专利名称：第二信使细胞信号传送抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明提供一组有效药剂化合物，其抑制通常由炎性刺激物诱导的特异性细胞信号传递活动，发挥着抗炎或免疫抑制剂的作用，发挥着用于治疗癌症的细胞毒性剂的作用，或直接或间接地抗微生物酵母或真菌感染。更特别地是，本发明的化合物在连结于核心部分的侧链上至少有一个氨基醇(或其衍生物)功能基团。本发明的化合物是有用的拮抗剂，控制细胞内特异sn—2不饱和磷脂酸及相应的源于磷脂酸的二酰基甘油，对初期炎性和选择性增殖刺激物反应产生的细胞内细胞信号传送信使的水平。
己酮可可碱[1—(5—氧己基)—3，7—二甲基黄嘌呤]，简写为PTX，是医疗上广泛用于增加血流量的黄嘌呤衍生物。美国专利号为3422107和3,737,433，二者皆为Mohler等公开的PTX。PTX的代谢物Davis等已概述于“哺乳动物代谢微生物模型己酮可可碱的微生物还原和氧化”，Applied and Environmental Microbiology，Vol.48 No.2 pages 327—381，August，1984，及Bryce等“健康志愿者14C—己酮可可碱代谢和药物动力学”Arzneim—Forsch.1 Drug Res.Vol.39，No.4 pages 512—517，1989。PTX的一个代谢物是1—(5—羟己基)—3，7—二甲基黄嘌呤，命名为M1。M1由于可增加脑血流量也公开了，美国专利号为4,515,795和4576,947。其它代谢物包括1—(5—戊酰基)—3，7—二甲基黄嘌呤羧酸，命名为M4，及1—(4—丁基)—3，7—二甲基黄嘌呤羧酸，命名为M5。此外，美国专利号4,833,146和5,039,666公开了用于增加脑血流量的黄嘌呤叔醇类似物的用途。
PTX及其已知代谢物在特异的生物系统证明有体内活性。美国专利号4,636,507描述了在多型核白细胞对趋代性刺激强趋化性的PTX的能力。此外，PTX和相关的叔醇取代的黄嘌呤抑制了美国专利号4965,271和5,096,906所述的影响趋化性的某种细胞因子活性。而且，同时给药PTX和GM—CSF，进行异体骨髓移植的患者肿瘤坏死因子(TNF)的水平降低。Bianco等“己酮可可碱(PTX)和GM—CSF降低进行异体骨髓移植(MBT)病人的肿瘤坏死因子(TNF·α)水平，”Blood，Vol.76 No.1，Suppl.1(522)，page133a，November 15，1990。可测定的TNF水平的降低伴随着BMT—相关的并发症的降低。然而，在一些正常的志愿者，接受了PTX，TNF水平较高。因此，提高的TNF水平不是此类并发症的主要原因。
所以，需要对人或动物用药安全、有效，面对各种炎性刺激物能维持细胞稳态的有效治疗化合物。本发明就是为寻觅此类化合物进行研究的结果。
本发明提供了对大量不同的治疗适应症有用的化合物，用于调节由通过特异的细胞内信号途径产生的细胞内信号传递引起的疾病。此外，本发明的化合物和药物组合物适于为提供治疗化合物有效剂量的正常的治疗给药途径(例如，非肠道、口腔、皮肤表面等等)。
本发明提供一类化合物，他们是有效的治疗药剂，可抑制特异性炎症和增殖性细胞信号传递活动。此化合物和药物组合物的结构式为(X)j—(核心部分)式中j是1至3的整数，核心部分是非环状的，并可含不同的原子，环状或杂环，此处环状或杂环核心部分至少含-4～7小环，并且X是消旋的混合物、R或S对映体、溶合物、水合物、或盐 *C是手性碳原子；n是1～4的整数(最好是1～3)；(CH2)n的一或多个碳原子可被酮基或羟基取代；m是4～14的整数(最好是8～14)；独立地，R1和R2是氢，直链或支链烷烃或烯烃，长度至多12个碳原子，或—(CH2)wR5，w是2～14的整数，R5是一个单、二、或三取代的或不饱和芳基基团，R5上的取代基是羟基、氯、氟、溴、或C1-6烷氧基；或R1和R2结合在一起形成了一种取代或非取代的、饱和或不饱和的有4～8个碳原子的杂环基团，N为杂原子；R3是氢或C1-3；或 式中R4是氢，直链或链烷烃或烯烃，长度至多8个碳原子，—(CH2)wR5，w是2～14的整数，R5是单、双或三取代或非取代的芳基基团，R5上的取代基是羟基、氯、氟、溴，或C1-6烷氧基、或取代或非取代、或饱和或不饱和有4～8个碳原子的杂环基团，r和s是独立地1～4的整数；总和(r＋s不大于5；t是1～14的整数；和一个或多个(CH2)s碳原子，或(CH2)t可被酮基或羟基取代。
非环核心部分可以是，如乙酰胺、酰胺、胺、氨基酸(一或二个)、羧基、酯、卤素原子、末端氢、羟基、戊二酸、甘氨酸衍生物、酮、磷酸酯、膦酸酯、硫酸酯、磺酸酯、砜、亚砜、单一离子功能基团、硫醇或硫醇酯。典型的核心部分氨基酸可包括一或多种下列氨基酸丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸，最好是一个更疏水的氨基酸如亮氨酸或异亮氨酸。非环核心部分最好包括一个含前面所述例证列出的两个氨基酸的二肽。举例的核心卤素原子包括溴、氯、氟、碘。
一个核心部分可分别含至少一5～7员环，最好为1～3个，在一个突出的平面构象中有5～6员环结构。假如有氮的话，最好，取代基(X)和环上氮相链。例如，核心部分可从含取代或非取代巴比土酸、苯甲酰胺、苯、联苯、环己烷、环己烷二酮、环戊烷二酮内酰胺、戊二酰胺、高邻苯二甲酰亚胺、氢邻苯二甲酰亚胺，咪唑、咪唑酰胺、1—对氯苯甲酰—5甲氧—2—甲基吲哚醋酸、异喹诺酮、2，4—二氧四氢喋啶、萘、酚、喋啶、pthalimide、哌啶、吡啶、嘧啶、吡咯酰胺、喹嗪二酮、喹唑啉酮、喹诺酮、recozsinol；水杨酸及其衍生物。芪、琥珀酰亚胺、3，7—二甲基黄嘌呤、胸腺嘧啶、三嗪、三环十二烷、尿酸、尿嘧啶、维生素A、E或K，或黄嘌呤的基团中选取。
最好环状核心含取代或非取代戊二酰胺、甲基胸腺嘧啶、甲基尿嘧啶、3，7—二甲基黄嘌呤、尿嘧呤和黄嘌泠，最理想是卤素取代的黄嘌呤。列举的优选核心包括1，3—环己烷二酮、1，3—环戊烷二酮、1，3—二羟基萘、1—甲基—2，4—二氧四氢喋啶、甲基巴比土酸、3，3—二甲基戊二酰胺、乳清酸、四或六氢邻苯二甲酰亚胺、邻位酚、前列腺环素、2—羟基吡啶、甲基二羟吡唑并嘧啶、尤其是1，3—二甲基二羟基吡唑并[4，3—d]嘧啶、甲基吡咯并嘧啶、1—甲基吡咯并[2，3—d]嘧啶、1，3—二羟基萘、1—吡咯酰胺、2—吡咯酰胺、3—吡咯酰胺、1，2，3，4—四氢异喹诺酮、1—甲基—2，4(1H，3H)—喹嗪二酮(1—甲基苯甲酰烯脲)、喹唑啉—4(3H)酮、舒林酸、双氢胸腺嘧啶、烷基取代(C1-6)胸腺嘧啶、2，4—二氧六氢—1，3，5—四嗪、甲基胸腺嘧啶、烷基取代(C1-6)尿嘧啶、稠合到萘的尿嘧啶、6—氨基尿嘧啶、1—甲基—5，6双氢尿嘧啶、1—甲基尿嘧啶、位置5和/或6取代的尿嘧啶(如，5—氟尿嘧啶)、作为维生素A的紫罗酮、作为维生素A的2，6，6—甲基—环己烯—1—乙醛、作为维生素K4四氢萘酮、1，7—二甲基黄嘌呤、3，7—二甲基黄嘌呤、3—甲基黄嘌呤、3—甲基—7—甲基新戊酰黄嘌呤、8—取代黄嘌呤(含如N或S的取代基)、和7甲基次黄嘌呤。
最好X与核心部分氮相连，最好核心部分是黄嘌呤而且X和N1黄嘌呤氮相连，N3及N7黄嘌呤氮独立地被从由氢、甲基、氟、氯和氨基组成的基选择的成分取代。
本发明提供了一种含发明化合物及药物学上可接受的赋形剂的药物组合物。药物组合物可配成药方，对患者经口腔、非肠道或皮肤表面给药。
本发明含一种治疗患不同种疾病患者的方法。疾病可被确定或治疗，通过抑制免疫应答或对外部或就地原发性刺激的细胞应答，通过在近细胞膜内小叶发挥作用的特异的磷脂为基础第二信使调节的细胞应答。第二信使途径通过对富于各种疾病状态特色的不同的有害或增殖刺激反应而活化。这里已叙述了此第二信使途径的生化过程。更特异地，此发明包括治疗或预防不同疾病状况临床症状或降低其它疗法的毒性的方法，后者通过抑制由第二信使途径产生的细胞信号传递，此途径包括由磷脂酸和聚糖磷脂酰肌醇(Gly PI)产生的信号传递。
本发明的化合物对抑制由IL—2诱导的增殖反应特别重要。IL—2信号传递抑制作用对治疗包括T—细胞激活和过度增生在内的多种病情具有潜在的作用。通过抑制IL—2信号传递治疗的典型自身免疫性疾病有狼疮、硬皮病、类风湿性关节炎、多重硬化、肾小、球肾炎及潜在恶化，包含但不限于慢性骨髓性白血病等。
图1A和1B是由刀显素A(ConA)和IL—2α(IL—2)共刺激使鼠胸腺细胞增殖，以及环孢菌素A(CsA，图1A)和不同的发明化合物(N1B)的剂量反应曲线。
图2A和2B说明了使用双向，混合淋巴细胞反应在一个实验中测定对异源刺激的增殖PMBC反应，化合物第5号和第26号(见下面相应的名称和结构)的免疫调节活性。
图2C和2D分别报告的是在一个混合淋巴细胞反应中第27号和第13化合物的活性资料及IC50资料图2E表明在一个混合淋巴细胞实验中测定所测化合物的免疫抑制活性，5个发明化合物(相应化学名称见下文)的百分存活率图2F指产生于混合淋巴细胞反应实验的百分存活率结果。
图3A报告的是从对鼠胸腺细胞增殖显示抑制作用的几种发明化合物获得的结果。
图3B指的是共刺激胸腺细胞增殖抑制实验的比较结果。
图4报告的是在鼠脾细胞增殖(抗—mμ刺激实验)第27号和28号化合物的IC50值。
图5A和5B是一个IL—2(α链CD25)受体表达实验用2000个细胞测定频率直方图。
图6指的是鼠胸腺细胞IL—2生产抑制实验和CsA比较第49号和50号化合物的结果。
图7和8报告的是在一个重点为细胞或T细胞免疫应答的体外实验剂量反应结果。
图9A和9B报告的是在鼠细胞毒T—细胞系，CT6，关于直接由IL—2诱导的增殖，和CsA比较，发明复合物的抑制活性。
图10说明在抗酵母和抗真菌实验中发明复合物的活性。
图11报告的是在一个设计测定潜在抗原特异的诱导无反应性实验中发明化合物的活性资料。
图12指的是在一个用于说明预防或治疗再狭窄、动脉粥样硬化和冠状动脉病药物活性实验的第28号、30号、31号、33号和29号发明化合物的活性结果。
图13指的是在一个人基底细胞/血小板生长因子刺激实验发明化合物的细胞毒性结果。
图14报告的是在一个测定对PDGF/IL—1共刺激抑制作为实验第27号、28号、32号、30号、31号、32号和34号发明化合物的抑制活性结果。
图15说明PDGF诱导Balb/3T3细胞增殖，选择的发明化合物的剂量反应曲线。
图16报告的是在鼠胸腺细胞ConA/IL—2共刺激实验中选择的发明化合物抑制结果。
图17比较了几种发明化合物的IC50和ID50资料。
图18报告的是对转化细胞(Ras3T3)和非转化细胞(正常)第27号发明化合物的细胞毒性结果。
图19指的是显示第58号发明化合物对PDGF诱导的人主动脉平滑肌细胞(主动脉SMC)增殖的抑制作用资料。
图20A和20B指的是第58号化合物对aFGF和bFGF诱导人主动脉平滑肌细胞(主动脉SMC)的增殖作用。
图21A和21B指的是鼠胸腺细胞，用CoA和IL—2共刺激，第35号化合物和CsA各自的抑制活性。
图21C和21D表明化合物35号和CsA分别对IL—2诱发的细胞毒性CT—6细胞增殖的抑制结果。
图22报告的是在一个人脐静脉上皮细胞系(HUVEC)，有关血管内皮生长因子(VEGF)诱导的增殖，第58号化合物的活性结果。
图23是一系列从HUVEC细胞流式细胞计数分析获得的频率直方图。
图24解释了第50号和57号化合物对粘附于IL—1活化的HUVEC的THP—1细胞获得的抑制结果。
图25A和25B指的是在肺平滑肌细胞，对aFGF和bFGF诱导的增殖，第58号化合物的作用。
图26A、26B和26C在PDGF诱导的Balb/3T3细胞增殖，第77号、7号和78号发明化合物的剂量反应曲线。
图27说明通过ConA和IL—2共刺激的鼠胸腺细胞增殖，第78号、79号和80号发明化合物的剂量反应曲线。
图28报告的是在血小板生长因子诱导的Balb/3T3细胞增殖，第50号发明化合物的结果。
图29指的是TNF—2实质上增加92KD基质金属蛋白酶(MMP)的表达，中等程序增加72KD MMP的产量，第50号化合物的存在抑制了TNFR—2刺激的每一MMP的表达。
图30指的是抗增殖活性，图31报告的是第50号发明化合物对HF29细胞的抗克隆形成活性。
图32和33阐述了第50号发明化合物对3LL细胞(Lewis肺癌)的细胞毒性及浓度依赖性。
图34指的是在正常的人骨髓基底细胞，第50号发明化合物缺少细胞毒性。
图35和36指的是第50号发明化合物对3LL细胞基质胶体浸润和存活率的作用。
图37说明VEGF诱导的HUVEC增殖作为一种预测粘附实验。
图38指的是第50号发明化合物对粘着于IL—1β刺激的HUVE的THP—1的作用。
图39说明第50号发明化合物对TNFα刺激的HUVEC的VCAM—1表面表达的作用。
图40说明第50号发明化合物对TNFα刺激的HUVEC的I-CAM—1表面表达的作用。
图41A、41B和41C说明用B16黑色素瘤细胞进行小鼠体内研究的结果。
图42A和42B说明在B16黑色素瘤细胞实验用第50号发明化合物处理小鼠的T和B的细胞应答实验。
图43报告的是在体内实验证明第50号发明化合物可阻止小鼠Lewis癌的生长。
图44A和444B说明了在Lewis肺癌实验中杀死鼠的血小板及中性粒细胞的各自计数。
图45A、45B和45C说明使用第50号发明化合物处理或不处理3LL暴露小鼠的肺照片比较。
图46报告的是在一个研究第45号发明化合物对IL—2调节的增殖作用获得的结果。
图47说明第45号发明化合物抑制通过细胞数测定的CT—6.1的增殖。
图48说明第45号发明化合物也抑制2针对IL—2、IL—4和IL—7的促有丝分裂反应。
图49说明第45号发明化合物也抑制对刀豆素A(ConA)和IL2反应的鼠胸腺细胞增殖。
图50A和50B说明第45号化合物分别抑制鼠混合肿瘤淋巴细胞培养(MTLC)及人混合白细胞反应(MLR)。
图51说明第45号发明化合物的迟缓加入对共刺激的胸腺细胞增殖的作用。
图52说明第45号发明化合物抑制抗—CD3刺激的脾细胞增殖。
图53A和53B说明第45号化合物不抑制T细胞受体(CD3)调节的信号传递。
图54A和54B说明第45号发明化合物不抑制抗CD3调节的IL—2受体α亚单位向上调节。
图55报告的是第45号发明化合物不抑制IL—2受体β(P70)亚单体内在化。
图56A和56b说明第45号发明化合物也诱导抗原特异的T—细胞无反应性。
图57说明第45号发明化合物抑制B细胞增殖。
图58A和58B说明第45号发明化合物不抑制CD28调节的IL—2释放。
图58C和58D说明第45号化合物抑制通过阻止IL—2信号传递的IFN—γ的释放。
图59A、59B和59C报告的是研究第45号发明化合物对由抗CD3刺激的小鼠脾细胞释放的细胞因子的作用实验结果。
图60A说明用第45号化合物进行的MTLC源验增殖的抑制。
图60B和60C说明第45号化合物即不抑制MTLC的IL—2也不抑制TNFα的释放。
图60D说明第45号发明化合物抑制IFN—γ释放。
图61说明第45号发明化合物对从IL—1α刺激的人包皮纤维母细胞，HS68释放的前列腺素EX没有影响。
图62A和62B(分别为TNFα或IL—1β)报导THP—1粘附到HUVEC上的抑制作用。
图63A和63B说明第45号发明化合物抑制HUVEC上的粘附受体表达。
图64报告的是第45号发明化合物抑制PDGF—BB诱导的鼠BALB/3T3增殖。
图65A—65F说明第58号发明化合物对人主动脉或肺平滑肌细胞(SMC)增殖的抑制。
图66A和66B分别是第58号发明化合物抑制Balb/3T3细胞增殖的剂量反应及细胞毒性曲线。
图67A和67B说明第58号发明化合物分别抑制HUVEC VEGF诱导的增殖及Swiss/3T3细胞EGF诱导的增殖。
图68说明第58号发明化合物的迟缓加入对由对PDGF—BB反应的Balb/3T3增殖的影响。
图69说明第58号发明化合物比血清诱导的增殖更大程序地抑制PDGF诱导的Balb/3T3细胞增殖。
图70说明第58号发明化合物抑制内皮细胞迁移。
图71说明第58号发明化合物不抑制人类平滑肌细胞(SMC)对PDGF的趋化性。
图72A和72B说明第58号发明化合物抑制THP—1细胞对TNF或IL—1刺激的HUVEC的粘着(分别地)。
图73A和73B分别是VCAM或ICAM表达的抑制，此是通过第58号发明化合物对于TNF活化的HUVEC。
图74说明第58号发明化合物使用人类全血体外实验抑制TNF释放。
本发明提供了一类能通过第二信使途径系统(Bursten等“肾小球细胞IL—1快速刺激溶血磷脂酸酰基转移酶和磷脂酸磷酸水解酶活性”J.Biol.Chem..，Vol.266，No.31，pages 20732—20743，November5，1991)特殊时期控制细胞行为的化合物。第二信使是类脂或磷脂并使用下列缩写PE＝磷脂酰乙醇胺LPE＝溶血磷脂酰乙醇胺PA＝磷脂酸LPA＝溶血磷脂酸DAG＝甘油二酯LPLD＝溶血磷脂酶DLPAAT＝浓血磷脂酸酰基转移酶PAPH＝磷脂酸磷酸水解酶PLA2＝磷脂酶A2PLD＝磷脂酶DPAA＝磷酸花生四烯酸PC＝磷脂酰胆碱“重塑”PA，环形途径＝PAA、LPA、PA和DAG中介物在指定的sn—1和sn—2位置用1—饱和、2—亚麻酰基或1，2—二油酰基、二油酰/1，2—sn—二亚麻酰取代。
“经典PI途径”＝PI，DAG.PA中间物用硬1—1脂酰基、2—花生四烯酰脂肪酰侧链取代。
“产生PLD的PA＝PE、PC、LPA、PA和DAG中间产物用如1，2—sn—二油酰基、1—烷基、2—亚麻酰基、和1—烷基、、2—二十二碳六烯酰基侧链取代。
溶血磷脂酸转移酶(LPAAT)通过来自酰基CoA的酰基基团结合，从溶血磷脂酸(LPA)合成磷脂酸(PA)。通过PA磷酸水解酶(PAPH)磷酸酯部分分的水解导致DAG的形成。此途径的这些方面似乎在细胞表面受体发挥作用的原发性刺激物(如IL—1、IL—2、或TNF样细胞因子)—刺激立即被活化(一分钟内)。立即可测到的结果是PA和DAG水平的提高。本发明给药此化合物逆转这种提高。
本发明的化合物和药物组合物包含带有1，2—双不饱和1—烷基、2—不饱和亚种中间产物底物特异性的LPAAT和PAPH酶亚种抑制剂。每一膜磷脂亚类(如PA、PI、PE、PC和PS)由于每一亚类的质膜环状重型及翻转达到了稳定的富于脂肪酰侧链的内容物。PA通常稳定，但这里数量相当少。在休止期细胞PA多半含饱和酰基链、通常含肉豆蔻酸盐、硬脂酸盐及棕榈酸盐。在休止期细胞PC的酰基侧链多半在sn—1位含酰基棕榈酸盐、在sn—2位置含亚油酸盐。PE和PI主要由sn—1硬脂酸盐及sn—2花生四烯酸盐组成。
由于在sn—1和sn—2位置这种有特点的酰基基因成分，可以从sn—1和sn—2位置，从其酰基基团的化学性质推导出任何种PA的起源。例如，如果通过酶PLD的作用，PA可源于PC，那么含有PC底物特征性酰基侧链的PA通过第二信使途径传递。而且，任何l，2sn—底物种类的起源可分化为其起源。然则，重要的是知道是每一磷脂类从起初到DAG水解通过PA传递。已证明溶血PA转变成PA然后变成DAG。第二信使途径的复杂性可通过脂肪酰基侧链在二信使途径刺激后不同时间点细胞中间产物合理的化学(即，通过薄层层析、气—液相色谱、或高压液相色谱)分析分类。
在某些间充质细胞，如中性粒细胞和大鼠或人肾小球细胞，几种信号传递途径可成串，同时或两个一起活化。如中性粒细胞，F—Met—Leu—Phe通过PLD的作用刺激PA的形成，紧接着通过PAPH的作用DAG形成。几分钟后，通过经典的磷酸肌醇途径由PI生成DAG。在许多细胞，DAG源于通过环形重型的PA，此处PA由PLA2在sn—2处水解，接着通过LPAAT，sn—2转酰基作用，源于PA的PLD途径从PE或PC或通过PLD的两个底物产生。
在sn—2位置带有不饱和脂肪酸底物而不是花生四烯酸和与正常的细胞“看家”功能无关的PAPH和LPAAT的那些亚种类的本第二信使途径是经典PI途径的一部分。
和本第二信使途径相关的PAPH和LPAAT酶对不同的酰基侧链和底物的异构形式来说是很有立体特异性的。所以本发明的化合物最优化、实质地、对映上纯、最好和羟基基团相连手性碳原子R的对映异构体。
和炎症传导及细胞膜紊乱相关的额外信号传递途径产生了分离的PA种类、富于如上所述的肉豆蔻酸盐而且源于GlyPI。在此信号传递条件下，此发明化合物阻止或直接抑制PiG—PLD的活化，水解GlyPI形成PA和聚糖肌醇。在某些肿瘤细胞和TNF活化的细胞(即，II型受体)，此发明化合物的功效可能是双重抑制LPAAT和GlyPI水解。实验结果证实了此抑制作用。用IL—2刺激CT—6细胞，刺激后15—45秒，出现GlyPI种类的迅速水解，接着是GlyPI的迅速重新合成。此发明的化合物阻止这种水解并刺激GlyPI合成，没有GlyPI起源的PA形成或水解的证据，遍及整了刺激过程产生了GlypI的显著增加。对人脐静脉内皮细胞用TNF刺激产生源于LPAAT和源于Gly—PI的PA种类。此发明化合物抑制两种PA种类的形成。溶血PA和GlyPI聚集。本发明化合物的治疗应用如上所述，第二信使途径的特异性激活和/或抑制，通过不同的有害刺激活化，证实此发明化合物对治疗多种不同的临床适应症是有用的。而且，此处提供的体外及体内资料，为预测资料，对特异的第二信使途径有类似的作用，通过本发明的化合物可治疗多种各异的临床适应症，这些化合物特异地抑制通过有害刺激物活化的及通过如炎性细胞因子调节的第二信使途径。实际上，本发明的化合物作用机理解释了为什么这些化合物有各种多样的临床适应症。
第二信使途径的活化是对有害刺激物反应的主要调节剂，进一步导致引起临床症状，如急、慢性炎症、自身免疫病及癌细胞生长的细胞内信号传递。可是所有抑制剂(即本发明化合物)不能抑制第二信使途径的所有酶。通过本第二信使途径调节的信号含如，LPS直接的那些细胞反应、通过抗原的T、B细胞活化、对第一信使的细胞反应，如，IL—1和TNF、通过转化刺激的生长、含但不限于活化的癌基因(例如，ras、ab1、her2—neu等)、通过血小板生长因子(PDGF)、b—FGF、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和IL—1刺激的平滑肌细胞增殖、通过IL—2、IL—4或IL—7刺激的T、B细胞生长、更普遍的是，T细胞受体信号传递。
本发明的化合物(1)通过所示的I型受体，如通过阻止IL—1及IL—1同PDGF的平滑肌、内皮和肾小球细胞(LPAAT效应)增殖的诱导抑制IL—1信号传导；(2)例如通过阻止内皮细胞的VCAM，抑制所示粘性分子的向上调节；(3)抑制TNF、LPS和IL—1诱导的金属蛋白酶(炎症和癌转移模型)；(4)阻止LPS、TNF或IL—1诱导的继发细胞因子产物(预防和治疗败血病休克症状)；(5)抑制由抗原，如IL—2和IL—4引起的T、B细胞活化；(6)抑制由免疫球蛋白E(IgE)引起的柱细胞活化；(7)对转化细胞和肿瘤细胞系有细胞毒性，但对正常细胞在同等剂量下没有细胞毒性；(8)对T和B细胞，通过IL—2、IL—4、IL—6和IL—7阻止信号传递。
上述细胞结果是下面药理作用的基础，含但不限于由革兰氏阳性或革兰氏阴性菌引起的内毒性休克和脓毒症的预防与治疗、肿瘤细胞生长与转移播散的抑制与预防、协同免疫抑制、自身免疫病的治疗、同种移植反应的抑制、刺激头发生长(例如，治疗秃发或预防由细胞减少疗法所致的头发脱落)、通过细胞程序化死亡过程逆转治疗低增殖皮肤病如牛皮癣(如细胞减少疗法、IL—2疗法、cy-closporinA、两性霉素B等)。此发明化合物用于预防和治疗败血病休克、治疗急、慢性炎症、抑制免疫应答、治疗或预防自身免疫病及刺激头发生长(局部使用时)最有效。
此发明化合物作为佐剂也用于抑制药物的毒副作用，其副作用通过本第二信使途径调节。金属蛋白酶调节组织损害，如肾小球病、关节炎所致关节损害、肺气肿所致肺损害，并对肿瘤转移发挥重要作用。三种金属蛋白酶的例子是由TNF、IL—1和PDGF加上bFGF诱导的92KDV型明胶酶、通常主要生产并由TNF或IL—1刺激的72KD胶原酶、由TNF和IL—1诱导的基底水解酶/PVMP—1。此发明的化合物可抑制TNF或IL—1对92KD V型明胶酶，一种可诱导的金属蛋白酶的诱导。而且，此发明化合物可降低由IL—1(每毫升100单位)诱导的PUMP—1活性。因此，本发明化合物阻止通过IL—1或TNF诱导的某些金属蛋白酶的诱导，与组成上产生的参与正常组织重塑的蛋白酶(如72KD VI型胶原酶)无关。
此发明化合物抑制IL—1信号传导，因此被认为是IL—1拮抗剂。最近有一篇题目为“疾病的机制IL—1对疾病的作用”的综述性文章(Dinarello等人，N.Engl.J.Med.，Vol.328，No.2，Pages106—1113.January，14，1993)叙述了IL—1作为“一种重要、快速、直接的疾病决定素。”例如败血病休克，IL—1通过快速生长血小板活化因子和氮氧化物直接对血管发挥作用诱导血管舒胀，而在自身免疫病，通过刺激其它细胞生产细胞因子或此后对靶组织发挥作用的酶发挥作用。“文章叙述了一种由IL—1调节的疾病，包括脓毒病综合症、类风湿关节炎、炎性肠病、急性骨髓性白血病、胰岛素依赖性糖尿病、动脉粥样硬化和其它疾病，包括移植排斥反应、宿主病移植(GVHD)牛皮癣、哮喘、骨质疏松症、牙周病、自身免疫性甲状腺炎、乙醇性肝炎、继发于输卵管感染的早产及失眠。因此发明化合物是IL—1拮抗剂，所以此发明化合物可用于治疗所有上述疾病。
例如，对脓毒病综合症，IL—1诱导休克的机制似乎是IL—1增加血浆中小分子调节剂如血小板活化因子、前列腺素及氮氧化物的浓度的能力。这些物质是有效的血管舒张剂，对实验动物诱导休克。IL—1作用的阻止预防了这些调节剂的合成与释放。在动物，只静注IL—1降低平均动脉压、降低系统血管耐性、诱导白细胞减少症和血小板减少症。在人类，静脉内给药IL—1也能迅速降低血压、每千克体重300ng或更高的剂量可导致严重的低血压。抑制IL—1作用的治疗益处在于没有干扰对稳定有作用的分子的生产预防其有害的生物学作用。本发明化合物提出了Dinarello等证实的抑制IL—1细胞信号传递的需要。
关于类风湿性关节炎，Dinarello等叙述“IL—1存在于类风湿性关节炎患者滑液衬层滑液中以及在体外生产IL—1的这种患者滑液组织的外植体。在动物，动脉内注射IL—1诱导白细胞浸润、软骨分解及关节周围骨的重塑。在体外分离的软骨和骨细胞，IL—1启动胶原酶、磷脂酶、环氧合酶基因的表达，在大鼠，阻止它的作用可降低细菌细胞壁诱导的关节炎”。因此，本发明的化合物，作为IL—1拮抗剂，对治疗和预防类风湿性关节炎是有用的。炎性肠道病，溃疡性结肠炎和Crohn’s病特征是包含活化的中性粒细胞和巨噬细胞的肠道浸润性损害。IL—1能刺激炎性二十烷类的生产，如前列腺素E2(PGE2)、白细胞三烯B4(LTB4)及IL—8，一和睦有中性粒细胞诱导剂及刺激中性粒细胞特性的炎性细胞因子。PGE2和LTB4的组织浓度和患溃疡性结肠炎病人的病的严重程序相关，患炎性肠道病的病人在在IL—1和IL—8的组织浓度高。因此，IL—1拮抗剂，如发明化合物，对治疗炎性肠道疾病有效。
鉴于急、慢性骨髓性白血病日渐证明，IL—1作用此种肿瘤细胞的生长因子。因此，发明化合物对预防急、慢性骨髓性白血病的恶化是有效的。
IDDM据认为是一种自身免疫病，伴随由免疫力的细胞调节的Langerhans小岛β细胞的损害。自发产生IDDM(如BB大鼠或MOD小鼠)动物小岛有含IL—1的炎症细胞。因此，此发明化合物对预防和治疗IDDM有用。
IL—1在动脉粥状硬化形成中也发挥作用。内皮细胞是IL—1靶。IL—1刺激血管平滑肌细胞增殖。分离自低胆固醇血症的兔脂肪主动脉斑的泡沫细胞含OL—1β和IL—1β信使RNA。外周血单核细胞的摄取导致这些细胞开始生产IL—1。IL—1也刺激PDGF下生产。两者一同摄入IL—1对动脉粥样损害的发展起作用。因此，IL—1拮抗剂，如本发明化合物对预防和治疗动脉粥样硬化有用。
DAG和PA在癌基因转化的细胞中属向上调控。例如，活化的ras突变，当用促癌剂刺激后，DAG生成量增加。在非转化的肾小球细胞，IL—1β刺激加强了PLA2和LPAAT活化导致sn—2不饱和PA的产生及由磷脂酸磷酸水解酶接着水解成DAG。NIH/3T3细胞的ras转化向上调控DAG和PA的血清刺激生成。由血清刺激DAG的特异种类是二油酰及PA、二亚油酰、二油酰。此向上调节产生超过4—12小时，用此发明化合物预处理细胞阻止这些磷脂第二信使的产生。产生抑制或通过抑制从溶血PA产生PA，或通过一或二Land环的臂。因此ras转化通过间接刺激PLA2和/或LPAAT活性调节特异PA种类的向上调节。此发明化合物抑制向上调溶血PA向PA的转化，其次抑制由细胞膜上PA/DAG诱导的细胞表型的改变。
在体内外比发明化合物抑制增殖和ras转化细胞形成肿瘤的能力反映了此发明化合物抑制不饱和磷脂产生的能力。
过分或未调节的NF(肿瘤坏死因子)产量意味着调节或加重许多疾病，包括类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、骨关节炎、痛风关节炎及其它关节情况，脓毒病、败血病体克、内毒素休克、革兰氏阴性菌脓毒症、中毒休克综合症、成人呼吸窘迫综合症、脑疾病、慢性肺炎、移植对宿主的反应、同种移植排斥、发烧由于流感感染梁、以及继发感染的亚病质艾滋病或恶性病、其它病毒感染(例如CMV流感、腺病毒、泡疹家族)、瘢痕瘤形成、疤组织形成、Crohn’s病、溃疡性结肠炎或pyresis。本发明化合物其用药上可接受的盐可用在人或其它哺乳类任何疾病状况预防或治疗药的生产，这些疾病可通过本第二信使细胞基于磷脂的信号传递途径和通过“第一信使”炎性细胞因子如TNF或IL—1过分或向上调节生产而加重或传递信号。至于TNF第一信使信号传递，有几种通过单核或巨噬细胞过分或非调节的TNF生产的疾病状况意谓着加重或导致疾病。
这些包括，如中枢衰竭疾病，象Alzheimers病、内毒素血症或中毒性休克综合症(tracey et al.，“anti—cachectin/TNF Monoclonal Anti-bodies Prevent Shock During Lethal Bacteraemia，”Nature，Vol.330，pages 662—664，December.17，1987 and Hinshaw etal.，“survival ofPrimates in LD 100 Septic shock Following Therapy with Antibody to Tu-mor Necyosis Factor(TNFα)”，Circ.shock，vol.30，page 279—292，1990)；恶病质(Dezube et al.，“Pentoxifylline and Wellbeiing in patientswith cancer，”the Lancet，page 662，March 17，1990)，及成人呼啄窘迫综合症(Miller et al.，“tumor Necrosis Faotor in BronchopulmonarySecrections of Patients with Adult Respiratory Distress Syndrome”，theLancet，pages 712—713，September 23，1989)。此发明化合物可局部用于由过度的TNF或IL—1调节或加重的局部疾病的预防性疗法，如病毒感染(泡疹或结膜炎)牛皮癣、真菌或酵母感染(癣、运动员脚、阴道炎、脂溢性皮炎等)或皮肤低增殖病。在急性疾病发作(Grau et al.，“Tumor Necrosis Factor and Disease Severith in Childrenwith Falciparum Malaria”，N.Engl.J.Med.，Vol.320，No.24，pages1586—1591，June 15，1989)、慢性肺炎性疾病，如矽肺和石棉肺(Ptguet et al.，“Requirement of Jumor Necrosis Facfor for Developmentof Silica—induced Pulmonary Fibrosis”，Nature，Vol.344，Pages 245—247，March 15，1990，and Bissonnette et al.，“Pulmonary Inflammationand Fibrosis in a Murine Model of Asbestosis and Silicosis”，Inflammation，Vol.13，No.3，Pages 329—339，1989)、再灌注损伤(Vedder et al.，“Inhibition of Leukocyte Adherence by Anti cd18 Monoclonal Antibody At-ten uates Reper fusion Injury in the Rabbit Ear”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.87，Pages 2643—2646，April 1990)TNF水平高。
此发明包括治疗或预防不同疾病状况临床症状的方法或通过第二信使途径抑制细胞信号传递降低其它疗法的毒性。从含肿瘤细胞增殖的基因选择疾病状况或治疗引起的毒性，以反应活化的癌基因、由细胞减少疗法引起的血细胞减少症、由T细胞应答或B细胞应答及抗体产生引起的自身免疫疾病、败血病休克、间质细胞对肿瘤坏死因子(TNF)的抗性、III滑肌细胞、内皮细胞、纤维细胞及对生因子如POGF、FGF、EGF和VEGF(即动脉粥样硬化、再狭窄、中风及冠状动脉疾病)反应的其它类型细胞的增殖。人类免疫缺陷病毒感染(AIDS和AIDS相关复合体)、对IL—1、MIP—1α、PDGF或FGF反应的肾小球细胞增殖、炎症、对环孢菌素A或两性霉素B治疗反应的肾小球或肾小管毒性、对细胞减少疗法(例如细胞毒药物或放疗)反应的器官毒性(例如骨肠或肺上皮)、增强非烷基化抗肿瘤剂的抗肿瘤作用、反应由细胞表面金属蛋白酶生产或柱细胞及反应IgE的中性粒细胞脱离为特征的炎症刺激物(例如，TNF、IL—1等)过敏、通过破骨细胞、破骨细胞活化因子(DAG)过度生产所致的骨疾病、由中枢神经递质肾上腺素或乙酰胆碱或其结合的信号传递降低引起的CNS病。
总之，此处化合物和药物组合物(1)抑制肿瘤细胞增殖；(2)抑制由抗原或IL—2刺激的T—细胞活化；(3)抑制通过内毒素、TNF、IL—1或GM—CSF刺激的单核细胞/巨噬细胞活化(4)抑制对抗原反应的B细胞抗体生产；(5)抑制对能刺激所说增殖的生产因子反应的平滑肌细胞增殖；(6)降低内皮细胞有关的系统血管抗性；(7)降低由内皮细胞引起的系统血管抗体；(8)降低由此增强子诱导的粘性分子的表达；(9)由HIV抑制T细胞和巨噬细胞的活化；(10)抑制反应由IL—1和/或MIP—1α和/或PDGF和/或FGF刺激肾小球细胞的增殖。(11)增强肾小球或肾小管细胞对环孢菌素A或双性霉素B的抗性；(12)阻止由单核和巨噬细胞刺激的IL—1、TNF或内毒素引起的MIP—1α的释放；(13)阻止由IL—1、TNF、或由巨真核细胞、纤维母细胞和巨噬细胞处理的内毒素引起血小板活化因子的释放；(14)阻止TNF处理的血细胞减少的原代细胞细胞因子受体的向下调节；(15)在IL—1刺激或TNF刺激的肾小球上皮细胞或滑液细胞抑制金属蛋白酶的生产；(16)增强胃肠或肺上皮细胞对细胞毒药物或放射的抗性；(17)增强非烷基化抗肿瘤剂的抗肿瘤作用；(18)抑制对IL—1反应的破骨细胞活化因子的生；(19)抑制由IgE引起的脱粒；(20)增强肾上腺素神经递质、乙酰胆碱的释放；(21)调节肾小腺神经递质多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、或神经递质的突触后“慢流”效应；(22)通过含乙酰胆碱、亮氨酸脑啡呔、5—羟色胺(seretonin)的神经递质抑制信号传递；(23)提高发病阈值。
此发明化合物用于提高侵袭阈、稳定突触对抗神经毒素，如土的宁、增强抗Parkinson药，如L—多巴的作用，增强催眠化合物的作用，缓解由用了安定药引起的运动失调，降低或预防由脑血管病如中风伴着的进展性神经死亡相关的神经元过烧。此外，此发明化合物用于治疗去甲肾上腺素缺乏性抑制及骨源性糖皮质激素释放相关的抑郁、阻止地塞米松、甲基氢化泼尼松对中枢神经系统的毒性，治疗慢性疼痛对药物无成瘾性。而且，此发明化合物可用于治疗学习和注意力缺乏儿童，一般来说对有器官缺乏，包括Alaheimers病的患者改善对问题的记忆力。
本发明提供一类化合物，他们是有效的治疗药剂、可抑制特异性炎症和增殖性细胞信号传递活动。此化合物和药物组合物结构式为(X)j—(核心部分)式中j是1至3的整数，核心部分是非环状的，并可含杂原子，环状或杂环，此处环状或杂环核心部分至少含一4～7环，并且X是消旋的组合物，R或S对映体、溶合物、水合物、或盐 *C是手性碳原子；n中1～4的整数(最好是1～3)；(CH2)n的一或多个碳原子或被酮基或羟基取代；m是4～14的整数(最好是8～14)；独立地，R1和R2是氢，直链或支链烷烃或烯烃，长度至多12个碳原子，或—(CH2)wR5，w是2～14的整数，R5是一个单、双、或三取代的或不饱和芳基基团，R5上的取代基是羟基、氯、氟、溴、或C1-6烷氧基；或R1和R2结合一起形成了一种取代或非取代的、饱和或不饱和的有4～8个碳原子的杂环基，N为杂原子；R3是氢或C1-3；或 式中R4是氢，直链或链烷烃或烯烃，长度至多8个碳原子，—(CH2)wR5，w是2～14的整数，R5是单、二或三取代或非取代的芳基基团，R5上的取代基是羟基、氯、氟、溴、或C1-6烷氧基、或取代或非取代、或饱和或不饱和有4～8个碳原子的杂基，r和s是独立地1～14的整数；和一个或多个(CH2)5碳原子，或(CH2)t可被酮基或羟基取代。
非环状/核心部分可以是，如乙酰胺、酰胺、胺、氨基酸(一或二个)、羧基、酯、卤素原子、末端氢、羟基、戊二酸、甘氨酸衍生物、酮、磷酸酯、膦酸酯、硫酸酯、磺酸酯、砜、亚砜、单一离子功能基团、硫醇或硫醇酯。典型的核心部分氨基酸可包括一或多种下列氨基酸丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸，最好时一个更硫水的氨基酸如亮氨酸或异亮氨酸。单环核心部分最好包括一个含前面所述例证列出的两个氨基酸的二肽。举例的核心卤素原子包括溴、氯、氟、碘。
一个核心部分可分别含至少一5～7个环，最好为1～3个，在一个突出的平面构象中有5～6环结构。假如有氮的话，最好，取代基(X)和环上氮相链。例如，核心部分可从含到代或非取代巴比土酸、苯甲酰胺、苯、联苯、环己烷、环己烷二酮、环戊烷二酮内酰胺、戊二酰胺、高邻苯二甲酰亚胺、氢邻苯二甲酰亚胺、咪唑、咪唑酰胺、1—对氯苯甲酰—5甲氧—2—甲基吲哚醋酸、异喹诺酮、2，4—二氧四氢喋啶、萘、酚、喋啶、pthalimide、哌啶、吡啶、嘧啶、吡咯酰胺、喹嗪二酮、喹唑啉酮、喹诺酮、recozsinol；水杨酸及其衍生物，芪、琥珀酰亚胺、3，7—二甲基黄嘌呤、胸腺嘧啶、三嗪、三环十二烷、尿酸、尿嘧啶、维生素A、E或K，或黄嘌呤的基团中选取。
最好的环状核心含取代或非取代戊二酰胺、甲基胸腺嘧啶、甲基尿嘧啶、3，7—二甲基黄嘌呤、尿嘧呤和黄嘌泠，最理想是卤素取代的黄嘌呤。列举的优选的核心包括1，3—环己烷二酮、1，3—环戊烷二酮、1，3—二羟基萘、1—甲基—2，4—二氧四氢喋啶、甲基巴比土酸、3，3—二甲基戊二酰胺、乳清酸、四或六氢邻苯二甲酰亚胺、邻位酚、前列腺环素、2—羟基吡啶、甲基二羟吡唑并嘧啶、尤其是1，3—二甲基二羟基吡唑并[4，3—d]嘧啶、甲基吡咯并嘧啶、1—甲基吡咯并[2，3—d]嘧啶、1，3—二羟基萘、1—吡咯酰胺、2—吡咯酰胺、3—吡咯酰胺、1，2，3，4—四氢异喹诺酮、1—甲基—2，4(1H，3H)—喹嗪二酮(1—甲基苯甲酰烯脲)、喹唑啉—4(3H)酮、舒林酸、双氢胸腺嘧啶、烷基取代(C1-6)胸腺嘧啶、2，4—二氧六氢—1，3，5—四嗪、甲基胸腺嘧啶、烷基取代(C1-6)尿嘧啶、稠合到萘的尿嘧啶、6—氨基尿嘧啶、1—甲基—5，6—双氢尿嘧啶、1—甲基尿嘧啶、位置5和/或6取代的尿嘧啶(如，5—氟尿嘧啶)、作为维生素A的紫罗酮、作为维生素A的2，6，6—甲基—环己烯—1—乙醛，作为维生素K4四氢萘酮、1，7—二甲基黄嘌呤、3，7—二甲基黄嘌呤、3—甲基黄嘌呤、3—甲基—7—甲基新戊酰黄嘌呤、8—取代黄嘌呤(含如N或S的取代基)、和7—甲基次黄嘌呤。
最好X与核心部分氮相连，最好核心部分是黄嘌呤而且X和N1黄嘌呤氮相连，N3及N7黄嘌呤氮独立地被从由氢、甲基、氟、氯和氨基组成的基选择的成分取代。
本发明提供了一种含发明化合物及药物学上可接受的赋形剂的药物组合物。药物组合物可配成药方，对患者径口腔、非肠道或皮肤表面给药。
本发明进一步提供了一种含发明化合物及用药上可接受的赋形剂的药物组合物。药物组合物可配成药方，对患者经口腔、非肠道或皮肤表面给药。药物组合物可选择地含有一种或多种发明化合物及用药上可接受的载体或赋形剂。用发明化合物或药物组合物的个体治疗包括在体外培养基中，在体外治疗中，和发明化合物接触，或通过(口腔、非肠道或局部)给接受治疗的客体细胞发明化合物或药物。
本发明含一种制备发明化合物的方法。下文及下面实施例讨论了制备此发明化合物的典型方法。按照此发明的合成，含想要的核心(认为此发明化合物的核心部分)化合物进行反应生产了含核心化合物的阴离子。因此，结果产生的阴离子与一个取代烯烃反应置换烯烃上靶功能的基团，结果产生了一个中间产物。先确定量的含核心的化合物与合适的碱溶剂和取代烯烃反应，取代烯烃至少有一种别的功能基团，它在置换反应中可以通过想要的含核心的化合物取代。
最好的碱含但不限于氢化钠、氨化钠、醇钠、氢化锂、氢化钾、氨化锂、氨化钠及氨化钾。特别优选的碱是氢化钠。优选的溶剂可以是二甲基硫氧化物、二甲基甲酰胺或醇。典型优选的醇含但不限于甲醇、乙醇、或异丙醇。含此发明化合物链结构的取代烯烃可用于此发明的反应。优选的烯烃可以是ω—取代的烯烃。优选的烯烃含但不限于卤代烯烃。
含有包含核心化合物复杂结构和取代烯烃的中间产物，可由此转换为相应的环氧化物。按此发明方法，中间产物可与有机过酸反应以获得期望的环氧化物。优选、典型的有机过酸包括3—氯过氧苯甲酸、过醋酸和三氟过醋酸。特别优选的过酸是3—氯过氧苯甲酸。
选择地，中间产物通过与合适的氧化剂反应，首先转变成对应的二醇。优选的氧化剂含但不限于四氧化锇。优选的氧化剂如四氧化锇在有再生剂时需要催化量的氧化剂。典型地，再生剂可以是4—甲基吗啉—N—氧化物和三甲胺—N—氧化物。特别优选的再生剂是4—甲基吗啉—氧化物。在接着的卤化反应中，在有机酸存在时使用卤素生成剂，结果产生的二醇转变成卤酯。典型的生卤剂包括溴化氢和氯化氢。优选的有机酸是醋酸和丙酸。结果产生的卤酯此后与碱性的酯水解剂反应，获得一个期望的环氧化物产物。优选的酯水解剂包括但不限于金属醇盐和金属氢氧化物。特别优选的金属醇盐是甲醇钠、乙醇钠、异丙醇钠和戊醇钠。优选的金属氢氧化物是氢氧化钠。
此发明方法的最后步骤是从含核心的在上述程序合成的环氧化物制备期望的发明化合物。最后步骤可以通过两个优选方法中任何一个来完成。第一个方法，含核心的环氧化物在有取代或非取代含有在最终发明化合物中功能基团的胺存在时受热。优选的胺功能基团上述已公开了。
第二个方法包括未取代或取代胺与含核心氧化物和反应激活剂在某一溶剂中反应。典型的反应激活剂包括过氯酸锂。优选的溶剂上述已公开了。
典型地，发明中优选的化合物包括R和S对映结构体及下列化合物的外消旋混合物。
1 N—(9—辛氨基—8—羟壬基)苯邻二甲酰亚胺 2 N—(11—辛氨基—10—羟十一烷基)高苯邻二甲酰亚胺
3—(5—羟—6—(N—苄基)氨己基)—3—甲基亚苯甲酰基脲 4 3—(11，10—氧十一烷基)喹唑啉—4(3H)—酮 5 N2—(5—羟—6—(N3—丙基)氨己基—(N’—丙基)戊二酸 6 2—(11—辛氨基—10—羟十一烷基甲酰氨基)—辛基甲酰氨苄基 7 1—辛氨基—2，11—十一烷二醇 8 1—(9—辛氨基—8—羟壬基)—3—甲基黄嘌呤 9 1—(9—十四烷氨基—8—羟壬基)—3—甲基黄嘌呤 10 1—(11—辛氨基—10—羟十一烷基)—3—甲基黄嘌呤 11 7—(11—辛氨基—10—羟十一烷基)—1，3—二甲基黄嘌呤 12 1—(11，10—辛氨基—10—羟十一烷基)—1—甲基—2，4—二氧化四氢蝶啶 13 1—(5—羟基—6—(N—苄基)氨己基)—3，7—二甲基黄嘌呤
14 1—(5—羟基—6—(N—丙基)氨己基)—3，7—二甲基黄嘌呤 15 N—(11—辛氨基—10—羟十一烷基)戊二酰胺 16 N—(11—辛氨基—10—羟十一烷基)—2—哌啶酮 17 N—(11—辛氨基—10—羟十一烷基)琥珀酰亚胺 18 2—(11—辛氨基—10—羟十一烷基)—1，3—二甲氧基苯 19 3—(5—羟基—6—(N—丙基)氨己基)—1—甲基尿嘧啶 20 3—(9—辛氨基—8—羟壬基)—1—甲基尿嘧啶 21 3—(11—辛氨基—10—羟十一烷基)—1—甲基尿嘧啶 22 3—(11—辛氨基基—10—羟十一烷基)—1—甲基双氢尿嘧啶 23 3—(9—辛氨基—8—羟壬基)—1—甲基胸腺嘧啶 24 3—(5—羟基—6—(N—十一烷基)氨己基)—1—甲基胸腺嘧啶
25 3—(11—辛氨基—10—羟十一烷基)—1—甲基胸腺嘧啶 26 3—(6—丙氨基—5—羟己基)—1—甲基胸腺嘧啶 27 1—(8—羟基—9—(N—苄基)氨壬基)—3，7—二甲基黄嘌呤 28 1—(5—羟基—6—(N—辛基)氨己基)—3，7—二甲基黄嘌呤 29 1—(5—羟基—6—(N—(4—苯基)丁基)氨己基)—3，7—二甲基黄嘌呤
30 1—(6—十一烷氨基—5—羟己基)—3，7—二甲基黄嘌呤 31 1—(5—羟基—6—(N—环己甲基)氨己基)—3，7—二甲基黄嘌呤 32 1—(5—羟基—6—(N—(6—羟基)己基)氨己基)—3，7—二甲基黄嘌呤 33 1—(5—羟基—6—(N，N—二己基)氨己基)—3，7—二甲基黄嘌呤 34 1—(5—羟基—6—(N—(4—甲氧基)苄基)氨己基)—3，7—二甲基黄嘌呤
35 1—(8—羟基—9—(N—辛基)氨壬基)—3，7—二甲基黄嘌呤 36 1—(5—羟基—6—(N—十四烷基)氨己基)—3，7—二甲基黄嘌呤 37 1[6—(环丙甲氨基)—5—羟己基)]—3，7—二甲基黄嘌呤 38 1—(6—癸氨基—5—羟己基)—3，7—二甲基黄嘌呤 39 1—(6—十二氨基—5—羟己基)—3，7—二甲基黄嘌呤 40 1—(11—苄氨基—10—羟十一烷基)—3，7—二甲基黄嘌呤 41 1—(9—癸氨基—8—羟壬基)—3，7—二甲基黄嘌呤 42 1—(9—十二氨基—8—氢壬基)—3，7—二甲基黄嘌呤 43 1—(9—十四氨基—8—羟壬基)—3，7—二甲基黄嘌呤 44 1—(11—己氨基—10—羟十一烷基)—3，7—二甲基黄嘌呤 45 1—(11—辛氨基—10—羟十一烷基)—3，7—二甲基黄嘌呤
46 1—(6—烯丙基氨基—5—羟己基)—3，7—二甲基黄嘌呤 47 1—(11—烯丙基氨基—10—羟十一烷基)—3，7—二甲基黄嘌呤 48 1—(6—N—甲基十八氨基—5—羟己基)—3，7—二甲基黄嘌呤 49 1—(11—癸氨基—11—羟十一烷基)—3，7—二甲基黄嘌呤 50 1—(11—十二氨基—10—羟十一烷基)—3，7—二甲基黄嘌呤
51 1—(11—十四氨基—10—羟十一烷基)—3，7—二甲基黄嘌呤 52 1—[11—(4—氟苄氨基)—10—羟十一烷基]—3，7—二甲基黄嘌呤 53 1—[11—(4—三氟甲苄氨基)—10—羟十一烷基]—3，7—二甲基黄嘌呤 54 1—[11—(3—二乙氨丙氨基)—10—羟十一烷基]—3，7—二甲基黄嘌呤 55 N，N’—双[(10—基—9—羟癸基)—3，7—二甲基黄嘌呤]二氨基十二烷 56 1—(14—溴基—13—羟十四烷基)—3，7—二甲基黄嘌呤 57 1—[11—(4—氨苄氨基)—10—羟十一烷基]—3，7—二甲基黄嘌呤 58 1—[11—(3，4，5—三甲氧苄氨基)—10—羟十一烷基]—3，7—二甲基黄嘌呤 59 1—[11—(3—丁氧丙氨基)—10—羟十一烷基]—3，7—二甲基黄嘌呤 60 1—(14—辛氨基—13—羟十四烷基)—3，7—二甲基黄嘌呤 61 1—(11—丙氨基—10—羟十一烷基)—3，7—二甲基黄嘌呤 62 1—(11—十一烷氨基—10—羟十一烷基)—3，7—二甲基黄嘌呤 63 1—(11—苯氨基—10—羟十一烷基)—3，7—二甲基黄嘌呤 64 N，N—双[11—基—10—羟十一烷基—3，7—二甲基黄嘌呤]十一烷胺 65 1—(11—十八烷氨基—10—羟十一烷基)—3，7—二甲基黄嘌呤 66 1—[9—(N—甲基辛氨基—8—羟壬基)]—3，7—二甲基黄嘌呤 67 1—(4—十四烷氨基—3—羟丁基)—3，7—二甲基黄嘌呤 68 1—[9—(2—羟癸基—1—氨基)壬]—3，7—二甲基黄嘌呤 69 1—(6—十八烷氨基—5—羟己基)—3，7—二甲基黄嘌呤 70 1—[111—(N—辛乙酰氨基)—10—羟十一烷基]—3，7—二甲基黄嘌呤 71 11—辛氨基—10—羟十一烷酸酰胺 73 2—(11—辛氨基—10—羟十一烷基)—N—甲苯酰胺 74 1—[11—(N—甲基—N—辛氨基)—10—羟十一烷基)—3，7—二甲基黄嘌呤 75 11—辛氨基—10—羟十一烷 76 11—辛氨基—10—羟十一烷酸甲酯
77 1—辛氨基—10—羟—11—(N—甲乙酰氨基)十一烷 78 11—辛氨基—10—羟十一烷酸 79 11—辛氨基—10—羟十一烷酸N—甲酰胺 80 11—辛氨基—10—羟十一烷酸N，N—二甲基酰胺 81 N—(11—辛氨基—10—羟十一烷基)二乙酰胺 药物配方合适的药物配方依赖于所治疾病的特性、选择药物的特性、主治医的判断。虽然如经粘膜或经皮肤的其它给药方式可以应用，但一般来说，此方法配制的发明化合物用于注射或口腔给药。例如在Reningtion′s Pharmaceutical Sciences(最新版)，Mack PubLishing Compa-ny，Easton PA.，发明了这些化合物的合理配方。
本发明化合物和其药物上可接受的盐类能以多种不同的药物形式得到应用。药物方面可接受盐类的制备由化合物本身的化学性质决定，并可通过常规易行的技术制备。因此，如果应用固体载体，制品可制成片剂，以粉末或丸剂形式或片剂、糖锭形式存放在坚硬的明胶胶囊中。固体载体的量变化较大，但最好为约25mg至约1克，其中每个剂量本发明化合物的量对成人最好在25mg至1克左右。如用液体载体，制品可用糖浆、乳液、软明胶胶囊、消毒可注射的液体如安瓿或非水溶性液体悬液形式。发明组合物以胶囊形式时，任何途径胶囊化都适用，例如用以前提及的以硬明胶胶囊壳的载体。软明胶壳胶囊形式的组合物，可以考虑任何常规用于制备分散悬液的任何药物载体，例如水树胶、纤维素、硅酸酯或油，并掺合在一起，放放软明胶胶囊壳中。糖浆配方通常含在有香料或增色剂的液体载体中(如乙醇、聚乙烯乙二醇椰子油、甘氨酸或水)化合物或其盐的悬浮液或溶液。
局部用药疗效需要的发明化合物的量当然随选择的化合物、疾病的性质和严重度及治疗提供者审慎处理而变化。非肠道用药包括静脉内、肌肉内、皮下、鼻腔内、直腔内、阴道内或腹腔内给药。此种给药合适的剂量形式常规技术制备。典型的非肠道组合物包括在消毒或非水溶性载体中此发明化合物或其盐的溶液或悬液，选择地含非肠道可接受的油、例如聚乙烯乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、卵磷酯、花生油、芝麻油。治疗脓毒病或其它严重炎症经非肠道给药的每日剂量是约0.001mg/kg至约40mg/kg，最适是从约0.01mg/kg至约20mg/kg本发明化合物或按游离碱计算的用药上可接受的其盐。
本发明化合物可以服给药。口服给药的每日合理剂量从约0.1mg/kg至约1000mg/kg/每天。按游离碱计算，给药剂量适于从约0.001mg/kg至约40mg/kg本发明化合物或其可药用盐。活性成分可给药从1～6次/每日有效地展示活性。
此发明化合物可经吸入给药(例如，鼻脑内或口腔内)。合理的剂量形式包括按常规方法制备的气雾或计量剂量吸入计。本发明化合物或其用药上可接受的盐类，以游离碱计算，合理的每日适量是从约0.001mg/kg至约40mg/kg典型的吸入化合物是以溶液、悬液或乳液形式，使用常规的推进剂，作为干粉末以气雾的形式给药。
通过下列实施例论述了此发明，无论如何其不能认为限制此发明。
实施例1此实施例说明几种用于合成其它化合物的中间体的化合物的合成。1—(8，9—氧壬基)—3，7—二甲基黄嘌呤合成如下在二甲基亚砜(250ml)中搅拌3，7—二甲基黄嘌呤(17.64g，98mmol)和氢化钠混合物15分钟，加入9—溴—1—壬烯(20.0g，98mmol)继续搅拌3天。将反应混合物倒入水中(300ml)，用二氯甲烷(4×200ml)萃取。结合的有机层用饱和水溶性氯化钠溶液(2×150ml)洗涤，通过硫酸钠干燥、溶液经真空蒸发。剩余物结晶(二氯甲烷—乙醚)，产生白色晶体1—(8—壬基)—3，7—二甲基黄嘌呤(24.34g，99％产率)。
在丙酮和水中的1—(8—壬烯基)—3，7—二甲基黄嘌呤(810mg，2.7mmol)、4—甲基吗啉—N—氧化物(340mg，2.9mmol)和2.5％滴t—丁醇(3滴)的四氧化锇溶液搅拌24小时，加入饱和水溶性连二亚硫酸钠溶液(5ml)。搅拌15分钟后，用25％的乙醇—二氯甲烷(4×50ml)萃取反应物。合并的有机相用硫酸钠干燥并用真空蒸发溶剂。重结晶固体残留物(乙醇—氯仿)结果产生1—(8，9—二羟壬基)—3，7—二甲基黄嘌呤(490mg，产率54％)搅拌1—(8，9—二羟壬基)—3，7—二甲基黄嘌呤(428mg，1.3mmol)和30％存在醋酸中的溴化氢混合物90分钟。将溶液倒入水(10ml)、碳酸氢钠及二氯甲烷(10ml)的混合物中，剧烈搅拌10分钟后分层，水溶性部分用二氯甲烷(3×15ml)萃取。合并的有机相通过硫酸钠干燥，溶剂在真空下蒸发掉，结果产生黄色油1—(8—乙氧—9溴壬基)—3，7—二甲基黄嘌呤(550mg，产率96％)。不进一步纯化，油液就溶于甲醇(5ml)中，然后加入1M溶于甲醇(1.4ml)中的甲醇钠溶液，30分钟后，将反应混合物倒入水中(30ml)、并用二氯甲烷(3×40ml)萃取。合并的有机相用硫酸钠干燥，溶剂在真空下蒸发。固体剩余物经重结晶(二氯甲烷—石油醚)，结果产生1—(8，9—氧壬基)—3，7—二甲基黄嘌呤(380mg、产率为91％)1—(5，6—氧己基)—3，7—二甲基黄嘌呤合成如下搅拌1—溴己烯(10.7g，66mmol)、氢化钠(1.58g，66mmol)和二甲基亚砜(100ml)中的3，7—二甲基黄嘌呤(11.9g，66mmol)43小时，用水(200ml)处理此溶液，然后用二氯甲烷(3×80ml)萃取。用水(3×100ml)洗合并的萃取物，经硫酸镁干燥，然后溶剂在真空下蒸发，结果产生白色粉末1—(5—己烷基)—3，7—二甲基黄嘌呤(17g产率98％)。
在水(20ml)和丙酮(10ml)中的1—(5—己烷基)—3，7—二甲基黄嘌呤(1.07g，4.1mmol)及甲基吗啉—N—氧化物(1.44g，12.3mmol)加入2.5％滴t—丁醇(6滴)的四氧化锇溶液中。搅拌48小时后，混合物用20％水溶性连二亚硫酸钠溶液(20ml)处理。2分钟后，混合物用25％的乙醇—二氯甲烷(3×30ml)处理。合并的萃取物用硫酸镁干燥，溶剂在真空下蒸发，生成白色粉末1—(5，6—二羟己基)—3，7—二甲基黄嘌呤(750mg，产率为62％)在1—(5，6—二羟己基)—3，7—二甲基黄嘌呤中(1.0g，3.38mmol)加入30％溴化氢—乙酸(3.4ml)30秒后搅拌直至所有固体都溶解(2.5小时)。仔细将溶液倒入碳酸氢钠(12g)和冰水(50ml)的混合物中。二氧化碳释放物沉淀后，用二氯甲烷(3×25ml)萃取混合物。合并的萃取物用硫酸镁干燥、溶剂在真空下蒸发，生成1—(5—乙氧—6—溴己基)—3，7—二甲基黄嘌呤(1.3g，产率为96％)，为一种可溶在甲醇(5ml)中的粘性油状物。加入1M溶于甲醇(3.9ml)中的甲醇钠溶液30秒后，搅拌20分钟，溶液用水(20ml)处理，然后用二氯甲烷(3×15ml)萃取。合并的萃取物经硫酸镁干燥，溶剂在真空下蒸发生成白色晶体1—(5，6—氧己基)—3，7—二甲基黄嘌呤(900mg，产率为100％)。
3—(5，6—氧己基)—1—甲基尿嘧啶的合成如下搅拌氢化钠(86mg，3.6mmol)和二甲亚砜(25ml)中的1—甲基尿嘧啶(500mg，4mmol)15分钟，然后加入6—溴—己烯(647mg，4mmol)搅拌20小时后，将反应混合物倒入水中(50ml)并用20％的乙醇—二氯甲烷(3×50ml)萃取。合并的有机层用饱和水溶性氯化钠溶液(20ml)洗涤，经硫酸钠干燥。溶剂在真空下蒸发，用柱层析纯化残留物(二氧化硅、乙酸乙酯)生成3—(5—己烯基)—1—甲基尿嘧啶(598mg，产率为72％)。
搅拌3—(5—己烯基)—1—甲基尿嘧啶(598mg，2.9mmol)、4—甲基吗啉—N—氧化物(408mg，3.5mmol)溶液和溶于丙酮(15ml)和水(5ml)中的加入t—丁醇(3滴)的25％四氧化锇溶液3天，加入饱和水溶性连二亚硫酸钠(10ml)、搅拌混合物15分钟，加入水(50ml)，用20％乙醇—二氯甲烷(4×40ml)萃取混合物。合并的有机层通过硫酸钠干燥，真空下蒸发溶剂生成3—(5，6—二羟己基)—1—甲基尿嘧啶(461mg，产率66％)，一种无色油状物。
搅拌3—(5，6—二羟己基)—1—甲基尿嘧啶(350mg，1.4mmol)和溶于乙酸(0.87ml，4.3mmol)的30％的溴化氢45分钟。将溶液加入到碳酸氢钠(1.6g)、水(10ml)和二氯甲烷(20ml)的混合物中。剧烈搅拌15分钟后，分层，水层用二氯甲烷(3×40ml)萃取。经硫酸钠干燥合并的有机层，溶剂在真空下蒸发生成3—(5—乙氧—6—溴己基)—1—甲基尿嘧啶(500mg，产率为100％)。因此获得的溴乙酸不经进一步纯化可用于下一步反应。3—(5—乙氧—6—溴己基)—1—甲基尿嘧啶(360mg，1.0mmol)溶于乙醇中(5ml)并用溶于甲醇(1ml)中1M甲醇钠处理。搅拌15分钟后，将溶液倒入水(10ml)中，并用二氯甲烷(3×30ml)萃取。合并的有机层经硫酸钠干燥，溶剂蒸发后生成无色油状物3—(5，6—氧己基)—1—甲基尿嘧啶(150mg，产率为67％)。
3—(5，6—氧己基)—1—甲基胸腺嘧啶合成如下搅拌氢化钠(343mg，14mmol)和溶于二甲基亚砜(30ml)的1—甲基胸腺嘧啶(2.00g，14mmol)15分钟，然后加入6—溴—1—己烷(2.30g，14mmol)。搅拌69小时后，将反应混合物倒入水中(100ml)，并用二氯甲烷(4×50ml)萃取。合并的有机层用饱和水溶性氯化钠溶液(40ml)洗涤，经硫酸钠干燥，此后溶剂在真空下蒸发，生成残留物经重结晶(二氯甲烷—乙醚)产生3—(5—己烷基)—1—甲基胸腺嘧啶(2.80g，产率为88％)。
搅拌3—(5—己烷基)—1—甲基胸腺嘧啶(2.00g，9mmol)、4—甲基吗啉—N—氧化物(1.17mg，10mmol)相溶于丙酮(15ml)和水(1 0ml)中的四氧化锇(溶于t—丁醇的0.15ml 2.5％的溶液)溶液20小时。加入饱和水溶性连二亚硫酸钠(10ml)，搅拌15分钟后，用20％的乙醇—二氯甲烷(4×40ml)萃取混合物。合并的有机层经硫酸钠干燥，溶剂在真空下蒸发，生成固体残留物。重结晶(乙醇)固体，生成3—(5，6—二羟己基)—1—甲基胸腺嘧啶(2.00g，产率为89％)。
搅拌3—(5，6—二羟己基)—1—甲基胸腺嘧啶(1.65g，6.4mmol)和30％溶于乙酸(3.8ml，19.3mmol)中的溴化氢1.5小时。然后加此混合物至碳酸氢钠(6.7g)、水(40ml)和二氯甲烷(50ml)混合物中。剧烈搅拌15分钟后，分层，水层用二氯甲烷(2×50ml)萃取。合并的有机层经硫酸钠干燥、溶剂在真空下蒸发，生成3—(5—乙酰氧基—6—溴己基)—1—甲基胸腺嘧啶(2.30g，产率为100％)。不进一步纯化溴乙酸可用于下一步反应。3—(5—乙氧—6—溴己基)—1—甲基胸腺嘧啶(2.30g，6.4mmol)溶于甲醇(10ml)中，加入1M溶于甲醇(7ml)中的甲醇钠溶液，搅拌15分钟后，将溶液倒入水(60ml)中，并用20％乙醇—二氯甲烷(2×70ml)萃取。合并的有机层经硫酸钠干燥，溶剂在真空下蒸发，生成3—(5，6—氧己基)—1—甲基胸腺嘧啶(1.30g，产率为85％)，一种白色固体。
3—(5，6—氧己基)—1—甲基苯甲酰脲合成如下搅拌氢化钠(0.76g，30mmol)和二甲基亚砜(100ml)中的苯甲酰脲(4.86g，30mmol)10分钟，然后加入甲基碘化物(1.87ml，30mmol)。搅拌14小时后，加入水(100ml)，用二氯甲烷(3×100ml)萃取溶液。过滤混合物，用硫酸钠干燥二氯甲烷相。真空下溶剂蒸发后，重结晶(二氯甲烷)残留物，生成1—甲基苯甲酰脲(1.3g，产率为25％)，一种白色固体。
搅拌氢化钠(0.17g，6.8mmol)和溶于二甲基亚砜(50ml)的1—甲基苯甲酰脲(1.07g，6.1mmol)溶液10分钟，然后加入1—溴己烷(0.82ml，6.8mmol)。14小时后，加入水(50ml)，用二氯甲烷萃取溶液，合并的有机相用水(3×50ml)洗涤，经硫酸钠干燥，溶剂在真空下蒸发，生成3—(5—己烯基)—1—甲基苯甲酰脲(1.51g，产率为96％)，一种白色固体。
搅拌3—(5—己烯基)—1—甲基苯甲酰脲(1.5g，5.8mmol)、4—甲基吗啉—N—氧化物(0.87g，7.4mmol)和溶于丙酮(12.5ml)和水(4ml)中的双水化锇酸钾(IV)(0.021g，0.1mmol)。18小时后，加入20％水溶性连二亚硫酸盐(20ml)溶液，并搅拌30分钟。溶液由二氯甲烷(3×75ml)萃取合并的有机相经硫酸钠干燥，溶剂在真空下蒸发。通过闪蒸层析(二氧化硅，5％甲醇—二氯甲烷)纯化残留物，生成3—(5，6—二羟己基)—1—甲基苯甲酰脲(1.59g，94％)，一种白色固体。
搅拌溶于乙酸(0.63ml，9.3mmol)的30％溴化氢溶液中的3—(5，6—二羟己基)—1—甲基苯甲酰脲(0.92g，3.1mmol)90分钟。将反应混合物倒入碳酸氢钠(0.78g，9.3mmol)、水(20ml)和二氯甲烷(20ml)混合物中。两相分离，水相用二氯甲烷(2×20ml)萃取。合并的有机相用盐水(20ml)洗涤，经硫酸钠干燥，溶剂在真空下蒸发，生成3—(5—乙酰氧基—6—溴己基)—1—甲基苯甲酰脲(1.2g，96％)。
将1—(5—乙酰氧基—溴己基)—3—甲基苯甲酰脲(1.17g，2.9mmol)溶入甲醇(25ml)中5分钟，然后加入溶于甲醇(3.1ml)的1M甲醇钠溶液中。搅拌1小时后，加入水(50ml)。用二氯甲烷(3×25ml)萃取溶液。合并的有机相经硫酸钠干燥，溶剂在真空中蒸发，生成3—(5，6—氧乙基)—1—甲基苯甲酰脲(0.77g，97％)，一种白色固体。
1—(5，6—氧乙基)戊二酰胺合成如下搅拌戊二酰胺(2.00g，7.7mmol)和保存于二甲基亚砜(40ml)中的氢化钠(425mg，17.7mmol)混合物20分钟，然后加入6—溴—1—己烯(2.90g，17.7mmol)。搅拌20个小时后，将反应液倾入水中(100ml)，并用二氯甲烷(4×50ml)萃取，合并的有机层用水(50ml)洗涤，然后再用饱和水溶性氯化钠溶液(50ml)洗涤。经硫酸钠干燥后，溶剂在真空中蒸发，生成1—(5—己烯基)戊二酰胺(2.92g，产率为85％)。
在溶于二氯甲烷(10ml)的1—(5—己烯基)戊二酰胺(630mg，3.2mmol)加入溶于水(10ml)含50％m—氯过氧苯甲酸(2.5g，7.2mmol)的碳酸氢钠(2.20g，26mmol)溶液。搅拌17小时后，加入连二亚硫酸钠(1.7g，9.0mmol)、并搅拌30分钟。用二氯甲烷(3×10ml)萃取混合物，然后用饱和水溶性碳酸氢钠溶液(10ml)洗涤合并的混合物层。经硫酸钠干燥后，在真空中蒸发掉溶剂，经柱层析(二氧化硅、10％乙醇—二氯甲烷)纯化残留物产生1—(5，6—氧己基)戊二酰胺(180mg，27％的产率)实施例2此实施例叙述合成1—(8—羟—9—(N—苄基)氨壬基)—3，7—二甲基黄嘌呤(第27号化合物)的方法。加热来自实施例1的1—(8，9—氧己基)—3，7—二甲基黄嘌呤(500mg，1.6mmol)和苄胺(2.0g，19mmol)4小时。冷却至室温后加入乙醚(30ml)。用冰冷的乙醚洗涤沉淀物，产生(第27号化合物)(278mg，41％的产率)。
实施例3此实施例解释了1—(5—羟基—6—(N—辛基)氨己基)—3，7—二甲基黄嘌呤(第28号化合物)的合成。在实施例1中合成的1—(5，6—氧己基)—3，7—二甲基黄嘌呤(400mg，1.4mmol)和1—辛胺(391mg，3mmol)在135℃加热4小时。冷却到室温后，加入乙醚(15ml)。用己烷洗沉淀物几次，产生第28号化合物(537mg，产率为94％)实施例4此实施例说明1—(5—羟基—6—(N—(4—苯基)丁基)氨己基)—3，7—二甲基黄嘌呤(第29号化合物)的合成。来自实施例1的1—(5，6—氧己基)—3，7—二甲基黄嘌呤(300mg，1.1mmol)和4—苯基—1—丁胺(322mg，2.2mmol)的混合物于130℃加热70分钟。冷却至室温后，将残留物溶于二氯甲烷(2ml)中，然后加到乙醚(20ml)中。用己烷洗沉淀物几次，产生第29号化合物(280mg，产率为60％)实施例5此实施例说明1—(6—十一烷氨基—5—羟己基)—3，7—二甲基黄嘌呤(第30号化合物)的合成。来自实施例1的1—(5，6—氧己基)—3，7—二甲基黄嘌呤(300mg，1.1mmol)和1—十一烷胺(754mg，4.4mmol)在100℃加热4小时，然后在130℃1小时。冷却至室温后，加入醚(10ml)。用己烷洗蜡状沉淀几次产生第30号化合物(403mg，产率为82％)。
实施例6此实施例说明1—(5—羟基—6—(N—环己甲基)氨己基)—3，7—二甲基黄嘌呤(第31号化合物)的合成。来自实施例1的1—(5，6—氧己基)—3，7—二甲基黄嘌呤(300mg，1.1mmol)和环己烷甲胺(249mg，2、2mmol)混合物在100℃加热5小时，然后在120℃加热1小时。冷却至室温后，加入乙醚(7ml)和己烷(10ml)。沉淀物经己烷洗几次，产生第31号化合物(294mg，产率为68％)。
实施例7此实施例说明1—(5—羟基—6—(N—(6—羟基)己基)氨己基)—3，7—二甲黄嘌呤(第32号化合物)的合成。来自实施例1的1—(5，6—氧己基)—3，7—二甲基黄嘌呤(300mg，1.1mmol)和6—氨基—1—己醇(754mg，2.6mmol)混合物在120℃加热2小时。冷却至室温后，加入乙醚(20ml)。用己烷洗沉淀几次产生第32号化合物(321mg，产率为74％)。
实施例8此实施例说明1—(5—羟基—6—(N，N—二己基)氨己基)—3，7—二甲基黄嘌呤(第33号化合物)的合成。来自实施例1的1—(5，6氧己基)3，7二甲基黄嘌呤(300mg，1.1mmol)和二己胺(556mg，3.0mmol)混合物在135℃加热5小时，然后在170℃加热2小时。冷却至室温后，加入汽油醚(20ml)。在冰箱中冷却后，用汽油醚洗几次沉淀物，产生第33号化合物(263mg，产率为52％)。
实施例9此实施例说明1—(5—羟基—6—(N—(4—甲氧基)苄基)氨己基)—3，7—二甲基黄嘌呤(第34号化合物)的合成。来自实施例1的1—(5，6—氧己基)—3，7—二甲基黄嘌呤(300mg，1.1mmol)和4—甲氧苄胺(0.7g，5mmol)的混合物在100℃加热4小时，冷却至室温后，加入乙醚(10ml)。用汽油醚洗沉淀几次，产生第34号化合物(355mg，产率为78％)。
实施例10此实施例说明3—(5—羟基—6—(N—丙基)氨己基)—1—甲基尿嘧啶(第19号化合物)的合成。来自实施例1的3—(5，6—氧己基)—1—甲基尿嘧啶(100mg，0.4mmol)和n—丙胺(10ml)混合物在一个密封的压力瓶中于80—90℃加热69小时。未反应的n—丙胺蒸发后产生一黄色油状物，重结晶(乙醚—二氯甲烷)，产生第19号化合物(80mg，71％)，一种白色固体。
实施例11此实施例说明3—(5—羟—6—(N—苄基)氨己基)—1—甲基亚苯甲酰基脲(第3号化合物)的合成。来自实施例1的3—(5，6—氧己基)—1—甲基亚苯甲酰基脲(0.1g，0.4mmol)和苄胺(0.13g，1.2mmol)的混合物在氩中于115℃搅拌，3小时后，未反应的苄胺在真空中蒸发，残留物持续结晶，产生(第3号化合物)(0.14g产率为93％)，一种白色固体。
实施例12此实施例说明1—(5—羟基—6—(N—丙基)氨己基)—3，7—二甲基黄嘌呤(第14号化合物)的合成。来自实施例1溶于n—丙胺(5ml)的1—(5，6—氧己基)—3，7—二甲基黄嘌呤(238mg，0.86mmol)溶液在100℃于密封压力瓶中加热23小时。冷却至4℃后，启开密封瓶，在真空中蒸发未反应的n—丙胺，产生(第14号化合物)(190mg，产率为64％)，一种粘稠油状物。
实施例13此实施例说明1—(5—羟基—6—(N—苄基)氨己基)—3，7—二甲基黄嘌呤(第13号化合物)的合成。来自实施例1的(5，6—氧己基)—3，7—二甲基黄嘌呤(50mg，1.8mmol)和苄胺(1.7g，15.8mmol)混合物在150℃加热4小时。冷却至室温后，加入乙醚(20ml)。用冷乙醚洗沉淀物，产生第13号化合物(470mg，产率为70％)。
实施例14此实施例说明N2—(5—羟—6—(N3—丙基)氨己基)—(N’—丙基)戊二酸(第5号化合物)的合成。来自实施例1在n—丙胺(5ml)中的1—(5，6—氧己基)戊二酰胺(60mg，0.3mmol)溶液在密封瓶中于80—90℃加热3小时。未反应的n—丙胺在真空中蒸发，产生的残留物和乙醚研制，产生化合物5(100mg，100％的产率)。
实施例15此实施例说明3—(5—羟基—6—(N—十一烷基)氨己基)—1—甲基胸腺嘧啶(第24号化合物)的合成。来自实施例1的3—(5，6—氧己基)—1—甲基胸腺嘧啶(250mg，1.1mmol)和十一烷胺(0.7ml)的混合物在110℃加热4小时。冷却至室温后，加入乙醚(5ml)和石油醚(10ml)。冷却至—10℃2小时后，用石油醚洗沉淀物几次产生第24号化合物(361mg，产率为80％)。
实施例16此实施例说明3—(6—丙氨基—5—羟己基)—1—甲基胸腺嘧啶(第26号化合物)的合成。来自实施例1在n—丙胺(10ml)中的3—(5，6—氧己基)—1—甲基胸腺嘧啶(200mg，0.8mmol)溶液在密封的压力瓶中子100—105℃加热24小时，未反应的n—丙胺蒸发后，结晶(乙醚)残留物，产生第26号化合物(162mg，产率为68％)。
实施例17此实施例说明1—(8—羟基—9—(N—辛基)氨壬基)—3，7—二甲基黄嘌呤(第35号化合物)的合成。来自实施例1的1—(8，9—氧己基)—3，7—二甲基黄嘌呤(300mg，0.9mmol0和壬胺(1ml)在110℃加热3小时。冷却至室温后，加入乙醚(10ml)，用汽油醚洗沉淀几次，产生第35号化合物(342mg，产率为85％)。
实施例18此实施例说明1—(5—羟基—6—(N—十四烷基)氨己基)—3，7—二甲基黄嘌呤(第36号化合物)的合成。来自实施例1的1—(5，6—氧己基)—3，7—二甲基黄嘌呤(300mg，1.1mmol)和1—十四烷胺(604mg，2.8mmol)在110℃加热3小时，冷却至室温后，加入乙醚(6ml)。沉淀物用汽油醚洗几次，产生第36号化合物(356mg，产率为66％)。
实施例19此实施例说明合成1—(9—十四烷氨—8—羟壬基)—3，7—二甲基黄嘌呤(第73号化合物)的方法1—(8，9—氧壬基)—3，7二甲基黄嘌呤(上述实施例1合成的，1.00g，3.1mmol)和无水过氯酸锂(329mg，3.1mmol)混合物在无水乙腈(30ml)中搅拌。加入十四烷胺(Aldrich，722mg，3.4mmol)后，在60℃搅拌混合物4小时。冷却后，加入水(50ml)用二氯甲烷(3×50mml)萃取混合物。合并的有机层用水(30ml)和饱和水溶性盐溶液(30ml)洗涤，接着用硫酸钠干燥。溶剂在真空中蒸发掉，产生一白色残留物。用层析法(中性II氧化铝，二氯甲烷/5％甲醇)分析白色残留物，结果生成860mg第73号化合物(产率为52％))。
实施例20此实施例说明合成第63号化合物的方法。在溶于二甲基亚砜(300ml)的3，7—二甲基黄嘌呤(7.2g，40mmol)的溶液中加入氢化钠(95°)(1.26g，50mmol)。搅拌20分钟后，加入十一烷基甲磺酸(7.95g，30mmol)在室温搅拌12小时。反应物加温至70—80℃后，搅拌4小时，将反应物倾入含1升水的分液漏斗中，用二氯甲烷萃取(5×200ml)。合并有机萃取物用水(100ml)和盐水(100ml)洗溶，经无水硫酸镁干燥，在减压条件下浓缩。进一就纯化获得的粗制品，方法是使用20％的己烷/二氯甲烷洗脱剂通过二氧化硅胶闪蒸层析，以获得4.6g 1—(10—十一烷基)—3，7—二甲基黄嘌呤(46.3％的产率)。
搅拌1—(10—十一烷基)—3，7—二甲基黄嘌呤，上述已制备(4.3g，13mmol)、4—甲基吗啉—N—氧化物(1.942g，16.6mmol)，在丙酮(45ml)和水(10ml)中的二水化锇酸钾(9.5mg.0.026mmol)溶液6小时，加入20％的水溶性连二亚硫酸钠(12ml)、搅拌30分钟。用25％乙醇/二氯甲烷(4×100ml)萃取反应混合物。合并的有机提取物经无水硫酸镁干燥、在减压下浓缩，使用甲醇/5％二氯甲烷洗脱剂通过二氧化硅凝胶内蒸层析法提纯，获得3.6g(1—(10，11—二羟十一烷基)—3，7—二甲基黄嘌呤(产率为76％)。
1—(10，11—二羟十一烷基)—3，7—二甲基黄嘌呤，上述已制备(3.6g，1 0mmol)，与溴化氢(6.2ml，8.4g溶于30％乙酸中，31.1mmol)一同搅拌90分钟。混合物此后加入到含100ml水溶性碳酸氢钠溶液和75ml二氯甲烷的长颈瓶中，剧烈搅拌10分钟后，分层，用二氯甲烷(3×75ml)洗水溶性成分。合并有机相，经硫酸镁干燥，然后蒸发，产生1—(10—乙酰氧基—11—溴十一烷基)—3，7—二甲基黄嘌呤(3.6g)。不进一步纯化，从甲醇(25ml)中提取溴乙酸，并用甲醇钠(从0.28g，12.2mmol钠、25ml甲醇中制备)处理。30分钟后，大部分溶剂在减压下蒸掉，残留物用二氯甲烷(3×75ml)萃取。合并有机部分，经硫酸镁干燥，在减压下浓缩，产生一灰白的固体，使用二氯甲烷/3％甲醇洗脱剂经二氧化硅胶通过柱层析纯化，获得2.0g 1—(10，11—氧十一烷基)—3，7—二甲基黄嘌呤(产率为57％)。
上述制备的1—(10，11—氧十一烷基)—3，7—二甲基黄嘌呤(50mg，1.4mmol)和过氯酸锂(来自Aldrich，149mg，1.4mmol)混合物在无水乙腈(来自Aldrich，20ml)中搅拌直至匀质状态。加入苯胺(来自Aldrich，670mg，7.2mmol)，在室温下搅拌混合物16小时，在回流温度下3小时，残留物直接加到二氧化硅柱上。使用二氯甲烷/10％甲醇梯度层析法产生0.45g第63号化合物(产率为73％)实施例21此实施例说明诱导CMV启动子活性的不同发明化合物增殖活性资料。CMV启动子实验测定基因的转录和翻译活性，在转化(脲病毒)的细胞中，任何活化的化合物都有抑制细胞蛋白合成的细胞毒性。测定了每一个化合物，资料列入下表I。第30号化合物是测定的最有细胞毒性的化合物。
表1化合物 IC50(μM)13＞50028 5029＞10030 1531＞10032＞10033 1005 ＞50019＞50026＞500
实施例22此实例说明通过5—羟色胺释放实验抑制柱细胞脱粒的发明化合物的作用。此实施例对过敏和哮喘的治疗产品提供了一体外模型。下表II指出了5种发明化合物的结果(化学名称和结构见上面)。
表II化合物％抑制率浓度(μM)1328％1002729％5030 too toxic 5035 too toxic 5019 inactive 50实施例23此实施例说明对环孢菌素A(CsA，图1A)和通过刀豆素A(ConA)和白细胞介素II(IL—2)共刺激的鼠胸腺细胞增殖的不同发明化合物(图.1B)产生50％抑制浓度(IC50)的剂量反应曲线。ConA，用于激活CD3，诱导T—细胞增殖和分化。来自正常、雌性小鼠的胸腺，离解后以每孔2×105个细胞的密度接种进96孔的培养皿中。在孔中加入CohA(0.25mg/ml)和IL—2(15v/ml)。在37℃孵育细胞4天。在第四天，用氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷脉冲细胞，并再培养4小时。用液闪计数器确定收获的细胞掺入的氚标记的胸苷染料。在ConA和IL—2激活前2小时加入药剂(图1A和1B中已说明)。背景计数少于200cpm。测定的CsA和发明的化合物抑制胸腺细胞增殖的活化。
实施例24此实施例说明使用下列指定的实验步骤，通过与获得的细胞毒性资料比较潜力(抑制活性)，用于不同自免和炎症疾病的发明化合物的治疗潜力。在第5号、13号、26号和27号的混合淋巴细胞反应实验，一种双向混合淋巴细胞反应中出现了对同种异体刺激的增殖性PMBC应答。第5号和第6号化合物在此特异性、免疫调节的活性实验中，出现了最低的实验活性，IC50值如图2A和2B所示，超过250μM。第27号和13号化合物在此实验中出现了剂量一反应活性，IC50值分别如图2C所示的40和55μM。
图2D说明在一个测定化合物免疫抑制活性的混合淋巴细胞实验中五种发明化合物(见上述相应的化学名称)的IC50值直方图。
第27号化合物没有出现显著的抑制活性。第28号化合物证实是那些实验中第有潜力的化合物。
在混合淋巴细胞反应实验培养中，在细胞培养6天后确定百分存活率。图2E说明百分存活率的直方图结果。在此培养条件下，非暴露于药物的对照细胞一般为78—85％的百分存活率，在此实验中，所有发明化合物的浓度皆为100μM，一般在此实验(见图2D)中，在相应的IC50值之上。最有潜力的化合物，第28号化合物，也在100μM最具细胞毒性的，但此浓度在IC50值之上，提示有显著的治疗前景。第13和27号化合物在高于各自的IC50值浓度时，很少或不出现细胞毒性。
按实施例21所用的方法，十个其它代表性的发明化合物分析证实了抑制生物活性结果。如上所述，在胸腺细胞ConA/IL—2共刺激实验中，获得了测定的发明化合物的IC50值。使用下列细胞毒性实验，获得了此十个化合物的百分之五十(50％)致死剂量浓度(LD50)。以每孔104个细胞接种人类骨髓起源的基底细胞(早期)，达到满度后，继续加液培养3天。在清洗之前，用此发明化合物处理基底细胞2小时，并使用存活率染料、BCECF、分析荧光度。使用的最大浓度为50μM(这里，LD50大于50μM，意味着在50μM无副作用)。图2F说明从胸腺细胞共刺激实验(IC50值)和第10号、35号、39号、42号、43号、45号、49号、50号、51号和60号发明化合物细胞毒性实验(ID50)获得的结果。如所证明的一样，大多数化合物对基底细胞无细胞毒作用，但在胸腺细胞IL—2共刺激实验中，是非常有潜力的抑制剂。
实施例25此实施例说明出现抑制作用的几种发明化合物对鼠胸腺细胞增殖的作用。所示和讨论的资料通过以往不知的机制证实了发明化合物的功能。在此实施例的第一部分，第30、33、28和27号化合物(见上述化学名称和结构)出现了通过ConA和白细胞介素1α(IL—α)刺激的对鼠胸腺细胞增殖的有效抑制。在一个近似于实施例21讨论的胸腺细胞共刺激步骤中，用ConA和IL—1α激活前2小时，在培养基中加入第30、33、28和27号化合物。在实验中测定的所有化合物都出现了剂量反应抑制特性及获得的每种化合物的剂量反应曲线。测定的每种发明化合物确定的IC50值如下第30号化合物IC50为0.94μM，第33号化合物IC50为8.6μM，第28号化合物IC50为4.6μM，第27号化合物IC50少于12.5M。实验中背景计数少于200cpm。
在补充研究中，获得的结果说明，发明化合物比所知的两种广泛研究的免疫抑制剂，CsA和/或FK506有不同的免疫抑制机理。在增殖实验中，用ConA(“启动步骤”过夜预培养小鼠胸腺细胞，清洗，在发明化合物存在时用IL—2重复刺激。第四天，用氚标记的胸苷脉冲细胞，并允许其再培养4小时。收获细胞，用液闪计数器通过收获的细胞计算掺入的氚标记的胸苷的量。图3A报告了获得的结果。在对照细胞，用ConA预培养，以近似于抗原识别的方式，通过刺激CD3受体启动了胸腺细胞。研究表明，CD3抗体可被ConA取代。一旦继续加入IL—2，胸腺细胞就增殖了。在ConA接种、“启动”期间加入的CsA抑制对IL—2刺激应答的胸腺细胞增殖。然而，当用ConA和第35号化合物预培养胸腺细胞，“启动”产生了，如图3所示，通过继续—观察的正常对IL—2刺激反应的胸腺细胞增殖。发明化合物不抑制由干扰对IL—2刺激反应的继续增殖必须的此“启动步骤”的增殖。
此外，用ConA过夜预培养细胞，清洗、用IL—2刺激(加或不加CsA或发明化合物)。第四天，用氚标记胸苷脉冲细胞，许其再培养4小时。收获细胞，用液闪计数器确定掺入的氚标记胸苷的量。用ConA预刺激的细胞对IL—2刺激反应而增殖。图3B表明这些实验中获得的结果。CsA(50μM)对胸腺细胞增殖很小出现抑制(通过掺入的记录染料量说明)。然而形成鲜明对比的是，第35号化合物(在很少的浓度，1μM)却显著地抑制胸腺细胞增殖。
此实验最终证实，CsA和FK506(以同样方法抑制CD3)和发明化合物比较，有不同的作用机制。CsA抑制ConA“启动”。此发明化合物不能。此发明化合物抑制IL—2刺激，CsA不能。证实的结果说明此发明化合物用于降低或预防需要细胞刺激剂状况的负作用。
实施例26此实施例说明第27号和28号化合物，通过抗—mμ(10mg/ml)和白细胞介素4(IL—4)(12.5ng/ml)刺激鼠脾细胞增殖的抑制作用。如上所述，此体外实验指出了强调体液或B细胞免疫应答的免疫抑制/自身免疫处理实验。以固定的剂量在用抗—mu和IL—4活化前2小时将此发明化合物加入细胞中。第27和28号化合物以剂量反应方式，抑制脾细胞增殖。如图4所示，第27和28号化合物的IC50值分别是3.3μM和5.2μM。背景计数少于200cpm。
实施例27此研究说明IL—2(α链CD25)受体在鼠脾细胞上的表达。在休止期T—细胞，IL—2受体不表达，但可通过某些刺激剂，例如，抗原识别或用ConA或抗CD3(抗—CD3)的抗体，迅速诱导。IL—2依赖的增殖需要IL—2受体表达。用抗CD3抗体(10μg/m)，在加或不加入CsA(20μM)或第49号化合物(1μM)时，刺激脾细胞。接着过夜培养，用荧光化抗IL—2受体抗体对脾细胞染色，通过流式细胞诗数方法测定荧光度。图5A和5B是测定每个样品20,000个细胞的频度直方图。培养基对照荧光度水平低，然而在IL—2受体表达时，用抗—CD3刺激物刺激，有大的相对增加。用CsA共培养，抑制CD3—刺激的，IL—2受体表达，而用第49号发明化合物培养，以阻止90％IL—2刺激增殖的脾细胞浓度，对受体表达无影响。这些资料证实，CsA和第49号化合物通过不同的机理影响免疫细胞。
实施例28此实施例说明和CsA的作用相比，在鼠胸腺细胞，第49和50号化合物不抑制IL—2的生产。用ConA和IL—1刺激胸腺细胞4天，对培养基加或不加入发明化合物。移去上清液，用市售试剂盒，通过ELISA分析IL—2水平。图6所示结果说明在20nM CsA培养抑制IL—2生产及分泌。另有证明，测定的典型发明化合物不抑制IL—2。这些资料说明CsA和测定的发明化合物经不同的机制干扰鼠淋巴细胞功能。
实施例29此实施例说明在测定对细胞刺激物反应的实验中，第27、49、50、45、43或41号(上述的)代表性发明化合物的活性。
一个关于鼠淋巴结细胞增殖(由抗原刺激)的实验用于测定第27号化合物对淋巴结细胞增殖的抑制活性。此体外实验是一个强调细胞或T细胞免疫应答的免疫抑制/自身免疫治疗的预测实验。此实验用了在体外增殖对可溶性蛋白抗原应答的鼠T细胞，用于启动体内T细胞。在同种异体抗原活化前2小时，以图7和8(指出实验结果)指定的剂量在细胞中加入化合物。第27号化合物以剂量反应方式抑制T细胞增殖。第一个实验(结果见图7)第27号化合物的IC50值是23.1μM，第二个实验(结果见图8)IC50值是19μM。
此实施例另外一个实验是用来测定在鼠细胞毒T—细胞系CT6，此发明化合物对直接的IL—2诱导的增殖的抑制活性。CT6细胞系是IL—2依赖的细胞系。在刺激前24小时，从培养基中移去IL—2。在IL—2刺激前1小时，以不同的浓度加入CsA或第49、50、45、43或41号化合物。用IL—2刺激细胞，氚标记胸苷掺入染料的量在48小时后测定。背景计数少于5000cpm。分析结果用图9A和9B以图线形式绘出。这两个图线说明CsA和发明化合物对IL—2诱导的增殖有不同的作用。CsA甚至在很高的浓度下不抑制增殖。然而，不同的是，发明化合物抑制直接的IL—2诱导的CT6增殖。
实施例30此实施例说明参比化合物“×”。和第29、30、31、32和33号发明化合物(见上述名称和结构)和在任何化合物添加物(对照)存在时的酵母活性比较，使用100μM的浓度，对酵母生长(Saccha-rmyces cervisiae)的作用。此实验测定了检测的发明化合物抗酵母和抗真菌活性。如图10所示，第30号和33号化合物呈现了酵母—生长抑制活性，预测此测定的发明化合物是局部或系统的抗微生物化合物。
实施例31此实施例说明了此发明化合物的潜在的抗原特异的无反应诱导。无反应性是由于T细胞抗原识别(无共刺激)或诱导的增殖抑制所致的T细胞“无反应”的延长状态。当对IL—2反应的T细胞增殖能力被某种试剂抑制时，此后来的T细胞无反应便产生。无反应性通常认为是一种对抗原活化的耐受。因此，体外无反应性是预测体内耐受增强剂的措施。耐受在预防移植方法的器官排斥，及其它自免疾病，如动脉粥样硬化、风湿性关节炎、狼疮、和糖尿病相关的自身免疫力是重要的。
A、B细胞瘤、2PK3(H—2d)用于刺激C57BL/6脾细胞(H—2b)、一种相对应的细胞。B—细胞瘤和脾细胞混合培养基在有或无1μM第45号化合物存在时，培养5天。5天后，清洗细胞、用培养基、原来抗原(2Pk3)或抗—CD3重悬。氚标记胸苷加入至产生的悬液中，24小时后测定胸腺掺入率。结果见图11。如所述的，用第45号化合物处理的培养基和未处理的培养基对抗—CD3反应相同。然而，同第45号化合物培养的培养基5天后对原抗原2PK3反应降低。因此，C57BL/6脾细胞通过在预培养步骤使用的发明化合物对原抗原反应得到抑制。然而，对抗CD3刺激反应的正常培养基预测此发明化合物出现抗原特异的，无反应性诱导特征。
实施例32此实施例说明发明化合物对反应PDGF刺激的人基底和Balb/3T3细胞增殖的抑制作用。
此实验用于预测预防和治疗再狭窄、动脉粥样硬化和冠状动脉病的治疗活性。在无水清的培养基中人基底细胞饥饿一天，然后用50ng/ml PDGF—BB刺激。以不同浓度在PDGF刺激前1小时，加入发明化合物。PDGF和氚标记胸苷加入后，培养细胞1天，接着加入PDGF和胸苷。24小时后，收获细胞，并通过液闪计数。第28、30、31、33和29号化合物的结果见图12。背景计数(饥饿细胞)约为对照水平的1％。结果表明用第30、28、29、32和31号化合物各自的IC50值(用μM表示)0.9、3.2、40、＞50和＞50在这种预测体外模型药物有活性。
结合人基底细胞/PDGF刺激实验，测定的此发明化合物对基底细胞的毒性也确定了。图13说明此细胞毒性实验的结果。只有第30号化合物，出现显著的测定化合物抑制作用，在浓度大于0.9μM，IC50值出现细胞毒作用。
在PDGF—1共刺激、增殖实验，测定抑制作用，一组发明化合物出现抑制特性。PDGF实验用于测定体内活性，指出治疗和预防再狭窄和再灌注的治疗能力。图14报告一组发明化合物第27、28、32、30、31、32和34号的IC50直方图结果，在此预测性体外模型中，第28和30号化合物出现潜在的抑制活性，预测对再狭窄及再灌注有治疗作用。
此发明化合物对PDGF诱导的Balb/3T3细胞增殖有抑制作用。Balb/3T3细胞对PDGF刺激剧烈反应，并用于进一步研究PDGF诱导增殖的体内模型中。错误调节的PDGF—增殖反应和多种疾病相联系，包括如再狭窄、动脉粥样硬化、纤维化和肿瘤细胞血管形成因子。在用不同浓度第45号发明化合物刺激前24小时，将细胞接种在含低血清的培养基中。PDGF—BB以怛定浓度10μM加入。24小时后氚标记胸苷加入后，收获细胞，进行液闪计数。图15说明此实验的剂量反应曲线，包括IC50值，近于0.08μM，测定化合物的典型抑制活性。
实施例33在上述类似实施例32和其他实施例的实验中，研究了不同发明化合物抑制鼠胸腺细胞和Balb/3T3细胞对刺激物反应增殖的能力。根据实施例23，在鼠胸腺细胞ConA/IL 2同刺激实验中，获得了第13、27、28、29、30、31、33、5和26号发明化合物的IC50值。图16报告了在此体外模型中不同的测定化合物的比较结果。第28、30和27号化合物在那些体内模型中显示了最有效的免抑疫制作用。
在另一个类似于实施例32的Balb/3T3增殖实验中，第70、45、59和58号化合物的IC50和ID50值确定了。如实施例32那样，用细胞毒性实验，确定了LD50值。在这些实验中，Balb/3T3细胞，用PDGF刺激并用类似于上述氚标记胸苷的方法，用上述发明的化合物之一处理，代替用存活染料BcEcF、荧光染料培养。使用荧光平四读数器测定荧光度。使用的最高浓度为50μM，因此，LD50值大于50μM意见味着在50μM无副作用。图17说明通过比较测定的发明化合的LC50与LD50值的实验结果。大多种测定的化合物是非细胞毒性但却是重要的增殖抑制剂。
实施例34此实施例比较了第27号发明化合物对转化细胞与非转化细胞的细胞毒性结果。在转化细胞(Ras3T3)和正常3T3细胞，在浓度为1、10和100μM时，确定了第27号化合物的细胞毒性。图18报告了此实验获得的结果。在上述每一个浓度，第27号化合物对癌细胞比正常细胞细胞毒性更大。这些结果表明，测定的化合物对肿瘤细胞有分化毒性，预测了在癌化疗中的潜在利用性。
实施例35此实施例说明第58号发明化合物对增殖的抑制作用。一个实验用于研究对PDGF诱导的人主动脉平滑肌细胞(主动脉SMC)增殖的作用从商业上提供者(Cell Systens，Inc.，Seattle，WA)购买的细胞，在加或不加第58号(5μM)化合物时，用不同浓度的PDGF—BB培养。如图19所示，第58号化合物甚至在高的PDGF浓度下，提供最大的增殖刺激，第58号化合物抑制PDGF诱导的增殖。此外，一些培养基在PDGF刺激前1小时，用第58号此发明化合物处理。如所证实的一样，PDGF在此细胞系刺激增殖。5μM第58号发明化合物的加入阻止PDGF刺激的增殖，观察到第58号化合物没有毒性作用。
另一个实验用于研究第58号发明化合物对人主动脉平滑肌细胞(主动脉SMC)碱或酸性FGF诱导的增殖和的抑制作用。错误调节的bFGF或aFGF诱导的增殖SMC增殖动脉硬化形成和再狭窄的新内膜闭合相联系，并在肿瘤细胞的自泌和外分泌刺激及肿瘤细胞诱导的血管形成中发挥作用。在此实验中，用不同浓度的PDGF刺激前24小时，在低血清(0.5％胎牛血清)中接种细胞。用不同浓度的aFGF或bFGF过夜刺激，在选择培养基中加入5μM第58号化合物。第58号化合物是在此细胞类型，代表其它被检细胞类型aFGF和bFGF诱导增殖潜在抑制剂。图20A(aFGF)和图2B(bFGF)所示的结果说明了抑制程度。已观察在此实验中第58号化合物到无毒性作用。
实施例36此实施例说明使用类似于实施例23的方法用ConA和IL—2共刺激鼠胸腺细胞的增殖研究。另一个相关的实验检查了CT6细胞增殖的抑制作用。CT6细胞是对鼠IL—2(15U/ml)反应增殖的鼠IL—2依赖性的、细胞毒T细胞系。图21A、21B、21C和21D说明在每一实验中，第35号化合物和CsA的实验结果。图21A说明第35号化合物对鼠淋巴细胞共刺激的抑制活性程度。图21B CsA的比较的抑制活性。第35号发明化合物和CsA在低微克分子和毫微克分子范围各自的IC50值，呈现明显的胸腺细胞增殖抑制性。图21C和21D分别说明第35号化合物和CSA的抑制作用。第35号化合物和CsA在此实验中没有活性，表明，没有一个抑制IL—2诱导的细胞毒CT6细胞的增殖。
实施例37此实施例说明在人脐静脉内皮细胞系(HUVEC)第58号化合物对血管内皮生长因子(VEGF)诱导的增殖的抑制作用研究。在此实验方法，在用不同的浓度的VEGF刺激前24小时，将细胞接种在低血清(0.5％胎牛血清)中。VEGF经证实对肿瘤细胞调节的血管形成是重要的。如图22所示，第58号化合物，5μM，在所有测定的VEGF浓度，抑制VEGF—诱导的增殖。
实施例38此实施例说明第由58号化合物，血管细胞粘性分子(VCAM)在HUVEC上表达的抑制研究。在其它不同的自身免性疾病中，内皮细胞VCAM的表达是动脉粥样硬化形成和多重硬化病理过程的早期事件。图23是在此典型实验中获得的一系列频率直方图。最上边组说明是从用直接抗VCAM抗体和次级干山羊抗鼠—FITC抗体染色的HUVEC流式细胞计数获得的频率直方图。在TNF存在时，HUVEC上VCAM的表达水平很低。中间组说明用流式细胞计数分析前6小时用TNF刺激细胞的频度直方图。细胞荧光度平均增加接近10倍。下边组是在第58号化合物存在时；TNF刺激细胞的频率直方图。和源于TNF刺激细胞，在第58号化合物存在时的平均荧光度比较，此发明化合物的存在，通过一个因子8降低平均荧光度。
实施例39此实施例说明粘附于IL—1—活化的HUVEC THP—1细胞上第50和57号化合物的抑制的抑制活性。在一个研究实验中，在一96孔的微滴度板上，无或有不同浓度的药物存在时，用IL—1(10ng/ml)刺激HUVEC 10天。在孔板上，以每孔50000个细胞加入人单细胞白血病细胞系THP—1细胞。用BCECF预培养THP—1细胞，使用荧光染料经荧光平皿读数器测定细胞数。在37℃十分钟后，反转微滴度板，并在900rpm旋转。然后分析内含的粘附THP—1细胞。如图24所示，非刺激的背景粘度近于1500相对单位，在TNF刺激下，增至近6500，测试的发明化合物即使在很低浓度下，显著地抑制THP—1粘附。
实施例40此实施例说明第58号发明化合物对人肺平滑肌细胞aFGF或bFGF诱导的增殖的抑制作用。在用不同浓度的PDGF刺激前24小时，将细胞接种在低血清(0.5％胎牛血清)中。在有和无第58号化合物(5μM)存在时分析用aFGF或bFGF刺激的细胞，图25A和25B(aFGF和bFGF，分别地)报告了实验结果)。如结果中所示，第58号化合物是此细胞类型aFGF和bFGF诱导的增殖的潜在抑制剂，此平滑肌细胞是其它检测类型细胞的代表。在此实验中没有观察到第58号化合物的毒性作用。
实施例41此实施例说明1—辛氨基—10—羟—11—(N—甲基乙酰氨基)十一烷(第77号化合物)的合成。将氢化钠(0.56g，23mmol)加到1—溴—10—十一烷(5.4g，23mmol)和DMSO(4ml)中N—甲基乙酰胺(91.7g，23mmol)溶液中，8小时后，反应完毕，将混合物加入水(100ml)中，并用二氯甲烷(3×100ml)萃取。合并的萃取物用水(70ml)及饱和水溶性盐溶液(70ml)洗涤，经硫酸钠干燥。在真空下蒸发溶剂，产生黄色残留物，经层析(二氧化硅/乙酸乙酯)产生2.95g 1—(N—甲基乙酰氨基)—10—十一烷，一种无色油状物(产率为57％)。
1—(N—甲基乙酰氨基)—10—十一烷(2.0g，8.9mmol)、N—甲基吗啉—N—氧化物(溶于水中4ml 6％水溶液，18mmol)及溶于丙酮(50ml)、水(30ml)和t—丁醇(10ml)中的二水化饿酸钾(10mg)在室温搅拌17小时。加入连二硫亚酸钠(200mg)以减少饿的催化剂。30分钟后，混合物加入二氯甲烷(50ml)后分层。水层相用二氯甲烷(3×50ml)萃取。用饱和水溶性盐溶液(50ml)洗合并的有机层，并经硫酸钠干燥，接着在真空下蒸发掉溶剂直至一厚层残留物，使用二氧化硅和二氯甲烷/15％甲醇洗脱剂经层析法纯化残留物，结果产生1.61g 1，2—二羟—11—(N—甲基乙酰氨基)十一烷(产率为70％)。结果产生的二醇(1.61g，6.2mmol)在溶于乙酸(3.7ml)的30％的溴化氢溶液中搅拌1小时，将溶液加入到溶于水(50ml)的碳酸氢钠(7g)和二氯甲烷(25ml)的混合物中。泡沫消失后，分层，用二氯甲烷(2×70ml)萃取水层。合并的有机层用水(30ml)和饱和的水溶性盐溶液(30ml)洗涤，然后经硫酸钠干燥。在真空下移去溶剂，获得2.16g 1—(N—甲基乙酰氨基)10—乙酰氧基—11—溴十一烷，一种无色油状物(产率为96％。将甲醇钠(351mg，6.5mmol)加入到溶于甲醇(15ml)的溴乙酸(2.16g，5.9mmol)溶液中。搅拌1小时后，将混合物加入水(25ml)中并用二氯甲烷(3×25ml)萃取。合产的有机层用饱和水溶性盐溶液(25ml)洗涤，并经硫酸钠干燥。真空下蒸发掉溶剂，用二氧化硅和乙酸乙酯洗脱剂经层析法纯化残留物，产生831mg 1，2—氧—11—(N—甲基乙酰氨基)十一烷(产率为58％)。
搅拌1，2—氧—11—(N—甲基乙酰氨基)十一烷(400mg，1.7mmol)、辛胺(0.26g，2mmol)和在于乙腈(10ml)中的过氯酸锂(181mg，1.7mmol)16小时。混合物加入水(20ml)中，并用二氯甲烷萃取(3×30ml)。用饱和盐溶液洗涤合并的有机层，并经硫酸钠干燥。在真空下蒸发掉溶剂。产生的残留物使用二氯甲烷/5％甲醇/5％三乙胺洗脱剂经层析纯化，产生416mg第77号化合物(产率为56％)。
实施例42此实施例说明发明化合物对反应PDGF刺激的Balb/3T3细胞增殖的作用。研究表明，发明化合物对PDGF诱导的Balb/3T3细胞增殖具有抑制作用。Balb/3T3细胞对PDGF刺激反应强烈，并用于研究PDGF诱导的增殖体外模型中。错误调节的PDGF—增殖反应和多种疾病有关，包括如再狭窄、动脉粥样硬化、纤维化和肿瘤细胞血管形成。在用不同浓度的第77、7和78号发明化合物刺激前24小时将细胞接种在低血清的培养基中。
在PDGF刺激前1小时，以不同浓度，加入第77、7和78号发明化合物。PDGF—BB以恒定浓度10μM同氚标记胸苷一起加入。培养细胞一天，接着加入PDGF和氚标记胸苷，24小时后，收获细胞并经液闪计数。图26A、26B和26C分别表示第77、7和78号化合物的结果。背景计数接近1％对照水平。此结果说明在预测性体外模型，测试药物抑制Balb/3T3增殖。
实施例43此实施例说明第78、79和80号发明化合物对由ConA和IL—2共刺激的鼠胸腺细胞增殖用于产生50％抑制作用浓度(IC50)的剂量反应曲线。从正常雌性Balb/c鼠获得的胸腺，消化分解后以2×105细胞/每孔的密度接种于96孔的培养板中。将ConA(0.25mg/ml)和IL—2(15U/ml)加入孔中。细胞在37℃培养4天，第4天，用氚标记的胸苷脉冲细胞并再培养4天，收获的细胞用液闪计数器测定氚标记的胸苷掺入染料的量。在ConA和IL—2活化前2小时加入试剂(见图26A、26B和26C)。背景计数少于200cpm。此测试化合物的IC50值对第78、79和80号化合物分别为12.4、10.6和3.8μM。所有测试的化合物抑制胸腺细胞增殖和活化。
实施例44此实施例说明从不同的体外、体内发明化合物的实验结果收集的结论性资料。通过一系列公开的类别(第50号化合物)呈现的抗癌药物。
通常，恶性肿瘤的生长和播散(细胞通过正常调节机理快速、无控制的增长)标志着癌症的特征。癌的确切病因尚未明了。此发明化合物的亚临床和临床实验表明，癌细胞生长可经第二信使途径调节。癌基因突变产生异常的持续对此途径的刺激，导致失调和失分化生长(即恶性转化)。癌细胞转移(即突破血管壁播至远隔身体部位)并分泌称为金属蛋白酶，能“分解”血管壁，允许癌细胞进入血流并形成远处肿瘤(蛋白水解)的酶。有一种这样的金属蛋白酶，IV型胶原酶。此外，肿瘤细胞粘附受体(整合素)产生粘着—对肿瘤定位于器官—肿瘤细胞定位于血管壁及正常器官显然是必需的。癌细胞也分泌某种蛋白质，如bFGF，刺激新血管形成(血管形成或新血管化)、这些新血管对孕育恶性肿瘤生长提供了营养。令人懊恼的研究结果表明第二信使途径和IV型胶原酶生产、粘附受体表达及bFGF分泌结合一体。
不象常规的抗癌疗法，此发明化合物通过抑制第二信使途径降低通过抑制癌基诱导活动的肿瘤细胞生长；通过抑制金属蛋白酶生产的转移能力；通过抑制粘性受体表达的肿瘤对正常器官的粘附；通过抑制bFGF或其它肿瘤依赖性生长因子信号诱导携带营养的血管形成的肿瘤细胞的能力。
此发明化合物表现出抗几种恶性状况的抗癌特性，包括肺、乳腺和结肠癌，不象常规的癌化疗，在体外，发明化合物对癌细胞为致死浓度，对正常细胞无毒。从具有代表性的第50号化合物获得的体外资料如下图28报告了PDGF诱导的Balb/3T3细胞(实施例32)增殖，第50号化合物获得的结果，说明这些发明化合物对PDGF诱导的增殖的抑制特性，在2μM低的浓度时出现显著的抑制作用。抑制增殖的能力(在肿瘤细胞生长中代表一种癌基因诱导活动)表明发明化合物，特别是第50号化合物能通过抑制癌基因诱导活动，降低肿瘤细胞生长。
另一个实验是测定发明化合物的潜力，如第50号化合物出现的抑制癌细胞金属蛋白酶的生产。在实验方法中，THP—1人血白病细胞(12×100/35mm皿)接种于0.5％血清RPMI培养基中，以2.5μM加入第50号发明化合物，接着培养1小时，加入TNF—α，培养18小时，从对照和实验皿中收集上清液，蛋白质电泳分离后在明胶(酶谱)中测定蛋白酶活性。如图29所示，TNF—α实质上增加了92kD基质蛋白酶(MMP)的表达，中等程度增加了72kD MMP的产量。第50号发明化合物的存在抑制了TNF—α刺激的92kD和72kD MMP的表达。第50号化合物，作为此发明化合物的代表，能通过抑制金属蛋白酶的生产，实质上降低癌细胞的转移能力。
下列实验结果说明其它发明化合物的潜在活性的体外体内证据。
图30说明第50号发明化合物对HT—29细胞的抗增殖活性，图31报告的是抗克隆形成活性。将HT—29细胞(1×105细胞/35mm皿)接种于有10％血清的Mc Cog′s培养基中培养过夜。加入浓度为3和6μM的第50号化合物。在所示的时间内计算存活细胞数。在克隆形成实验，接种实验和对照细胞(300/每皿)，使其长生集落。7天后固定集落，计数。图31的数值是3个皿的平均数。
图32和33说明第50号发明化合物对3LL细胞(Lewis肺癌)的细胞毒性和浓度依赖性。接种3LL细胞(3×103细胞/每孔)于含10％血清的RPMI培养基中培养过夜。以不同的浓度加入第50号化合物，在不同的时间点，以主要染料吸收法测定细胞数，所示的数值是3份孔的结果。
图34说明第50号发明化合物，即使在较高的浓度，而不是所示的对肿瘤细胞具有细胞毒性的浓度，在正常的人骨髓基底细胞缺乏细胞毒性。在96孔平皿、有血清的McCoy′s培养基中接种人骨髓基底细胞(1×104细胞/每孔培养过夜，加入不同稀释程度的第50号发明化合物，通过主要染料吸收法计算存活的细胞数。
图35和图36说明第50号化合物对基质胶体浸润的作用及3LL细胞的存活度。将3LL细胞接种(4.5×105细胞/每孔)于基质胶体小室内膜中。加入不同浓度的第50号化合物，37℃培养48小时。移去膜顶层的细胞，用Diff Quick溶液染色运动到底层的细胞，记录相对浸润的分数。分别测定了第50号发明化合物对3LL细胞存活度的作用。
图37说明预测粘附实验VEGF诱导的HUVEC增殖。在有血清的EBM培养基中接种HUVEC，令其生长4天，将不同稀释度的第50号发明化合物加入平皿中，接着和氚标记的胸苷一起(1mCi/ml)同VEGF(50ng/ml)一道加入。增殖了4倍，这些资料说明第50号发明化合物抑制粘附。
图38说明第50号发明化合物对THP—l粘附于lL一1β刺激的HUVEC的作用。将HUVEC(4×103细胞/每孔)接种于含10％血清的RPMI培养基中培养48小时，加入不同浓度的第50号发明化合物，培养1小时，加入IL—1β(15ng/m1)培养1小时，呈指数生长的THP—1肿瘤细胞经BCECF染料预染后加入(1.5×105细胞/每孔)令其粘附20分钟，冲洗去未粘附细胞，测定粘附的肿瘤细胞数。
图39说明第50号发明化合物对TNF—α刺激的HUVE(表面VCAM—1表达的作用。此实验是预测粘附的模型。在6孔皿，含10％血清的RPMI培养基中HUVEC长至90％满度，加入不同浓度的第50号化合物，培养30分钟，加入TNF—α(20ng/ml)，培养细胞5小时。收集细胞，经间接免疫法测定VCAM—1的量，接着进行荧光活化细胞分类(FACS)分析。例如药物处理的以百分表示的对照样本，TNF—α刺激的细胞平均荧光度正常至100％。
图40说明第50号发明化合物对ATNF—2刺激的HUVEC表面ICAM—1表达的作用。此实验是预测粘附模型。下面方法和上述方法一样，所不同的是用ICAM—l抗体染色细胞。
图4lA、4lB和41C说明小鼠体内实验结果，在第0天将黑色素瘤细胞经小鼠尾静脉注入。第1—14天经非肠道用药第50号化合物，浓度为10mg/kgQD或20mg/kg QOC。第15天处死小鼠，切下肺，固定在福尔马林中。计算黑色转移灶数。图4lA、41B和41C说明三个肺的转移灶数。在第15天，通过测定鼠中性粒细胞数和血小板数估计了骨髓的毒性。每个图中肺的照片下图示了这些资料。这些资料表明，第50号化合物用药的剂量对骨髓无毒性(和每个已知的癌症化疗方法比较)，实际上没处理的对照动物提高了计数。
图42A和42B说明用接着的上面实验方法经第50号发明化合物处理的小鼠T和B细胞应答实验。将来自处理鼠的脾制成单细胞悬液，在补充10％血清的RPMI培养基中接种(200,000细胞/每孔)细胞于平底96孔的平皿中。将抗—CD3(图42A)或抗—mu/IL—4(图42BN)的混合物加入孔中至终浓度分别为1mg/ml和1mg/ml/12.5mg/ml。每个平皿都设了合适的阳性和阴性对照。分析了四份样品，平皿培养了2天，通过氚标记胸苷掺入率确定增殖。
图43报告在体内实验中第50号发明化合物在小鼠Lewis肺癌阻止生长在的结果。第0天经皮下给BDFI小鼠注射1×1063LL细胞，然后用发明化合物(20mg/kg ip)、环磷酰胺(20mg/kg)或载体从第7天开始每隔一天处理一次。第20天处死动物，切下肺肿瘤并称重。图43说明第50号化合物对现有的癌化疗试剂出现很好的效果。
图44A和44B说明在紧接着的上面实验中，处死小鼠的血小板和中性粒细胞计数不变，表明骨髓不是第50号发明化合物的毒靶。
图45A、45B和45C说明来自用或不用第50号发明化合物处理的3LL暴露鼠的肺图形比较。用india墨水注射肺，这样正常肺组织染成黑色，肿瘤呈现白色。肿瘤细胞用药7天后处理的肺差别显而易见。这些体内资料高度预见发明化合物的显著临床特性和降低骨髓毒性的特性。
实施例45
此实施例说明，如上所述的一系列公开类别(第45号化合物)，预测发明化合物的体外、体内结论性证据，是自身免疫疾病和抑制免疫应答的有效疗法。
一种这样的自身免疫病，类风湿性关节炎，在一般的易感个体，通过不明的环境或内源性活动引发。B淋巴细胞的错误调节导致免疫复合物的产生。和关节相关的活化T细胞(主要是CD4辅助细胞类型)促进自身抗体的产生。巨噬细胞和树突细胞产生大量的炎性细胞因子，进一步刺激淋巴细胞。此外，淋巴细胞和巨噬细胞产生其它剌激，导致血管翳形成和关节畸形的剌激滑渡细胞增殖的细胞因子。降解的酶，如IV型胶原酶，，释放入关节腔，损伤包括动脉表面软骨的连接组织。对类风湿性关节炎，淋巴细胞和巨噬细胞释放因子在关节损伤和系统症状的病理形成方面发挥着不同的作用。只影响此复杂过程单一部分的化合物不可能有效或改变疾病，除非这些化合物击中近于瀑布式及基本炎症反应本身过程。因为生物系统总是还原的，所以常规疗法只击中复杂反应的单一方面，只部分有效。
发明化合物干扰导致关节损伤和类风湿性关节炎系统综合症的瀑布式活动的多种关键成分。特别是下列体外、体内实验，第45号发明化合物(作为此发明代表性化合物)抑制T和B细胞增殖，因此抑制异常的自身抗体生产，巨噬细胞活化、细胞因子生长及最重要的由多种细胞因子产生的信号传递(例如，反应IL—2、IL—4、IL—7、TNF—2的驱使T、B细胞增殖及抗原引起的T细胞受体活化)、反应PPGF、FGF、EGF及胰岛素样生长因子(IGF)的滑液细胞增殖信号；由局部炎症细胞剌激的粘性分子的表达(包括VCAM和I-CAM)，导能导致和炎症部位相通的淋巴细胞及巨噬细胞减少的这些粘性分子的抑制，因而减少炎症过程的发展。因此，第45号发明化合物，作为代表性发明化合物，从多方面，抑制产生急、慢性疾病的症状，如类风湿性关节的炎性和失调性应答。
来自体外和体内的资料如下列结果所述。证实了此发明化合物作为免疫抑制剂的活性。
饥饿CT—6.1细胞过夜并用IL—2(20ng/ml)刺激20小时后，用3HH—TdR标记4小时，经液闪计数。背景计数约2000cpm。在此细胞系产生抑制的IC50约0.8μM。作为阻性对照的CsA对IL—2调节的增殖没有影响。图46报告了在此实验中获得的结果，说明使用细胞计数，通过3H—TdR测定掺入率，第45号发明化合物对增殖的抑制。
在加或不加第45号发明化合物(2μm)情况下，用IL—2培养CT6.1细胞，计数活细胞数达8天。第四天，洗涤以前用第45号化合物培养的两培养基，并用新鲜的IL—2在有或无第45号化合物(2μM)情况下再培养。图47报告的结果说明通过测定细胞数第45号发明化合物抑制增殖，其作用甚至在培养4天后是可逆转的。
图48所示的结果说明第45号发明化合物也抑制IL—2、IL—4和IL—7的促分裂反应。按步骤地，饥饿CF6.1细胞过夜并用IL—2(20ng/ml)，IL—4(50ng/ml)或IL—7(25ng/ml)剌激。在20小时加入3HH—IdR，4小时后收集细胞，测定3HH—TdR掺入率。第45号发明化合物说明对IL—2、IL—4或IL—7刺激的CF6.1细胞增殖，IC50＜1.0μm。所有掺入实验和细胞计数实验(资料未列出)相平行。这些资料预测发明化合物诱导类似X—连锁SCID样情况的免疫抑制。
在另一体外方法中，通过亚促分裂剂ConA(0.25μg/ml)和IL—2(20ng/ml)诱导胸腺细胞增殖。加入3HH—TdR4小时前刺激细胞96小时。收获细胞，测定3HH—TdR掺入率。背影计数约2000cpm。图49报告的结果，第45号发明化合物也抑制反应ConA和IL—2的鼠胸腺细胞增殖，IC50约0.35μM。
图50A和50B说明第45号化合物抑制鼠混合肿瘤淋巴细胞培养(MTLC)和人混合白细胞反应(MLR)。对MTLC，用同种异体抗原在有或无第45号化合物的情况下B细胞肿瘤靶细胞系(2pk3)刺激(共培养)脾细胞。刺激细胞3天，加入3HH—TdR，4小时后收获细胞，通过液闪测定3HH—TdR掺入率。背景计数是1000—1200cpm。对人MLR来说，来自两个HLA分散个体的纯化外周淋巴细胞，在有或无第45号化合物时共培养6天。第7天用3HH—TdR脉冲培养基，并通过液闪记数。如52A和52B报告的，MTLC和MLR的IC50约0.5μM。
图51说明第45号发明化合物的延缓加入对共刺激胸腺细胞增殖的影响。在实验步骤中，鼠胸腺细胞用ConA和IL—2刺激。在IL—2(—1)刺激前1小时，用IL—2(0)同时或在IL—2加入(1—92小时)的不同时间加入第45号1μM化合物。在第92小时用3HH—TdR脉冲胸腺细胞，收获细胞，4小时后用液闪记数。图53报告的结果说明第45号化合物即使在加入24小时后接着IL—2刺激能最大限度地抑制胸腺细胞增殖。而且，甚至随着加入IL—2在72小时和92小时仍保持显著的抑制作用。
图52说明第45号发明化合物抑制抗—CD3刺激的脾细胞的增殖。在此实验中，用直接抗CD3(1μg/ml)的单克隆抗体激化鼠脾细胞，产生IL—2调节的增殖反应。背景约2000cpm。如图52报告的，抑制脾细胞的IG50约0.85μM。
图53A和53B说明第45号发明化合物不能抑制T细胞受体(CD3)调节的信号传递。按步骤地，在有或无CsA(0.1μM)或第45号化合物(1μM)……图53A的情况下用抗CD3过夜培养鼠脾细胞。接着过夜培养，洗涤细胞并在不加CsA或发明化合物的情况下用IL—2重复刺激20小时。用3HH—TdR脉冲细胞4小时，收获细胞，测定3H—TdR掺入率。用CsA和抗—CD3一起预培养脾细胞抑制细胞对IL—2反应的能力。这里由于CsA抑制TCR调节的IL—2α链受体(CD25)的向上调节。对比之下，用发明化合物和抗CD3预培养脾细胞不抑制脾细胞IL—2的反应能力。
如果细胞首先经抗—CD3过夜处理，洗涤使用IL—2和CsA(0.1μM)重新培养，和只有对照……图53B的IL—2比较不抑制增殖。CsA不抑制IL—2调节的信号传递活动。但是如果在CT—2576(1μM存在时用IL—2刺激抗—CD3启动的脾细胞，就抑制增殖。这些资料表明，第45号发明化合物特异地抑制IL—2诱导的抗—CD3激活的脾细胞的增殖，不抑制TCR—调节的活化，因此预测和CsA有不同的作用机制。
在另—个实验中，第45号发明化合物不抑制抗—CD3调节的IL—2受体2亚单位的向上调节。图54A和54B用直方图说明了这些资料。用抗—CD3(1μg/ml)活化鼠脾细胞24小时，用CD25的荧光抗体染色，经流式细胞计数分析。图54A是细胞用或不用10μM CsA或培养基对照处理的直方图。CsA通过抑制TCR信号传递抑制CD—25受休的向上调节。然而，图54B，说的是类似的实验，不同的是和第45号发明化合物(1μM)处理细胞而不是用CsA。报告的结果证实，第45号发明化合物不抑制CD—25(P55)受体由抗—CD3引起的向上调节。
图55，第45号发明化合物不抑制IL—2受体β(P70)亚单位的内在化及遵循IL—2刺激的细胞表面向下调节。在此实验方法中，CT—6.1细胞径饥饿过夜，用20ng/mlIL—2刺激。接着IL—2刺激在不同时间，使细胞迅速悬入冷的PBS中，使用荧光化单克隆识别的IL—2受体的β亚单位染色，径流式细胞计数分析细胞表面的表达。图55是IL—2加入后平均的荧光度对时间(以分钟表示)的曲线，说明随着IL—2的加入IL—2rβ亚单位迅速内在化，细胞表面低表达6小时。第45号发明化合物不能抑制这种受体的内在化活动。
如图56A和56B所示，第45号发明化合物也诱导抗原特异的T细胞无反应性。按步骤地，在有或无第45号化合物(1μM；近于IC50)的情况下，用同种异体的靶细胞系2PK3刺激鼠脾细胞。接着培养5天，洗涤细胞，重复培养，并用原启动抗原和抗—CD3单克隆抗体重复刺激在原代培养的5天中，如果用第45号发明化合物培养细胞，对启动抗原的继发反应就会受到抑制。多克隆T—细胞对抗—CD3的反应不受影响，表明在5天启动期间发明化合物没有细胞毒性。虽然预先用第45号发明化合物处理的细胞一般对多克隆刺激发生反应，但是相反的是用同种异体抗原处理的那些细胞不能。因此，第45号化合物诱导特异的无反应或对同种异体抗原无反应性状态。
图57所示的结果说明第45号发明化合物抑制B细胞增殖。用抗—IgM抗体(10μg/ml)和鼠IL—4(12.5μg/ml)刺激鼠脾细胞。用3H—TdR脉冲44小时，4小时后收获细胞，通过液闪测定3H—TdR掺入率。如图59所示，此发明化合物抑制增殖，IC50为1.2μM。
图58A和58B说明第45号发明化合物不抑制CD28—调节的IL—2释放。用抗—CD3和抗—CD28单克隆抗体混合物刺激鼠脾淋巴细胞。在这些系统第45号发明化合物抑制T细胞增殖(图60A)，但是不抑制CD28调节的IL—2释放(图60B)。
图58C和图58D说明第45号化合物通过阻止IL—2信号传递抑制IFN—γ释放。按步骤地，用抗CD3/CD28抗体的混合物刺激鼠脾细胞。第45号发明化合物抑制IFN—8(图60C)释放。在培养基中加入抗IL—2受体α亚单位抗体和抗—IL—2受体β亚单位抗体抑制增殖和IFN—γ(图60D)的释放。这说明用抗—CD28/CD3刺激后IFN—8释放的抑制是因为阻止IL—2信号传递。
图59A、59B和59C报告了研究第45号发明化合物对来自抗—CD3—刺激的鼠脾细胞释放的细胞因子作用的实验结果。在有或无CsA(50NM)或第45号化合物(1μM)存在时，用抗CD3过夜刺激细胞。选择的浓度接近于IC50值。收获上清液，使用市售测定增殖的ELISAS分析细胞因子水平。抗—CD3刺激IL—2，IFN—γ和IL—4(培养基的背景水平可忽略不计)的释放。如图59A所示，和CsA比较第45号化合物不能显著地抑制IL—2的释放。然而类似CsA(图59B)第45号化合物强烈地抑制IFN—γ的释放。预测发明化合物对Th—2细胞因子IL—2和IFN—γ释放有不同作用。第45号化合物只部分地抑制由Th—2细胞(图59C)产生的IL—4释放。
在一个和MTLC相关的实验中，从MTLC培养基上清液经ELISA测定细胞因子水平。图60A说明用第45号化合物全面的增殖抑制。图60B和60C说明第45号化合物不能抑制从MTLC释放IL—2或TNFα，对比之下，图60说明第45号化合物抑制IFN—γ释放。
图61说明第45号发明化合物对从IL—1刺激人包皮纤维母细胞，HS 68释放前列腺素E2有作用。用100pg/mlIL—1α刺激细胞。在刺激前1小时加入第45号发明化合物。24小时后收获上清液，通过市售免疫分析仪测定PGE2的水平。图61报告了此结果，并证实对PGE2释放无作用。
第45号发明化合物抑制单细胞白血病细胞(THP—1)对IL—1β或TNF2—活化的HUVEC的粘附。用20ng/ml IL—1β或15ng/mlTNFα刺激HUVEC6小时。将荧光标记(BCECF—AM)THP—1细胞粘附在HUVEC上20分钟，洗一次，在荧光度平板读数器上不断分析荧光度。图62A和62B(TNFα或IL—1β，各自地)报告的结果说明了对THP—1粘附于HUVEC的抑制。
图63A和63B报告的实验结果说明第45号发明化合物抑制HUVEC上粘附受体的表达。用TNFα(20ng/ml)刺激HUVEC5小时并用抗ICAM—1或VCAM—1的荧光抗体染色。通过流式细计数法分析细胞表面表达。和阳性对照(＝100％)的平均荧光强度峰值比，所有值都是正常的。如图63A和63B所示，与未刺激的对照比，用TNFα刺激的平均诱导水平对ICAM—1高20倍，对VCAM—1高过50倍。
图66报告第45号发明化合物抑制PDGF—诱导的鼠BALB/3T3增殖。按步骤地，在0.2％血清中细胞休止过夜并用25ng/mlPDGF刺激。在刺激前1小时加入第45号化合物，24小时后，用3H—TdR脉冲细胞，4小时后收获细胞用液闪计数。如图64所示，第45号化合物在浓度小于30μM的实验中抑制增殖。
总之，上述资料实质地支持这个结论，第45号化合物，此处公开的发明化合物的代表，是一种好的免疫抑制和抗炎治疗药，影响许多如类风湿性关节炎的特征病的瀑布式活动。
实施例46此实施例说明了预测发明化合物，如所示一系列公开的类(第58号化合物)，是动脉粥样硬化和再狭窄的有效疗法药物的证据。
在扩大的空间里，从动脉粥样硬化观察到的过程和导致再狭窄的病理机制相同。动脉粥样硬化所致的动脉狭窄是包含血管损伤的复杂过程的最后结果，通过脂类的集聚启动细胞和细胞因子调节活动的瀑布式效应。如此的活动包括在损伤部位血小板的集聚。释放的细胞因子刺激平滑肌细胞增殖。观察到的动脉狭窄主要是由于在动脉管壁内定位的巨噬细胞的集聚和平滑肌细胞的增殖。不象在动脉粥样硬化看到的慢性狭窄，由血管形成术和血管手术所致动脉损伤后，疾病过程大大加重了。下列实验资料，集中报告的结果说明，第58号化合物，作为发明化合物的代表，抑制导致动脉粥样硬化和再狭窄的许多细胞和细胞因子调节的活动。
图65A—65F说明在人主动脉或肺平滑肌细胞(SMC)，通过第58号发明化合物抑制增殖。按步骤地，在用不同浓度的PDGF(图65A和65B)、酸性FGF(图65C和65D)或碱性FGF(图65E和65F)刺激前24小时将细胞培养在含0.5％血清的培养基中。在用3H—TdR标记4小时前刺激细胞24小时，收获细胞并用液闪计数。在用浓度5μM刺激前1小时加入第58号化合物。即使在生长因子最大刺激的点上，第58号化合物在主动脉和肺SMC完全抑制细胞增殖。此外，估计细胞数，用第58号化合物处理的细胞，在生长因子刺激后，数目无增加。
图66A和66B分别是第58号发明化合物抑制Balb/3T3细胞增殖的剂量反应和细胞毒性曲线。在此实验方法中，细胞在含0.5％血清的培养基中饥饿过夜，接着用20ng/ml的PDGF刺激24小时。用3H—TdR标记细胞4小时，收获细胞，用液闪计数。
图66A报告的结果是，此细胞系，抑制的IC50约200—500NM。图66B说明第58号化合物对Balb/3T3无细胞毒性。
如图67A和67B所示，第58号发明化合物分别抑制VEGF诱导的HUVEC增殖和EGF诱导的Seiss/3T3细胞增殖。按步骤地，在有或无第58号发明化合物(5μM)存在时，在用不同浓度的VEGF刺激前，将HUVEC接种在含0.5％和血清的培养基中。24小时后，用3H—TdR脉冲细胞，4小时后收获细胞并用液闪计数。抑制的IC50约50—100NM。用20ng/ml EGF刺激Swiss 3T3细胞，24小时后收获细并用液闪计数。抑制的IC50约20μM。
图68说明延缓加入第58号发明化合物对反应PDGF—BB增殖的Balb/3T3增殖的影响。用PDGF(20ng/ml)和第58号发明化合物，或同时与PDGF(0)加入，或在PDGF加入后不同时间刺激细胞直到6小时后。在24小时，和3H—TdR脉冲细胞4小时后用液闪计数。进一步实验说明，如果第58号化合物在PDGF刺激后20小时加入，完全抑制增殖。
图69说明第58号发明化合物比血清诱导的增增殖更大程度地抑制PDGF—诱导的Balb/3T3细胞增殖。在此实验方法中，在加入20ng/ml PDGF或10％血清前，细胞血清饥饿24小时。第58号发明化合物对血清诱导的Balb/3T3增殖没有显著的影响。
如图70所示，第58号发明化合物抑制内皮细胞迁移。接种HU—VEC于基质浸润实验体系中(Becton Dickin son)在有或无可变浓度的第58号化合物的情况下估计VEGF诱导的迁移度。以试量依赖方式，IC50约100—200NM，50ng/ml VEGF诱导的HUVEC基质迁移受到抑制。
图71说明第58号发明化合物不抑制人平滑肌细胞(SMG)对PDGF的趋化性。在实验中，在有或无不同浓度的第58号发明化合物的情况下，将细胞接种在Boyden小室中。8小时后，能用眼计算移动的细胞数。第58号发明化合物对PDGF引导的趋化性无作用。
图72A和72B分别说明第58号发明化合物抑制THP—1细胞粘着于TNF或IL—1刺激的HUVEC。按步骤地，用TNF或IL—1刺激HUVEC8小时、THP—1加入20分钟。然后洗涤HUVEC，分析粘附性。第58号发明化合物抑制THP—1细胞粘附于HUVEC，IC50对TNF和IL—1来说约为1μM。
图73A和73B分别说明在TNF活化的HUVEC，第58号发明化合物对VCAM或ICAM表达的抑制作用。在有或无发明化合物的情况下，刺激细胞8小时，用抗VCAM或ICAM的荧光抗体染色，经流式细胞计数法分析。
图74说明第58号发明化合物抑制TNF释放。58使用人全血体外实验。在此实验中，用鼠TNFα和人IL—1α在有或无不同浓度的第58号发明化合物时刺激人全血细胞，6小时后，使用ELISA分析人血浆TNFα水平。图74报告了此结果。
权利要求
1.一种有下式的化合物(X)j—(核心部分)式中j是1至3的整数，核心部分是非环状的，环状或杂环，此处环状或杂环核心部分至少含4—7员环，并且X是外消旋的混合物，K或S对映体、溶合物，水合物，或盐 其中*C是手性碳原子；n是1—4的整数(最好是1—3)；(CH2)n的一或多个碳原子可被酮基或羟基取代；m是4—14的整数(最好是8—14)；独立地，R1和R2是氢，直链或支链烷烃或烯烃，长度至多12个碳原子，或—(CH2)wR5，w是2—14的整数，R5是一个单、二、或三取代的或不饱和芳基基因，R5上的取代基是羟基、氯、氟、溴、或C1-6烷氧基；或R1和R2一起形成了一种取代或非取代的，饱和或不饱和的有4—8个碳原子的杂环基因；R3是氢或C1-3；或 式中R4是氢，直链或链烷烃或烯烃，长度至多8个碳原子，—(CH2)wR5，W是2—14的整数，R5是单、双或三取代或非取代的芳基基因，R5上的取代基是羟基、氯、氟、溴、或C1-6烷氧基、或取代或非取代、或饱和或不饱和有4—8个碳原子的杂环基团、r和s是独立地1—4的整数；总和(r＋s)不大于5；t是1—14的整数；和一个或多个(CH2)s或(CH2)t碳原子，可被酮基或羟基取代。
2.权利要求1的化合物，其中非环状核心部分是从由乙酰胺、酰胺、胺、一或二个氨基酸、羧基、酯、卤素原子、末端氢、羟基、戊二酸、甘氨酸衍生物、酮、磷酸酯、膦酸酯、硫酸酯、磺酸酯、砜、亚砜、单一离子功能基团、硫醇和硫醇酯组成的基团中选择的成分。
3.权利要求1的化合物，核心部分在主要的平面结构中有从1—3个5—6员的环状结构。
4.权利要求1的化合物，核心部分是从由取代或非取代、的巴比土酸、苯甲酰胺、苯、联苯、环己烷二酮、环戊烷二酮、与δ—酰胺、flutarimide、戊二酰胺、高邻苯二甲酰亚、咪唑酰胺、异喹诺酮、2，4—二氧四氢蝶啶、萘、蝶啶、pthalinide、哌啶、吡啶、嘧啶、吡咯酰胺、喹唑啉二酮、喹唑啉酮、喹诺酮、recorsinol、芪、琥珀酰亚胺、3，7—二甲基黄嘌呤、胸腺嘧啶、三嗪、和三环十二烷组成的基团中选取的。
5.权利要求1的化合物，其中核心部分是从由取代或非取代的戊二酰胺、甲基胸腺嘧啶、甲基尿嘧啶、胸腺嘧啶、3，7—二甲基黄嘌呤、尿嘧啶和黄嘌呤组成的基团中选取的。
6.权利要求1的化合物，其中核心部分是黄嘌呤X和N1黄嘌呤氮相连，N3和N7黄嘌呤氮独立地被从由氢、甲基、氟、氯和氨基的组成的基团中选取的成分取代。
7.权利要求1的化合物，其中核心部分从由1，3—环己烷二酮，1，3—环戊烷二酮、1，3—二羟基萘、1—甲基2，4—二氧四氢喋啶、甲基巴比土酸、3，3—二甲基flutarimide，2—羟基吡啶，甲基二羟基吡唑嘧啶，甲基吡咯嘧啶、2—吡咯酰胺、3—吡咯酰胺、1，2，3，4—四氢异喹诺酮，1—甲基—2，4(1H，3H)—喹嗪二酮(1—甲基苯甲酰烯脲)、喹唑啉—4(3H)酮，烷基取代(C1-6)胸腺嘧啶、甲基胸腺嘧啶、烷基取代(C1-6)尿嘧啶、6—氨基尿嘧啶、1—甲基—5，6—双氢尿嘧啶、1—甲基尿嘧啶、位置5和/或6取代的尿嘧啶、1，7—二甲基黄嘌呤、3，7—二甲基黄嘌呤、3—甲基黄嘌呤、3—甲基—7—甲基新戊酰黄嘌呤、8—氨基—3—甲基黄嘌呤和7—甲基次黄嘌呤组成的基团中选取的。
8.权利要求1的化合物，从下列化合物中选取的。
9.一种含权利要求1化合物和用药上可接受的赋形剂的药物组合物，配制的该药物组合物经口腔、非肠道、体外或局部用药给患者。
10.权利要求9的组合物，其中化合物口服剂量从约50mg至约1500mg，每日2—3次，非肠道给药剂量从约1.0g—约5.0g(i.v.，i.p.，i.m.，或s.c.)24小时1疗程，局部用药是从约体重的1％—约4％浓度，而且体外培养浓度是从约10μM—约500μM。
11.一种治疗和预防自身免疫病的方法，其包括用有效量的权利要求1的化合物，其中自身免疫病从含胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、成人—发病糖尿病、动脉粥样硬化、多重硬化症、牛皮癣、哮喘、牙周病、骨质疏松症、乙醇性肝炎、继发于输卵管感染的早产、自身免疫性甲状腺炎、Alzheimer′s病、类风湿性关节炎、肾小球肾炎、炎性肠道病和狼疮的基团中选取。
12.一种治疗和预防急、慢性炎性疾病，艾滋病、和艾滋病相关综合症、乙醇性肝炎、由于柱细胞和嗜碱性细胞脱粒引起的过敏症、血管形成、哮喘、动脉粥样硬化、自身免疫性甲状腺炎、冠状动脉疾病、肾小球肾炎、脱发或秃发、HIV—有关的痴呆、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、肺缺氧症、狼疮、恶性病、多重硬化症、骨髓性白血病、由细胞毒性疗法引起的器官或血细胞减少症、骨关节炎、骨质疏松症、牙周病、由输卵管感染引起的早产、牛皮癣、再狭窄、类风湿性关节炎、失眠、败血病休克、脓毒病综合症、硬皮病、中风和需用此疗法的哺乳动物移植排斥反应的方法，其包括给有效量的权力要求1的化合物或其药物组合物。
13.制备权利要求1化合物的方法，其包括含核心部分的化合物与适当的碱、溶剂和取代烯烃反应以获得一中间产物，中间产物含有核心部分和取代烯烃的复合结构；中间产物与有机过酸反应生成含核心部分的环氧化物；而且含核心部分的环氧化物与取代或非取代的胺反应获得权利要求1的化合物。
全文摘要
本发明提供一组有效药剂化合物，其抑制通常由炎性刺激物诱导的特异性细胞信号传递活动，发挥着抗炎或免疫抑制剂作用，发挥着用于治疗癌症的细胞毒性剂作用，或直接或间接地抗微生物，酵母或真菌感染。更特别地是，本发明的化合物在连结于核心部分的侧链上至少有一个氨基醇(或其衍生物)功能基团。本发明的化合物是有用的拮抗剂，控制细胞内特异sn-2不饱和磷脂酸及相应的源于磷脂酸的甘油二酯，对初期炎性和选择性增殖刺激物反应产生的细胞内细胞信号传递信使的水平。
文档编号A61K31/519GK1122600SQ94191983
公开日1996年5月15日 申请日期1994年3月31日 优先权日1993年3月31日
发明者J·密奇尼克, G·E·安德里纳, J·P·克莱恩, G·C·里斯, P·S·桑卡拉 申请人:细胞治疗有限公司