催产素拮抗剂的制作方法

专利名称：催产素拮抗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种作为催产素拮抗剂具有高活性并且对加压素具有很轻拮抗作用的新的化合物。发明背景在美国，未足月分娩是导致产前发病和产前死亡的主要因素，目前采用的防止未足月分娩的一些方法并不总是有效的并经常伴有明显的副作用。由于子宫是催产素的靶器官并且推测催产素是引起未足月分娩的一个重要因素，所以开发一种强力催产素拮抗剂将能够成功地防止末足月分娩并极少伴有副作用。
催产素(OT)和抗利尿激素(ADH)，也称加压素，在结构上是类似的。他们比较结构如下所示 催产素(OT) 加压素(ADH)
文献中已报道了在合成用于治疗高血压的ADH拮抗剂和合成催产素拮抗剂方面的各种研究结果。1960年，Law，H·D·和V·DuVigneaud在J.Am.Chem.Soc，824579中首次报道合成了一种催产素拮抗剂(2-O-甲基酪氨酸-OT)。1967年，Chan，Fear和DuVigneaud在Endocrinology，811267中报道了1-L-青霉胺-催产素和1-脱氨基青霉胺-催产素的合成。这是第一次研究显示了一种催产素拮抗剂在麻醉大鼠中对子宫收缩的体内抑制效果以及对催产素的反应。
1980年，Sawyer等人在Endocrinology，10681中报道了一种结合Law和DuVigneaud拮抗剂及Chan等人的拮抗剂两个重要特性的催产素拮抗剂的合成。这种新的拮抗剂是(1-脱氨基青霉胺，2-O-甲基酪氨酸)催产素。经催产素生物检定测得这种新的拮抗剂的pA2为7.8。pA2是将对拮抗剂的反应降至1/2时的拮抗剂摩尔浓度的负对数，其定义见Schild，British J.Pharmacology2189(1947)。
1983年，Manning等人在J.Med.Chem.，261607-161中报道合成了一些ADH拮抗剂。已证实这些拮抗剂的一种是具有潜在的抗催产素活性的pA2为8.2的[β，β-1，5-亚戊基-β-巯基丙酸1，D-Phe2，Ile4]精氨酸加压素，或者换句话说其比Sawyer等人在1980年报道的拮抗剂的强度高2.5倍(见第1610页，表I，化合物1号)。这一催产素拮抗剂可以被称为[Pmp1，D-Phe2，Phe3，Ile4，Arg8]催产素。Wilson和Flouret在Abstract for Society forthe Study of Reproduction Meeting July14-17，1986中披露了一种相关的催产素拮抗剂，[Pmp1，D-Trp2，Phe3，Ile4，Arg8]催产素。
1981年Melin等人，Endocrinology，88173，开发了一种用于抑制未足月分娩的催产素拮抗剂，他们合成了pA2为7.2的1-脱氨基乙基催产素。他们还证实这一化合物在大鼠中能在体内抑制子宫收缩，而对于人类，在体内和体外均可抑制子宫收缩(Akerland等人，Obstet.and Gynecol.，62309，1983。1985年Akerland等人在Obstet.and Gynecol.Scand.，64499中报道合成了pA2为8.3的1-脱氨基[D-Tyr(OEt)2，Thr4，Orn8]加压素，他们在体外条件下于人体子宫组织上测试了这一化合物并证实其抑制子宫收缩。
美国专利4,597,901公开了一族加压素拮抗剂，其中催产素和加压素中均存在半胱氨酸-1并被β，β-环戊二烯并亚甲基-β-巯基丙酸取代。
加压素的其它氨基酸被取代，由此产生的一组化合物被称为加压素拮抗剂，其生物学活性为利尿的。本发明的概述本发明包括一种为催产素的类似物的催产素拮抗剂。在本发明的化合物中，催产素的半胱氨酸-1被β，β-(3-硫代-1，5-亚戊基)-β-巯基丙酸所取代。另外左旋酪氨酸-2被右旋色氨酸取代，青霉胺在6位被1-半胱氨酸取代以及左旋精氨酸在8位被左旋亮氨酸取代。由此得到的化合物[(S)Pmp1，D-Trp2，Pen6，Arg8]催产素据信是新的并现具有显著的特性，其作为催产素拮抗剂是高活性的。同时，虽然这种新化合物与文献中描述的加压素和加压素拮抗剂的结构类似，但其展现了极小的ADH拮抗作用。当这两种拮抗作用以比值表达时，本发明的化合物具有非常高的抗催产素/抗ADH活性比。这种性质的结合特别有利于治疗用途，可以获得有效的抗催产素效果而仅具有最小的抗ADH副作用。因此本发明的化合物在对体内催产素进行反应时适合用于子宫肌肉的收缩，从而可用于防止未足月分娩。本发明的详细描述本发明的催产素拮抗剂由下式代表 其中Pmp为β，β-(3-硫代-1，5-亚戊基)-β-巯基丙酸，D-Trp为右旋色氨酸。Ile、Gln、Asn、Pen(Pen＝青霉胺)、Pro、Arg分别为左旋的异亮氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、脯氨酸和精氨酸。
以下将描述通过生物检测而证实的本发明的新化合物的显著特性。
催产素生物检测用于催产素生物检测程序的流程方法是从Sawyer等人发表在Endocrinology，10681(1980)上的论文中所描述的方法衍生而来的，而Sawyer等人的方法又是基于Munsick，Brit。J.Pharmacol.，3328(1960)和Holton，Brit.J.Pharmacol，3328(1948)的报道。Schild，British J.Phar.macology，2189(1947)描述了用于pA2估值(estimates)的分析计算。本程序与本领域其他人报道的那些程序的主要区别在于将收缩面积求积分，而大多数其它技术是计算幅度。虽然积分法的pA2估值比用收缩幅度作为终点所报道的pA2估值大约低一个数量级，但积分法提供了更一致和更可靠的结果。方法1.动物处于自然发情期的纯种大鼠(Holtzman)的子宫的一块1.5cm的部分用于检测。
2.缓冲液/检测浴所用缓冲液为Munsick缓冲液，这一缓冲液含有可降低pA2估值的0.5mM Mg++，但所报道的结果与体内试验数据(Sawyer等，1980)的相关性更好。用95％氧气和5％二氧化碳连续向缓冲液充气，以使pH为7.4。检测浴的温度为37℃，使用了含有保温水夹套和加入及排放缓冲液的入口和出口管的10ml检测浴。
3.多种波动描记器/传感器用于检测的该块子宫组织的一端被固定；另一端与Statham Strain Gauge Forcc Transducer连接，后者与Grass PolygraphModel79相接以监控收缩。
4.检测程序(a)将所述的组织放入检测浴中平衡1小时，其间每15分钟用新鲜缓冲液洗一次，全程均保持组织上的张力为1克。
(b)最初用10nM催产素刺激组织以使组织“适应”并用4mMKCl刺激以确定最大收缩反应。
(c)随后用催产素确定累加剂量反应曲线，并用相当于最大反应的约80％时的催产素浓度估算拮抗剂的pA2。
(d)将组织在催产素(Calbiochemical，San Diego，California)中暴露1分钟后洗去催产素，在加入下一剂量兴奋剂或拮抗剂之前有3分钟间隔。当测试拮抗剂时，在给予兴奋剂之前5分钟给予拮抗剂，兴奋剂的给予时间为1分钟。用7P10 Grass Integrator对所有反应求积分。这就是本程序与文献中的其它程序的主要区别，后者通常测量收缩的幅度作为反应。相当于最大反应的80％时的单一浓度的催产素被用来测试拮抗剂，使用了三种不同浓度的拮抗剂，其中两种将使对兴奋剂的反应降低不超过50％，而另一种将使所述反应降低超过50％(理论上这种关系应为25％、50％、和75％)。对于三点检测，每一剂量拮抗剂重复三次。
(e)pA2的计算计算对于拮抗剂的剂量-反应(DR)比，以Log(DR-1)比Log拮抗剂浓度的值作Schild’s Plot图。用最小平方回归分析计算作出的线。回归线通过Log(DR-1)纵坐标的零点时拮抗剂的浓度即为pA2。将对兴奋剂的反应降低一半时的拮抗剂浓度的负对数即为pA2。
作为催产素的类似物，本发明的新化合物可被示为[(S)Pmp1、D-Trp2、Pen6、Arg8]催产素。当用上述检测方法测定该化合物对催产素的竞争性拮抗作用时，取十次检测的平均值，发现pA2值大于8.86。
ADH-生物检测还检测了上述化合物对加压素的拮抗作用。通过测定在有拮抗剂和无拮抗剂时由于ADH引起的尿中拮抗剂排出量的变化可以确定抗ADH活性。Sawyer等人在Endocrinology，63694(1958)中描述了合适的ADH检测方法。当用这种方法测试时，发现化合物[(S)Pmp1，D-Trp2，Pen6，Arg8]催产素作为加压素拮抗剂所表现的活性非常低。与先有中请中公开的组合物的访该比值为200相比，本发明的化合物的催产素拮抗作用与ADH拮抗作用的比值非常高，也即超过1866。
本发明的化合物由于其催产素拮抗剂的活性及最小的加压素拮抗作用而可用在人类和动物中治疗需催产素拮抗剂的综合症。其可用于抑制子宫收缩、奶水分泌以及末足月分娩。虽然本发明的化合物的结构与催产素和加压素的结构均类似，但是其不仅具有增加的抗催产素活性而且其抗ADH活性也极大地降低。该化合物也可以用于防止痛经、或者在用催产素催产过程中引起子宫收缩过度的刺激中用作解毒药，或者用于治疗高血压。
本发明的化合物可以通过各种公知的给药途径给予妇女，在医院使用中通常选择静脉输注。然而也可以通过腹膜内，皮下或肌内给药方式给予所述的化合物，口服给药也是可行的。如果需要，可用肠溶衣包被用于口服的片剂和胶囊剂以保护所述的化合物不在胃中被破坏，同时允许其在肠道内释放。通过在置于舌下的模印片中加入合适剂量的该化合物而进行舌下给药也是可行的。这是激素催产素用于诱导从哺乳期母亲的乳房中分泌乳汁的给药方式。
在这种治疗中使用了有效但无毒剂量的本发明化合物。用本发明化合物预防或治疗综合症的剂量标准是根据各种因素进行选择的，所述的因素包括妇女的类型、年龄、体重、性别和病情，综合症的严重程度以及给予该化合物的途径。普通的医疗工作者即可根据催产素拮抗剂的给药途径而决定有效剂量并开出处方以防止或抑制需抑制的病情的发展，例如，使用如溶于灭菌生理盐水中的静脉内给药方式时有效的剂量范围可以是每千克体重每天给药0.01-100毫克。
本发明的化合物可通过一种新方法而制备。在过去由于色氨酸肽是酸敏感的所以要避免肽中色氨酸的取代。为了避免色氨酸肽的酸处理，Bodanszky等人在J.Med.Chem.231258-1261(1980)以及Sawyer等人在Endocrinology，10681(1980)中使用了较难的间接方法制备[Trp8-]催产素。U.S.Serial Nos.07/289,780和07/433,644中公开的方法在此作为参考文献。实施例1[(S)Pmp1，D-Trp2，Pen6，Arg8]催产素的合成β-巯基丙酸衍生物的合成使用Wadsworth和Emmons的方法(Wadsworth，W.S.，Jr.Emmons，W.D.(1973)in Organic Synthesis(Baumgarten，H.ed.)Col.Vol.V，PP.547-549，JohnWiley & Sons，NY)使四氢噻喃-4-酮与三乙基膦酰乙酸反应生成4-四氢噻喃基烯(thiopyranylidene) (TEP)乙酸乙酯。通过Yim和Huffman的方去(Yim，N.C.F. & Huffman，W.F.(1983)Int.J.Pept.Prot.Res.21，568-570)对4-甲基苄基硫醇的Michael加成反应以及皂化作用生成四氢噻喃基-4-(4-甲基基硫代)-4-乙酸，或(S)Pmp(S-Meb)，见

图1。
本文所用的缩写符合IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature的建议(J.Bio.Chem.264，688-673，(1989))。除非另有说明，氨基酸均为L构型。所用的其它缩写为OT，催产素；Pmp，β，β-1，5-亚戊基-β-巯基丙酸；(S)Pmp，β，β-(3-硫代-1，5-亚戊基)-β-巯基丙酸；Boc，叔丁氧基羰基；Meb，4-甲基苄基；Tos，对甲苯磺酰基；ONp，4-硝基苯基酯；DCM，二氯甲烷；TFA，三氟乙酸；EtOH，乙醇；DIEA，二异丙基乙胺；DMF，二甲基甲酰胺；DCC，二坏已基羰二酰亚胺；HOBt，1-羟基苯并三唑；MeOH，甲醇；CHL，氯仿；Ac2O，乙酐；TEA，三乙胺；MeCN，乙腈；BuOH，正丁醇；AcOH，乙酸；Pyr，吡啶；Et2O，乙醚；HPLC，高效液相色谱；TLC，薄层层析；PITC，苯基硫代异氰酸；PTC，苯基硫代氨甲酰基；UV，紫外；OR，旋光肽合成拮抗剂的所有被保护的肽前体均由固相(SP)方法(Merrifield，R.B.(1963)J.Am.Chem.Soc.85，2149-54)人工合成。合成的Boc氨基酸(Stewart，J.M.& Young，J.D.(1984)in Solid Phase Peptide Synthesis pp.1-176，PierceChemical Co.，Rockford，IL)策略随之进行。Pmp的所有1位类似物均具有由4-甲基苄基基团保护的巯基。通过茚三酮试验(Kaiser，E.，Colescot，R.L.，Bossinger，C.D.& Cook，P.I.(1970)Anal.Biochem.34，595-598)监控偶联的完成。通过氨解作用将被保护的肽从树脂上去掉(Manning，M.，(1968)J.Am.Chem.Soc.90，1348-1349)。通过用Na/液氨还原(du Vigneaud，V.，Ressler，C.，Swan，J.M.，Roberts，C.W.，Katsoyannis，P.G.& Gordon，S(1953)J.Am.Chem. Soc. 75，4879-4880)或用液态高闪点苯甲醚(Sakaribara，S.&Shimonishi，Y.(1965)Bull.Chem.Soc.Jpn.38，1412-1413)还原而使被保护肽在侧链功能区中无阻断基因，并通过用铁氰化物氧化(Hope，D.B.，Murti，V.V.S. & du Vigneaud，V.(1962)J.Biol Chem 237，1563-1566)在一非常稀的溶液中使二巯基肽环化成环状二硫化物(Manning，M.，Lammek，B.& Kolodziejczyk，A.M.(1981)J.Med.Chem.24，701-706)。通过在Sephadex G-15(Manning，M.，Wuu，T.C.& Baxter，J.W.M.(1968)J.Chromatogr，38，396-398)上凝胶过滤(Porath，J.& Flodin，P.(1959)NatureLondon)183，1657-1659)以及通过制备高效液相色谱(HPLC)(Flouret，G.，Brieher，W.，Mahan，K.，和Wilson，L.，Jr.(1991)J.Med.Chem.34，64-646)从自由肽中去除小的副产品和盐。用TLC、HPLC和氨基酸分析(Bidlingneier，B.A，Cohen，S.A& Tarvin，T.L.(1984)J.Chromatogr.336，93-104)控制肽纯度。
每一类似物的肽序列是用一机械振荡器和一特殊的容器使用SP方法人工装配的。当合适时，用一全特氟龙容器和液体HE可使一些肽脱保护(ProteinResearch Foundation，Osaka，Japan)。Boc氨基酸由Bachem提供，合成树脂或离子树脂由BioRad提供，所有其它试剂由Aldrich Chemical Co，Pierce或Chemical，Dynamics提供。用前述的Millipore容器(Flouret，G.，Brieher，W，Mahan，K.，和Wilson，L.，Jr.(1991)J.Med.Chem.34，642-646)和一分析μBondapak C18柱(30×0.39cm)通过分析HPLC检测肽纯度。对于制备HPLC，我们使用了一种前述Gilsonauto-preparative HPLC System 71(Flouret，G.，Brieher，W.，Mahan，K.，和Wilson，L.，Jr(1991)J.Med.Chem.34，642-646)和带有5cm防护组件的21.4×25cm的制备柱组件，两种组件均填充有Dynamax-60A，8μm，C18(Rainin)。用于层析或合成的溶剂均是HPLC级的(Fisher Scientific)。用于分析或制备HPLC的溶剂系统为(a)0.05％TFA；(b)60％MeCN-40％溶剂A。肽的纯度也通过在硅胶G预涂布的Uniplates(0.25mm，Analtech)上的薄层色谱(TLC)来控制。所用的溶剂系统(给出了体积比)为(A)n-BuOH-AcOH-H2O(4∶1∶1)；(B)n-BuOH-AcOH∶H2O(4∶1∶5，上层相)；(C)n-BuOH-AcOH∶H2O(5∶1∶1)(D)n-BuOH-AcOH∶H2O∶Pyr(5∶1∶1∶1)。用Ehrlich试剂或氯-联甲苯胺(Stewart，J.M. & Young，J.D.(1984)in Solid Phase Peptide Syntheisppl-176；Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)进行肽显色。将类似物用6NHCl在110℃水解24小时用于氨基酸分析，得到的氨基酸组分用苯基硫代异氰酸酯进行衍生并用Waters Associates Picotag方法进行分析(该方法使用前述的Waters Picotag装置(Flouret，G.，Brieher，W.，Mahan，K.和Wilson，L.，Jr.(1991)J.Med.Chem 34，642-646)。肽的旋光性用Rudolph Polarimeter(精确度±0.01°)测定。被保护肽的固相合成Boc氨基酸用于合成和用于侧链功能区的保护，Boc Arg(Tos)，Boc-Pen(Meb)和(S)Pmp(Meb)。我们使用了Boc-Gly Resin (0.7mmole Boc-Gly/g)，其是通过在用二乙烯基苯1％交联的200-400目氯甲基化树脂(BioRad)上与相应的Boc氨基酸的铯盐的酯化而制备的(Gisin，B.F.(1973)Helv.Chim.Acta65，1476-1482)。通过前述改进的SP合成方法(Flouret，G.，Brieher，W.，Mahan，K.，和Wilson，L.，Jr.(1991)J.Med.Chem.34，642-646)人工使Boc-Gly-Resin (0.5-0.7mmol/g)经过所需次数的偶联循环。在每一循环中，用在DCM中的30％三氟乙酸除去Boc基团并且用在DCM中的10％DIEA中和树脂后，用过量三倍的Boc氨基酸和DCC进行偶联。在合适的步骤使用过量6摩尔的在DMF中的Boc-Asn-ONp或Boc-Gln-ONp，用水沉淀回收过量的试剂。用通常呈阴性反应的茚三酮试验控制偶联步骤的完成，如果该试验为阳性，重复偶联步骤，但如果仅仅是微弱阳性，则肽被用Ac2O∶DIEA∶DCM(1∶1∶8)的乙酰化作用而加帽。在2位引入未保护的Boc-D-Trp，随后用含有1％巯基乙醇和10％苯甲醚的在DCM中的30％TFA除去Boc基团，并通过用DCC和HOBt活化掺入在DMF溶液中的过量3摩尔的(S)Pmp(S-Meb)。通过用氨饱和的MeOH(25ml)进行氨解而从树脂上除去最后装配好的肽。三天后过滤除去树脂并用热DMF抽提三次。将甲醇类滤液和DMF抽提物合并并蒸发至干燥，残留物溶于DMF(2-3ml)中。通过用水或EtOH∶Et2O处理从合并后的DMF抽提物中沉淀出被保护的肽酰胺，得到400-600mg被保护的肽。氨解后对得到的被保护的肽进行的TLC分析显示通常有一主组分和少量杂质，因此，这些被保护的肽直接用于脱保护和制备自由类似物。
4-四氢噻喃基烯乙酸乙酯这种酯用上述的4-四氢噻喃基烯乙酸乙酯的制备方法(Wadsworth，W.S.，Jr.Emmons，W.D.(1973)in Organic Synthesis(Baumgarten，H.ed.)Coll.Vol.V，PP.547-549，John Wiley Sons，New York)和真空蒸馏而制备，为油状物(产率为73％)。
四氢噻喃基-4-(4-甲基苄基硫代)-4-乙酸，或(S)Pmp(4-S-Meb)这种被保护的酸通过Yim和Huffman所述的用于制备Pmp的方法(Int.Pept.Prot.Res.21，568-570,1983)由上述的酯进行制备，熔点为113-1158(产率为50-70％)。OT，或Antag III将通过上述SP方法(用0.5mmol氨基酸-树脂起始)装配的(S)Pmp(S-Meb)-D-Trp-Ile-Gln-Asn-Pen(Meb)-Pro-Arg(Tos)-Gly-NH2(600mg)溶于从钠中新蒸镏出的液氨(200ml)中，并在无水条件下用钠棒处理直至出现持续约15-30秒的浅蓝色。真空蒸发掉氨后，将固体残渣溶于20ml50％AcOH，将这种溶解的肽加到除去空气的水(2L)中(这种大体积可通过一改进的方法而显著降低)，加入浓氢氧化铵调节pH为7.0，通过用0.01N铁氰酸钾滴定二巯基(disulfhyryl)肽而开始向二硫肽的环化直至产生不褪色的黄色，然后加入20％过量的铁氰酸钾溶液。20分钟后，通过与AG1X-2(Cl-)离子交换树脂(15g)搅拌10分钟然后将悬浮液通过含有另外的离子交换树脂(15g)的柱，用另外的0.2N AcOH(100ml)洗脱而除去亚铁氰酸盐和铁氰酸盐。将合并的滤液和洗脱液冻干，在一分析μBondapak C18柱(30×0.39cm)分析得到的含有所述肽的固体，在220nm监测，并用55％溶剂B(溶剂A，0.05％TFA；溶剂B，60％Me CN-40％的0.05％TFA)以1.8ml/min的速度等度洗脱。在这些条件下可很好地除去杂质。将残留物溶于尽可能小体积的50％乙酸中并加到-Sephadex G-15柱(115×2.7cm)中，以约50-60ml/hr(6)的速率用相同溶剂洗脱。用紫外分光光度计在254nm监测洗脱过程。对应于主峰的组分采用分析HPLC监测，其是采用一分析μBondapakC18柱(30×0.39cm)，用57％溶剂B洗脱并在220nm检测肽。将HPLC标准的纯组分合并并冻干，残留物溶于0.2NAcOH(20ml)中并加到制备Dynamax-60A，8μM，C18(Rainin)柱中，21.4×25cm，带有-5cm的防护组件。在45分钟内形成0-45％B的梯度，以5ml/min的速率洗脱，在280nm处监测洗脱液。在约3.5小时后洗脱下主组分的中心部分。将用分析HPLC确定的这种更纯的组分合并并冻干，得到Antag III(240mg，为起始树脂的42％)。通过在4种独立溶剂系统中的薄层层析(TLC)、分析HPLC和氨基酸分析确定类似物的纯度。类似物给出了预期的氨基酸分析比±10％。在280nm(13)通过紫外分光光度计测出肽中的D-色氨酸。所发现的色氨酸的较低值0.96预示着所述的肽冻干物可能含有TFA和/或H2O。
表1[alpha]D27*-39*(lN，AcOH)TLC(A)n-BuOH-ACOH-H2O(4∶1∶1) Rf0.27(B)n-BuOH-ACOH∶H2O(4∶1∶5，上层相) 0.42(C)n-BuOH-ACOH∶H2O(5∶1∶1) 0.19(D)n-BuOH-ACOH∶H2OPyr(5∶1∶1∶1) 0.56实施例2化合物的比较测试合成三种相关的化合物以与[(S)Pmp1，D-Trp2，Pen6，Arg8]催产素(表2中的拮抗剂D)相比较。其中之一是Manning等人在J.Med.Chem，261607-1613(1983)中所述的化合物，这一化合物可被称为[Pmp1，D-Phe2，Phe3，Ile4Arg8]催产素，在表2中这一包化合物被称为拮抗剂A。另一化合物为[Pmp1，D-Trp2，Phe3，Ile4，Arg8]催产素，其由美国专利申请07/239,780公开并在表2中被称为拮抗剂B。第三种比较化合物[Pmp1，D-Trp2，Arg8]催产素公开于美国专利申请07/433,664并在表2中被称为拮抗剂C。这四种化合物在生物检测中加以比较研究。
催产素生物检测用于催产素生物检测方法的程序是从Sawyer等人在Endocrinology，10681(1980)上发表的论文中所述的方法中衍生出来的，而后者又是基于Munsick，Brit.J.Pharmacol.3328(1960)和Holton，Brit.J.Pharmacol 3328(1948)中的报道。用于pA2估值的检测计算描述于Schild，Brit.J.Pharmacol.(1947)。本方法与那些以前报道的方法的主要区别在于其是对收缩的面积求积分而不是仅仅计算幅度。虽然这种pA2估值比那些用收缩幅度作为终点所报道的低约一个数量级，但求积分提供了更一致和更可靠的结果。
方法动物处于自然发情期的纯种大鼠(Holtzman)的子宫的一块1.5cm的部分用于检测。
缓冲液/检测浴所用缓冲液为Munsick缓冲液，这种缓冲液含有可降低pA2估值的0.5mMMg++，但据报道结果与体内试验数据(Sawyer等，1980)的相关性更好。用95％氧气∶5％二氧化碳连续向缓冲液充气，以使pH为7.4。检测浴的温度为37℃，使用了合有保温水夹套和加入及排放缓冲液的入口和出口管的10ml检测浴。
多种波动描记器/传感器用于检测的该块子宫组织与Statham Strain Gauge Force Transducer连接，后者又与Grass Polygraph Model79相接以监控收缩。
检测程序(a)将所述的组织放入检测浴中平衡1小时，其间每15分钟用新鲜缓冲液洗一次，全程均保持组织上的张力为1克。
(b)最初用10nM催产素刺激组织以使组织“适应”，并用4mMKCl刺激以确定最大收缩反应。
(c)随后用催产素确定累加剂量反应曲线，并用相当于最大反应的约80％时的催产素浓度估算拮抗剂的pA2。
(d)将组织在催产素(Calbiochemial)中暴露1分钟后洗去催产素。在加入下一剂兴奋或拮抗剂之前有3分钟间隔。当测试拮抗剂时，在给予兴奋剂之前5分钟给予拮抗剂，兴奋剂的给予时间为1分钟。用7P10 Grass积分器对所有反应求积分。这就是本程序与文献中的其它程序的主要区别，后者通常测量收缩幅度作为反应。相当于最大反应的80％时的单一浓度的催产素被用来测试拮抗剂，使用了三种不同浓度的拮抗剂，其中两种将使反应降低超过50％(理论上这种关系应为25％，50％和75％)。对于三点检测，每一剂量拮抗剂重复三次。
通过在拮抗剂的存在和不存在下由于ADH引起的尿中拮抗剂量的变化来测定抗ADH活性以确定拮抗剂的特异性，抗ADH检测的描述见Sawyer等，Endocrinology，63694(1958)。
另外进行了一些研究以确定大鼠生物检测的结果是否反应了对大鼠和人类中的子宫OT受体的结合亲和性。比较了5种不同催产素拮抗剂的相关结合亲和性。
催产素受体检测方法大鼠在怀孕21天时(分娩期＝211/2-221/2天)从Holtzman大鼠中取出子宫组织，将组织的内容物排空，用冰冷的缓冲液洗，切成小块并于-70℃冷冻直至均化。
人子宫肌层组织是征得同意后从剖腹产病人中收集的，用冷缓冲液洗组织，切成小块并于-70℃冷冻直至均化。
催产素受体的分离催产素受体(OTrs)位于细胞膜并且在怀孕末期在子宫组织中以高浓度存在。在Tris缓冲液中均质冷冻的组织，过滤均化化物，于4℃以1000g离心滤液15分钟。以40000g离心上清30g分钟并将含有细胞膜的沉淀物悬浮于10％蔗糖中，随后将该10％蔗糖悬浮液置放于35％蔗糖上并在一吊桶式转头中以105000g离心30分钟从而进行密度梯度超离心。取出位于10％/35％蔗糖界面的细胞膜并在含EDTA的Tris缓冲液中悬浮30分钟。这一步骤除去二价阳离子并使任何内源性的被结合的OT与受体分离。随后在100000g将混合物离心15分钟并将含细胞膜OTrs的沉淀物用超声波悬浮于Tris，PMSF，Mg++缓冲液。
OT受体检测结合检测由0.1ml 20000cpm氚标记的OT(New England Nuclear，37.1Ci/nmol)、以增加的浓度加入的0.1mlOT拮抗剂、0.25ml缓冲液和0.05ml细胞膜(70-150μg蛋白)组成。在一非特异性试管中加入100倍的冷OTA，在30℃温育30分钟，通过在超明亮型小离心管(5×41mm)中于105000g离心30分钟而沉淀细胞膜，得到的含有结合3H-OT的沉淀物溶于0.1NaOH，并在45℃保持30分钟，随后将该混合物放入液体闪烁计数流体中并在一闪烁计数仪中计数dpms。
通过非线性曲线修正法分析数据，采用的是用于确定Kds和Kis的饱和及竞争分析的McPherson的EBDA程序(J.Pharmacol Methods 1421-228，1985)及Munson和Rodbad的LIGAND程序(Anal Biochem 107220-239，1980)。
比较生物检测和受体研究的结果示于表2-4中。表2催产素生物检测ADH生物检测oTA* pA2抗催产素相对活性 pA2抗ADH相对活性 抗OT/抗ADH比A7.35 0.7 7.66 1.000 0.70B7.51 1.0 7.40 0.550 1.82C7.77 1.7 5.51 0.007 242.86D8.86 22.4 ＜5.75 0.012 ＞1866.7*化合物A为[Pmp1，D-Phe2，Phe3，Ile4，Arg8]催产素，见Manning等在J.Med.Chem，261607-1613(1983)中所述。化合物B为[Pmp1，D-Trp2，Phe3，Ile4，Arg8]催产素＝ANTAGI。化合物C为[Pmp1，D-Trp2，Arg8]催产素＝ANTAGII。化合物D为[(S)Pmp1，D-Trp2，Pen6，Arg8]催产素＝ANTAGIII。
在表2中，包含本发明的新化合物的化合物D证明比其它三种化合物具有更高的抗催产素活性，另外其抗ADH活性则低得多。化合物D的抗OT/抗ADH比值大于1866.70，而化合物A的该比值为0.7，化合物B的该比值为1.8，化合物C的该比值为242.9。因此这些数据表明当以一种有效剂量的催产素拮抗剂给予化合物D时，预期其会产生比化合物A、B或C低的抗ADH的副作用。
表3示出了由大鼠子宫受体检测(Kas)估算的结合亲和力(Kas)对生物检测的比较。Log10Ka与Log10ED50的相关性是非常显著的(r＝0.92；p＜0.01)。通过大鼠子宫受体检测和生物检测的ANTAGIII(化合物D)相对于ANTAGI(化合物B)的相对活性的比较示于表5。通过两种检测显示ANTAGIII的效力约比ANTAGI大20倍。
表4示出了与大鼠生物检测相比的不同的的OTA对人子宫OTr的结合亲和力。Log10Ka与Log10ED50的相关性非常显著(r＝0.95；p＜0.01)。ANTAGIII对ANTAGI的对人OTr(hOTr)的相对结合活性的比较示于表5。通过这一评价显示ANTAGIII(化合物D)的效力约比ANTAGI大80倍。因此，显示出这种大鼠检测可能低估了ANTAGIII在人中的相对效力。这种可能性进一步由下述的在怀孕的狒狒中进行的体内研究而得以支持。实施例3在怀孕的狒狒中测试化合物这项研究的目的在于利用限养的怀孕狒狒模型确定四种催产素拮抗剂的相对体内活性，并将这些结果与前述的用大鼠检测和人OTr检测得到的活性估值相比较。狒狒由于其与人类在生理学和解剖学上的相似而是一种优秀的动物模型(见我们实验室的论文Am J Obstet Gynecol 1631815-1882，1990；Am J Obstet Gynecol 165456-560，1991；AmJ Obstet Gynecol 1651487-1498，1991；其它实验室的论文Endocrine Reviews 11124-150，1990；11151-176，1990)。在怀孕第130至145天(分娩＝第184天)对限养的怀孕狒狒进行研究。通过动脉内注射1mg的单一大剂量而给予催产素拮抗剂，接着在1分钟后输注催产素，催产素以最初10mU并每隔20分钟加倍剂量地连续输注直至400mU/分钟或者直至收缩力[收缩力CF＝(频率×平均幅度)/10分钟]反应显著(即CF＞50)。如果没有显著的反应，则在24小时后重复催产素攻击试验。拮抗剂反应间隔(ARI)是将以分钟计的到第一次显著反应的时间乘以收缩与脉冲比(CF/OT浓度)而确定的。结果结果示于表5。对于4/5的催产素拮抗剂，ARI与大鼠和人OTr结合亲和力(Ka)的估值高度相关(r＝0.98；p＜0.01)。一种催产素拮抗剂(表5中的拮抗剂F)在所测剂量显示出没有抑制活性，虽然其在大鼠和人OTr检测和大鼠生物检测中具有中等的结合亲和力。这种拮抗剂不是我们实验室生产的并且不是催产素类似物。1mg所测的最好的催产素拮抗剂(化合物D，本发明的新化合物)阻断了对催产素拮抗剂的反应超过24小时。不同的OTA对化合物B(ANTAGI)的相对活性的比较预示着化合物D，[(S)Pmp1，D-Trp2，Pen6，Arg8]催产素(即ANTAGIII)，比化合物B的效力约高130倍。总之，通过大鼠生物检测、大鼠受体检测、人受体检测和体内狒狒生物检测得到的ANTAGIII(D)与ANTAGI(B)的相对活性之比(见表5)分别为22、2082和133。这些数据暗示大鼠检测低估了ANTAGIII在灵长目中的效力。
表3催产素拮抗剂的相对子宫受体结合(Ka)和生物检测抑制活性的比较受体检测 催产素检测ED50催产素拮抗剂Ka(10+8M-1)(nM)A 0.39 44.76B 1.16 30.90C 2.03 16.98C2 11.50 1.91D 24.40 1.38E 0.51 102.33F 5.89 19.93受体检测怀孕大鼠子宫(P-21)生物检测发情期大鼠子宫AManning等在J.Med.Chem.261607，1983中所述B[Pmp1，D-Trp2，Phe3，Ile4，Arg8]催产素＝ANTAGIC[Pmp1，D-Trp2，Arg8]催产素＝ANTAGIIC2[Pmp1，D-Trp2，Phe3，Arg8]催产素＝ANTAGII-2D[(S)Pmp1，D-Trp2，Pen6，Arg8]催产素＝ANTAGIIIIE[Mpa1，D-Tyr(Et)2，Thr4，Orn8]催产素(即ATOSIBAN)FL-366，948，购自MERCK PHARMACEUTICAL表4 催产素拮抗剂的在人子宫肌层组织中的子宫受体结合(Ka)与大鼠子宫生物检测的抑制活性(ED50)的比较受体检测 生物检测OTAKa(10+8M-1) ED50(nM)B 0.5130.9C 1.8217.0D 4.171.38E 0.53102.3F 2.4920.0受体检测取自横切产妇的子宫肌层组织生物检测发情期大鼠子宫化合物B-F见表3所述表5在怀孕狒狒中5种催产素拮抗剂(OTA)的生物活性(ARI)之比与在大鼠和人中催产素受体(OTr)结合亲和力和生物检测活性之比的比较OTA ARIARI rOTrhOTR生物检测(OTA/(OTA/ OTA/(ANTI/ANTI)ANTI) ANTI)OTA)B59 11.0 1.0 1.0C54791.8 3.6 1.8D7856 133 20.081.8 22.1E - -0.4 1.0 0.3F 0 05.1 4.9 1.5ARI在怀孕狒狒中拮抗剂-反应间隔(见文中对计算的解释)rOTr大鼠催产素受体hOTr人催产素受体生物检测大鼠催产素生物检测ANTIANTAGI化合物B-F见表3所述虽然本发明结合特殊的和优选的实施方案已作大致描述，应理解的是本发明可以在不背离本发明的实质范围内加以改进。所附的权利要求书希望能覆盖按照本发明一般原则对本发明所述的所有变化、使用或选用，并且包括对本领域的熟练技术人员来说，用已知的或常规的方法作出的那些偏离本发明的改进也是显而易见的。
权利要求
1.由下式代表的催产素拮抗剂 其中(S)Pmp为β，β-(3-硫代-1，5-亚戊基)-β-巯基丙酸，D-Trp为右旋色氨酸Ile、Gln、Asn、Pen(Pen＝青霉胺)、Pro和Arg分别为左旋的异亮氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、脯氨酸和精氨酸。
全文摘要
1、由下式(I)代表的催产素拮抗剂其中(S)Pmp为β，β-(3-硫代-1，5-亚戊基)-β-巯基丙酸，D-Trp为右旋色氨酸Ile、Gln、Asn、Pen(Pen＝青霉胺)、Pro和Arg分别为左旋的异亮氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、脯氨酸和精氨酸。该化合物可给予怀孕妇女以防止早产，同时避免由抗利尿激素即加压素的拮抗作用引起的不希望的副反应。
文档编号A61K38/11GK1121709SQ94191909
公开日1996年5月1日 申请日期1994年2月9日 优先权日1993年4月26日
发明者乔治·弗洛里特, 莱尔德·威尔逊 申请人:西北大学