ 25。C的温度条件下緩慢搅拌3 ~ 5小时；所加入的蛋白质沉淀剂包括但 不限于硫酸铵、叔丁醇或乙醇等；所加入的浓度范围在33% ~80% (v/v )。所述的交联优选按照以下方法进行加入双功能交联剂在4-25。C温度条件下 緩慢搅拌15~24小时；所加入的双功能交联剂包括但不限于戊二醛、苯基二异 硫氰或双重氮联苯胺-2等；所加入的浓度范围在0.1% ~ 2.5% (v/v )之间。
刚性的多孔微球由于自身材料的特性，具有良好的化学稳定性和一定的机械强 度。本发明合理利用多孔微球的孔隙特性，使聚集体交联酶在形成的过程中固定于 载体的孔隙中，不规则的孔隙使形成的稳态固体酶保留在载体中，达到了固定化酶 的目的，而小于蛋白质分子的孔隙就成为化学反应体系中底物、产物的传质和对流 的通道。
本发明解决了聚集体交联酶所存在的不能回收再利用的缺点，赋予了聚集体交 联酶一定的物理形态和稳定结构，又保留了聚集体交联酶的优点，适应于工业化批 次和连续化生产，开拓了聚集体交联酶工业化应用的前景。
本发明固定化酶方法简单，简便易行，反应条件易于最佳化，无需特殊设备。 本发明方法所制备的固定化酶稳定性高，抗胰蛋白酶能力强，可反复使用，可填充 各种形状的装置，具有较高的液体流速，易于在工业化生产中使用。
图1 对硝基酚标准曲线；
图2 邻硝基酚(ONP)标准曲线；
图3 固定化的交联有机磷降解酶聚集体和液体有机磷降解酶的热稳定性比
较；
图4固定化的交联有机磷降解酶聚集体的牢固度测试(振荡摇床的转速为200 转/分)；
图5 固定化的交联有机磷降解酶聚集体批次法连续反应测试； 图6固定化的交联乳糖酶聚集体的牢固度测试(振荡摇床的转速为200转/ 分)；
图7固定化的交联乳糖酶聚集体批次法连续反应测试。
具体实施例方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述 而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本 领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方
5案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1固定化的交联有机磷降解酶聚集体的制备
称取有机磷降解酶溶解在磷酸盐緩冲液中，配制成蛋白浓度为0.4mg/ml的酶溶液，加入多孔微球(聚苯乙烯型非极性吸附树脂，型号为ADS - 5;平均孔径为30nm，粒径大于100nm;性能对蛋白质、糖类、无机酸、碱、盐、小分子亲水性有机物均不吸附；在热、酸、碱、有机溶剂等条件下均有很高的稳定性。天津南开和成科技有限公式生产)，在4。C下緩慢搅拌3小时；再加入硫酸铵至饱和度为67.5%，在4'C下緩慢搅拌5小时；加入戊二醛(25% )溶液至最终浓度为2.2%,在4。C下緩慢搅拌18小时；过滤取出多孔微球，反复漂洗至溶液澄清。
实施例2
称取乳糖酶溶解在磷酸盐緩冲液中，配制成蛋白浓度为0.5mg/ml的酶溶液，加入多孔微球(聚苯乙烯型非极性吸附树脂，型号为ADS-5。平均孔径为30nm,粒径大于100pm;性能对蛋白质、糖类、无机酸、碱、盐、小分子亲水性有机物均不吸附；在热、酸、碱、有机溶剂等条件下均有很高的稳定性。天津南开和成科技有限公式生产)，在4。C下緩慢搅拌3小时。加入硫酸铵至饱和度为67.5%，在4'C下緩慢搅拌5小时。加入戊二醛(25% )溶液至最终浓度为2.2%, 4。C下緩慢搅拌18小时。过滤取出多孔微球，反复漂洗至溶液澄清。
试验例1 本发明固定化的交联酶聚集体的性能测试
一、 试验材料
受试样品1:实施例1所制备的固定化的交联有机磷降解酶聚集体；受试样品2:实施例2所制备的固定化的交联乳糖酶聚集体；
二、 测试项目
1 .有机磷降解酶酶活测定方法对硝基酚标准曲线的绘制
取0.08346g对硝基酚，先用少量95%乙醇溶解，然后用水定容至100mL (6mmol/L)。在试管中分别加入O、 2.5、 5、 7.5、 10、 15、 20、 30、 40、 50|xL的对硝基酚溶液和1000、 997.5、 995、 992.5、 990、 985、 980、 970、 960、 950|iL的50mmol/L
Tris-Cl(pH8.0)緩冲液，总体积为lmL,然后每管加入lmL10。/。三氯乙酸，再加入lmL
6100/c)Na2C03溶液，总体积为3mL, 410nm测定光吸收值。同时，绘制对硝'基酚标准曲线(图1)。
游离酶和实施例l所制备的固定化的交联有机磷降解酶聚集体的活力测定游离酶的测定在試管中加入5mL (10mg/mL)曱基对硫磷溶液，pH8.0、 900ML ( 50mmol/L ) Tris-HCl緩沖液和100 |jL经适度稀释的酶液，37。C保温10分钟，加入1 mL 10%三氯乙酸终止反应，再加入1 mL 10。/。Na2C03溶液显色，410nm测定光吸收值。按照下述公式计算酶活力
酶活力(U/mL) =(58.593 0D4,。-0.5625)X②(3XI0-3)XI。①XN
N为酶液的稀释倍数；
一个酶活性单位(U)定义为在37。c,每分钟释放出liimol对硝基酚所需的酶量。
固定化酶的测定在试管中加入5fiL (10mg/mL)曱基对硫磷溶液，pH8.0、995 |jL ( 50mmoI/L ) Tris-HCl緩冲液和60mg的受试样品1 ， 37。c保温10分钟，加入1 mL 10%三氯乙酸终止反应> 再加入1 mL 10。/。Na2C03溶液显色，410nm测定光吸收值。按照上述公式计算酶活力。
2.乳糖酶酶活测定方法
邻硝基酚(ONP)标准曲线的绘制
称取0.25gONP溶解、定容于lOOmlO.lMHAc-NaAc緩冲液中。在试管中分别加入0、 50、 100、 150、 200、 250、 300pL的ONPG溶液和1000、 950、 900、 850、800、 750、 700pL的O.lmmol/L HAc-NaAc (pH5.2)緩冲液，总体积为lmL，然后每管加入lmL10。/o三氯乙酸，再加入2mL 1MNa2C03溶液，总体积为4mL, 420nm测定光吸收值。同时，绘制邻硝基酚(ONP)标准曲线(图2)。
游离酶和实施例2所制备的固定化的交联乳糖酶聚集体的活力测定游离酶的测定在试管中加入800pL的0.25%邻硝基酚-B _ D半乳糖苷(ONPG),将加入以上底物的试管放入60。c水域中预热2min，加入20(HiL的经适度稀释的酶液，6(TC保温15分钟，加入1 mL 10%三氯乙酸终止反应，再加入2 mL1M Na2C03溶液显色，420nm测定光吸收值。按照下述公式计算酶活力(814.88 OD420+5.6746)X5XN酶活力(U/ml) - 15X誦-
N为酶液的稀释倍数
一个酶活性单位(U/ml)定义为在60。C,每分钟分解邻硝基苯酚-(3 - D半乳糖苷(ONPG)生成lpmol邻硝基酚ONP所需的酶量。
固定化酶的测定在试管中加入1000 mL的0.2% onpg溶液和10mg的受试样品1 ， 60。C保温15分钟，加入1 mL 10 %三氯乙酸终止反应，再加入2 mL 1M Na2C03溶液显色，420nm测定光吸收值。
3. 热稳定性试验
分别取适量的有机磷降解酶液体酶和实施例1所制备的固定化的交联有机磷降解酶聚集体，在70度水浴中分别保温0、 30、 60、 90、 120、 150、 180、 210分钟后，按照酶活力测定方法测定酶活。
4. 牢固度试验
在三角瓶中分别加入10克实施例1所制备的固定化的交联有机磷降解酶聚集体、实施例2所制备的固定化的交联乳糖酶聚集体，以及200ml pH7.5的磷酸緩沖液，置于37。C摇床中，转速为200r.p.m。振荡2小时后，取出约0.5克固定化多孔微球，置4。C备用。抽干三角瓶的緩冲液，加入新的緩冲液，再次振荡2小时，重复上述步骤取样。固定化酶在摇床中共连续振荡14小时。振荡结束后，按照上述测定酶活的方法分别测定酶活。
5. 连续反应批次试验
(1 )实施例1所制备的固定化的交联有机磷降解酶聚集体的测定在7毫升西林瓶中加入60毫克实施例1所制备的固定化的交联有机磷降解酶聚集体，995 pL (5Ommol/L， pH8.0) Tris-HCl緩沖液，5 pL (10mg/mL)曱基对硫磷溶液，37"保温10分钟。反应结束后，小心的吸出反应液，置于试管中，加入1 mL 10%三氯乙酸终止反应，再加入1 mL 10 %Na2C03溶液显色，410nm测定光吸收值。
在保留有固定化酶的西林瓶中再加入995 mL (5Ommol/L, pH8.0) Tris-HCl緩冲液，5 |iL (10mg/mL)曱基对硫磷溶液，进行新一轮的反应，共重复反应50次。
8(2 )实施例2所制备的固定化的交联乳糖酶聚集体的测定
在7毫升西林瓶中加入10毫克实施例2所制备的固定化的交联乳糖酶聚集体，
加入1000 mL的0.2%onpg溶液，60。C保温15分钟。反应结束后，小心的吸出反
应液，置于试管中，加入1 mL 10%三氯乙酸终止反应，再加入2 mL 1M Na2C03
溶液显色，420nm测定光吸收值。
在保留有固定化酶的西林瓶中再加入1000 mL的0.2%onpg溶液，进行新一轮
的反应，共重复反应40次。
三、测试结果
1、 热稳定性试验
分别测定本实施例1所制备的固定化的交联有机磷降解酶聚集体与有机磷降解酶的液体酶的热稳定性，测定结果表明，本实施例所制备的固定化的交联有机磷降解酶聚集体的热稳定性高，要远远优于有机磷降解酶的液体酶的热稳定性(图3)。
2、 牢固度试验
采用振荡摇床(振荡摇床的转速为200转/分)分别测定了受试样品1和受试样品2的固定化酶的牢固度，测定结果说明，本发明所制备的固定化的交联有机磷降解酶聚集体和交联乳糖酶聚集体牢固度好(图4、图6)。
3、 连续反应测试
通过批次法连续反应测试，表明受试样品1和受试样品2可反复使用，适应于工业化批次和连续化生产(图5、图7)。
9
权利要求
1、一种交联酶聚集体，其特征在于所述交联酶聚集体固定于多孔微球载体上。
2、 按照权利要求1的交联酶聚集体，其特征在于所述的多孔微球由有机材 料或无机材料制成；其中，所述的有机材料优选为有机高分子材料；所述的无机材 料优选为玻璃或陶瓷。
3、 按照权利要求1或2所述的交联酶聚集体，其特征在于所述的多孔微球 的平均孔径为10nm~300nm。
4、 按照权利要求3所述的交联酶聚集体，其特征在于所述的多孔微球的孔 径为30nm。
5、 按照权利要求1或2所述的交联酶聚集体，其特征在于所述的交联酶聚 集体是交联有机磷降解酶聚集体、交联乳糖酶聚集体、交联木聚糖酶聚集体、交联 脂肪酶聚集体、交联葡萄糖氧化酶聚集体或交联植酸酶聚集体。
6、 一种制备权利要求1所述的交联酶聚集体的方法，包括酶蛋白的沉淀、交 联，其特征在于首先让需要固定的游离态酶分散于多孔微球中；再依次在多孔微 球内进行酶蛋白的沉淀、交联，最后漂洗多孔微球，即得。
7、 按照权利要求6所述的方法，其特征在于所述的游离态酶选自有机磷降 解酶、乳糖酶、木聚糖酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶或植酸酶。
8、 按照权利要求6所述的方法，其特征在于所述的多孔微球由有机材料、 无机材料制成；其中，所述的有机材料优选为有机高分子材料；所述的无机材料 优 选为玻璃或陶瓷。
9、 按照权利要求6-8任何一项所述的方法，其特征在于所述的多孔微球的 平均孔径为10nm~300nm。
10、 按照权利要求6所述的方法，其特征在于将游离态酶溶于磷酸盐緩冲液 中，配制成浓度为0.1 ~ 1.5mg/ml的酶溶液，在4 ~ 25。C温度条件下緩慢搅拌1 ~ 3 小时，让游离态酶分散于多孔微球中。
全文摘要
本发明公开了固定化的交联酶聚集体及其制备方法。该交联酶聚集体固定于多孔微球上，其制备方法包括将需要固定的游离态酶分散于多孔微球中；在多孔微球内依次进行酶蛋白的沉淀、交联，最后漂洗多孔微球，即得。本发明固定化酶的方法可用于固定各种类型或来源的酶，固定化方法简便易行，容易操作，无需特殊设备，生产成本低，所制备的交联酶聚集体稳定性高，抗胰蛋白酶能力强，具有一定的物理形态和稳定结构，可回收并反复使用，在工业化生产中能用于连续性生产。
文档编号C12N11/04GK101492665SQ20081005659
公开日2009年7月29日 申请日期2008年1月22日 优先权日2008年1月22日
发明者伍宁丰, 伟 张, 健 田, 范云六, 军 郭 申请人:中国农业科学院生物技术研究所