专利名称：杀菌/增强通透性蛋白质产物的治疗用途的制作方法
本申请是申请日为1993年3月12日的美国专利申请08/030，644的部分继续申请。
本发明涉及杀菌/增强通透性(BPI)蛋白质产物的治疗用途，它们用于治疗与革兰氏阴性细菌感染有关的病情及与革兰氏阴性细菌感染不直接相联系的病情，包括中和肝素的抗凝血特性，抑制血管形成，肿瘤及内皮细胞增生和治疗慢性发炎疾病状态(如关节炎)。
肝素结合肝素是一组不均一的直链阴离子粘多糖，称为葡糖氨基葡聚糖，具有抗凝血特性。在肝素中出现的主要糖类有(1)a-L-艾杜糖醛酸2-硫酸盐，(2)2-脱氧-2-磺氨基-a-D-葡萄糖6-硫酸盐，(3)β-D-葡萄糖醛酸，(4)2-乙酰氨基-2-脱氧-a-D-葡萄糖，和(5)a-L-艾杜糖醛酸，尽管可能存在其他的糖类。这些糖类通常按(2)＞(1)＞(4)＞(3)＞(5)的顺序含量递减，并以糖苷键连结，形成大小不同的多聚体。肝素具有强酸性，因为它含有共价相连的硫酸和羧酸基团。肝素在肥大细胞颗粒中发现并经脱颗粒而释放。肝素的一种细胞相关性形式称为硫酸乙酰肝素。硫酸乙酰肝素是一个广义的术语，用于描述各种在哺乳动物细胞膜表面和胞外基质中发现几乎随机分布的硫酸化蛋白聚糖(HSPG′S)。HSPG含有可变百分比的五聚体肝素样序列，其功能与可溶肝素相似。HSPG′s作为抗凝血酶III(ATIII)和肝素结合生长因子(如成纤维细胞生长因子(FGF)1-5，IL-8，GM-CSF和IL-3)的仓库。Folkman etal.，InflammationBasic Principles and Clinical Correlates ZdEd.Chapter 40，PP821-839(1992)。事实上，用遗传方法制备的HSPG′s缺乏性细胞需要外源性肝素用于生长。
在外科手术过程中(如心肺旁路，心脏导管插入和血液透析程序)，为阻止该过程中的血液凝固，通常以达到400U/Kg的剂量施用肝素。肝素在血液中的抗血凝效力是肝素与ATIII相互作用的结果。肝素/ATIII复合物是凝血级联过程中的许多凝血因子的有效抑制剂。对激活的因子IXa，Xa，XIa、XIIIa和凝血酶的特异性抑制已被证实。肝素/ATIII复合物对因子Xa和凝血酶具有最高亲和力，因子Xa和凝血酶是内部和外部凝血途径共有的，作为导致纤维蛋白原转化为纤维蛋白的凝血级联的最后两步牵涉到这两个途径。
当在手术过程中施用肝素以产生抗凝血效力时，手术后治疗的一个重要方面是立即中和肝素的效力以便恢复正常的凝血功能。通常用鱼精蛋白中和肝素。鱼精蛋白是一种通常从鲑鱼精子中分离出的低分子量的简单蛋白质。它们富含精氨酸残基并具有强碱性。单独用药时，鱼精蛋白(通常以鱼精蛋白硫酸盐的形式)具有抗凝血效力。当在存在肝素的条件下用药时，形成一种稳定的复合物，并且两种药物的抗凝血活性丧失。鱼精蛋白明显的降低血压和类过敏性效力限制了其临床使用。
报道的其他具有肝素中和活性的化合物包括血小板因子4(PF4)和主要的碱性蛋白质，见美国专利5,086,164。主要的碱性蛋白质证实具有肝素中和活性，但也具有高毒性。血管形成血管形成与内皮细胞增生密切相关并构成新毛细血管的发育。因此，它是哺乳动物发育和生长的重要过程。在月经过程中，血管形成生长因子(如成纤维细胞生长因子1-5)的释放经一种肝素依赖性受体结合机制诱导内皮细胞的增生。见Yayon et al.，Cell，64841-848(1991)。这些肝素结合生长因子能由血管创伤(伤口愈合)，免疫刺激(自身免疫疾病)，发炎介质(前列腺素)和从肿瘤细胞释放。
血管形成还与一些希望抑制该新血管发育的病理状态相关。作为一个例子，血管形成对各种肿瘤的生长，增生和转移是关键的。其他与血管形成相关的病理状态包括糖尿病的视网膜病，晶状体后的纤维组织形成，新血管青光眼，牛皮癣，血管纤维瘤，免疫和非免疫性发炎(包括类风湿性关节炎)、动脉粥样硬化斑内的毛细血管增生，血管瘤，子宫内膜异位和卡波济肉瘤。
Folkman等(出处同上)公开了皮肤牛皮癣损害受上皮增生，新血管形成，和发炎细胞浸润的支配。然而，血管形成是牛皮癣的发病机理中的一步还是一种继发性现象尚不清楚。
一些物质已知具有血管形成抑制剂的功能，并已报道了抑制肿瘤血管形成，防止关节炎的发作以及抑制在胶原蛋白诱导的关节炎模型中建立的关节炎，Peacock et al.J.Exp.Med.175，1135-1138(1992)。作为一个例子，鱼精蛋白已知抑制肿瘤血管形成及随后的肿瘤生长。根据Taylor et al.，Nature，297307-312(1982)，鱼精蛋白的抗血管形成活性由其结合肝素的能力所引起。已知PF4也表现出抗血管形成活性。本发明感兴趣的是美国专利5,112,946公开的具有抗血管形成活性但缺乏结合肝素能力的被修饰的PF4及其类似物。PF4已被证明至少具有两种功能特征。尽管肝素结合已被最广泛地研究，但PF4最初被描述为具有胶原酶抑制特性。胶原酶抑制剂是第一个发现的血管形成抑制剂。见Folkman1973，(出处同上)。PF4肝素结合区中的突变对胶原酶抑制活性的影响检查不到。令人感兴趣的是，凝血酶敏感蛋白也是一种血管形成抑制剂并以丝氨酸/色氨酸区域代替碱性氨基酸区域与肝素结合。因此，没有明显的肝素结合或血管形成抑制的单个一致性序列。
公开的PCT专利申请WO92/01003公开了葡糖氨基葡聚糖(肝素)衍生物的用途及其用于抑制肿瘤的侵袭力。公开的肝素衍生物被描述为基本上没有抗凝血活性，并能阻止宿主中肿瘤细胞转移瘤的形成。慢性炎症慢性炎症通常伴随着血管形成。关节炎是一种慢性综合症，其特征为外周关节发炎并伴随着滑膜增厚和免疫因子及细胞(如多形核白细胞(PMN)的流入。在类风湿性关节炎中，炎症是免疫驱动的，而在反应性关节炎中，炎症与滑膜组织受化脓性细菌或其它感染物的感染相关。Folkman等(1973.出处同上)还提出许多种类的关节炎从一个关节的发炎浸润占优势的时期到后期新血管血管翳侵入关节并开始破坏软骨。但在关节炎中是否血管形成是疾病的起因而不是一种表面现象尚不清楚。在类风湿性关节炎中，有证据表明血管形成是维持滑膜炎所必需的。尽管非类固醇抗炎药物(NSAIDs)，皮质类固醇和其它疗法在减轻关节炎的治疗方面提供了改进，但在本领域仍需要对关节炎和其他发炎疾病的更有效的疗法。
现在了解到炎症和血管形成是可分开的但并不互相排斥的过程。已发现特异性血管形成蛋白刺激血管形成而不引起炎症，另外血管抑制类固醇能抑制血管形成而不减轻急性炎症。见Folkman，1973出处同上。令人感兴趣的是，已鉴定内毒素通过其对巨噬细胞细胞素和生长因子的刺激作为一种最有效的外源性血管形成刺激因子。杀菌/增强通透性蛋白质杀菌/增强通透性蛋白质(BPI)是一种从哺乳动物PMNs颗粒中分离出的蛋白质，PMNs是抵抗微生物侵入所必需的血细胞。经酸提取并结合离子交换色谱〔Elsbach，J.Biol.Chem.，25411000(1979)〕或E.Coli亲和色谱〔Weiss.et al.，Blood，69652(1987)〕从多形核嗜中性的细胞中分离出了人BPI蛋白质，此处称为天然BPI，它对广谱革兰氏阴性细菌具有有效的杀菌活性。人BPI分子量大约为55,000道尔顿(55KD)。人BPI全蛋白的氨基酸序列以及编码该蛋白质的DNA已在Gray et al.，J.Bio.Chem.，2649505(1989)的
图1中给出。此处引用以供参考。
BPI的杀菌效力对敏感性革兰氏阴性种类表现出高度特异性，而对其他微生物和真核细胞无毒性。BPI杀死细菌的确切机理还不知道，但知道BPI必须首先附着到感受态革兰氏阴性细菌的表面。这种BPI对细菌的最初的结合涉及碱性BPI蛋白质与脂多糖(LPS)上带负电荷的位点之间的静电相互作用。LPS由于可刺激强烈的发炎反应，已被称为“内毒素”。LPS经宿主发炎细胞诱导介质的释放，可能最终导致不可逆的内毒素攻击。BPI与脂A结合，脂A是LPS中最具毒性的最具生物学活性的成份。
在感受态细菌中，认为BPI的结合破坏了LPS的结构，导致降解磷脂和肽葡聚糖的细菌酶激活，改变细胞外膜的通透性，启动最终导致细菌死亡的发生。Elsbach and Weiss，InflammationBasicPrincipkes and Clintcal Correlates.eds.Gallin etd.，Chapter30，Review Press，Ltd.(1992)。认为BPI分两阶段发挥作用。第一为亚致死阶段，其特征为生长立即停滞，处膜穿透和水解磷脂和肽葡聚糖的细菌酶选择性激活。在这一阶段的细菌可经在含血清白蛋白的培养基上涂布来挽救。第二阶段的特征为生长抑制不能用血清白蛋白来逆转，在细菌长期接触BPI后出现，其特征为广泛的生理学和结构改变，包括细胞质膜的穿透。
BPI也能中和其所结合的LPS之内毒素的特性。由于其革兰氏阴性杀菌特性和其中和LPS的能力，BPI能用于治疗哺乳动物由革兰氏阴性细菌所引起的疾病，如败血症或脓毒症。
与人BPI全蛋白N-端部分相对应的蛋白水解片段具有天然产生的55KD人全蛋白的脂A结合和抗菌活性。与N-端部分相反，分离的人BPI蛋白质C-端区域仅表现出微弱的可检测的抗菌活性。Ooi.et al.，J.Exp.Med.，174649(1991)。含有人BPI全蛋白和大约开始199个氨基酸残基的BPI N-端片段称为“rBPI23”，已用重组方法以23KD蛋白质的形式生产出来。Gazzano-Santoro et al.，Ifect.Immun.604754-4761(1992)。
本申请感兴趣的是在公开号为WO92/03535的PCT国际申请PCT/US91/05758说明书中涉及的含有一种BPI蛋白质和一种阴离子化合物的组合物，所说的组合物表现出(1)无杀菌活性，和(2)内毒素中和活性。阴离子化合物优选一种蛋白质，如血清白蛋白，但也可以是一种蛋白多糖，如肝素。另外，Weiss et al.，J.Clin.Invest.5533-42(1975)公开了肝素硫酸盐与LPS结合阻断BPI增强通透性活性的表达。然而，没有文献公开用与BPI组合来进行肝素中和。
本领域对用于肝素中和，肿瘤，血管形成和内皮细胞增生的抑制以及慢性炎症的治疗的新产品和方法的需要仍然存在。
根据本发明的一个方面，提供了中和肝素的抗凝血活性的方法，包括给受实验者的体内或体外含肝素的液体样品中施用有效量的BPI蛋白质产物。
根据本发明的另一个方面，给受实验者施用一种BPI蛋白质产物以抑制内皮细胞增生，包括但不限于与血管形成相关的内皮细胞增生。本发明提供抑制与各种临床症状相联系的血管形成的方法。本发明特别提供以抑制与恶性肿瘤增生，卡波济肉瘤损害和相似疾病相联系的血管形成来治疗癌症的方法。对施用BPI蛋白质产物的治疗敏感的肿瘤包括黑素瘤、肉瘤、和癌，包括但不限于乳房、结肠、肺、和前列腺癌。能施用BPI蛋白质产物来抑制血管形成的其他症状包括眼视网膜病，晶状体后纤维组织形成，牛皮癣，血管纤维瘤，子宫内膜异位，血管瘤和相似症状。本发明还期望提供避孕方法，包括供给有效量的BPI蛋白质产物以阻止受精卵的植入。
本发明还提供治疗慢性发炎疾病症状(如并节炎、牛皮癣、发炎性的疾病，节段性回肠炎，溃疡性结肠炎，戏斑狼疮，自身免疫眼色素层炎，Lyme疾病，和气喘病的方法，包括给感染发炎疾病症状的病人施用有效量的BPI蛋白质产物。
本发明还提供制备用于中和肝素的抗凝血特性，抑制肿瘤和内皮细胞增生，抑制血管形成和治疗慢性发炎疾病症状的药物之方法。
该药物可制备成口服，注射或其他肠胃外方式的剂型并优选包含本领域的技术人员已知的常用的药物上可接受的载体和佐剂。药物优选以单位剂量的固体，半固体和液体形式的剂型如片剂、丸剂、粉末、液体溶液或悬液，以及可注射的和可浸入的溶液。预期的有效剂量范围从大约100μg/kg到大约10mg/kg的体重。
此处所用的“BPI蛋白产物”包括天然的和重组产生的杀菌/增强通透性蛋白质，天然的，重组的具生物学活性的杀菌/增强通透性蛋白质的多肽片段，以及生物学活性多肽或类似物，包括杀菌/增强通透性蛋白质或具生物学活性片段的杂种融合蛋白质。
附图的简要描述图1描绘了rBPI23和rBPI的肝素结合试验图；图2显示了肝素对rBPI23结合E.coli J5脂A与结合各种LPS和磷壁酸质样品相比较的影响；图3显示了rBPI23对凝血酶的ATIII/肝素抑制的影响；图4显示了rBPI23对因子Xa的ATIII/肝素抑制的影响；图5显示了rBPI23对人血浆中肝素介导的延长凝血酶时间的影响。
图6显示了rBPI23对部分凝血致活酶时间的影响；
图7显示了rBPI23和thaumatin对照蛋白质对具轻度关节炎的胶原诱导性关节炎模型之关节炎程度的影响；图8显示了rBPI23和鱼精蛋白对具严重关节炎的胶原蛋白诱导性关节炎模型的关节炎程度之影响；图9显示了rBPI23对耶尔辛诱导性关节炎模型的关节炎发病率的影响；图10显示了rBPI23对LAL的Borrelia burgdorferi LPS样刺激的抑制试验之影响；图11显示了在小鼠肿瘤转移模型中以BPI或缓冲液处理后小鼠的存活率；图12显示了rBPI23对II型鼠毛细血管内皮细胞增生的影响；图13图示了BPI对上皮细胞的结合；图14描绘的是合成的BPI肽肝素结合试验图；图15描绘的是鲎属变形细胞溶胞产物(LAL)对合成的BPI肽抑制试验图；图16描绘的是合成的BPI肽放射状扩散杀菌试验的图；图17描绘的是合成的BPI肽在肝素结合试验中的影响；图18a和18b显示的是合成的BPI肽对凝血酶ATIII/肝素抑制的影响；图19a和19b显示的是合成的BPI肽在LAL抑制试验中的影响；图20a，20b，20c和20d显示的是合成的BPI肽在放射状扩散的杀菌试验中的影响；图20e和20f描写的是合成的BPI肽在E.coli培养试验中的影响；图21a和21b显示的是rBPI23蛋白质水解片段的HPLC吸收结果；图22显示的是rBPI23蛋白质水解片段的LAL抑制试验结果；图23描绘的是rBPI23功能区。
本发明涉及用于治疗各种与细菌感染不直接相关的治疗症状之杀菌/增强通透性蛋白质(BPI)蛋白产物的用法。
虽然此处所述的BPI蛋白质可用作革兰氏阴性细菌的有效细胞毒素和用于中和革兰氏阴性细菌细胞壁相联系的脂多糖的有害影响，但是已发现了BPI蛋白质产物与革兰氏阴性细菌感染不直接相关的各种治疗效力。具体地说，本发明提供了治疗与革兰氏阴性感染不直接相关的症状之方法，包括中和肝素的抗凝血活性、抑制肿瘤和内皮细胞增生(包括与血管形成相关的细胞增生)以及慢性发炎疾病症状(如关节炎)的治疗。
根据本发明的方法用药的包括BPI全蛋白生物活性片段的BPI蛋白质产物可用本领域已知的任何方法生产和/或分离出来。此外引用共同拥有，共同未决的美国专利申请07/885.501及其部分继续申请-申请日为1993年5月19日的美国专利申请08/072，063以供参考，它们公开了从遗传转化的哺乳动物宿主细胞培养物中表达和分泌的重组BPI蛋白质产物之新的纯化方法，并公开了如何生产大量的适于配制成稳定的，均质的药物制剂的重组BPI产物。
BPI的生物学活性片段包括含有与BPI全蛋白相同氨基酸顺序的生物学活性分子，不同的是该分子缺失全蛋白的氨基末端氨基酸，内部氨基酸和/或羧基末端氨基酸。该片段的非限制性例子包括此处所述和以前提到的天然的25KD片段和称为rBPI23的重组23KD、人BPI全蛋白199个氨基酸残基的氨基末端片段，见.Gaz-ano-Santoro et al.，Infect.Immun.604754-4761(1992)。在该文献中，一个表达载体用作编码重组表达产物(rBPI23)的DNA来源，rBPI23具有31个残基的信号序列和成熟的人BPI前199个N-端氨基酸，同Gray等人(出处同上)的SEQ ID NOs1和2所列出的一样，不同之处在于151位的缬氨酸由GTG编码而不是GTC编码，185位的残基是谷氨酸(由GAG编码)而不是赖氨酸(由AAG编码)。此处称为rBPI或rBPI50的重组全蛋白也已被生产出来，它具有来自Gray等(出处同上)SEQ ID NOs1和2所列出的序列，该序列已在对rBPI23的描述中提及。
其他BPI生物学活性片段的非限制性例子包括例如BPI全蛋白或将该蛋白质以试剂(如溴化氰CNBr)进行化学裂解或以试剂(如蛋白内切酶Asp-N)进行酶消化产生的rBPI23的片段。BPI蛋白质片段还可以用含有BPI全蛋白内、尤其是该蛋白一半的氨基末端内大约5个到大约50个连续的氨基酸复制物的线型或环状的合成肽的形式提供。提供的该肽可以为单体的形式，二聚体或多聚体(其中的肽复制一具有半胱氨酸残基的BPI区域)的形式，以及“线型”二聚体或多聚体的形式，其中的一段BPI序列在肽中重复出现，具备或不具备为允许所选择的构象显示的“间隔”氨基酸所分开。
BPI的生物学活性类似物包括但不限于重组杂种融合蛋白质，它包含BPI全蛋白或其生物学活性片段，以及至少其他一种其它多肽的至少一部分。该蛋白质在Theofan等共同拥有，共同未决的美国专利申请07/885.911及其部分继续申请-申请日为1993年5月19日的美国专利申请08/064,693〔代理人备案号为27129/31429〕中进行了描述，此处引用其全文以供参考，其中包括的杂种融合蛋白质在其氨基末端包含-BPI蛋白质或其生物活性片段，在其羧基末端包含一免疫球蛋白重链的至少一个恒定区或其等位变异体。
BPI生物活性类似物也包括但不限于BPI蛋白质产物，其中的一个或多个氨基酸残基被一不同的氨基酸或被非典型的氨基酸所取代。例如在申请日为1993年2月2日共同拥有，共同未决的美国专利申请08/013,801(Theofan等，“稳定的杀菌/增强通透性蛋白质产物和含有该产物的药物组合物”)(此处引用以供参考)中公开了BPI和BPI片段的多肽类似物，其中132位或135位的半胱氨酸残基被一不同的氨基酸所取代。一个命名为rBPI23△Cys的优选的蛋白质产物含有BPI全蛋白的前199个氨基酸残基，但其中132位的半胱氨酸残基被丙氨酸取代。
BPI蛋白质产物的投药优选用含有BPI蛋白质产物和药物上可接受的稀释剂，佐剂或载体的药物组合物来实现。该BPI蛋白质产物组合物可与已知的抗生素、表面活性剂、或其他化学治疗试剂联用或不联用进行投药。一种优选的含BPI蛋白质产物的药物组合物包含BPI浓度为1mg/ml的柠檬酸缓冲盐水(0.02M柠檬酸，0.15M NaCl，pH5.0)，它含有0.1％(重量)的Poloxamer 188(Pluronic F-68，BASF Wyandotte，Parsippany，NJ)和0.002％(重量)的Polysorbate80(Tween80.ICI Americas Inc.，Wilming-ton DE)。该优选的组合物在申请日为1993年2月2日的共同拥有，共同未决的美国专利申请08/012.360(McGregor et al.，“改进的药物组合物”)中进行了描述，此处引用该说明书以供参考。
用于部分或完全中和肝素的抗凝血活性及此处所述的其他效力的BPI和BPI蛋白质产物的有效剂量可被本领域的技术人员根据常用参数(包括受试验者的大小，给受试验者施用的肝素量及肝素施用后的时间)很容易检测出来。
本发明的其他方面和优势将以下面列出的实施例来理解。实施例1论述了用BPI蛋白质产物进行肝素结合的定量之试验系统；实施例2描述了肝素阻断细菌LPS结合BPI蛋白质产物的相对能力；实施例3和4分别提供了BPI蛋白质产物抑制抗凝血酶III/肝素复合物对凝血酶或因子Xa的激活能力的试验结果；实施例5涉及BPI蛋白质产物对肝素介导的凝血酶时间延长的影响；实施例6涉及BPI蛋白质产物对肝素介导的部分凝血致活酶时间延长的影响。实施例7-9涉及在胶原蛋白和细菌诱导的关节炎动物模型系统中BPI蛋白产物的投药倒证对慢性发炎性疾病症状的治疗。实施例10-11说明了在小鼠恶性黑素瘤转移模型系统中BPI蛋白质产物的血管抑制效力试验。实施例12论述了BPI蛋白质产物对于内皮细胞增生和可能涉及的结合机理的影响。实施例13涉及合成的BPI肽的制备。实施例14-16说明了实施例13合成的BPI肽的肝素结合，LPS结合和杀菌活性。实施例17涉及其他的合成BPI肽的制备。实施例18-21论述了实施例17肽的特征。实施例22揭示了BPI蛋白水解片段肽的制备。实施例23揭示了BPI蛋白水解片段的杀菌效力。实施例24揭示了BPI蛋白水解片段的肝素结合特征。实施例25揭示了BPI蛋白水解片段对LAL试验的影响。
实施例1BPI蛋白质产物与肝素的结合使用与膜结合的天然和重组BPI分子和放射标记的肝素进行肝素结合试验。简单地说，在孔底安置有Imobilon-P(Millipore，Bedford.MA)膜的96-孔微滴定板的孔中加入rBPI23和命名为rBPI或rBPI50的全蛋白质。每孔加入5μg蛋白质。孔经干燥随后以0.1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水pH7.4(封闭缓冲液)封闭。3H-肝素(Dupont，NEN，Wiulmington，DE)在封闭缓冲液中稀释并在含BPI的孔中4℃保温1小时。吸出未结合的肝素，孔用封闭缓冲液洗三次，干燥并取出在液闪计数器中定量。图1以图形提供了典型的试验结果。BSA在封闭缓冲液中确实对肝素具有较低的亲合力和结合能力，这被认为是在生理上不相关的，因此按常规从试验总信号中减去背景。放射标记的肝素结合被过量100倍的未标记肝素完全抑制数据未显示)。
以thaumatin对照蛋白(所带电荷和大小与rBPI23相似)或以洗涤缓冲液(1％BSA)对照进行相同试验比较rBPI23，rBPI50和天然全蛋白(BPI)的肝素结合。在这些试验中，观察到天然和重组BPI全蛋白质的肝素结合较少。rBPI和nBPI结合的减少程度可能是在蛋白制品中存在碳水化合物污染的结果。
另外，使用Grafit软件(Erithicus softward Ltd.，staines，UK)的非线型功能最小化测定了rBPI23，rBPI，鱼精蛋白硫酸盐(SigmaChemical Co.)和thaumatin的以3H-肝素作配体的结合常数，结果如下表1所示
表1以3H-肝素作配体的结合常数
实施例2BPI蛋白质产物结合的肝素竞争试验了肝素，可溶脂A，LPS和磷壁酸质与固相E.Coli J5脂A竞争结合可溶rBPI23的能力。具体地说，用E.coli J5脂A以0.5μg/ml浓度的甲醇溶液(50μl体积)覆盖Immulon 2(Dynatech，Chin-tilly，VA)微滴定孔。然后孔用含0.1％BSA的PBS 37℃封闭4小时。对照孔只用50μl的甲醇处理再按上述方法封闭。吸出被封闭的孔内溶液并用PBS/0.05％Tween-20洗2次。各种浓度的推断抑制剂以25μl体积的PBS溶液形式加入孔中，接着加入25μl含0.1％Tween-20的200,000cpm放射碘标记的rBPI23PBS溶液。试验溶液包括200μg/ml的明尾苏达沙门氏菌(Salmonellaminnesota)R60之Ra LPS，200μg/ml来自E.coli0113的光滑型LPS(RIBI Immunochem，Hamilton，MT，#R318)；400μg/ml来自粪链球菌(Streptococcs faecalis)的脂磷壁酸质(Sigma，St.Louis，MO，#L-4015)400μg/ml来自金黄色葡萄球菌(staphhylo-coccus Aureus)的脂磷壁酸质(Sigma#L-2525)；和400μg/ml的肝素钠USP注射液(Lypho-Med.Rosemont，IL，#9155-01)。轻轻摇动4℃过夜进行结合，然后吸出孔内溶液，用PBS/0.05％Tween-20洗涤3次并计数，结果在图2中列出，表明rBPI23对肝素具有高亲合力而且肝素也阻断脂A对BPI的结合。
实施例3用BPI蛋白质产物进行肝素中和BPI对以ATIII/肝素复合物导致的凝血酶失活的影响使用产色试验鉴定rBP23对ATIII/肝素复合物的凝血酶灭活之影响。具体地说，使用一种“ChromostrateTX”抗凝血酶试验试剂盒(Organon Teknika Corp.Durham.NC)检测在血浆中以ATII-I/肝素复合物进行的纯化凝血酶的抑制作用。
在96孔微滴定板中以每孔200μl的终体积一式三份进行试验。试验组分的加入次序如下1)50μl终浓度为100，50，25，10和1μg/孔的样品(rBPI23或用作对照蛋白的thaumatin)PBS溶液；2)50μl血浆的1∶100缓冲液；3)50μl1nkat/ml的凝血酶缓冲液；和4)50μl 1μmol/ml的生色底物水溶液。37℃下进行反应10分钟，以50μl 0.1M的柠檬酸终止反应，颜色反应在微板阅读器上定量。试验结果如图3所示，表明rBPI23在含肝素的人血浆中能以剂量依赖的方式有效地中和ATIII/肝素复合物。随着血浆的滴定，凝血酶活性的总量增加。这由加入的血浆中的抑制性ATIII/肝素复合物的减少而引起。对照蛋白质(thau-matin)无相同的中和效力，其在各种蛋白质浓度下的试验结果基本上与缓冲液对照一样。
实施例4以BPI蛋白质产物进行肝素中和BPI对以ATIII/肝素复合物导致的因子Xa失活的影响使用产色试验鉴定rBPI23对由ATIII/肝素复合物导致的因子Xa中和之影响。具体地说，使用一种Chromostrate肝素抗因子Xa试验试剂盒(Organon Teknika Corp.)进行试验，试验在因子Xa和ATIII的浓度固定的条件下进行。肝素浓度以在PBS中按浓度为1，0.5，0.25，0.125，0.063，0.031，0.016，0.008，0.004，0.002和0单位/ml变化，以便产生肝素的标准曲线。本试验以从合成底物中释放的产色的化合物来测定功能性因子Xa活性。ATIII/肝素复合物中和因子Xa的活性，因此，在试验样品中释放的发色团量与肝素的抗因子Xa活性的量反相关。
在96孔微滴定板中以每孔200μl的终浓度一式三份进行试验。试验组分加入微滴定孔的顺序为1)50μl终浓度为100，50，25，10，和1μg/孔的样品(rBPI23或作为对照蛋白的thaumatin)PBS溶液；2)50，0.14nKat.ml的因子Xa水溶液；3)25μl 0.5u/ml的ATIII水溶液；4)24μl 0.25u/ml的肝素缓冲液；5)50μl底物(3μmoles/ml)。37℃下进行反应10分钟，以50μl 0.1M柠檬酸终止反应，然后在一微板阅读器上对颜色反应进行定量。试验结果如图4所示，表明了rBPI23能在因子Xa的ATIII/肝素抑制作用中有效地中和肝素。随着肝素的浓度增高，中和肝素所需的rBPI23量也增加。对照蛋白thaumatin无相似的中和效力并在所有蛋白质浓度下都与缓冲液对照基本等同。
实施例5以BPI蛋白质产物进行肝素中和BPI对肝素介导的凝血酶时间延长的影响我们检查了BPI蛋白质产物对肝素介导的凝血酶时间(即凝血酶和血浆混合物凝固所需时间)延长的影响。凝血酶时间由于由源性或外源性凝血酶形成抑制剂(如治疗上施用的肝素)的存在而延长。中和肝素的抗凝血效力的试剂将减少试验测定的凝血酶时间。人柠檬酸盐血浆(200μl)与15μl稀释剂(0.15M NaCl，0.1M Tris，pH7.4)或15μl含25ug/ml肝素(187单位/mg)的该稀释剂一起37℃保温1分钟。加入15μl体积的各种浓度的rBPI23(从0.0到56ug/ml)，接着立即加入100μl的凝血酶试剂(Sigma ChemicalCo.，No.845-4)。用BBL Fibrometer(Becton Dickenson Micro-biology Systems.Co ckeysvine MD)测定凝血时间(凝血酶时间)。结果如图5所示，表明rBPI23抑制肝素介导的凝血酶时间延长。当不存在肝素时，即使rBPI23浓度高达56μl/ml，对该试验也无影响。
实施例6以BPI蛋白质产物进行的肝素中和
BPI对部分促凝血酶原激酶时间的影响在施用肝素的大鼠中检测了rBPI23或鱼精蛋白硫酸盐对部分促凝血酶原激酶时间(PTT)的影响。由于内源性或外源性凝血酶形成抑制剂(如治疗上施用的肝素)的存在，PTT被延长。中和肝素的抗凝血效力的试剂将减少试验测定的PTT值。按NIH标准的室内由Sprague-Dawley大鼠经动物尾静脉的静脉内注射施用100U/kg肝素，接着施用5mg/kg rBPI23，5mg/kg鱼精蛋白硫酸盐或缓冲液。从预先麻醉的动物腹主动脉收集的血液样品测定PTT。也测定了未处理动物的PTT。结果如图6所示，表明rBPI23和鱼精蛋白对处理过的动物的PTT立即产生影响。这些动物资料证实了实施例2-5所示的BPI蛋白质产物的肝素中和效力。
从实施例1到实施例6收集的结果表明在直接结合试验中rBPI23结合肝素并有效地中和凝血蛋白酶的肝素抑制作用。根据这些特征，设计BPI蛋白质产物，一般以在功能上与鱼精硫酸盐所推荐的剂量相对应的剂量用于肝素抗凝血效力的临床中和，但它们不具有鱼精蛋白严重的降血压和类过敏性效力。
实施例7BPI蛋白质产物对慢性发炎疾病胶原蛋白诱导的关节炎模型的疗效本发明的另一方面涉及BPI对治疗和预防慢性发炎疾病症状的影响之用途，慢性炎症包括类风湿性和反应性关节炎，牛皮癣，发炎性肠疾病，节段性回肠炎，溃疡性结肠炎，红斑狼疮，自身免疫眼色素层炎，Lyme疾病，和哮喘。提供了治疗关节炎患者的例证方法，包括施用有效量的BPI蛋白质产物以预防或治疗关节炎。BPI蛋白质产物可局部投药，或经注射(如关节内，静脉内，肌肉内或皮下注射)或经肠胃外和非肠胃外方式用药。
在胶原蛋白诱导的关节炎模型中研究了施用BPI蛋白质产物的效果。具体地说，小鼠关节炎的诱导按照Stuat et al.，J.Clin In-vest.，69673-683(1982)的方法在鼠尾基部进行牛II型胶原蛋白的皮内免疫。一般来说，小鼠在胶原蛋白免疫后的第21天开始形成关节炎综合症。然后以盲目的方式评价所治疗的小鼠关节炎程度，在120天的期间内，每隔21-25天，以一定剂量的rBPI23，thau-matin对照蛋白，或缓冲液经尾静脉注射治疗小鼠。
具体地说，在第0天在尾巴基部经皮内注射施用牛II型胶原蛋白(Southern Biotechnolgy Associate InC.，Birmingham AL)(0.1mg/小鼠)，试验在10只雄性小鼠的各组中进行，每只小鼠重约20-25g。rBPI23溶于0.5M NaCl，20mM乙酸钠，pH6.0中，用PBS缓冲液稀释(1mg/ml)，以0.125mg/小鼠用药。Thaumatin蛋白质的PBS溶液(0.121mg/小鼠)或仅用PBS缓冲液(0.1ml)进行投药作为对照。
结果如图7所示，表明rBPI23与PBS缓冲液和thaumatin蛋白质对照相比，对减轻所治疗的小鼠关节炎程度具有统计学上显著的效力。
实施例8BPI蛋白质产物与鱼精蛋白硫酸盐对慢性发炎疾病胶原蛋白诱导的关节炎模型治疗效果的比较使用thaumatin蛋白质和缓冲液作为对照，用实施例7的胶原诱导性关节炎模型评价BPI蛋白质产物的效果与鱼精蛋白硫酸盐的比较。具体地说，rBPI23溶于0.5M NaCl，20mM乙酸钠pH6.0中，以PBS缓冲液稀释(1mg/ml)并以0.125mg/小鼠用药。其他试验物质按下面剂量用药鱼精蛋白硫酸盐(Sigma Chemical Co)(0.13mg/小鼠)，thaumatin(0.121mg/小鼠)，PBS缓冲液(0.1ml)。每隔28天到32天，在其尾静脉处通过静脉注射对四组10只小鼠的每只中施用试验或对照物质。图8揭示了在28-80天测定的各种治疗和对照方案的关节炎程度的结果。图8中的星号(*)代表rBPI23和缓冲液间统计学上P＜0.01的显著差别，而加号(+)代表rBPI23和缓冲液间统计学上P＜0.05的显著差别。这些结果表明在模型系统中对于所治疗的小鼠rBPI23明显减轻关节炎程度。
实施例9革兰氏阴性诱导的反应性关节炎模型根据Yong.et al.，Microbial Pathogenelis，4305-310(1988)的方法在一种小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocoliti-ca)反应性关节炎模型中研究了施用BPI蛋白质产物治疗反应性关节炎的效果。具体地说，预先通过尾静脉用小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolirica)CWA 08Tz(即，缺失根据Yong etal.，出处同上的毒性质粒)以计算的4×108个细菌的剂量进行静脉内注射诱导DBA/2J雄性小鼠非脓毒性关节炎，再对这种小鼠施用BPI蛋白质产物。3组15只小鼠的每只在尾静脉处通过静脉内注射接受试验或对照物质。小鼠接受以剂量为大约5.0mg/kg，溶于20mM柠檬酸钠，150mM氯化钠，0.1％poloxamer188，0.002％Polysorbate80，pH 5.0的缓冲液中的rBPI23；以剂量为大约5.0mg/kg，溶于20mM柠檬酸钠，150mM氯化钠，0.1％poloxamer188，0.002％polysorbate80 pH 5.0的缓冲中液中的thaumatin蛋白质；或仅有缓冲液。结果如图9所示，表明BPI蛋白质产物与缓冲液或thaumatin对照蛋白相比明显降低反应性关节炎的发病率。
Borrelia burgdorferi是引起Lyme疾病和相关的关节炎的病原体，在其细胞壁上具有一LPS类复合物，其细胞壁与E.coli不同但在结构上有关。在鲎属(LTmulas)变形细胞溶胞产物(LAL)抑制试验中测定了施用BPI蛋白质产物对Borreha burgdorferi LPS抑制作用的影响。具体地说，根据实施例15的方法进行LAL试验，施用2.5μg/ml的rBPI23和2ng/ml的E.coli 0113LPS测定rBPI23对Borrelia burgdorferi LPS的影响。结果如图10所示，表明在LAL试验中，rBPI23中和Borrelia burgdorferi LPS和E.coli0113LPS的效力。
实施例10BPI在小鼠恶性黑素瘤模型中的效力根据本实施例，在小鼠恶性黑素瘤转移模型中试验了BPI蛋白质产物，鱼精蛋白，和thaumatin蛋白质及缓冲液对照的效力。具体地说，在第0天经尾静脉的静脉注射以105B16F10恶性黑素瘤细胞接种4组9只C57BL/6J小鼠。在第1，3，6，8，10，13，15，17和19天将rBPI23(0.13mg/小鼠)，鱼精蛋白硫酸盐(0.13mg/小鼠)，thaumatin(0.13mg/小鼠)或PBS缓冲液(0.1ml/小鼠)静脉注射到小鼠尾静脉中。在第20天经折颈处死动物观察肺组织。灌注每个肺的肺叶，从气管往肺里注入3ml水使其膨胀。借助于解剖显微镜计数表面的肿瘤结，每组发现的肿瘤数用于分析统计学上显著的差异。尽管数据在统计学上是不显著的，但用BPI23处理过的动物具有最低肿瘤负荷，随后是那些用鱼精蛋白，thaumatin蛋白质对照和缓冲液对照处理过的动物。统计学显著性的缺乏(肿瘤数不是以反应肿瘤的大小)表明需要更特异性的试验方法学来鉴定肿瘤负荷。
实施例11BPI在小鼠恶性黑素瘤模型中的效力在实施例10的小鼠恶性黑素瘤转移模型中再次试验BPI蛋白质产物，鱼精蛋白，和thaumatin蛋白质和缓冲液对照的效力。具体地说，在第0天用105B16.F10恶性黑素瘤细胞经静脉内注射到尾静脉中接种6组C57BL/6J小鼠。在第1，2，5，7，9，12，14，16，和19天rBPI23(0.125mg/小鼠)，鱼精蛋白硫酸盐(0.125mg/小鼠)，thaumatin(0.125mg/小鼠)或PBS缓冲液(在下面表2中列出)经静脉内注射到小鼠尾静脉中。在第20天A-D组的所有动物以折颈处死观察其肺组织。取出肺并放入烧杯内的冷水中。然后灌注每个肺的肺叶，经气管注射3ml水到肺内使其膨胀。然后分析表面肿瘤结中的黑色素含量。
表2组 对照/试验项目 动物数A 缓冲液 10B 鱼精蛋白 10
CThaumatin 10DrBPT2310E缓冲液 5FrBPT235E和F组包含的分别以缓中液或rBPT23处理的动物不处死，但每天观察一次其死亡率。图11显示了这两组动物的存活资料。尽管这10只动物在43天内全部死亡，但PBI处理过的小鼠一般比未处理的小鼠存活时间明显延长，这表明BPI具有抗血管形成效力并能减慢黑素瘤肿瘤的转移。
除了上面部分，根据本发明的其他方面，BPI蛋白质产物可在Miles et al.，VII International Conference on AID，Florence It-aly， Paper 41(8)，1991的模型系统中用于抑制卡波济肉瘤。
实施例12BPI对内皮细胞增生的影响如Bauer，Microvascular Research 37148-161(1989)所述的鼠大脑毛细血管内皮细胞(EC)在含Earle氏盐，L-谷氨酰胺和2.2g/l碳酸氢钠(Gibco Grand sland，NY，#400-100EB)，加上10％加热灭活的胎牛血清(Irvine Scientific，Irvine，CA)和1％青霉素/链霉素(Gibco，#600-5140AG)的199培养基中传代。以胰酶-EPTA(Gibco#610-5300PG)消化3分钟收获汇合的细胞。经加入10ml培养基到培养瓶中来终止胰酶消化。在标准平底96孔微滴定板中对新收获的EC进行增生试验。试验中每孔的终体积保持200μl/孔。每孔共加入含各种浓度的rBPT23，thaumatin对照蛋白或缓冲液对照的4×104EC。在5％CO2培养箱中培养48小时后，每孔加入10μl含1μCi〔甲基-3H〕胸苷的199培养基。脉冲24小时后，经胰酶消化玻璃微纤维滤器过滤收集EC细胞，用一气相固相成比例的β-计数器定量掺入的〔3H〕胸苷。
rBPT23对EC细胞增生的浓度依赖性抑制作用见图12。当孔中加入相同浓度的thaumatin或等体积的缓冲液时观察不到效果。最先观察到的增生抑制作用为12.4μg/ml rBPT23，效力最大时为50ug/ml。已知EC细胞的生长依赖于小牛血清中的FGF-2(bFGF)，而FGF-2需要细胞表面的乙酰肝素用于受体激活(Yayonet al.，Cell64841-848，1991)。在不打算受本发明的理论束缚的情况下，认为rBPT23与EC细胞表面的乙酰肝素结合干扰了细胞被FGF-2激活。
从汇合的培养瓶中收获传代10次的细胞，用胰酶消化的细胞重悬于12.5ml培养基中进行rBPT23对EC细胞的直接结合试验。在标准24孔组织培养板的每孔中加入0.5ml悬液并培养过夜。用0.1％牛血清白蛋白的钙镁磷酸盐缓冲液(Gibco)洗涤平板。洗涤后，每孔加入0.5ml的BSA/PBS。初步实验表明每孔加入50ng/nl的125I-标记的rBPT23，4℃培养3小时，以PBS洗涤3次，再用1M NaOH溶胞后，由溶胞产物的y射线计数得到大约30,000比cpm。
50ng/ml的125I-标记的“热”rBPT23与EC细胞特异性的结合可经加入20μg/ml肝素(Sigma Grade I)进行竞争。往结合培养物中加入未标记的(“冷”)rBPT23可观察到相似的竞争。未标记的rBPT23与肝素的混合物(同时加入或预先混合后加入)不能使结合减少到低于仅用肝素竞争(图13)。这些资料表明rBPT23经肝素样分子与内皮细胞结合，并且该结合似乎干扰对肝素结合生长因子(FGF-2)的EC细胞增生。
实施例13BPI15残基合成肽的制备为了试验BPI蛋白质产物肽片段的生物学活性，制备了以BPI23KD氨基末端片段为基础的15个氨基酸残基的合成肽，并评价其肝素结合活性，在鲎属(Limulus)变形细胞溶胞产物抑制(LAL)试验中的活性和杀菌活性。具体地说，以上述rBPT23序列为基础，以副本的形式制备了47种合成肽，每种含15个氨基酸，并且相邻肽有11个氨基酸重叠。
根据Maeji et al.，mmunol、Methods，13423-33(1990)和Gammon et al.，J.Exp.Med.，173609-617(1991)的方法，在Coselco Mimotopes Pty Ltd的许可下使用Cambridge ResearchBiochemicals Ltd的固相技术同时合成肽。简单地说，将rBPT23(1-199)序列分成47个不同的15残基肽，每到第15个氨基酸便出现下一个肽，这47个肽沿rBPT23的线型序列延伸。该肽的合成在技术上允许在96-孔板上安置的分开的栓上对多个肽以小批量同时进行合成。因此，94个单独的栓用于该合成，剩余的栓(B，B)不加活化的FMOC氨基酸与其他栓进行相同的步骤。使用含水碱性缓冲液(碳酸钠，pH8.3)从固相栓支持物上进行15残基肽的最终裂解。在这些产生裂解肽(在每个肽羧基末端具有环(赖氨酰脯氨酰)部分)的条件下，与栓的单一连接经历了一个定量的环缩二氨酸的环化过程。氨基末端不乙酰化，以便使自由氨基具有产生阴离子结合反应的潜力。从每孔中回收的15残基肽平均大约各为15μg。
实施例14BPI15残基合成肽的肝素结合根据实施例1所述的方法将上述合成的BPI蛋白质产物肽用于肝素结合试验。结果如图14所示，表明存在3个分开的功能区具有肝素结合活性；第一个大约从氨基酸21延伸到55，第二个大约从氨基酸65延伸到107；第3个从氨基酸137延伸到171。来自空白对照栓上的物质无肝素结合效力。
实施例15BPI15残基合成肽对LCL试验的影响合成的BPI蛋白质产物肽用于进行鲎属(Limulus)变形细胞溶胞产物(LAL)抑制试验以鉴定LPS结合特征。具体地说，合成的BPI肽在Eppendorf管中与固定浓度的E.Coli0113 LPS(4ng/ml终浓度)混合37℃保温3小时并不时摇动。也试验了含0.05ug/ml的加入量对照。保温后，每管加入360μl D-PBS以得到200pg/ml的LPS浓度用于LAL试验。然后样品以每孔50μl体积转移到Im-mulon II带(Dynatech，Chantilly，VA)上。
每孔加入50μl鲎属(Limulus)变形细胞溶胞产物(定量产色LAL试剂盒，Whitaker Bioproduct，Inc.，Walkersville，MD)，室温培养25分钟。然后每孔加入100μl体积的产色底物并混匀。室温培养20到30分钟后，加入100μl乙酸终止反应。然后在多板阅读器(Vmax，Molecular Dynarnics，Menlo Park，CA)上测量405nm下的光密度，图15所示的是在LPS抑制百分数方面的结果。图15的资料表明至少3个主要区域具有明显的LAL抑制作用第1个从氨基酸17延伸到55；第2个大约从氨基酸73延伸到99，第3个大约从氨基酸137延伸到163。其他个别肽也表现出LAL抑制作用。作为对照，来自空白对照栓上的物质用LAL试验测量不表现出LPS中和效力。
实施例16BPI15残基合成肽的杀菌效力在一放射扩散试验中试验了合成的BPI蛋白质产物肽对粗糙型突变E.Coli J5细菌的杀菌效力。具体地说，E.coli J5的过夜培养物用新鲜的胰蛋白酶大豆培养基按1∶50稀释，37℃培养3小时达到对数期。然后在Sorvall RT6000B中以3000rpm离心5分钟沉淀细菌，加入5ml 10mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)，制品再次离心。弃去上清液，加入5ml新鲜缓冲液重悬细菌，经在590nm下测量吸光率测定其浓度。1.25×109CFU/nd的悬液吸光率等于1.00。细菌在100ml熔化的铺底琼脂糖(大约45℃)中稀释成4×106CFU/ml并以用于该用途的15ml聚丙烯管反复倒转混合。
管内的全部内容物倒入完全水平的方形培养皿中，经敲击培养皿各侧面使分布均匀。琼脂糖不超过30秒变硬，并且有相同的厚度约为1mm。然后用一无菌的与真空装置相连的3mm打孔器在变硬的琼脂糖上打一系孔的孔。打孔器用100％乙醇灭菌并空气干燥。
10μl合成的BPI肽小心吸移到每孔中，作为对照，在一单独的孔中加入pH 8.3的缓冲液，作为阳性对照，也加入5μg/ml和1μg/ml浓度的rBPT23。另外，试验来自空白栓B和B的产物作为对照。平板37℃培养3小时，然后往水平培养皿中加入10ml的熔化覆盖琼脂糖(大约45℃)，使其变硬并37℃培养过夜。与菌苔相反，在那些具有杀菌活性的孔中以菌苔为背景看到一清晰的环带。为了提高这些环带的可见性，往琼脂上注入稀的考马斯溶液(0.002％考马斯亮兰，27％甲醇，15％甲醛(37％贮液)和水)染色24小时。用Mitutoyo测微尺测量细菌环带。
试验结果如图16所示，其中所示唯一具有杀菌活性的合成BPI肽是与氨基酸85-99相对应的片段。阳性rBPT23对照也具有杀菌效力，而缓冲液和空白栓对照无杀菌效力。
实施例17BPI肽片段的制备根据实施例13到16重叠肽的试验结果，按照Merrifield.J.Am Chem.Soc.852149(1963)和Merrifield et al.，Anal，Chem381905-1914(1966)的方法，使用Applied Biosystems.Inc.Model432合成仪，经固相肽合成制备BPI蛋白质产物肽片段。制备的9种BPI蛋白质产物肽命名的BPI-2到BPI-10，它们具有如下表3所列出的rBPT231-199氨基酸残基中的部分氨基酸序列。例如BPI-7，BPI-9和BPI-10肽代表部分或甚至多次重复的序列。具体地说，BPI-7含有20个残基，由氨基酸残基90-99在单一线型链上重复两次组成。BPI-10含有30个残基，由氨基酸残基90-99在单一线型链上重复3次组成。BPI-9含有16个残基，在单一线型链上含有氨基酸残基94-99，随后是残基90-99。
表3蛋白质产物肽
实施例18用BPI蛋白质产物肽进行肝素结合在本实施例中，根据实施例1所示的方法对BPI蛋白质产物肽BPI-2、BPI-3、BPI-4、BPI-6、BPI-7，BPI-8以及BPI cys进行肝素结合试验。结果如图17所示，表明BPI-7和BPI-8具有极高的肝素结合能力，而BPI-2和BPI-3具有中等偏高的肝素结合能力，BPI-4和BPI-6具有很小或无肝素结合能力。
实施例19用BPI蛋白质产物肽进行肝素中和在本实施例中，根据实施例3的方法，对BPI蛋白质产物肽BPI-2，BPI-3，BPI-4，BPI-5，BPI-6，BPI-7和BPI-8以及rBPI23进行试验以测定它们对ATIII/肝素复合物引起的凝血酶失活的影响。施用范围为1.0μg/ml到100μg/ml的各种浓度的BPI蛋白质产物以测定其影响。BPI蛋白质肽BPI-7，BPI-3和BPI-5分别具有最显著的肝素中和效力，如图18a和18b所示，其中所描绘的样品浓度分别为重量或摩尔浓度。
实施例20BPI蛋白质产物肽对LAL试验的影响在本实施例中，根据实施例15的方法，对BPI蛋白质产物肽BPI-2，BPI-3，BPI-4，BPI-6，BPI-7和BPI-8以及rBPI23进行LAL试验以测定其LPS结合和抑制特性。结果表明BPI-7和BPI-3具有显著的LPS抑制特性，BPI-2和BPI-8具有中等程度的LPS抑制特性，BPI-4和BPI-6无显著的LPS抑制活性，如图19a和19b所示，其中所描述绘的样品浓度分别为重量或摩尔浓度。
实施例21BPI蛋白质产物肽的杀菌试验在本实施例中，根据实施例16的方法，试验了BPI蛋白质产物肽BPI-2，BPI-3，BPI-4，BPI-5，BPI-6，BPI-7，BPI-8，BPI-9和BPI-10以及rBPI23在放射扩散试验中对突变型E.coliJ5(粗糙型)和E.coli0111B4(光滑型)细菌的杀菌效力。结果在图20a至20d中描绘出，显示出BPI-2，BPI-3，BPI-5，BPI-7，BPI-8，BPI-9和BPI-10各自具有或大或小程度的杀菌活性，而BPI-4和BPI-6不表现出杀菌活性。每个杀菌肽倾向于对粗糙型比对光滑型E.coli菌株更有效。
本实施例的另一方面，进行培养抗菌试验以测定某些BPI肽的杀菌活性。具体地说，从琼脂平板的单个菌落中挑选E.coli J5(粗糙型)和E.coli0111B4(光滑型)细菌，并用于接种到加有一系列10倍稀释的BPI蛋白质产物肽的培养平板上。平板培养过夜并在ELISA板面读器上读数以测定存活的菌落形成单位。该试验的结果在图20e(E.coli J5)和20f(E.coli0111B4)中描绘出，显示了BPI蛋白质产物肽BPI-3，BPI-7，BPI-9和BPI-10具有显著的抗菌活性。
这些杀菌试验以及肝素结合和LAL试验的结果表明存在具有一种或多种杀菌、肝素结合和LPS中和效力的小型合成的BPI肽，并且在23KD氨基末端片段中至少存在3个明显分离的功能区。一个功能区位于氨基酸残基17和45之间，第二个功能区在3个试验的活性鉴定中活性最强，位于氨基酸71和99之间。一个特异性的肽86-99在所有3个试验中均证实具有活力。第三个功能区由残基142-169组成。
实施例22BPI蛋白水解片段肽的制备在本实施例中，对rBPI23运用化学裂解和酶消化过程，根据Gazzano-Santoro et al(出处同上)的程序生产，以形成各种大小的重组蛋白质的蛋白水解片段。
rBPI23在用溴化氰(CNBr)或蛋白内切酶ASP-N进行蛋白水解前先被还原和烷基化。蛋白质以冷(4℃)丙酮沉淀法(1∶1V/V)脱盐过夜，并经离心(5000×g)10分钟沉淀。rBPI23沉淀用冷丙酮洗涤2次并在氮气流下干燥。然后rBPI23在8M尿素/0.1M Tris，pH8.1中重新配成1mg/ml的溶液，经加入3.4mM二硫苏糖醇(Calbiochem，San Diego.CA)37℃处理90分钟来还原。经加入碘乙酰胺(Sigma Chemical Co.，St，louis，MO)至终浓度为5.3微摩尔在室温黑暗中处理30分钟进行烷基化。还原和烷基化的蛋白质按上面所述进行丙酮沉淀，离心和洗涤，沉淀再熔解以备CNBr或Asp-N消化。
在加入CNBr前，洗过的沉淀溶于70％的三氟乙酸(TFA)(蛋白质测序级，Sigma)中使最终蛋白质浓度为5mg/ml。加入溶于70％TFA中的溴化氰(Baker Analyzed Reagent，VWR Scienti-fuc，San Francisco.(A)使最终CNBr与蛋白质之比(W/W)为2∶1。这样CNBr大约比蛋白质中甲硫氨酸残基摩尔数过量75倍。用氮净化反应，并在室温、黑暗中进行24小时。经加入9体积的蒸馏水终止反应，随后冷冻(-70℃)并冻干。
还原和烷基化的rBPI23以510mg/ml溶于8M尿素/0.1MTris，pH8.1中。加入等体积0.1M Tris，pH8.1，使最终状态为2.5mg/ml蛋白质存在于5M尿素/0.1M Tris，pH8.1中。来自莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)的蛋白质内切酶Asp-N(Boehrinyer-Mannheim，Indianapolis，IN)按酶∶底物比为1∶1000(W/W)加入，37℃消化6小时。经加入TFA至终浓度为0.1％来终止反应，然后样品以反相HPLC分馏。
在Zorbax蛋白质加C3柱(4.6×250mm，300A孔径，MAC-MOD Analytical InC.Chadsford，PA)上纯化CNBr和Asp-N片段混合物。在2小时内以1.0ml/分的流速用梯度从5％乙腈的0.1％TFA溶液到80％乙腈的0.1％TFA溶液进行洗脱。用Beekman System Gold HPLC在220mm下监测片段的洗脱。使柱的加热室维持在35℃并手工收集馏分，-70℃冷冻并在Speed Vac浓缩器中干燥。用前片段再溶于20mM乙酸钠，pH4.0/0.5M NaCl中。
由Francis Bitsch博士和John Kim先生在儿童医院-澳克兰研究所，Cedric Shackleton博士实验室中使用VG Bio-Q质谱仪进行电喷射电离质谱测量。经过数据的数学转移得到分子质量。
尽管rBPI23DNA序列编码成熟蛋白质的1-199氨基酸残基，但以电喷射电离质谱测量(ESI-MS)鉴定出大部分该蛋白质，它是在Leu-193和Val195截断而产生的。经过分离被测序并以ESI-MS分析过的C端胰蛋白酶水解肽，证实了这些C端截短物。在56，70，100，111，170，和196位有6个甲硫氨酸残基，预计用溴化氰进行化学裂解产生6个主要肽片段。CNBr裂解实验的结果在表4中进行了小结。用反相(C3)HPLC(图21A)分离出这些片段并用Ed-man降解法测定了其N-端序列。以C3HPLC柱未能解析出两个最大的片段(C1和C5)，而且进一步用离子交换色谱解析它们的尝试也已失败，假设的原因为它们的长度和等电点相似。用ESI-MS鉴定了混合物中C1，C5片段的一致性。考虑到在CNBr的裂解反应中C端甲硫氨酸转化为高丝氨酸引起30a.m.u的丧失，预计G的质量为6269(表4)。观察到的质量为6251.51±0.34，它与高丝氨酸内酯中间体中丧失了一个水分子(18a.m.u)是一致的，由于C1片段C-端氨基酸的疏水性，该中间体可能比高丝氨酸的形成更有利。C5片段预计的质量为6487，观察到的质量是6385.84±0.39(表1)。对于C5片段，由于C端氨基酸是亲水的，所以高丝氨酸内酯中间体的水解可能更有利。从N端测序和质谱数据来看，C5组分代表了C1/C5混合物中大约10-25％的物质。
用蛋白质内切酶对包含在CNBr C1/C5混合物内的区域进行蛋白水解的裂解以提供更多的片段。在rBPI23序列内有6个天冬氨酸残基，位于15，36，39，57，105和116位。以C3HPLC(图21B)分离的6个主要Asp-N片段被测序并以EsI-Ms(表4)测定了其质量。用酶∶底物为1∶1000(W/W)进行短期消化以消除潜在的非特异性断裂，尤其是在谷氨酸位点。由于分离到一个Asp残基(氨基酸15和35)未被裂解的片段(1-38)，它证明了消化一旦完成就不再继续。Asp-N片段的质谱与预测的各个片段的质量一致。不象CNBr裂解，其中的C端片段很难分辩，Asp-N片段从氨基酸116到C末端能很好地从所有其他Asp-N片段中分辩出。
表4rBPI23裂解片段分析的小结
实施例23BPI蛋白水解片段的杀菌效力筛选根据实施例22形成的BPI蛋白水解片段在基本上根据实施例16程序的放射扩散试验中对粗糙型突变E.coli J5细菌的杀菌效力。当试验量高达25pmol/孔时，由CNBr或Asp-N消化产生的rDPT23片段证实无杀菌活性。在本试验中用每孔含量小到0.75pmol的rBPT23仍检测到可测量的杀菌活性。还原的并烷基化的rBPT23(高达100pmol/孔)也不能杀菌，而烷基化的rBPT23保持与rBPT23相等的杀菌活性。
实施例24用BPI蛋白水解片段进行肝素结合根据实施例22形成的rBPT23和BPI蛋白水解片段基本上按照实施例1的程序用于肝素结合试验。
CNBr的片段的肝素结合在含饱和浓度的3H-肝素(20μg/ml)的每孔中使用100微微摩尔的各片段进行测量。结果如表5所示(两份孔的平均值加上或减去两值之差)，表明含有氨基酸71-100(C3)和1-56及112-170(C1，5)的CNBr片段结合肝素的程度相似。CNBr片段171-193也结合比对照蛋白质(thaumatin，一种与rBPT23分子量和电荷相似的蛋白质)更多的肝素。
Asp-N片段也证实在rBPT23中有多个肝素结合区。见表5，57-104Asp-N片段结合最高量的肝素，随后是1-38和116-193片段。这些资料与CNBr片段资料一起表明在rBPT23中至少有3个分离的肝素结合区，其中结合能力最高的是在残基71-100内。
表5rBPI23片段的肝素结合
实施例25BPI蛋白水解片段对LAL试验的影响根据实施例22形成的BPI蛋白水解片段用于基本上根据实施例15的LAL抑制试验，结果如图22所示，其中实心三角代表rBPT23；空心圈代表Asp-N片段A3；实心圈代表Asp-N片段A2，空心方框代表Asp-N片段A3；实心方框代表Asp-N片段A1A2；空心三角代表Asp-N片段A6b；小空心三角代表CNBr片段C3；小实心方框代表CNBr片段C1/C5。
含有氨基酸片段1-56和112-170的CNBr消化片段以IC50为大约100nM抑制LPS诱导的LAL反应。在相同试验中，该IC50大约比rBPT23的IC50(9nm)高10倍。其他CNBr消化片段无抑制活性。
对Asp-N消化产生的片段观察到的结果略有不同，其中发现3个片段在LAL试验中具有抑制力。与氨基酸116-193相应的片段表现出与完整rBPT23相似的LAL抑制活性，在15nM下能完全抑制LPS诱导的LAL反应。与氨基酸57-104和1-38相应的片段也抑制LAL试验，但所需量高10倍。这些结果与CNBr消化结果一起表明在rBPT23分子中至少3个区域具有中和LAL反应中LPS激活的能力，其中具有最高效力的区域看来存在于116-193氨基酸片段内。
在实施例22的蛋白水解片段的有关试验中，涉及使用能封闭rBPT23杀菌和LAL抑制特性的兔多克隆抗-rBPT23抗体和两种不同的无封闭性的小鼠抗rBPT23单克隆抗体的ELISA试验。发现多克隆抗体能与116-193和57-104 Asp-N片段以及1-56和112-170 CNBr片段发生免疫反应，而鼠单克隆抗体仅与代表rBPT23残基1-4的Asp-N片段发生反应。
总之，该结果表明rBPT23含有3个有助于该分子全部生物学活性的功能区。第一个功能区在氨基酸17-45序列中并被36位残基的Asp-N裂解破坏。这一功能区在对LPS诱导的LAL活性及肝素结合试验的抑制作用中均具有中等程度的活性。第二个活性功能区在氨基酸65-99区域中，它对LPS诱导的LAL活性的抑制作用被70位残基的CNBr裂解消除。这一功能区也表现出最高肝素结合能力并含有杀菌肽85-99。第3个活性功能区在氨基酸142-169之间，在LPS诱导的LAL刺激试验中具有抑制活性并在3个功能区中表现出最低的肝素结合能力。
其他杀菌蛋白质，如Cecropins和magainins，其特征为含有为其活性所必需的一连续的亲水脂的a-螺旋区。在LPS结合/杀菌分子的阳离子/疏水部位和肝素结合蛋白的同感序列间观察到高度结构相似性。在结合肝素的合成rBPT23肽与那些抑制LPS诱导的LAL反应的分子间存在极好的相关性(r＝0.75，p＝0.0001，n＝47)(图14至16)。这些资料表明LPS和肝素对于与其相互作用的蛋白质而言可能呈现相似的电荷排列。因此，其他与LPS以高亲合力结合的蛋白质，也可能与肝素紧密结合。
根据本发明提供的优选实施例，以本发明的方法产生各种修饰型和变异体对本领域的技术人员而言是可预料到的。根据本发明的一个方面，设计了治疗革兰氏阴性细菌感染及其后遗症的方法，包括施用具有革兰氏阴性杀菌活性的BPI蛋白质产物肽。因此，在本发明范围上出现的唯一限制是所附权利要求中的内容。
序列描述(1)一般资料(i)申请人XOMA公司(ii)发明题目杀菌/增强通透性蛋白质产物的治疗用途(iii)序列数2(iv)联系地址(A)联系人Marshall，O’Toole，Gerstein，Murray&Borun(B)街道6300 Sears Tower，233 South Wacker Drive(C)城市芝加哥(D)州伊利诺斯州(E)国家美国(F)邮编60606-6402(V)计算机可读形式(A)媒体类型Floppy盘(B)计算机兼容性IBM PC(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件Patent In Release#1.0，Version # 1.25(vi)最近申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类(viii)代理人资料(A)姓名Sharp，Jeffrey S.
(B)登记号31,879(C)参考/建档号31580
(ix)电讯资料(A)电话3121474-6300(B)电传3121474-0448(C)电报25-3856(2)SEQ ID NO1资料(i)序列特征(A)长度1813个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/键CDS(B)定位31…1491(ix)特征(A)名称/键mat肽(B)定位124…1491
(xi)序列描述SEQ ID NO1CAGGCCTTGA GGTTTTGGCA GCTCTGGAGG ATG AGA GAG AAC ATG GCC AGG GGC54Met Arg Glu Asn Met Ala Arg Gly-31 -30 -25CCT TGC AAC GCG CCG AGA TGG GTG TCC CTG ATG GTG CTC GTC GCC ATA102Pro Cys Asn Ala Pro Arg Trp Val Ser Leu Met Val Leu Val Ala Ile-20 -15 -10GGC ACC GCC GTG ACA GCG GCC GTC AAC CCT GGC GTC GTG GTC AGG ATC150Gly Thr Ala Val Thr Ala Ala Val Asn Pro Gly Val Val Val Arg Ile-5 1 5TCC CAG AAG GGC CTG GAC TAC GCC AGC CAG CAG GGG ACG GCC GCT CTG198Ser Gln Lys Gly Leu Asp Tyr Ala Ser Gln Gln Gly Thr Ala Ala Leu10 15 20 25CAG AAG GAG CTG AAG AGG ATC AAG ATT CCT GAC TAC TCA GAC AGC TTT246Gln Lys Glu Leu Lys Arg Ile Lys Ile Pro Asp Tyr Ser Asp Set Phe30 35 40AAG ATC AAG CAT CTT GGG AAG GGG CAT TAT AGC TTC TAC AGC ATG GAC294Lys Ile Lys His Leu Gly Lys Gly His Tyr Ser Phe Tyr Ser Met Asp45 50 55ATC CGT GAA TTC CAG CTT CCC AGT TCC CAG ATA AGC ATG GTG CCC AAT342Ile Arg Glu Phe Gln Leu Pro Ser Ser Gln Ile Ser Met Val Pro Asn60 65 70GTG GGC CTT AAG TTC TCC ATC AGC AAC GCC AAT ATC 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TCT726Leu Gln Pro Tyr Phe Gln Thr Leu Pro Val Met Thr Lys Ile Asp Ser190 195 200GTG GCT GGA ATC AAC TAT GGT CTG GTG GCA CCT CCA GCA ACC ACG GCT774Val Ala Gly Ile Asn Tyr Gly Leu Val Ala Pro Pro Ala Thr Thr Ala205 210 215GAG ACC CTG GAT GTA CAG ATG AAG GGG GAG TTT TAC AGT GAG AAC CAC822Glu Thr Leu Asp Val Gln Met Lys Gly Glu Phe Tyr Ser Glu Asn His220 225 230CAC AAT CCA CCT CCC TTT GCT CCA CCA GTG ATG GAG TTT CCC GCT GCC870His Asn Pro Pro Pro Phe Ala Pro Pro Val Met Glu Phe Pro Ala Ala235 240 245CAT GAC CGC ATG GTA TAC CTG GGC CTC TCA GAC TAC TTC TTC AAC ACA918His Asp Arg Met Val Tyr Leu Gly Leu Ser Asp Tyr Phe Phe Asn Thr250 255 260 265GCC GGG CTT GTA TAC CAA GAG GCT GGG GTC TTG AAG ATG ACC CTT AGA966Ala Gly Leu Val Tyr Gln Glu Ala Gly Val Leu Lys Met Thr Leu Arg270 275 280GAT GAC ATG ATT CCA AAG GAG TCC AAA TTT CGA CTG ACA ACC AAG TTC 1014Asp Asp Met Ile Pro Lys Glu Ser Lys Phe Arg Leu Thr Thr Lys Phe285 290 295TTT GGA ACC TTC CTA CCT GAG GTG GCC AAG AAG TTT CCC AAC ATG AAG 1062Phe Gly Thr Phe Leu Pro Glu Val Ala Lys Lys Phe Pro Asn Met Lys300 305 310ATA CAG ATC CAT GTC TCA GCC TCC ACC CCG CCA CAC CTG TCT GTG CAG 1110Ile Gln Ile His Val Ser Ala Ser Thr Pro Pro His Leu Ser Val Gln315 320 325CCC ACC GGC CTT ACC TTC TAC CCT GCC GTG GAT GTC CAG GCC TTT GCC 1158Pro Thr Gly Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Val Asp Val Gln Ala Phe Ala330 335 340 345GTC CTC CCC AAC TCC TCC CTG GCT TCC CTC TTC CTG ATT GGC ATG CAC 1206Val Leu Pro Asn Ser Ser Leu Ala Ser Leu Phe Leu Ile Gly Met His350 355 360ACA ACT GGT TCC ATG GAG GTC AGC GCC GAG TCC AAC AGG CTT GTT GGA 1254Thr Thr Gly Ser Met Glu Val Ser Ala Glu Ser Asn Arg Leu Val Gly365 370 375GAG CTC AAG CTG GAT AGG CTG CTC CTG GAA CTG AAG CAC TCA AAT ATT 1302Glu Leu Lys Leu Asp Arg Leu Leu Leu Glu Leu Lys His Ser Asn Ile380 385 390GGC CCC TTC CCG GTT GAA TTG CTG CAG GAT ATC ATG AAC TAC ATT GTA 1350Gly Pro Phe Pro Val Glu Leu Leu Gln Asp Ile Met Asn Tyr Ile Val395 400 405CCC ATT CTT GTG CTG CCC AGG GTT AAC GAG AAA CTA CAG AAA GGC TTC 1398Pro Ile Leu Val Leu Pro Arg Val Asn Glu Lys Leu Gln Lys Gly Phe410 415 420 425CCT CTC CCG ACG CCG GCC AGA GTC CAG CTC TAC AAC GTA GTG CTT CAG 1446Pro Leu Pro Thr Pro Ala Arg Val Gln Leu Tyr Asn Val Val Leu Gln430 435 440CCT CAC CAG AAC TTC CTG CTG TTC GGT GCA GAC GTT GTC TAT AAA 1491Pro His Gln Asn Phe Leu Leu Phe Gly Ala Asp Val Val Tyr Lys445 450 455TGAAGGCACC AGGGGTGCCG GGGGCTGTCA GCCGCACCTG TTCCTGATGG GCTGTGGGGC 1551ACCGGCTGCC TTTCCCCAGG GAATCCTCTC CAGATCTTAA CCAAGAGCCC CTTGCAAACT 1611TCTTCGACTC AGATTCAGAA ATGATCTAAA CACGAGGAAA CATTATTCAT TGGAAAAGTG 1671CATGGTGTGT ATTTTAGGGA TTATGAGCTT CTTTCAAGGG CTAAGGCTGC AGAGATATTT l73CCTCCAGGAA TCGTGTTTCA ATTGTAACCA AGAAATTTCC AITTGTGCTT CATGAAAAAA 179AACTTCTGGT TTTTTTCATG TG 181(2)SEQ ID NO2(i)序列特祉(A)长度4γ7氮基酸(B)类型氨基酸(c)拓扑线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Arg Glu Asn Mec A1a Arg Gly Pro Cys Asn A1a Pro Arg Trp Va1-31 -30 -25 -20Ser Leu Met Val Leu Val Ala I1e Gly Thr Ala Val Thr Ala Ala Val-15 -10 -5 1Asn Pro G1y Val Val Val Arg Ile Ser Gln Lys Gly Leu Asp Tyr Ala5 10 15Ser Gln Gln Gly Thr Ala Ala Leu Gln Lys Glu Leu Lys Arg Ile Lys20 25 30Ile pro Asp Tyr Ser Asp Ser Phe Lys Ile Lys His Leu Gly Lys Gly35 40 45His Tyr Ser Phe Tyr Ser HecAsp 11e Arg Glu Phe G1n Leu PrO Ser50 55 60 65Ser G1n Ile Ser Mer Val Pr0 Asn Val G1y Leu Lys Phe Ser I1e Ser70 75 80Asn A1a Asn I1e Lys I1e Ser G1y Lys Trp Lys A1a G1n Lys Arg Phe85 90 95Leu Lys Mec Ser G1y Asn Phe Asp Leu Ser I1e Glu Gly Mec Ser I1e100 105 110Ser Ala Aeu Leu Lys Leu G1y Ser Asn pro Thr Ser G1y Lys pr0 Thr11S 120 125Ile Thr Cys Ser Ser Cys Ser Ser His Ile Asn Ser Val His Val His130 135 14O 145Ile Ser Lys Ser Lys Val G1y Trp Leu I1e G1n Leu phe His Lys Lys150 155 160I1e G1u Ser A1a Leu Arg Asn Lys Met Asn Ser Gln Val Cys G1u Lys165 170 175Val Thr Asn Ser Val Ser Ser Lys Leu Gln pro Tyr Phe G1n Thr Leu180 185 190Pro Val Met Thr Lys Ile Asp Ser Val A1a G1y I1e Asn Tyr G1y Leu195 200 205Val A1a Pro pro A1a Thr Thr A1a Glu Thr Leu Aap Val G1n Het Lys21O 215 220 225
46Gly Glu Phe Tyr Ser Glu Asn His His Asn Pro Pro Pro Phe Ala Pro230 235 240Pro Val Met Glu Phe Pro Ala Ala His Asp Arg Met Val Tyr Leu Gly245 250 255Leu Ser Asp Tyr Phe Phe Asn Thr Ala Gly Leu Val Tyr Gln Glu Ala260 265 270Gly Val Leu Lys Met Thr Leu Arg Asp Asp Met Ile Pro Lys Glu Ser275 280 285Lys Phe Arg Leu Thr Thr Lys Phe Phe Gly Thr Phe Leu Pro Glu Val290 295 300 305Ala Lys Lys Phe Pro Asn Met Lys Ile Gln Ile His Val Ser Ala Ser310 315 320Thr Pro Pro His Leu Ser Val Gln Pro Thr Gly Leu Thr Phe Tyr Pro325 330 335Ala Val Asp Val Gln Ala Phe Ala Val Leu Pro Asn Ser Ser Leu Ala340 345 350Ser Leu Phe Leu Ile Gly Met His Thr Thr Gly Ser Met Glu Val Ser355 360 365Ala Glu Ser Asn Arg Leu Val Gly Glu Leu Lys Leu Asp Arg Leu Leu370 375 380 385Leu Glu Leu Lys His Ser Asn Ile Gly Pro Phe Pro Val Glu Leu Leu390 395 400Gln Asp Ile Met Asn Tyr Ile Val Pro Ile Leu Val Leu Pro Arg Val405 410 415Asn Glu Lys Leu Gln Lys Gly Phe Pro Leu Pro Thr Pro Ala Arg Val420 425 430Gln Leu Tyr Asn Val Val Leu Gln Pro His Gln Asn Phe Leu Leu Phe435 440 445Gly Ala Asp Val Val Tyr Lys450 45权利要求
1.一种中和肝素的抗凝血效力的方法，包括给受试验者施用有效量的肝素结合BPI蛋白质产物。
2.一种抑制血管形成的方法，包括给受试验者施用一定量的对抑制血管形成有效的BPI蛋白质产物。
3.一种在液体样品中中和肝素的抗凝血效力的方法，包括将所说的样品与有效量的肝素结合BPI蛋白质产物接触。
4.权利要求2的方法，其中所抑制的血管形成与视网膜病有关。
5.一种抑制内皮细胞增生的方法，包括给受试验者施用一定量的对抑制增生有效的BPI蛋白质产物。
6.一种治疗子宫内膜异位的方法，包括给子宫内膜施用一定量的对抑制内皮细胞增生有效的BPI。
7.一种避孕方法，包括给受试验者的子宫由壁施用一定量的，对阻止与受精卵植入相联系的内皮细胞增生有效的BPI蛋白质产物。
8.一种抑制恶性肿瘤细胞增生的方法，包括给受试验者施用一定量的对抑制增生有效的BPI蛋白质产物。
9.一种权利要求8的方法，其中的恶性肿瘤是卡波济肉瘤。
10.一种治疗慢性发炎疾病症状的方法，包括给受试验者施用一定量的对减轻炎症有效的BPI蛋白质产物。
11.权利要求10的方法，其中的慢性发炎疾病是关节炎。
12.权利要求11的方法，其中的关节炎发炎疾病症状是类风湿性关节炎。
13.权利要求11的方法，其中治疗的关节炎发炎疾病症状是反应性关节炎。
14.权利要求1，2，5，6，7，8和10的方法，其中的BPI蛋白质产物是23—25KD的杀菌/增强通透性蛋白质氨基末端片段。
15.一种BPI蛋白质产物作为肝素结合药物的用途。
16.一种用于肝素结合的BPI蛋白质产物，用于中和肝素的抗凝血效力。
17.一种用于肝素结合的BPI蛋白质产物，用于抑制血管形成。
18.根据权利要求17的产物，其中抑制的血管形成与视网膜病有关。
19.一种用于肝素结合的BPI蛋白质产物，用于抑制内皮细胞增生。
20.根据权利要求17的产物，其中的内皮细胞增生与子宫内膜异位相联系。
21.一种用于肝素结合的BPI蛋白质产物，用作一种避孕药。
22.一种用于肝素结合的BPI蛋白质产物，用于抑制恶性肿瘤细胞增生。
23.一种根据权利要求22的产物，其中的恶性肿瘤是卡波济肉瘤。
24.一种用于肝素结合的BPI蛋白质产物，用于治疗慢性发炎疾病症状。
25.根据权利要求24的产物，其中的慢性发炎疾病是关节炎。
26.一种根据权利要求25的产物，其中的关节炎发炎疾病是类风湿性关节炎。
27.一种根据权利要求25的产物，其中的关节炎发炎疾病是反应性关节炎。
28.一种根据权利要求15，16，17，19，21，22和24中任意一项的产物，它是一种23-25KD的杀菌/增强通透性蛋白质氧基末端片段。
29.一种BPI蛋白质产物在肝素结合药物生产中的用途。
30.一种BPI蛋白质产物的用途，用于中和肝素的抗凝血效力之肝素结合药物的生产。
31.一种BPI蛋白质产物的用途，用于抑制血管形成之肝素结合药物的生产。
32.一种BPI蛋白质产物的用途，用于抑制与视网膜病相联系的血管增生之肝素结合药物的生产。
33.一种BPI蛋白质产物的用途，用于抑制由皮细胞增生之肝素结合药物的生产。
34.一种BPI蛋白质产物的用途，用于以抑制由皮细胞增生来治疗子宫内膜异位之肝素结合药物的生产。
35.一种BPI蛋白质产物的用途，用于肝素结合避孕药的生产。
36.一种BPI蛋白质产物的用途，用于抑制恶性肿瘤细胞增生的肝素结合药物的生产。
37.根据权利要求36的用途，其中的恶性肿瘤是卡波济肉瘤。
38.一种BPI蛋白质产物的用途，用于治疗慢性发炎疾病症状的肝素结合药物的生产。
39.根据权利要求38的用途，其中的慢性发炎疾病是关节炎。
40.根据权利要求39的用途，其中的关节炎发炎疾病是类风湿性关节炎。
41.根据权利要求39的用途，其中的关节炎发炎疾病是反应性关节炎。
42.根据权利要求29，30，31，32，33，34，35，36和38任意一项的用途，其中的蛋白质产物是一种23-25KD的杀菌/增强通透性蛋白质的氨基末端片段。
全文摘要
本发明涉及用于症状治疗的治疗学方法，包括施用杀菌/增强通透性(BPI)蛋白质产物来中和肝素的抗凝血活性，抑制血管形成、肿瘤和内皮细胞增生，治疗慢性发炎性疾病。
文档编号A61P13/02GK1124455SQ94191892
公开日1996年6月12日 申请日期1994年3月11日 优先权日1993年3月12日
发明者R·G·李特尔, H·伽扎奴-杉图茹, J·B·佩仁特 申请人:爱克斯欧玛公司