用作免疫抑制剂的、分离自间充质干细胞的微囊泡的制作方法

用作免疫抑制剂的、分离自间充质干细胞的微囊泡的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用作治疗炎性病变和免疫病变的免疫抑制剂的、分离自间充质干细胞的微囊泡。
【专利说明】用作免疫抑制剂的、分离自间充质干细胞的微囊泡
[0001]本发明涉及用作免疫抑制剂的、分离自间充质干细胞的微囊泡。特别地，本发明涉及用作治疗炎性和免疫病变的免疫抑制剂的、分离自间充质干细胞的微囊泡。
[0002]虽然人们对基质间充质干细胞的免疫调节特性的兴趣和临床应用增加了，但是其效果再现性有争议并且涉及到的机制仅仅部分被阐明了。间充质基质细胞(MSC)在体外、动物模型和临床应用中显示出免疫调控特性，例如在移植物抗宿主病中(参见Nauta2007, Zhao2010, Caimi2010的论文)。然而，其作用机制还没有被完全阐明。特别地，虽然关于MSC对活化T淋巴细胞的免疫抑制作用已有广泛研究(Krampera，2003)且揭示了多个参与因子，但是关于MSC对B淋巴细胞的作用和作用机制非常有争议(Corcione2006，Tabera2008, Comol?2008, Traggiai2008, Rasmussen2007)。鉴于有报导称MSC 与 B 细胞的相互作用存在种间差异(人与小鼠XRenseneb，2009)，下面仅讨论从人细胞获得的结果。总的来说，MSC-B淋巴细胞相互作用被认为介导可溶因子，并且确实有报导称这些因子对B淋巴细胞比对T淋巴细胞有更重要的作用(Augel1, 2006)。
[0003]如上面报导的，MSC对B淋巴细胞的作用似乎尚不明确。事实上，既有报导称MCS对B淋巴细胞的抗体增殖、分化和生成有抑制作用(Corcione2006，Tabera2008, ComoIi2008)也有报导称有刺激作用(Traggiai2008，Rasmussen2007)。有趣的是，制得注意的是，在某些情况下，MSC起抗原呈递细胞的作用(Chan，2006)，并由此将免疫反应放大。这种现象似乎可见于某些特定的环境条件，例如低水平Y-干扰素存在下(Chan，2006)。根据一项关于MSC与B淋巴细胞相互作用的研究，根据用于B细胞的刺激强度或供体来源，MSC会表现出相反的作用(抑制或刺激)(Rasmussen，2007)。这些相互冲突并且不可预知的结果阻碍了 MSC在复杂自体免疫疾病中的应用。
[0004]鉴于上述情况，很显然需要提供新的治疗方法来治疗炎性和免疫疾病并克服现有技术的缺陷。
[0005]近期，已发现免疫细胞的多种相互作用由微囊泡(MV)或微粒(如很多细胞表型分泌的膜包被体)介导(Th6ry，2009)。已经描述了多种MV种类，大小为50~1000nm或更大，并且根据其来源的胞内隔室而有不同的结构和生化特性。越来越多的实验证据显示:通过蛋白、mRNA和微RNA转运，MV在细胞间通信中起基础作用(Valadi，2007 ; Camussi, 2010)。
[0006]已知，MV对多种细胞表型(如树突细胞或T淋巴细胞)具有免疫反应载体的作用。从表达肿瘤抗原的树突细胞中分离的微囊泡已在两项I期临床试验中用于黑素瘤患者和肺癌患者(ESCudier，2005;MOrSe，2005)，用于刺激肿瘤免疫反应。这些研究显示MV对人系统性应用是安全的，由此激励个人患者临床应用的研究。PRobbins等研究了有免疫抑制活性的外来体(exo some)的应用(US20060116321)，该项研究从不同的细胞类型分离外来体，所述细胞类型包括抗原呈递细胞(树突细胞和巨噬细胞)。类似地，已有人提出将来自树突细胞的微囊泡用于免疫治疗(Lamparsky，US6812023)，例如预防不希望发生的自体抗原或移植物抗原引发的免疫反应，或用于降低过度抗原反应(Mattews AlbertL,US20020004041)。
[0007]现有技术还研究了将抗原呈递细胞的外来体用作疫苗载体(DelcayreA, US20060222654)或用作抗肿瘤反应发生器(Delcayre A, US7704964)。
[0008]现有技术研究了来自内皮细胞(优选内皮祖细胞)的微囊泡，例如这些微囊泡有望在胰岛胰腺内皮细胞移植治疗I型糖尿病或2型糖尿病中作为佐剂。佐剂效应能使移植的胰岛存活并具有功能(Cantaluppi V, US20100233216)。
[0009]再者，有报导称，当所述两种细胞的细胞群由渗透膜分开时，仍会发生MSC对B淋巴细胞的抑制作用，这一观察结果被认为是支持了可溶介体的存在(Corcione, 2006; Augello, 2005)。然而，当使用MSC培养物上清液时，没有发生所述抑制作用(Corcione, 2006)或仅发生部分抑制(Augel1, 2005)。因此，目前认为:MSC完全抑制需要细胞间接触或B淋巴细胞信号释放(Corcione，2006)。
[0010]对间充质干细胞而言，已有报道称:在动物模型中，来自间充质干细胞的微囊泡(MSC-MV)可能是与给予MSC相关的抗凋亡和促再生作用的介体(Bruno2009; Herrera, 2009;Cats, 2011)。
[0011]本发明的发明人现在发现:分离自干细胞的微囊泡适合于有效介导对B淋巴细胞的免疫抑制作用。事实上，本发明发明人在间充质干细胞产生微粒中鉴定到了介导间充质干细胞对B淋巴细胞抑制作用的特异性介体，也称为微囊泡(MV)，这些微囊泡最近被认作是细胞间通信的介体。因此，来自间充质干细胞的微囊泡或外来体能有利地用作免疫抑制剂，特别是用于慢性炎性病变和自体免疫疾病，如I型糖尿病。特别地，已发现:从间充质干细胞培养基中获得的MV对于B淋巴细胞经CpG刺激后的抗体增殖、分化和生成有强烈的剂量依赖性效果。使用荧光标记，FACS和共聚焦显微分析都显示MV与CpG刺激的B淋巴细胞相关联但是不与T淋巴细胞、树突细胞和NK细胞之类其它淋巴细胞相关联，这一结果进一步支持测得效果具有特异性的观点。
[0012]这些结果提示:间充质干细胞产生的MV是间充质干细胞对B淋巴细胞抑制作用的载体。因此，特定培养条件下MSC产生的MV可代替MSC细胞本身用于治疗，并且在标准化、便于操作、安全性和有效性方面有显著优势。如免疫球蛋白分泌减少所示，使用MSC和MSC-MV还能抑制B淋巴细胞的功能。另外，还发现MSC-MV浓度与B细胞增殖抑制和分化抑制之间线性相关。
[0013]为了检验观察到的现象是否是由PBMC中其他细胞群的相互作用所介导，在如前所述实验条件下用荧光染料标记MSC-MV，用FACS和共聚焦显微分析检验MSC-MV与不同细胞表型的关联，不同细胞表型各自用特异性细胞表面标志的荧光抗体标记。MSC-MV表现为仅仅与B淋巴细胞关联，而不与T淋巴细胞、NK和树突细胞关联。这些数据提示:MSC对B细胞的抑制作用很大程度上由MV的释放来介导，即便或许不是完全由此介导。
[0014]另外，下面报导的实验数据显示了 MSC-MV的体内抗炎性作用。特别地，溃疡性结肠炎动物模型获得的结果显示临床改善和炎症(flogosis)指数降低。
[0015]因此，使用MSC-MV代替完整的MSC活细胞在安全性和便于操作方面提供了一系列有意义的便利。另外，使用MSC-MV提供了生产和临床应用的便利。
[0016]就生产而言的便利有如下这些:
[0017]-MSC-MV能够在培养基中通过MSC的持续释放来生产，并能通过超滤/超速离心来分离。
[0018]-能用生物反应器来放大生产，所述生物反应器能使大量细胞适应三维结构，并且便于分离连续的MSC-MV产物流。
[0019]-能通过添加多种物质(例如细胞因子如Y干扰素)从而基于培养基组成或基于可调的物理条件(如氧气压力)来刺激细胞生产MSC-MV。
[0020]-MSC-MV能通过超滤来从培养基中分离，所述超滤使用截留值为30~IOOkD的过滤器。
[0021]-超滤浓缩之后，MSC-MV能通过1000OOg的超速离心来纯化。
[0022]-任选地，可以对分离和纯化的MSC-MV而不是活细胞进行辐射灭菌。
[0023]-可以方便地将MSC-MV冷冻在PBS中，可以任选性地添加批准用于临床的低温保护剂(如DMS0)，并可以在解冻后通过超滤/超速离心来洗涤。至此，所得产物既可使用，即不必像采用细胞那样检验其活力和功能。
[0024]-所得的产物比活细胞更容易标准化，这更符合药品管理和降低成本的要求。
[0025]-MSC-MV能用作效应放大分子(如膜联蛋白V)的载体(见图9)
[0026]临床优势包括:
[0027]-MSC-MV代谢迅速(Gatti，2011)，不会像活细胞那样发生异位定植问题。
[0028]-MSC-MV没有活细胞可见的致癌转化风险，特别是在体外(Tolar, 2007)。
[0029]-比之MSC，MSC-MV对活化的靶标B细胞(B淋巴细胞)有更具特异性和再现性的活性。
[0030]-与MSC不同，MSC-MV全身给药只需输注很少量的颗粒物质，因此，栓塞风险更低。
[0031]-MSC-MV重复给药，包括短间期的重复给药，没有安全问题，因而利于目标效果的实现，使用活细胞曾被报导有安全问题。
[0032]-MSC-MV比源细胞更简单、更稳定，并且其效果的再现性和可预期性更高，相反，移植之后MSC的命运是不确定的。例如，MSC的表现可能因相互作用的环境不同而不同，我们的实验数据也证实了这一点。相反，环境条件并不影响MSC-MV对淋巴细胞的活性。
[0033]-上面报导的所有优势就儿科医疗而言具有更为重要的意义，这是鉴于伦理原因和更小的体型以及更长的寿命。
[0034]因此，本发明的特定目标之一是提供分离自间充质干细胞的微囊泡用于免疫抑制治疗。
[0035]术语“微囊泡”的意义指大小约0.1~I微米的微粒的混合物。
[0036] 特别地，本发明的微囊泡能用于治疗炎性疾病、炎性慢性疾病和自体免疫疾病。所述炎性病变和自体免疫病变，特别是抗体介导的疾病，可以是严重疾病和慢性疾病。用本发明微囊泡治疗的目的是降低炎症(flogosis)程度、症状和相关并发症。慢性炎性疾病的例子包括自体免疫炎性疾病、风湿病如结缔组织炎症和脉管组织炎症。例如，能用根据本发明的MV治疗如下疾病:系统性血管炎、结节性多动脉炎、巨细胞动脉炎、韦格纳肉芽肿病、亨-舍二氏紫癜、冷球蛋白血症、中枢神经系统血管炎、多数性单神经炎、多发性大动脉炎(Takayasu's arteritis)、贝切特病、血栓闭塞性脉管炎(Buerger’s disease)、肠慢性炎性疾病如克罗恩病和溃疡性结肠炎、桥本甲状腺炎、自身免疫性溶血、阿狄森氏病、I型糖尿病、成人迟发型自体免疫性糖尿病(LADA)、迁延性糖尿病患者接受胰腺或胰岛移植后的复发性自体免疫性糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、皮肌炎、硬皮病、舍格伦综合征、多发性硬化、慢性自体免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、斑秃、白癜风、古德帕斯彻氏综合征、格-巴二氏综合征、慢性间质性肾炎、湿疹和皮炎、莱特尔综合征、活动性关节炎、囊性纤维化病、鼻窦炎、慢性支气管炎、牙周病、憩室病/憩室炎。
[0037]另外，本发明的微囊泡能用于治疗和预防移植排斥。例如，所述微囊泡能用于细胞、组织和实体器官移植，用于提高供体/受体相容性，降低免疫反应并促进免疫耐受性形成:移植物抗宿主病、对细胞和实体器官(移植物)的移植排斥。本发明的微囊泡还能用于抑制同种/异种细胞移植或基因治疗引起的免疫反应。
[0038]本发明的另一个目标是提供包含下列物质或由下列物质组成的药物组合物:作为活性成分的分离自间充质干细胞的微囊泡，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或佐剂，其中，所述微囊泡任选地与促进其免疫抑制活性的分子(例如膜联蛋白)结合。本发明的药物组合物的用途如前所述。
[0039]以下，将通过优选实施方式并结合附图对本发明进行描述，相关描述不具有限制性意义，其中:
[0040]图1显示CPG和MSC刺激的CLM的共培养。1A-1B)密度图显示的是CFMDA标记的CLM(c)和SCM(MSC/C)共培养之后CLM的细胞荧光检测分析结果，共培养所用SCM的MSC/C比分别为1:20、1:50和1:100。1A):R1门(gate)选择纯CLM培养物(C)和MSC共培养物中的⑶19阳性细胞。1B):左上象限Ql中显示纯CLM培养物(C)和MSC共培养物中的⑶19/CMFDA阳性细胞百分比。1C)柱状图(左)和折线图(右)分别显示纯CLM培养物(c)和MSC共培养物中CD19阳性淋巴细胞(B细胞)活度的平均值和抑制百分比，所示为采集3次独立实验数据所得。1D)柱状图(左)和折线图(右)分别显示纯CLM培养物(c)和MSC共培养物中CD19阳性和CMFDA标记细胞增殖的平均值和抑制百分比，所示为采集3次独立实验数据所得。
[0041]图2显示CpG、MSC或MSC-MV刺激的CLM的平行共培养。2A)密度图显示CMFDA标记的对照组(C) CLM和MSC或MSC-MV共培养CLM的细胞荧光检测分析。据活细胞(左图)的形态学参数(FSC-H;SSC-H)选择Ql门的淋巴细胞。依次对所述淋巴细胞进行增殖率分析(选择CD19/CD27阳性，右，上图)和对浆细胞(PC)中的分化期分析(选择CD19/CD27阳性，右，下图)。2B-2C)柱状图分别显示纯CLM培养物(C)和MSC或MSC-MV共培养物中CMFDA/⑶19阳性淋巴细胞的平均值和增殖抑制百分比。2D-2E)柱状图分别显示纯CLM培养物(C)和MSC或MSC-MV共培养物中CD19/CD27阳性浆细胞(PC)的分化平均值和分化抑制百分比。结果是3次独立实验的平均值和标准差。*p〈0.05
[0042]图3显示了在MSC或MSC-MV共培养之后，CpG刺激的CLM中免疫球蛋白产量的抑制。对纯CLM培养(C)、MSC共孵育或MSC-MV共孵育的上清液进行ELISA试验。结果是3次独立实验的IgM、IgG或IgA浓度(ng/ml)的平均值和标准偏差。*p〈0.05
[0043]图4显示了 MSC-MV的表征。使用FACSCanto细胞荧光仪获得MSC释放的MV的代表性散点图。4A)使用0.5-1 μ m标定珠来选定MV门。4B)Q4象限中用膜联蛋白V、7_AAD和Trucount (Pl)珠来鉴定4A中所示MV门选择的MSC-MV。
[0044]图5显示了 MSC-MV对CLM中B淋巴细胞的剂量依赖性效果。图A显示不稀释(MV)或者1:3或1:6稀释的MSC-MV培养之后CpG刺激的CLM的增殖抑制(左图)和分化抑制(右图)。观察到了强烈的抑制效果。 结果来自4次独立实验。
[0045]图6显示了在CpG刺激之后选定CLM群摄取经PKH26标记的MV的FAC分析。6A)在3个不同的门选定的⑶3+、⑶86+淋巴细胞和双阴性(Dneg)的密度图；6B)PKH26标记的MSC-MV孵育之前(上图)或孵育之后(下图)选定⑶3-FITC、⑶86-APC阳性淋巴细胞的荧光强度柱状图。⑶86阳性细胞的荧光强度较高。6C)在3个不同的门选定的⑶56+、⑶19+淋巴细胞和双阴性(Dneg)的密度图；6D)PKH26标记的MSC-MV孵育之前(上图)或孵育之后(下图)选定⑶56-FITC、⑶19-APC-Cy7阳性淋巴细胞的荧光强度柱状图。⑶86阳性细胞的荧光强度较高。
[0046]图7显示了 CLM的共焦显微镜分析。细胞用APC偶联的抗⑶3、抗⑶19和抗⑶86抗体(绿色伪染色)以及抗-CD56抗体(绿色)染色，细胞中添加PKH26染色的MSC-MV (红色)(右图)或不MSC-MV共孵育(左图)。MV主要见于CD19阳性细胞(箭头)和CD86阳性细胞(箭号)的胞质。细胞核用赫斯特复染。放大尺:10μm。
[0047]图8显示了对细胞亚群的Z重建共聚焦显微分析。对ΡΚΗ26阳性的MSC-MV共孵育淋巴细胞的显微照片进行激光扫描来进行Z重建微照片(a，d)，所述细胞用抗-CD19(a_c)和抗-CD86 (d-f)抗体染色。从连续多个光截面获得的XZ和XY(b-C，e-f)轴的投影图分别显示⑶19阳性(C，绿色)和⑶86阳性(f，绿色)细胞中荧光红色染料标记的MSC-MV的胞内定位。细胞核使用赫斯特染色。放大尺:5ym(a，d)和2ym(b_c，e-f)。图9中的柱状图显示纯PBMC培养物(c)和PBMC与MV共培养物中增殖细胞和分化细胞的平均值，所述共培养是用1:3稀释的MV共培养，或者用1:3稀释的MV和膜联蛋白V (浓度10 μ g~0.1 μ g)的共育物共培养。膜联蛋白V以剂量依赖性方式增强MV的抑制效果。
[0048]图10显示以下试验组实验第六天结肠组织中的TNF a、IL_1、IL_6和Cox2表达:没有结肠炎诱导并仅给予PBS的对照动物(载剂/PBS)、有DSS诱导的结肠炎并仅给予PBS的动物(DSS/PBS)、和有DSS诱导的结肠炎并注射给予分离自干间充质细胞并悬溶于PBS的微囊泡的动物(DSS/MV)。数值为平均值土SD。*p〈0.05。
[0049]图11显示以下试验组结肠组织的组织学分析(苏木精-伊红):有DSS诱导的结肠炎并仅给予PBS的小鼠(A)，有DSS诱导的结肠炎并注射给予分离自间充质干细胞的微囊泡。治疗组小鼠的粘膜和粘膜下层中可见明显淋巴单核细胞(I imphomononuc I ear )和组织细胞组分炎性浸润。
[0050]实施例1:从间充质干细胞分离微囊泡以及微囊泡对B淋巴细胞作用的体外研究
[0051]材料和方法
[0052]充质干细胞的培养和扩增
[0053]将骨髓来源的人间充质干细胞(购自MSC;瑞士巴塞尔的龙泽公司(Lonza))接种入有通气塞的75cm2聚苯乙烯培养瓶(美国BD公司(Becton Dickinson)),瓶中含有IOmlMesencult基础培养基(加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华的干细胞技术公司(Stem CellTechnologies))，接种浓度为4X103细胞/cm3，所述培养基补充有胎牛血清(20%，FBS,海克隆实验室公司(Hyclone Laboratories)) > 100U/ml的青霉素和100 μ g/ml的链霉素(纽约州格兰德岛的吉布可公司(Gibco))。培养物在37°C、5%C02的湿润环境中孵育。然后，细胞在相同培养基中维持，在80-90%融合时用胰蛋白酶/EDTA溶液(意大利英杰生命技术公司(Invitrogen, Life Technologies))消化,再以1:2稀释重新接种。每周更换培养基。
[0054]从外周血分离淋巴单核细胞
[0055]在罗马耶稣圣婴儿童医院输血中心(Centro Trasfusionale OspedalePediatrico Bambino GestO采集来自健康供体的血液样品。在知情同意后,用50ml肝素化的静脉血经过菲可梯度(美国密苏里州圣路易斯的西格玛化学公司(Sigma Chemical C.)Histopaque)分离外周血细胞中的单核淋巴细胞(CLM)，在磷酸盐缓冲盐水中洗涤两次，然后在液氣中低温储存。
[0056]来自外周血的淋巴单核细胞与MSC的共培养
[0057]实验测定与贴壁MSC共培养的B淋巴细胞的活力，所述MSC贴壁培养于96孔培养板(意大利米兰Celbio的康宁克斯公司(Corning-Costar)),培养基为加有20%FBS的基础Mesencult培养基，起始浓度为2.5xl04、IXlO4或5xl04细胞/孔。在免疫调节试验中，MSC以更低的浓度(5xl03细胞/孔)贴壁培养于96孔培养板，培养基为加有20%FBS的基础Mesencult培养基。第二天，将MSC附着孔中的培养基去除，换以CLM(5xl05/孔，分别对应1:20、1:50、1:100MSC/CLM比)。MSC预先用5-氯甲基荧光素二乙酸酯(CMFDA，分子探针公司(Molecular Probes)的分子追踪物(Cell Tracker))标记,标记浓度为0.5 μ Μ,并与MSC在加有10%FBS的RPMI1640培养基(比利时洛纳(Lona)的BW公司(BioWhittaker))中共培养。用2.5 μ g/ml的CpG人寡脱氧核糖核苷酸(HBT公司(Hycult Biotechnology))孵育来刺激B淋巴细胞。一周后，培养细胞在杜尔伯科(Dulbecco)磷酸盐缓冲盐水(D-PBS，意大利米兰的欧洲克隆公司(Euro-Clone))中洗涤，并用FACS (荧光活化细胞分选分析，FACSCanto II，BD生物科学公司)来分析。
[0058]CLM与来自MSC的微囊泡(MSC-MV)共培养
[0059]用90%融合的MSC培养物制备条件培养基(CM)。5天培养之后，从板上回收培养基，通过1000g离心20分钟除去细胞碎片，细胞培养的起始浓度为2xl06/孔。然后，如下所述分离MSC生产的微囊泡(MSC-MV)，加入到5x105CFMDA标记的已接受CpG刺激(HBT公司)I小时和24小时的淋巴细胞中。对某些选定试验，MSC-MV在RPMI1640培养基(BW公司)中以1:3、1:6稀释，然后加入到已培养I小时和24小时的经标记CLM培养物中。2.5 μ g/ml的CpG人寡脱氧核糖核苷酸(开始培养时加入)存在下一周以后，离心回收CLM、洗涤并进行FACS分析。
[0060]从培养基中分离微囊泡的具体说明
[0061]微囊泡分离方法是Lamparski等(2002)的改进方法
[0062]1.90% 融合的 MSC:n=6T75/cm2 (I lml/ 板)
[0063]2.回收培养基
[0064]3.在1000g离心10分钟以除去细胞碎片
[0065]4.从各样品回收IOml培养基
[0066]5.用4ml30kDa过滤器(密理博公司(Millipore))来浓缩培养基
[0067]6.回收浓缩的培养基(各个过滤器约50 μ I)，在超速离心管中稀释于PBSlOml
[0068]7.在4°C 1000OOg超速离心I小时
[0069]8.回收MSC-MV沉淀并在PBSlOml中稀释
[0070]9.用4ml30kDa过滤器(密理博公司)来浓缩MSC-MV溶液
[0071]10.回收约15-20 μ I的选定样品(MSC-MV)
[0072]为了从MSC分离微囊泡，在异质同晶聚合物管(意大利米兰的贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))中，将前文所述过程获得的条件培养基稀释于10ml PBS，然后在4°C 1000OOg超速离心I小时。在过程结束时，从管底收集了 2ml超速离心的培养基，稀释于 IOml 的 PBS,在 30kDa MWCO 亚米康(Amicon)超速离心(Ultra Centrifugal)无菌过滤器(密理博公司)中2000g离心浓缩20-30分钟，达到15-20 μ I终体积。
[0073]免疫球蛋白产量测评
[0074]经CFMDA标记的CLM在96孔板中、在加有FBS10%(海克隆公司)的RPMI1640 (Bff公司)培养基中与MSC(1:100比率)或MSC-MV共培养。一周后，孔板以300g离心5分钟，回收上清液，进行ELISA试验(酶联免疫吸附试验)。为了测评免疫球蛋白产量，针对PBS稀释的人 IgA、IgG 或 IgMdgAlO μ g/ml, IgG15 μ g/ml, IgM2, 5 μ g/ml,宾夕法尼亚州维斯格鲁甫的杰克逊免疫研究实验室公司(Jackson ImmunoResearch Laboratories))的纯化羊免疫球蛋白通过4°C过夜孵育附着到ELISA96孔板(康宁公司)的表面上。在3次0.1%PBS/吐温洗涤之后，将细胞培养上清液加到板上(50μ I/孔)，37°C湿润环境下孵育I小时。洗涤之后，孔板在37。。与PBS稀释的针对人IgA(1:1000)、人IgG(1:2000)或人IgM(l: 1000)的过氧化物酶偶联抗体(杰克逊免疫研究实验室公司)(50 μ I)孵育I小时。加入PBS稀释的邻苯二胺(o-phenylendiamine)片剂(西格玛-艾尔德里奇公司)作为发色底物。30分钟后加入10%十二烷基硫酸钠(50μ1/孔)中断反应。最后，用分光光度计(微孔板分光光度计Benchmark Plus)在4600D读板。[0075]细胞荧光测定分析
[0076]在共培养最后，从培养板中回收CLM，300g离心5分钟，并在PBS/FBS (2%)中重悬。单细胞悬液与针对下列人表面分子的直接偶联单克隆抗体在4°C暗孵育20分钟:CD19(1:7，Cy5 偶联)、CD27[1:7，藻红蛋白(PE)偶联]、CD38 (1:30，PE_Cy7 偶联)、IgMd: 100, Cy5 偶联)、CD86 (1: 5，APC 偶联)、CD3[1:7，荧光素(FITC)偶联]、CD56(1:7，FITC偶联)、CD19[1:20别藻蓝素-Cy7(APC)偶联]。所有抗体来自BD公司(Becton Dickinson)(美国新泽西州富兰克林湖市的BD)。抗体结合之后，细胞用2%PBS/BSA洗涤两次，并用FACSCanto II (BD)获得数据。用细胞搜索软件(Cell Quest Software)(BD)分析细胞荧光检测概况。每一个试验记录至少20，000个事件。
[0077]为了表征MSC-MV，每个试验中，如上所述从含有2x106MSC的上清液中获得MSC-MV，所得MSC-MV与5 μ I人表面分子单克隆抗体、APC偶联的膜联蛋白V(BD)与7-氨基-放线菌素活体染料[7-AAD，与多甲藻黄素-叶绿素-蛋白(PerCP)BD复合物偶联]的组合(complex)共孵育，所述孵育根据试剂盒说明书，在500 μ I终体积的膜联蛋白Vlx结合缓冲液(BBlx)中进行。这种组合能够特异性鉴定来自非凋亡MSC的MSC-MV。在室温暗孵育15分钟后，将MSC-MV样品转移到含微珠的Tixnicount (BD)管中以标化尺寸。使用所述微珠基于形态学参数来设定MSC-MV门(前向散射，FSC-H ;侧向散射，SSC-H)。
[0078]CLM 的 MSC-MV 摄取
[0079]根据生产商说明书，从2X106MSC(见上)的培养基中分离MV，并用2.5xl0_6(美国圣路易斯的西格玛公司)浓度的PKH26染料标记。经标记的MV与CLM(5X105细胞/孔)在加有10%FBS的RPMI中孵育。在37°C、5%C02的湿润环境中孵育I小时之后，细胞群用PBS洗涤，并分成2份，一份用细胞荧光仪分析，另一份用共聚焦显微镜分析。
[0080]免疫荧光分析
[0081]CLM与经PKH26标记的MV孵育，用PBS洗涤，在4%甲醛中固定，与5%PBS/FBS孵育30分钟，并用下列单克隆抗体单独染色=APC(BD)偶联的抗_CD86(1:10)、抗-CD3(1:10)和抗-CD19 (1:10)以及FITC偶联的(1: 30)抗-CD56 (BD)。所有的抗体都在1%PBS/BSA中稀释，并孵育I小时。使用没有MV孵育的CLM样品，或在染色中不使用一抗的CLM样品来制备阴性对照。
[0082]细胞核用赫斯特333421 μ g/ml (英杰公司，美国俄勒冈州的分子探针公司(Molecular Probes))复染。用PBS洗漆之后，样品用延长抗衰减(Pro-long Ant1-Fade)(英杰公司)试剂进行封固。
[0083]共聚焦显微观察和图像分析
[0084]共聚焦分析使用奥林巴斯Fluoview FV1000共焦显微镜，该显微镜包含2.0版FV10-ASW, Multi Ar (458-488 和 515nm)软件，配有二极管激光器 2X He/Ne (543 和 633nm)和60x (I, 35NA油镜)405透镜。1024X1024像素扫描获取各光学切片，207nm/像素大小，40微秒/像素的取样速度和12位(bit)/像素。通过多通道图像的自动顺序获取来避免荧光团混合，从而降低通道光谱干扰。’针孔’开口是IAir单位。
[0085]单个系列光学切片的Z重建参数如下:1024xl024像素扫描模式，对应103nm/像素的2倍电子放大、有20 μ s/像素的取样速度和0.40微秒/切片的Z间距。使用Photoshop9, O版(加利福尼亚州的Adobe系统公司)来处理图像。
[0086]统计学分析
[0087]对数据进行平均值、最大值和最小值等定量分析。进行方差的非参数分析(克-瓦二氏检验)以便进行各组定量数据比较；进行曼-惠特尼U检验，作为方差分析后的检验。认为P〈0.05是统计学显著的。使用GraphPad软件(GraphPad Prism, Release3.03,加利福尼亚州拉霍亚的Avenida de la Playa)进行统计学分析。
[0088]结果
[0089]CLM与MSC共培养
[0090]对B细胞活力的作用
[0091]首先研究了与MSC的共培养对CpG刺激的B淋巴细胞活力的作用。将MSC与经CMFDA标记的CLM(C)共培养，MSC采自7个健康供体。在7天孵育之后，通过细胞荧光检测分析来检测经标记的CLM总样品中的CD19阳性细胞。在MSC/C1:20观察到对B细胞活力的最大抑制(图1A);在1:50和1:100稀释被证明同样有抑制作用(图1A、1B)。
[0092]对B细胞增殖的作用
[0093]进一步测定了 MSC共培养对B细胞增殖的作用。在上述实验条件下7天之后，通过细胞荧光检测分析来选定⑶19/CMFDA双标记门。从图1C可见，在MSC/C1:20比率获得了对B细胞增殖的最大抑制。另外，MSC/C1:50和1:100被证明同样有抑制作用，1:100比率的效果较弱。图1D的Ql象限显示了增殖B淋巴细胞(⑶19阳性和CFMDA标记)相对于淋巴细胞总数的百分比；MSC/C1:100已将所述增殖高度抑制(90.3%)。因此，在后续共培养实验中全部使用这个比率。
[0094]CLM与MSC或MSC-MV共培养平行试验
[0095]在平行实验中，研究了与MSC或MSC-MV共培养对B淋巴细胞增殖和分化的作用。为此，在实验开始I小时和24小时后，将MSC-MV加入到CLM中。平行培养中，CLM与MSC在相同的1:100比率共培养。在存在MSC和存在MSC-MV两种情况下都观察到了具有统计学意义的B细胞增殖抑制(图2A)。在MSC存在和MSC-MV存在两种情况下，获得了相似的抑制百分比，分别为70%和60%(图2B)。在这些平行实验中，还研究了浆细胞分化。通过CD19和CD27的双染色来鉴定浆细胞系(PC)。在MSC存在和MSC-MV存在两种情况下都观察到具有统计学意义的抑制，分别为98%和100%。和MSC —样，MSC-MV也抑制IgM、IgG和IgA的生成(图3)。
[0096] 另外，还对上述细胞培养物中的免疫球蛋白生产进行了测定。7天之后，回收上清液进行ELISA分析。如图3所示，MSC和MSC-MV都抑制IgM、IgG和IgA的生成。
[0097]MSC-MV 的表征
[0098]已经证实了我们的方法能分离得到纯MSC-MV，还通过细胞荧光检测分析进行了定量检测。根据DNA7-AAD标记阴性将MSC-MV群区别于凋亡细胞片段，并且MSC-MV群显示膜联蛋白V阳性(图4)。
[0099]MSC-MV对B淋巴细胞的剂量依赖性效果
[0100]图5显示了 MSC-MV对B淋巴细胞的增殖和分化有剂量依赖性效果。分化抑制强于增殖抑制。
[0101 ] CLM 对 MSC-MV 的摄取
[0102]CLM与经PKH26标记的MSC-MV预孵育后进行细胞荧光检测分析，分析显示，所述的摄取选择性地可见于CD86阳性细胞亚群和其中的CD19阳性细胞，这些细胞对应B淋巴细胞。对应⑶3阳性细胞的T淋巴细胞显示阴性。对应⑶56阳性细胞的NK细胞也显示阴性(图 6)。
[0103]使用激光共聚焦显微镜对预先与PKH26标记的MSC-MV共孵育或不与其共孵育的CLM进行免疫荧光分析，用于测评MSC-MV与特异细胞类型的相互作用(图7)。使用针对⑶3、⑶19、⑶56和⑶86分子的荧光素偶联抗体组，抗体的共定位再度显示MSC-MV与⑶19和⑶86阳性细胞发生关联，而⑶19和⑶56阳性细胞则没有检测到关联(图7)。PKH26标记的染红MSC-MV的定位分析是基于⑶19和⑶86阳性细胞单个系列光学切片的Z重建来进行(图8)。XZ轴和YZ轴投影来测得的MSC-MV横向和轴向分布显示⑶19和⑶86阳性细胞胞质内的胞内定位(图8)。
[0104]实施例2:MV与膜联蛋白V结合增强对B淋巴细胞的抑制效果
[0105]膜联蛋白V结合细胞膜上外露的磷脂酰丝氨酸，并改变该细胞的免疫反应(Munoz, 2007)。在这个实验中，将如前所述获得的MVl: 3稀释，根据生产商说明书，与纯化的重组膜联蛋白V在室温(BD公司，浓度范围10 μ g~0.1 μ g)、在100 μ I终体积的膜联蛋白V结合缓冲液(BBBlx)中孵育15分钟。然后，MV用PBS通过超速离心洗涤，并与CFMDA标记的CpG刺激的PBMC共培养。7天后，对培养物进行细胞荧光仪检测以测定B淋巴细胞增殖和分化。添加膜联蛋白V以剂量依赖性方式显著增强MV对活化的B淋巴细胞的抑制作用。该策略可用于增强MV的免疫调节作用。
[0106]实施例3:用来自间充质干基质细胞的微囊泡(MSC-MVS)来治疗实验性溃疡性结肠炎
[0107]本实验在慢性炎性肠道疾病实验模型中测评MSC-MV抑制作用的治疗意义。
[0108]动物模型
[0109]在雌性8周龄B57BL/6J小鼠中进行实验。如下诱导结肠炎:给予溶于饮用水的3%十二烷基硫酸钠(DSS)，自由进食，为期5天。这是一个成熟且广泛使用的动物模型，在PubMed中被引用数百次(参见Kawada等，2007)。对所有的动物的处理都符合拉奎拉大学的伦理规范，其中，实验期间自由采食水和食物，且保持12小时暗/光周期。将动物分成三个实验组。
[0110]?第I组(n=4，正常对照):从第I天至第5天每日腹膜内(ip)注射PBS(纯载剂)0.2ml ；
[0111]?第2组(n=5，结肠炎诱导):饮用水中加有3%DSS，其余同第I组。
[0112]?第3组(n=4，结肠炎诱导并用微囊泡治疗):通过IP给予悬浮于0.2ml PBS的MSC-MV，其余同第2组。
[0113]在第6天，使用CO2处死动物。切下结肠，将一部分组织用福尔马林中固定以用于后续组织学分析，另一部分立即在液氮中冷冻并存储在_80°C以用于后续提取RNA。
[0114]MSC-MV的剂量和给药途径
[0115]如前所述，从24小时培养的2x106MSC制备MSC-MV，给予动物模型。
[0116]给药途径:从第O天至第5天，通过腹膜内方式每天给予悬浮于0.2ml PBS的MSC-MV。
[0117]小肠损伤测评
[0118]动物体重
[0119]疾病活动指数(粪检；见Tanaka F，2008)
[0120].炎症(flogosis)的组织病理学特征
[0121]?通过RT-PCR测定结肠组织提取物中炎症介体表达的效价:TNFa、IL6、IL_1 β和Cox20
[0122]结果的统计学分析
[0123]数据表示为平均值土SD。通过t检验来分析组间差异，p〈0.05表示显著。
[0124]结果
[0125]接受处理的所有动物都存活。对照动物(第I组)在一周中体重逐渐增加，经DSS处理的动物从第四天开始显示体重降低(表1)。体重降低被发现与液态稀便且含血相关，同时，结肠炎活动指数升高(表1)。给予DSS并且每天腹膜内注射给予MSC-MV的动物中，体重降幅和结肠炎活动指数都显著较低。给予DSS的动物中水摄取减少，且这种减少具有统计学意义，但接受和不接受MSC-MV两个实验组之间则未见具有统计学意义的区别(表I)。
[0126]表1显示以下动物组实验第六天的体重、疾病活动指数和水摄取:未经结肠炎诱导并仅给予PBS的对照动物(载剂/PBS)，经DSS诱导结肠炎并仅给予PBS的动物(DSS/PBS)和经DSS诱导结肠炎并注射给予微囊泡(所述微囊泡从间充质干细胞分离并悬溶于PBS)的动物(MV/DSS)。
[0127]根据下面标准来评价疾病活动指数(粪检评分):
[0128] 正常/半固体粪便=1 ;半固体含血粪便=2 ;含血液态稀便=3
[0129]表1
[0130]
【权利要求】
1.用于免疫抑制治疗的分离自间充质干细胞的微囊泡。
2.如权利要求1所述分离自间充质干细胞的微囊泡，所述微囊泡用于治疗急性炎性疾病和慢性炎性疾病以及自体免疫疾病。
3.如权利要求1所述分离自间充质干细胞的微囊泡，所述微囊泡用于治疗和预防移植排斥。
4.如权利要求1所述分离自间充质干细胞的微囊泡，所述微囊泡用于治疗和预防移植物抗宿主病。
5.如权利要求1所述分离自间充质干细胞的微囊泡，所述微囊泡用于抑制同种/异种细胞移植或基因治疗引起的免疫反应。
6.一种药物组合物，所述药物组合物包含下列物质或由下列物质组成:作为主要活性组分的分离自间充质干细胞的微囊泡和一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或佐剂，其中，所述微囊泡任选地与膜联蛋白结合。
7.如权利要求6所述的药物组合物，所述药物组合物用于免疫抑制治疗。
8.如权利要求7所述用于免疫抑制治疗的如权利要求6所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗急性炎性疾病和慢性炎性疾病以及自体免疫疾病。
9.如权利要求7所述用于免疫抑制治疗的如权利要求6所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗和预防移植排斥。
10.如权利要求7所述用于免疫抑制治疗的如权利要求6所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗和预防移植物抗宿主病。
11.如权利要求7所述用于免疫抑制治疗的如权利要求6所述的药物组合物，所述药物组合物用于抑制同种/异种细胞移植或基因治疗引起的免疫反应。
【文档编号】A61K35/28GK103917275SQ201280037526
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2012年7月26日 优先权日:2011年7月28日
【发明者】M·穆拉卡, A·费拉布拉奇 申请人:耶稣圣婴儿童医院