作为细胞增殖抑制剂的喹诺酮类似物的制作方法

专利名称：：作为细胞增殖抑制剂的喹诺酮类似物的制作方法
技术领域：
：0002本发明涉及喹诺酮类似物(quinoloneanalogs)及其应用。本发明还涉及制备喹诺酮类似物的方法。
背景技术：
：0003有证据表明四联体结构(quadruplexstructure)在体内可以存在于基因组的特定区域中，包括染色体的端粒末端和癌基因调控区(Han，etal.，TrendsPharm.Sci.(2000)21136-142)。四联体结构可以在富含嘌呤的核酸链中形成。在双链核酸中，某些富含嘌呤的链能够参与在典型的双螺旋结构与解链和非B型区之间的缓慢平衡。这些解链和非B型可以被称作“平行结构(paranemicstructures)”。有些型式与对S1核酸酶消化作用的敏感性相关，其可以被称作“核酸酶超敏元件(nucleasehypersensitivityelements)”或“NHE”。四联体是平行结构的一种类型，而某些NHE可以采用四联体结构。发明概述0004本发明提供了喹诺酮类似物，其可以抑制细胞增殖和/或诱导细胞凋亡。本发明还提供了喹诺酮类似物的制备方法及其使用方法。0005在一方面，本发明提供了化合物，其具有通式及其药物学上可接受盐、酯和前体药物(prodrug)；其中如果Z2、Z3或Z4分别是N，则B、X、A或V不存在，而如果Z2、Z3或Z4分别是C，则B、X、A或V独立地是H、卤素、叠氮基、R2、CH2R2、SR2、OR2或NR1R2；或者A和V、A和X、或X和B可以形成碳环、杂环、芳基或杂芳基，它们中的每一个可以任选地被环取代和/或与环稠合；Z是O、S、NR1、CH2或C＝O；Z1、Z2、Z3和Z4是C或N，条件是任何两个N不相邻；W与N和Z一起形成任选取代的五元环或六元环，其被稠合至任选取代的饱和或不饱和环；所述饱和或不饱和环可以包含杂原子，并且是单环或者与单个或多个碳环或杂环相稠合；U是R2、OR2、NR1R2、NR1-(CR12)n-NR3R4或N＝CR1R2，其中在N＝CR1R2中，R1和R2可以与C一起形成环，条件是U不是H，当U是OH、OR2或NH2时，则Z1-Z4中的至少一个是N；在每一个NR1R2中，R1和R2可以与N一起形成任选取代的环；在NR3R4中，R3和R4可以与N一起形成任选取代的环；R1和R3独立地是H或C1-6烷基；每一个R2是H或C1-10烷基或C2-10烯基，每一个可被卤素、一个或多个非相邻杂原子、碳环、杂环、芳基或杂芳基任选地取代，其中每个环被任选地取代；或者R2是任选取代的碳环、杂环、芳基或杂芳基；R4是H、C1-10烷基或C2-10烯基，其任选地含有一个或多个选自N、O和S的非相邻杂原子，且可被碳环或杂环任选地取代；或者R3和R4可以与N一起形成任选取代的环；每一个R5是位于环W上任何部位的取代基；且是H、OR2、氨基、烷氧基、酰氨基、卤素、氰基或无机取代基；或者R5是C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、-CONHR1，每一个任选地被卤素、羰基或者一个或多个非相邻杂原子取代；或者两个相邻的R5相连得到5-6元任选取代的碳环或杂环，其可以被稠合至另外的任选取代的碳环或杂环上；且n是1-6。0006在上面的式(1)中，当Z1是N时，B可以不存在，或者当Z1是C时，B是H或卤素。0007在上面的式(1)中，W与N和Z一起形成任选取代的5元环或6元环，其被稠合至任选取代的芳基或杂芳基，所述任选取代的芳基或杂芳基选自其中每一个Q、Q1、Q2和Q3独立地是CH或N；Y独立地是O、CH、C＝O或NR1；n和R5如上面所定义的。0008在其它实施方式中，W与N和Z一起形成具有选自下列的式子的基团其中Z是O、S、CR1、NR1或C＝O；每一个Z5是CR6、NR1或C＝O，条件是如果Z和Z5相邻，则两者不都是NR1；每一个R1是H、C1-6烷基、COR2或S(O)pR2，其中p是1-2；R6是H或者本领域已知的取代基，包括但不限于羟基、烷基、烷氧基、卤素、氨基或酰氨基；且环S和环T可以是饱和的或不饱和的。0009在一些实施方式中，W与N和Z一起形成稠合于苯基的5元环或6元环。在其它实施方式中，当U是NR1R2时，W与N和Z一起形成任选地稠合于另一环的5元环或6元环，条件是U不是NH2。在某些实施方式中，当U是NR1R2(例如NH2)时，W与N和Z一起形成5元环或6元环，其未稠合于另一环。0010又在另一实施方式中，本发明的化合物具有通式(2A)或(2B)其中A、B、V、X、U、Z、Z1、Z2、Z3、Z4和n如上所述；Z5是O、NR1、CR6或者C＝O；R6是H、C1-6烷基、羟基、烷氧基、卤素、氨基或者酰氨基；且Z和Z5可以任选地形成双键。0011在上面的式(1)、(2A)和(2B)中，U可以是NR1R2，其中R1是H，R2是由杂原子、C3-6环烷基、芳基或者含有一个或多个N、O或S的5-14元杂环任选取代的C1-10烷基。例如，R2可以是由任选取代的吗啉、硫代吗啉、咪唑、氨基二噻唑、吡咯烷、哌嗪、吡啶或哌啶取代的C1-10烷基。在其它实例中，R1和R2与N一起形成任选取代的哌啶、吡咯烷、哌嗪、吗啉、硫代吗啉、咪唑或氨基二噻唑。0012在其它实施方式中，U是NR1-(CR12)n-NR3R4；n是1-4；NR3R4中的R3和R4一起形成任选取代的哌啶、吡咯烷、哌嗪、吗啉、硫代吗啉、咪唑或氨基二噻唑。在一些实例中，U是NH-(CH2)n-NR3R4，其中R3和R4与N一起形成任选取代的吡咯烷，其可以在该吡咯烷环的任何位置处被连接于(CH2)n。在一种实施方式中，R3和R4与N一起形成N-甲基取代吡咯烷。在一些实施方式中，U是2-(1-甲基吡咯烷-2-基)乙氨基或(2-吡咯烷-1-基)乙氨基。0013在上面的式(1)、(2A)和(2B)中，Z可以是S或NR1。在一些实施方式中，B、X或A中至少一个是卤素，Z1、Z2和Z3是C。在其它实施方式中，当Z2和Z3是C时，并非每一个X和A是H。在上面的式(1)、(2A)和(2B)中，V可以是H。在具体实施方式中，U不是OH。0014在一种实施方式中，Z1、Z2、Z3和Z4中的每一个是C。在另一种实施方式中，Z1、Z2、Z3和Z4中的三个是C，而剩下的一个是N。例如，Z1、Z2和Z3是C，Z4是N。可选地，Z1、Z2和Z4是C，Z3是N。在其它实例中，Z1、Z3和Z4是C，Z2是N。仍在其它实例中，Z2、Z3和Z4是C，而Z1是N。0015在另一实施方式中，Z1、Z2、Z3和Z4中的两个是C，而剩下的两个是非相邻的氮。例如，Z1和Z3可以是C，Z2和Z4是N。可选地，Z1和Z3可以是N，Z2和Z4可以是C。在其它实例中，Z1和Z4是N，Z2和Z3是C。在具体实例中，W与N和Z一起形成稠合于苯基的5元环或6元环。0016在一些实施方式中，B、X、A和V中的每一个是H，Z1-Z4是C。在许多实施方式中，B、X、A和V中至少一个是H，对应的相邻的Z1-Z4原子是C。例如，B、X、A和V中的任何两个可以是H。在一个实例中，V和B可以都是H。在其它实例中，B、X、A和V中的任何三个是H，对应的相邻的Z1-Z4原子是C。0017在某些实施方式中，B、X、A和V中之一是卤素(例如氟)，对应的相邻的Z1-Z4是C。在其它实施方式中，X、A和V中的两个是卤素或SR2，其中R2是由杂原子、碳环、杂环、芳基或杂芳基任选取代的C0-10烷基或C2-10烯基；对应的相邻的Z2-Z4是C。例如，X和A都可以是卤素。在其它实例中，如果X和A中的每一个存在，则其可以是SR2，其中R2是由苯基或吡嗪取代的C0-10烷基。仍在其它实例中，V、A和X可以是炔基、氟化烷基诸如CF3、CH2CF3、全氟化烷基等，氰基、硝基、酰胺、磺酰胺或羰基化合物诸如COR2。0018在上面每一个式子中，U和X、V和A如果存在，则可以独立地是NR1R2，其中R1是H，而R2是由杂原子、C3-6环烷基、芳基或含有一个或多个N、O或S的5-14元杂环任选取代的C1-10烷基。如果在本发明的化合物中存在一个以上的NR1R2部分，如当任何一个上式的化合物中的A和U两者都是NR1R2时，每一个R1和每一个R2都是被独立地选择的。在一个实例中，R2是由任选取代的5-14元杂环取代的C1-10烷基。例如，R2可以是由吗啉、硫代吗啉、咪唑、氨基二噻唑、吡咯烷、哌嗪、吡啶或哌啶取代的C1-10烷基。可选地，R1和R2与N一起可以形成含有一个或多个N、O或S的任选取代杂环。例如，R1和R2与N一起可以形成哌啶、吡咯烷、哌嗪、吗啉、硫代吗啉、咪唑或氨基二噻唑。0019任选取代杂环的说明性实例包括但不限于四氢呋喃、1，3-二氧戊环、2，3-二氢呋喃、四氢吡喃、苯并呋喃、异苯并呋喃、1，3-二氢-异苯并呋喃、异唑、4，5-二氢异唑、哌啶、吡咯烷、吡咯烷-2-酮、吡咯、吡啶、嘧啶、八氢-吡咯并[3，4-b]吡啶、哌嗪、吡嗪、吗啉、硫代吗啉、咪唑、氨基二噻唑、咪唑烷-2，4-二酮、苯并咪唑、1，3-二氢苯并咪唑啉-2-酮、吲哚、噻唑、苯并噻唑、噻二唑、噻吩、四氢-噻吩1，1-二氧化物、二氮杂、三唑、二氮杂双环[2.2.1]庚烷、2，5-二氮杂双环[2.2.1]庚烷和2，3，4，4a，9，9a-六氢-1H-β-咔啉。0020在一种实施方式中，本发明提供了具有式(1)、(2A)或(2B)的化合物，其中A、V和B中的每一个如果存在，则其独立地是H或卤素(例如，氯或氟)；X是-(R5)R1R2，其中R5是C或N，且其中在每一个-(R5)R1R2中，R1和R2可以一起形成任选取代的芳环或杂芳环；Z是NH或N-烷基(例如N-CH3)；W与N和Z一起形成任选取代的5元环或6元环，其与任选取代的芳环或杂芳环相稠合；且U是-R5R6-(CH2)n-CHR2-NR3R4，其中R6是H或C1-10烷基，且其中在-CHR2-NR3R4部分中，每一个R3或R4与所述C可以一起形成任选取代的杂环或杂芳环，或者其中在-CHR2-NR3R4部分中，每一个R3或R4与所述N可以一起形成任选取代的碳环、杂环、芳环或杂芳环。0021在另一个实施方式中，本发明提供了具有式(1)、(2A)或(2B)的化合物，其中如果A存在，则其是H或卤素(例如氯或氟)；如果X存在，则其是-(R5)R1R2，其中R5是C或N，且其中在每一个-(R5)R1R2中，R1和R2一起可以形成任选取代的芳环或杂芳环；Z是NH或N-烷基(例如N-CH3)；W与N和Z一起形成任选取代的5元环或6元环，其与任选取代的芳环或杂芳环相稠合；且U是-R5R6-(CH2)n-CHR2-NR3R4，其中R6是H或烷基，且其中在-CHR2-NR3R4部分中，每一个R3或R4与所述C一起可以形成任选取代的杂环或杂芳环，或者其中在-CHR2-NR3R4部分中，每一个R3或R4与所述N一起可以形成任选取代的碳环、杂环、芳环或杂芳环。0022在以上每一式子中，每个任选取代的部分可以被一种或多种卤素、OR2、NR1R2、氨基甲酸酯、C1-10烷基、C2-10烯基取代，其每一个被卤素、C＝O、芳基或者一个或多个杂原子任选取代；无机取代基、芳基、碳环或杂环所取代。其它取代基包括但不限于炔基、环烷基、氟化烷基诸如CF3、CH2CF3、全氟化烷基等；氧化氟化烷基诸如OCF3或CH2CF3等；氰基、硝基、COR2、NR2COR2、磺酰胺；NR2SOOR2；SR2、SOR2、COOR2、CONR22、OCOR2、OCOOR2、OCONR22、NRCOOR2、NRCONR22、NRC(NR)(NR22)、NR(CO)NR22和SOONR22，其中每一个R2如式1中所定义。0023本发明还提供了药物组合物，其包括具有任何一种上式的化合物以及制药上可接受的赋形剂。在一个实例中，所述组合物包括在缓冲溶液中的具有任何一种上式的化合物、聚乙二醇和丙二醇。0024而且，本发明涉及减少细胞增殖和/或诱导细胞死亡的方法，包括使某一体系与有效量的具有任何一种上式的化合物或者其药物组合物相接触，并任选地与化学治疗剂相组合，从而在所述体系中减少细胞增殖和/或诱导细胞死亡，诸如凋亡或凋亡性细胞死亡。所述体系可以是细胞或组织。在一种实施方式中，所述体系包括胰腺细胞，诸如来自对象的细胞或者经培养的细胞(例如体外或离体)。在具体实施方式中，所述体系包括胰腺癌细胞。在一种实施方式中，所述体系是一种细胞系，诸如PC3、HCT116、HT29、MIAPaca-2、HPAC、Hs700T、Panc10.05、Panc02.13、PL45、SW190、Hs766T、CFPAC-1和PANC-1。0025本发明还提供改善细胞增生性病症的方法，包括向需要此类治疗的对象施用有效量的具有任何一种上式的化合物或者其药物组合物，并任选地与化学治疗剂相组合，从而改善所述的细胞增生性病症。例如，可以减少细胞增殖，和/或可以诱导细胞死亡诸如凋亡或凋亡性细胞死亡。细胞增生性病症可以是人类或动物对象中的肿瘤或癌症。在具体实施方式中，所述癌症是胰腺癌，包括非内分泌型肿瘤和内分泌型肿瘤。非内分泌型肿瘤的洗明性实例包括但不限于腺癌、腺泡细胞癌、腺鳞癌、巨细胞瘤、管内乳头状粘液瘤(intraductalpapillarymucinousneoplasms)、粘液囊性腺癌、胰母细胞瘤、浆液囊腺瘤、实性假乳头瘤。内分泌型肿瘤可以是岛细胞瘤(isletcelltumor)。0026以上用于减少细胞增殖和/或诱导细胞死亡的方法也可以与一种方法和/或一种化学治疗剂联合应用。可以与本发明的方法联合使用的方法的实例包括但不限于放射疗法或外科手术。在某些实施方式中，本发明的化合物与吉西他滨组合施用，用于减少细胞增殖、诱导细胞死亡和/或改善细胞增生性病症。0027而且，本发明提供了降低微生物滴度的方法，包括使某一体系与有效量的具有任何一种上式的化合物或者其药物组合物相接触，并任选地与抗微生物制剂相组合，从而降低微生物滴度。所述体系可以是细胞或组织。本发明还提供了改善微生物感染的方法，包括向需要此类治疗的对象施用有效量的具有任何一种上式的化合物或者其药物组合物，以及任选的抗微生物制剂，从而改善所述的微生物感染。所述对象可以是人类或动物。微生物滴定可以是病毒滴度、细菌滴度或真菌滴度。0028本发明还涉及测定具有任何一种上式的化合物与能够形成四联体结构的核酸之间相互作用的选择性的方法，包括a)在不存在竞争物分子的情况下，使一种化合物与三种或更多种能够形成四联体结构的核酸相接触，其中各种核酸不是端粒核酸；b)测量该化合物与所述三种或更多种核酸之间的直接相互作用；并且c)通过比较相互作用的测量结果来确定相互作用的选择性。在一个实施例中，三种或更多种核酸包括位于癌基因核苷酸序列5’的核苷酸序列。所述癌基因可以是MYC、HIF、VEGF、ABL、TGF、PDGFα、MYB、SPARC、HER、VAV、RET、H-RAS、EGF、SRC、BCL-1、BCL-2、DHFR或HMGA。在测定相互作用的选择性时，该化合物可以在不同容器中单独地与所述三种或更多种核酸的每一种相接触。而且，相互作用的选择性可以通过比较IC50值加以确定。0029本发明的化合物可以与或者可以不与能够形成四联体的DNA区相互作用。在某些实施方式中，本发明的化合物可以结合和/或稳定螺旋桨四联体(propellerquadruplex)。螺旋桨四联体的实例包括但不限于H-RAS、RET、BCL-1、DHFR、TGF-B、HIF-1α、VEGF、c-Myc或PDGFα。在另一实施方式中，所述化合物可以结合和/或稳定椅式(chair-eller)或篮式(basket)四联体。例如，该化合物可以结合和/或稳定BCL-2。0030本发明也提供了诱导细胞死亡诸如凋亡性细胞死亡(凋亡)的方法，包括向需要的体系或对象施用有效量的具有任何一种上式的化合物或者其药物组合物，以及可选的化学治疗剂。本发明还提供了治疗或改善由癌基因过量表达诸如c-Myc过量表达所介导的病症的方法，包括向需要此类治疗的体系或对象施用有效量的具有任何一种上式的化合物或者其药物组合物，以及可选的化学治疗剂。所述对象可以是人类或动物，体系可以是细胞或组织。0031在另一方面，本发明提供了制备式(3)或式(4)化合物的方法，包括使酯、NHR1R2和路易斯酸相接触，其中所述酯具有式(5)或式(6)，其中A、B、V、X、R1、R2、R5、Z、Z1、Z2、Z3、Z4和n如上文式(1)中所述；W与N和Z一起形成任选取代的5元环或6元环，其被稠合至任选取代的芳基或杂芳基，其中所述芳基或杂芳基可以是单环或者是与单个环或多个环相稠合，且其中所述环任选地含有杂原子；W1是任选取代的芳基或杂芳基，其可以是单环或者与单个环或多个环相稠合，且任选地含有杂原子；Z5是C或N，条件是如果Z是O、S或NR1，则Z5是C，并且进一步的条件是如果Z5是N，则Z和Z6不是N；且Z6、Z7和Z8独立地是C或N，条件是任何两个N是非相邻的。0032制备式(3)化合物的本方法包括在存在路易斯酸诸如氯化铝的条件下由酯与胺偶联成酰胺。合适的路易斯酸可以通过进行测试反应并观察所产生的反应产物量来加以选择，如下文所述。本方法在进行酰胺偶联之前无需将酯水解为羧酸。因此，本方法更为简便。如实施例29所示，本方法还提供了比现有的涉及要求将酯水解为酸的方法(实施例30)更高的收率和纯度。0033在一种实施方式中，所述的路易斯酸具有式MLn，其中L是卤素原子或有机基，n是3-5，M是第III族元素的原子、第IV族元素的原子、As、Sb、V或Fe。0034在以上方法中，所述的接触步骤可以在室温下进行。可选地，所述酯、胺和路易斯酸可以在低于或者高于室温的温度下进行接触，该温度可以由本领域技术人员确定。0035在一个实例中，所述的接触步骤包括将酯和胺在有机溶剂中接触以形成溶液，并将该溶液与路易斯酸接触。在一个实例中，所述有机溶剂是二氯甲烷。该反应也可以使用本领域已知的其它合适的溶剂来进行。0036在一种实施方式中，可以使用相对于酯而言过量的胺。例如酯与胺的比率可以是1∶2、1∶1.5或1∶1.25。0037在另一实施方式中，可以使用与所述胺等摩尔量的路易斯酸。可选地，所使用的路易斯酸的量可以多于或者少于所述胺。0038以上方法可以进一步包括分离具有任何一种上式的化合物。可以使用本领域已知的任何方法将分离的化合物进一步纯化。例如，可以通过柱色谱、重结晶或者两者将分离的化合物纯化。0039在以上方法中，分离的化合物的纯度可以在90％-99％之间。例如，分离的化合物可以具有90％-95％的纯度。0040在以上方法中，酯可以与NHR1R2相接触，其中R1是(CR32)n基团；R2是NR3R4；R3是H或C1-6烷基；n是1-6；且R4是H或C1-10烷基或C2-10烯基，其任选地含有一个或多个选自N、O和S的非相邻杂原子，并且可被碳环或杂环任选取代；且其中在NR3R4中，R3和R4可以形成任选取代的环，诸如上文在前面描述的那些。0041图1-10说明了本发明的示例性化合物在HCT-116结肠直肠癌异种移植物模型中的活性。定义0042如此处所用，术语“烷基”指含碳化合物，并包括含有一个或多个杂原子的化合物。术语“烷基”也包括由一种或多种取代基所取代的烷基，所述取代基包括但不限于OR1、氨基、酰氨基、卤素、＝O、芳基、杂环基团或者无机取代基。0043如此处所用，术语“碳环”指在环中只含有碳原子的环状化合物，而“杂环”指包含杂原子的环状化合物。碳环和杂环结构包括具有单环、二环或多环体系的化合物。0044如此处所用，术语“芳基”指多不饱和的、一般为芳香性的烃取代基，而“杂芳基(heteroaryl)”或“杂芳族(heteroaromatic)”指含有杂原子的芳环。所述芳基和杂芳基结构包括具有单环、二环或多环体系的化合物。0045如此处所用，术语“杂原子”指碳和氢以外的任何原子，诸如氮、氧或硫。0046杂环的说明性实例包括但不限于四氢呋喃、1，3-二氧戊环、2，3-二氢呋喃、吡喃、四氢吡喃、苯并呋喃、异苯并呋喃、1，3-二氢-异苯并呋喃、异唑、4，5-二氢异唑、哌啶、吡咯烷、吡咯烷-2-酮、吡咯、吡啶、嘧啶、八氢-吡咯并[3，4-b]吡啶、哌嗪、吡嗪、吗啉、硫代吗啉、咪唑、咪唑烷-2，4-二酮、1，3-二氢苯并咪唑啉-2-酮、吲哚、噻唑、苯并噻唑、噻二唑、噻吩、四氢-噻吩1，1-二氧化物、二氮杂、三唑、胍、二氮杂双环[2.2.1]庚烷、2，5-二氮杂双环[2.2.1]庚烷、2，3，4，4a，9，9a-六氢-1H-β-咔啉、环氧乙烷、氧杂环丁烷、四氢吡喃、二烷、内酯、氮丙啶、氮杂环丁烷、哌啶、内酰胺，并且也可以包括杂芳基。杂芳基的其它说明性实例包括但不限于呋喃、吡咯、吡啶、嘧啶、咪唑、苯并咪唑和三唑。0047如此处所用，术语“无机取代基”指取代基，其不含有碳或者含有结合于非氢元素的碳(例如元素碳、一氧化碳、二氧化碳和碳酸盐)。无机取代基的实例包括但不限于硝基、卤素、磺酰基、亚磺酰基、磷酸盐等。0048术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“治疗效果”，如此处所用，指降低或中止细胞增殖速率(例如减慢或中止肿瘤生长)或减少增殖性癌细胞数(例如去除部分或整个的肿瘤)。这些术语也可适用于降低被微生物感染的体系(即，细胞、组织或对象)中的微生物滴度，降低微生物繁殖速率，减少症状数或与微生物感染相关的症状的影响，和/或从所述体系中去除可检测量的微生物。微生物的实例包括但不限于病毒、细菌和真菌。0049如此处所用，术语“化学治疗剂”指可以用于治疗或改善细胞增生性病症诸如肿瘤或癌症的治疗剂。化学治疗剂的实例包括但不限于抗肿瘤剂、烷基化剂、植物碱、抗微生物制剂、磺胺类药物、抗病毒制剂、铂制剂和本领域已知的其它抗癌制剂。化学治疗剂的具体实例包括但不限于顺铂、卡铂、白消安、甲氨喋呤、柔红霉素、阿霉素、环磷酰胺、美法仑(mephalan)、长春新碱、长春花碱、苯丁酸氮芥、帕尼特西、吉西他滨和本领域已知的其它化学治疗剂。(参见例如Goodman&Gilman′s，ThePharmacologicalBasisofTherapeutics(9thEd)(Goodman等eds.)(McGraw-Hill)(1996)；和1999Physician′sDeskReference(1998))。0050如此处所用，术语“凋亡”指内在的细胞自毁或自杀程序。响应于触发性刺激，细胞经历了一系列级联事件，包括细胞皱缩、细胞膜出泡以及染色质凝聚和破碎。这些事件在细胞转变为成串的被膜颗粒(凋亡小体)的过程中达到高潮，被膜颗粒随后被巨噬细胞吞噬。发明详述0051本发明涉及式(1)、(2A)和(2B)的喹诺酮化合物及其药物学上可接受的盐、酯和前体药物。本发明还涉及使用此处所述化合物的方法，诸如在筛选和治疗中的应用。本发明的化合物可以与或可以不与能够形成四联体的DNA区相互作用。0052本发明的式(1)、(2A)和(2B)化合物被再现如下其中A、B、V、X、U、Z、Z1、Z2、Z3、Z4、X2和n如上所述。0053制备本发明化合物的合成方法在方案1和实施例中阐释。本领域普通技术人员已知的合成方法的其它变化也可以用于制备本发明的化合物。例如，各种保护基团可以被用在副线1(Side-Chain1)所阐释的中间产物的制备过程中。(参见例如实施例31)。方案10054本发明的化合物可以是手性的。如此处所用，手性化合物是与其镜像不同的化合物，并具有对映体。而且，所述化合物可以是外消旋的，或者是分离的对映异构体或立体异构体。合成手性化合物以及拆分对映异构体的外消旋混合物的方法是本领域技术人员熟知的。参见例如March，“AdvancedOrganicChemistry，”JohnWileyandSons，Inc.，NewYork，(1985)，其被并入本文作为参考。0055本发明的化合物使用筛选试验诸如本文所述的那些试验来加以测试。图1-10显示了本发明的示例性化合物在HCT-116结肠直肠癌异种移植物模型中的活性。有些化合物在特定剂量下未表现出活性。0056上式化合物的说明性实例被显示在表1(A-C)和实施例中。本发明也包括具有任何一种式(1)、(2A)和(2B)的其它化合物，其包括取代基U、A、X、V和B，所述取代基独立地选自表1(A-C)和实施例中举例说明的取代基。例如，表1A中所示的最后两种化合物中的异丙基取代基可以用乙酰基取代基加以替换，或者稠合环中的N-CH3可以用NH基团加以替换。另外，氟基团可以用H来替换。因此，本发明并不限于以下各种实施方式中所述的取代基的具体组合。表1A表1B表1C0057本文所述的化合物可以与能够形成四联体的核酸区相互作用。因为能够形成四联体的DNA区是生物学进程诸如癌基因转录的调控者，所以四联体生物学活性的调节物可以被用于癌症治疗。与能够形成四联体的DNA区域相互作用的分子对某些细胞增生性病症和相关的症状可以发挥治疗作用。特别地，异常增加的癌基因表达可以引起细胞增生性病症，四联体结构通常下调癌基因的表达。癌基因的实例包括但不限于MYC、HIF、VEGF、ABL、TGF、PDGFA、MYB、SPARC、HUMTEL、HER、VAV、RET、H-RAS、EGF、SRC、BCL1、BCL2、DHFR、HMGA以及本领域技术人员已知的其它癌基因。此外，本文所述的化合物可以诱导细胞死亡(例如凋亡)并且不与能够形成四联体的DNA区相互作用。0058结合于能够形成四联体的DNA区的分子可以根据不同的机制发挥生物学作用，其包括例如稳定天然四联体结构，通过阻止链切割而抑制天然四联体向双链DNA的转化，以及稳定具有使四联体去稳定的核苷酸取代和其它序列特异性相互作用的天然四联体结构。因此，为了下调癌基因的转录并进而治疗细胞增生性病症，可以将本文所述的结合于能够形成四联体的DNA区的化合物施用于细胞、组织或生物体。0059确定能够形成四联体的天然DNA的生物学活性在细胞、组织或生物体中是否被调节，可以通过监测四联体生物学活性来完成。形成四联体的DNA区的生物学活性可以在细胞、组织或生物体中被监测，例如通过检测在将形成四联体的DNA与分子相接触时所发生的响应中基因转录的减少或增加。转录可以通过直接观察RNA转录物或者观察由转录物翻译成的多肽来加以检测，它们是本领域熟知的方法。0060与形成四联体的DNA和形成四联体的核酸相互作用的分子可以被用于治疗许多细胞增生性病症。细胞增生性病症包括，例如结肠直肠癌和造血系统肿瘤病症(hematopoieticneoplasticdisorders)(即，涉及造血起源的增生细胞/瘤细胞，诸如那些起源于骨髓系、淋巴系或红细胞系或者其前体细胞的疾病)。此类疾病可以起源于不良分化的急性白血病，例如成红细胞性白血病和急性原巨核细胞白血病。其它骨髓病包括，但不限于，急性前髓细胞白血病(APML)、急性髓性白血病(AML)和慢性髓性白血病(CML)(Vaickus，Crit.Rev.inOncol./Hemotol.11267-297(1991))。淋巴系恶性肿瘤包括，但不限于急性淋巴母细胞白血病(ALL)，其包括B-系ALL和T-系ALL、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、幼淋巴细胞白血病(PLL)、毛发细胞白血病(HLL)和瓦尔登斯特伦巨球细胞白血病(WM)。其它形式的恶性淋巴瘤包括，但不限于非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma)或其变种、外周T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、大颗粒淋巴细胞白血病(LGF)、霍奇金病和里-施病(Reed-Sternbergdisease)。细胞增生性病症还包括结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、淋巴结癌、结肠癌、前列腺癌、脑癌、头颈癌、皮肤癌、肝癌、肾癌和心脏癌。与可以形成四联体的DNA区相互作用的化合物也可以用来治疗癌症相关的过程和症状，例如通过抑制对象中的血管发生来治疗增加的血管发生。0061本发明提供了减少细胞增殖或者治疗或缓解细胞增生性病症的方法，包括使具有能够形成四联体区的天然DNA的系统与具有任何一种上式的化合物相接触。所述系统可以是一组细胞或者一种或多种组织。在一种实施方式中，所述系统是需要治疗细胞增生性病症的对象(例如，哺乳动物诸如小鼠、大鼠、猴或人)。本发明还提供了治疗结肠直肠癌的方法，其通过将与c-MYC四联体形成区相互作用的化合物施用于需要该化合物的对象从而减少结肠直肠癌细胞增殖来完成。此外，本发明提供了抑制血管发生以及任选地治疗与血管发生相关的癌症的方法，包括将与血管内皮生长因子(VEGF)四联体形成区相互作用的化合物施用于需要该化合物的对象，从而减少血管发生并任选地治疗与血管发生相关的癌症。0062与DNA的四联体形成区相互作用的化合物也可以被用于减少微生物感染，诸如病毒感染。反转录病毒为G-四联体靶向疗法提供了很多潜在靶标。G-四联体结构作为功能性元件在由HIV的病毒RNA或DNA形成的至少两种二级结构、二聚体接头结构(DLS)和中心DNA翼(centralDNAflap，CDF)中被涉及到。此外，能够采用分子间或分子内四联体结构的DNA适体能够抑制病毒复制。在一个实例中，DNA适体能够通过以包膜糖蛋白为靶标(假定地)而抑制病毒复制。在另一个实例中，DNA适体通过分别以HIV-整合酶为靶标而抑制病毒复制，这表明天然四联体结构涉及与整合酶的相互作用。0063二聚体接头结构，其对于所有反转录病毒而言是常见的，可以通过两个病毒RNA序列的两个5’末端之间的非共价相互作用，将两个拷贝的病毒基因组结合在一起。在成熟的病毒颗粒中，基因组二聚体稳定地与gag蛋白相联结。在HIV的情况下，此非共价结合的起源可以追溯到含有若干轮的至少两个连续鸟嘌呤的98碱基对序列(例如用于体外形成RNA二聚体的3’)。除了反义序列不能有效地二聚化之外，还观察到的体外二聚体形成和稳定性的阳离子(钾)依赖性揭示了最有可能的结合结构将是分子间G-四联体。0064在整合进宿主基因组之前，反转录病毒DNA与至少两种主要病毒蛋白、整合酶和反转录酶形成整合前复合体(pre-integrationcomplex，PIC)，其随后被转运进细胞核。中心DNA翼(CDF)是指+链的99碱基长的单链尾，其存在于病毒双链DNA的中心附近，已知其在PIC输入细胞核的过程中发挥作用。已表明CDF的寡核苷酸模拟物可以在无细胞系统中形成分子间G-四联体结构。0065因此，识别四联体形成区的化合物可以被用于稳定二聚体接头结构，从而防止两个RNA链的解偶联。而且，通过结合于由CDF形成的四联体结构，可以中断用于PIC的细胞核转运的蛋白质识别和/或结合事件。在任一情况下，都可以存在着超越其它抗病毒疗法的实质性优点。目前的高活性抗反转录病毒治疗(HAART)方案依赖于组合使用以HIV蛋白酶和HIV整合酶为靶标的药物。多药物方案的要求是要使耐药性的出现最小化，所述耐药性在单独使用药剂时通常将会快速提高。这样的快速耐药性的根源在于反转录酶的失真，其在每10,000个碱基对出现大约一次突变。以病毒四联体结构作为靶标相对于蛋白质靶标的一个优势是耐药性的发展缓慢或者不可能产生耐药性。靶标四联体的点突变可能危及四联体结构的完整性并导致病毒的非功能性拷贝。基于此概念的单一治疗剂可以替代目前应用的多药物方案，伴随的好处是降低了成本并消除了有害的药物/药物相互作用。0066本发明提供了减少系统中微生物滴度的方法，包括使含有天然的DNA四联体形成区的系统与具有任何一种上式的化合物相接触。该系统可以是一种或多种细胞或组织。微生物滴度的实例包括但不限于病毒滴度、细菌滴度和真菌滴度。在一个具体实施方式中，所述系统是需要治疗病毒感染的对象(例如，哺乳动物诸如小鼠、大鼠、猴或人)。病毒感染的实例包括由肝炎病毒(例如乙型肝炎或丙型肝炎)、人免疫缺陷病毒(HIV)、鼻病毒、带状疱疹病毒(VZV)、单纯疱疹病毒(例如HSV-1或HSV-2)、细胞肥大病毒(CMV)、牛痘病毒、流感病毒、脑炎病毒、汉坦病毒(hantavirus)、虫媒病毒、西尼罗河病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、E-B病毒(Epstein-Barrvirus)和呼吸道合胞病毒引起的感染。本发明还提供了治疗HIV感染的方法，其通过将具有任何一种上式的化合物施用于需要此化合物的对象从而减少HIV感染来实施。鉴定可结合于DNA的四联体形成区的化合物0067本文描述的化合物可以结合于DNA的四联体形成区域，其中此区域在含有所述化合物的系统中产生的生物学活性，其通常表示为“信号”，不同于在不含所述化合物的系统中产生的信号。尽管在每次通过试验来探测新分子时，可以评价背景信号，但不是必须在每次测试新分子时，对背景信号进行检测。0068形成四联体的核苷酸序列的实例在下面表2中阐明0069除了测定测试分子或测试核酸是否产生不同的信号外，还可以量化核酸与化合物之间相互作用的亲和力。可以将IC50、Kd或Ki阈值与测得的每种相互作用的IC50或Kd值进行比较，从而鉴定出作为与四联体相互作用的分子的测试分子或者作为形成四联体的核酸的测试核酸。例如，10μM或更小、1μM或更小和100nM或更小的IC50或Kd阈值常常被使用。在另个一实例中，可以使用10nM或更小、1nM或更小、100pM或更小以及10pM或更小的阈值来鉴定与四联体相互作用的分子和形成四联体的核酸。0070许多试验可以用来鉴定对DNA的四联体形成区具有亲和力的化合物。在此类试验的一些中，生物学活性是四联体核酸结合到化合物，并将该结合作用作为信号加以测量。在其它试验中，生物学活性是四联体的中止聚合酶的功能，并以信号的减少来量度约束的程度。在某些试验中，生物学活性是转录，转录水平可以作为信号加以量化。在另一试验中，生物学活性是细胞死亡，对发生细胞死亡的细胞数进行量化。另一种试验监测的是癌细胞的增殖速度。试验的实例为荧光结合试验、凝胶迁移率变动试验(参见例如Jin&Pike，Mol.Endocrinol.(1996)10196-205)、聚合酶中止(polymerasearrest)试验、转录报告试验、癌细胞增殖试验和凋亡试验(参见例如AmershamBiosciences(Piscataway，NewJersey))，此类试验的实施方式在下文被描述。此外，拓扑异构酶试验可以被用于确定与四联体相互作用的分子是否具有拓扑异构酶通路活性(参见例如TopoGEN，Inc.(Columbus，Ohio))。凝胶电泳迁移率变动试验(EMSA)0071EMSA可用于确定核酸是否形成四联体以及核苷酸序列是否是四联体去稳定性的。作少量改动后，进行以前描述的EMSA(Jin&Pike，Mol.Endocrinol.10196-205(1996))。一般地，在存在[γ-32P]ATP(1,000mCi/mmol，AmershamLifeScience)的情况下，在5′末端用T4-激酶标记合成的单链寡核苷酸，并通过葡聚糖凝胶(sephadex)柱加以纯化。然后将32P-标记的寡核苷酸(～30,000cpm)在存在或者不存在各种浓度的测试化合物的情况下在20μl缓冲液温育，所述缓冲液含有10mMTrispH7.5、100mMKCl、5mM二硫苏糖醇、0.1mMEDTA、5mMMgCl2、10％甘油、0.05％NoneditP-40和0.1mg/ml聚(dI-dC)(Pharmacia)。室温下温育20分钟后，将结合反应物上样于0.25xTris硼酸-EDTA缓冲液(0.25xTBE，1xTBE，89mMTris-硼酸，pH8.0，1mMEDTA)中的5％聚丙烯酰胺凝胶上。将凝胶干燥并用磷光影像分析仪对每一条带定量。DMS甲基化作用保护试验0072化学足印试验可以用来评价四联体结构。通过确定核酸中的哪些核苷酸由于相对于修饰试剂为不可及或者可及而分别受到保护免遭化学修饰作用或者未受保护，对四联体结构加以评价。DMS甲基化作用试验是化学足印试验的一个实例。在此试验中，将来自EMSA的条带分离并使其经受DMS诱发的链断裂。将每条感兴趣的条带从电泳迁移率变动凝胶上切下并将其在4℃在100mMKCl溶液(300μl)中浸泡6小时。将溶液过滤(微量离心)并将30,000cpm(每个反应)的DNA溶液进一步用含100mMKCl的0.1XTE稀释至总体积70μl(每个反应)。加入1μl鲑精DNA(0.1μg/μl)后，将反应混合物与1μlDMS溶液(DMS∶乙醇；4∶1；v∶v)温育一段时间。每一反应用18μl终止缓冲液(b-巯基乙醇∶水∶NaOAc(3M)；1∶6∶7；v∶v∶v)淬灭。经乙醇沉淀(两次)和哌啶割裂后，将反应在制备型凝胶(16％)上分离并在磷光图像分析仪上观察。聚合酶中止试验0073中止试验包括可能包含形成四联体的序列的模板核酸，以及与形成四联体的序列的5’端的模板核酸杂交的引物核酸。该引物通过聚合酶(例如Taq聚合酶)被延伸，所述聚合酶从引物起沿模板核酸前进。在此试验中，四联体结构可以阻止或中止该酶的前进，导致较短的转录片段。同样地，中止试验可以在各种温度，包括45℃和60℃，以及各种离子浓度下进行。0074Taq聚合酶中止试验的实例在Han，etal.，Nucl.AcidsRes.(1999)27537-542中被描述，该试验是Weitzmann，etal.，J.Biol.Chem.(1996)27120958-20964所用的试验的改进。简言之，将模板DNA(50nM)、Tris·HCl(50mM)、MgCl2(10mM)、DTT(0.5mM)、EDTA(0.1mM)、BSA(60ng)和5′末端标记的四联体核酸(～18nM)的反应混合物加热至90℃5分钟，并将其在30分钟内冷却至室温。将Taq聚合酶(1μl)加入反应混合物中，并将反应在恒定温度下保持30分钟。加入10μl终止缓冲液(甲酰胺(20ml)、1MNaOH(200μl)、0.5MEDTA(400μl)和10mg溴酚蓝)后，将反应在制备型凝胶(12％)上分离并在磷光图像分析仪上观察。使用来自LifeTechnologies的双链DNA循环测序系统进行腺嘌呤测序(在凝胶顶部用“A”标示)。模板链的通用序列为TCCAACTATGTATAC-插入物-TTAGCGACACGCAATTGCTATAGTGAGTCGTATTA，其中“插入物”指包含形成四联体的序列的核酸序列(参见例如表2)。凝胶上表现出较低迁移率的条带是四联体形成的标志。高通量聚合酶中止试验0075已经开发出了高通量聚合酶中止试验。该试验包括将通常为DNA的模板核酸与通常也为DNA的引物相接触；将引物/模板复合物与本文所述的化合物(也被称为“测试化合物”)相接触；将引物/模板复合物与聚合酶相接触；并分离反应产物。该试验通常包括将引物/模板复合物混合物变性然后将此复合物复性的步骤，其通常在向此体系中加入测试分子之前进行。通常使用各种浓度的测试化合物来进行多重试验，由此例如可以得到IC50值。反应产物通常包括不同长度的延伸引物。在测试化合物不与模板中的四联体结构发生明显的相互作用的情况下，引物通常延伸至模板末端。0076当测试化合物与模板中的四联体结构发生明显的相互作用时，引物通常仅延伸至模板中的四联体结构而不再进一步延伸。因此，当测试化合物与模板中的四联体结构相互作用时，反应混合物通常包括至少两种反应产物，一种具有完全延伸的引物，一种具有不完全延伸的引物，将这两种反应产物分离。可以使用任何简便的分离方法分离产物，诸如质谱术，在一种实施方式中，是毛细管电泳。0077通常通过检测连接于引物的可检测标记来鉴定反应产物。可检测标记可以被非共价地连接于引物的5’端(例如共价连接于引物的5’末端的生物素分子，其非共价地连接于连接有可检测标记的亲和素分子)。可检测的标记可以在试验的任何阶段连接到引物中，有时候在将引物加入体系之前，在引物延伸以后，或者在将产物分离之后。通常使用根据可检测标记中化学基团的性质所选择的方法，将可检测的标记共价地连接于引物。0078用于将可检测标记共价连接于核酸的许多方法都是可用的，诸如将烯丙基胺衍生化的核苷酸化学偶联于可检测标记的琥珀酰亚胺基-酯衍生物，然后用标记的核苷酸生成引物。(参见例如NatureBiotech(2000)18345-348以及http地址info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/n_coupling.html)。有时将间隔子(通常为5-16个碳原子长)整入可检测标记和核苷酸之间。可以使用任何方便的可检测标记，包括但不限于放射性同位素(例如125I、131I、35S、32P、14C或3H)；光散射标记(例如球形金或银标记；GeniconSciencesCorporation，SanDiego，CA以及美国专利号6,214,560)；酶或蛋白标记(例如GFP或过氧化物酶)；或者有时使用另一种生色团标记或染料。通常，使用荧光标记(例如氨基-甲基香豆素(AMCA)；二乙基氨基甲基香豆素(DEAC)；瀑布蓝(cascadeblue，CB)；异硫氰酸荧光素(FITC)；Oregon绿(OG)；Alexa488(A488)；罗丹明绿(RGr)；镧系螯合物(例如铕)、羧基罗丹明6G(R6G)；四甲基罗丹明(TAMRA)；德克萨斯红(TxR)；Cy3；Cy3.5；Cy5，Cy5.5和羧基萘酚荧光素(CNF)，地高辛(DIG)和2，4-二硝基苯(DNP))。其它荧光团以及所具有的激发和发射波长在Anantha等，Biochemistry(1998)372709-2714和Qu&Chaires，MethodsEnzymol(2000)321353-369中有描述。0079在一种实施方式中，共价连接于荧光标记的引物寡核苷酸与模板DNA接触。所形成的复合物与测试分子相接触，然后与能够延伸引物的聚合酶接触。随后通过毛细管电泳分离并检测反应产物。与引物不包括共价连接的荧光团的实施方式或者不使用毛细管电泳进行分离的实施方式相比，更长的引物序列被用来完成此实施方式。在分离之前的试验任何阶段，通常是在引物与模板DNA相接触时，加入脱氧核苷酸。通常将模板DNA/引物复合物变性(例如通过提高体系的温度)，然后复性(例如通过冷却该体系)，再加入测试化合物。四联体结合试验0080一般地，将5’-荧光标记(FAM)的引物(P45，15nM)与模板DNA(15nM)在Tris-HCL缓冲液(15mMTris，pH7.5)中混合，所述缓冲液含有10mMMgCl2、0.1mMEDTA和0.1mM混合脱氧核苷三磷酸(dNTP’s)。在一个实例中，合成FAM-P45引物(5’-6FAM-AGTCTGACTGACTGTACGTAGCTAATACGACTCACTATAGCAATT-3’)(SEQIDNO.17)和c-Myc模板DNA(5’-TCCAACTATGTATACTGGGGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAAGGTTAGCGACACGCAATTGCTATAGTGAGTCGTATTAGCTACGTACAGTCAGTCAGACT-3’)(SEQIDNO.18)并用AppliedBiosystems进行HPLC纯化。将混合物在95℃变性5分钟，冷却至室温后，在37℃温育15分钟。0081待冷却至室温后，加入1mMKCl2和测试化合物(各种浓度)，将混合物在室温下温育15分钟。通过加入10mMKCl和TaqDNA聚合酶(2.5U/反应，Promega)进行引物延伸并在70℃温育30分钟。通过将1μl反应混合物加入到10μlHi-Di甲酰胺混合物和0.25μlLIZ120大小标准中来终止反应。Hi-Di甲酰胺和LIZ120大小标准购自AppliedBiosystems。部分延伸的四联体中止产物为61或62个碱基长，全长延伸产物为99个碱基长。用毛细管电泳分离并分析产物。使用ABIPRISM3100-AvantGeneticAnalyzer进行毛细管电泳。用上述化合物进行试验，结果显示在表1中。表1中报告的μM浓度是在试验中50％的DNA被中止(即较短的部分延伸的DNA(终止DNA)与全长延伸的DNA之比为1∶1)时的浓度。转录报告试验0082在转录报告试验中，测试四联体DNA与报告系统相连，由此四联体结构的形成或稳定可以调节报告信号。此类系统的一个实例为报告物表达系统，其中多肽诸如萤光素酶或绿色荧光蛋白(GFP)由可操纵地连接于潜在的四联体形成核酸的基因表达，并且该多肽的表达可以被检测。如此处所用的，术语“可操纵地连接”指由包含潜在的四联体形成核酸的序列调节的核苷酸序列。当序列位于与所述四联体DNA相同的核酸或者不同的核酸上时，该序列可以是可操纵地连接的。一种示例性的萤光素酶报告系统在此处被描述。0083He等，Science(1998)2811509-1512所述的萤光素酶启动子试验常常被用于研究四联体的形成。具体而言，本试验中所用的载体在He等的文件的参考文献11中阐明。在此试验中，根据制造商的方案，使用基于lipofectamin2000的体系(Invitrogen)转染HeLa细胞，其中使用了0.1μgpRL-TK(水母萤光素酶报告质粒)和0.9μg四联体形成质粒。按照制造商的方案，使用双重萤光素酶报告试验系统(Promega)以96孔板形式分析萤火虫萤光素酶和水母萤光素酶的活性。圆二色性试验0084圆二色性(CD)被用来确定是否有另一种分子与四联体核酸相互作用。CD对于确定PNA或PNA-肽共轭物是否在体外与四联体核酸杂交是特别有用的。在37℃，将PNA探针加入含四联体DNA(每种5μM)的缓冲液中，该缓冲液含有10mM磷酸钾(pH7.2)和10或250mMKCl，然后在记录光谱前，将其在相同温度下静置5分钟。CD光谱在配有热电耦控制单腔容器的JascoJ-715分光偏振计上被记录。通常在220nm和320nm之间检测CD强度，并生成单独的四联体DNA、单独的PNA和带有PNA的四联体DNA的比较光谱以确定相互作用的存在或不存在(参见例如Datta等，JACS(2001)1239612-9619)。光谱被设置为表示以100nm/分钟记录的八次扫描的平均值。荧光结合试验0085荧光结合试验的实例是包括四联体核酸、信号分子和测试分子的体系。当信号分子结合于四联体核酸时，其产生荧光信号(例如N-甲基间卟啉IX(N-methylmesoporphyrinIX，NMM))，并且当测试化合物与信号分子竞争结合于四联体核酸时，该信号发生变化。与测试化合物不存在的时候相比，测试分子存在时的信号变化将测试化合物鉴定为与四联体相互作用的化合物。008650μl的四联体核酸或者不能形成四联体的核酸被加入96孔板。还加入不同浓度的测试化合物。在100μl的20mMHEPES缓冲液，pH7.0，140mMNaCl和100mMKCl中进行典型的试验。然后加入50μl信号分子NMM至终浓度3μM。NMM从FrontierScientificInc，Logan，Utah获得。用FluroStar2000荧光计(BMGLabtechnologies，Durham，NC)在420nm的激发波长和660nm的发射波长测量荧光。将荧光作为测试化合物浓度或者四联体靶标核酸浓度的函数来作图，并在不存在这些分子的情况下评估NMM的最大荧光信号。细胞增殖试验0087在癌细胞增殖试验中，将细胞增殖速度作为加入到细胞培养基中的不同浓度的测试化合物的函数加以评估。本试验中可以使用任何癌细胞类型。在一个实施方式中，体外培养结肠癌细胞，并将测试化合物以各种浓度加入到培养基中。有用的结肠癌细胞系为colo320，其为保藏于国家健康研究院(NationalInstitutesofHealth)的结肠腺癌细胞系，登记号为JCRB0225。使用此类细胞的参数可在http地址cellbank.nihs.go.jp/cell/data/jcrb0225.htm获得。化合物的配制0088如本文所用，术语“药物学上可接受的盐、酯和酰胺”包括但不限于所述化合物的羧酸盐、氨基酸加成盐、酯和酰胺以及它们的两性离子形式，本领域技术人员已知它们适用于人类和动物。(参见例如Gerge，S.M等“PharmaceuticalSalts，”J.Pharm.Sci.(1977)661-19，在此将其并入本文作为参考。)0089可以制备本文所述化合物的任何合适的制剂。在化合物为足够碱性或足够酸性而可以形成稳定的非毒性酸性盐或碱性盐的情况下，将化合物以盐的形式施用可以是合适的。药物学上可接受的盐的实例为有机酸加成盐，其由形成生理学上可接受的阴离子的酸形成，例如甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐和α-甘油磷酸盐。也可以形成合适的无机盐，包括盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐和碳酸盐。使用本领域熟知的标准方法获得药物学上可接受的盐。例如，可以通过将足够碱性的化合物诸如胺与提供生理上可接受的阴离子的合适的酸反应而获得药物学上可接受的盐。也制备了羧酸的碱金属(例如钠、钾或锂)或碱土金属(例如钙)盐。0090可以将化合物配制为药物组合物并施用于需要此类治疗的哺乳动物接受体。在一种实施方式中，哺乳动物接受体是人类。可以使用任何合适的给药途径，包括但不限于经口的、胃肠外的、静脉内的、肌内的、局部的和皮下的途径。0091在一种实施方式中，将化合物与制药上可接受的载体诸如惰性稀释剂或者可同化的可食用载体组合进行全身性施用(例如口服)。它们可以被封装在硬壳或软壳明胶胶囊中，被压缩成片剂，或者直接与患者饮食中的食物混合。对于经口治疗给药而言，可以将活性化合物与一种或多种赋形剂组合，并以可消化的片剂、口腔片剂(buccaltablets)、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、包药干糊片(wafers)及类似的形式使用。此类组合物和制剂应当包含至少0.1％的活性化合物。所述组合物和制剂的百分比可以变化，可以方便地为给定的单位剂量形式的重量的大约2％至大约60％之间。此类治疗上有用的组合物中的活性化合物的量使得将会获得有效的剂量水平。0092片剂、锭剂、丸剂、胶囊以及类似物还可以包含以下成分可以加入粘结剂诸如黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂诸如磷酸二钙；崩解剂诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸和类似物；润滑剂诸如硬脂酸镁；和甜味剂诸如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜(aspartame)或者调味剂诸如胡椒薄荷、冬青油或浆果调味料。当单位剂量形式为胶囊时，除以上类型的物质外，它还可以包含液体载体诸如植物油或聚乙二醇。各种其它物质可以作为包衣存在或者以其它方式修饰该固体单位剂量形式的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用明胶、蜡、虫胶或糖及类似物包被。糖浆或酏剂可以含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖或果糖、作为防腐剂的对羟苯甲酸甲酯和对羟苯甲酸丙酯、颜料和调味剂诸如浆果调味料和柑橘调味料。用于制备任何单位剂量形式的任何物质都是制药上可接受的，并且在所应用的量内基本上是非毒性的。此外，可以将活性化合物整合入持续释放制剂和装置中。0093活性化合物也可以通过输注或注射在静脉内或者腹膜内来施用。活性化合物或者其盐的溶液可以在缓冲溶液中制备，通常为磷酸缓冲盐溶液，任选地与非毒性表面活性剂混合。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇、乙酸甘油酯和它们的混合物以及在油中制备。在普通的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。有时化合物被制成用于此类施用的含有聚基质(polymatrix-containing)的制剂(例如脂质体或微粒体)。脂质体在例如美国专利号5,703,055(Felgner等)和Gregoriadis，LiposomeTechnology，卷I至III(2nded.1993)中被描述。0094适合于注射或输注的药物剂量形式可以包括含有活性成分的无菌水溶液或分散体或者无菌粉剂，所述活性成分适合于临时制备无菌可注射或可输注的溶液或分散体，并且任选地包封于脂质体中。在所有情况下，最终的剂量形式在生产和储存条件下应当是无菌的、流动的和稳定的。液体载体(carrier)或载剂(vehicle)可以是溶剂或者液体分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、液体聚乙二醇及类似物)、植物油、非毒性甘油酯以及它们的合适的混合物。可以例如通过形成脂质体，通过在分散体的情形中保持颗粒的大小或者通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞撒(thimerosal)及类似物来防止微生物的作用。在许多情况下，将优选地包括等渗剂，例如糖、缓冲剂或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶中来达到可注射组合物的延长吸收。0095通过将所需量的活性化合物与以上列举的需要的各种其它组分并入适当的溶剂中，然后过滤灭菌，制备出无菌的可注射溶液。在用于制备无菌的可注射溶液的无菌粉末的情形中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其生产出活性成分的粉末以及存在于前述过滤灭菌溶液中的任何其它所需成分。0096对于局部施用，本发明化合物可以以液体形式被应用。化合物通常作为组合物或制剂，与可以是固体或液体的皮肤病学上可接受的载体相组合而被施用。用于向皮肤传递化合物的有用的皮肤病学组合物的实例是已知的(参见例如Jacquet等(美国专利号4,608,392)、Geria(美国专利号4,992,478)、Smith等(美国专利号4,559,157)和Wortzman(美国专利号4,820,508)。0097化合物可以与固体载体一起配制，所述固体载体包括精细分割的固体诸如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝及类似物。有用的液体载体包括水、酒精或乙二醇或者水-酒精/乙二醇混合物，本发明化合物可以以有效水平，任选地在非毒性表面活性剂的帮助下，溶解或分散于其中。可以加入佐剂诸如芳香物质以及其它抗微生物剂以优化用于特定用途的特性。所形成的液体组合物可以由吸收垫被应用，被用于浸透绷带和其它敷料，或者用泵式或气溶胶式喷雾器喷洒在起作用的区域。增稠剂诸如合成的聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性矿物质也可以与液体载体一起使用，从而形成可涂布的糊、凝胶、软膏、皂体及类似物，用于直接应用于使用者的皮肤。0098一般地，液体组合物中化合物的浓度通常为大约0.1wt％至大约25wt％，有时为大约0.5wt％至大约10wt％。半固体或固体组合物诸如凝胶或粉末中的浓度通常为大约0.1wt％至大约5wt％，有时为大约0.5wt％至大约2.5wt％。化合物组合物可以被制备成单位剂量形式，其根据制药工业中已知的常规技术来制备。概括而言，此类技术包括将化合物混入液体形式或精细分割固体形式或两种形式的药物载体(一种或多种)和/或赋形剂(一种或多种)中，然后根据需要将产品加工成形。0099表3显示了用于本文所述的化合物的制剂的实例。例如，化合物可以使用此处的配方被配制成具有10mg/mL至20mg/mL剂量的溶液。在表3中，名称“D5W”是指含5％葡萄糖的去离子水。每个配方中的每一组分都可以在不影响化合物活性的条件下被改变。在一个实例中，化合物是在包含聚乙二醇和丙二醇的溶液中配制的，所述聚乙二醇和丙二醇在缓冲溶液诸如磷酸盐缓冲液中。表30100化合物组合物可以被配制成任何剂量形式，诸如片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。组合物也可以被配制为含水的、非含水的或混合介质的悬浮液。含水悬浮液可以进一步包含增加粘性的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬浮液也可以包含一种或多种稳定剂。用于治疗所需的化合物或者其活性盐或衍生物的量将不仅随所选的具体盐而且随给药途径、所治疗疾病的属性以及患者的年龄和状况而变化，并最终以现场的内科医生或临床医生的判断为准。剂量0101有用的化合物剂量通常是通过评价它在细胞或组织系统中的体外活性和/或在动物系统中的体内活性来加以确定。例如，由小鼠或其它动物中的有效剂量来推断至人类的方法是本领域已知的(参见例如美国专利号4,938,949)。这样的系统可以被用于确定化合物的LD50(50％群体致死的剂量)和ED50(50％群体得以有效治疗的剂量)。毒性和治疗作用之间的剂量比率为治疗指数，其可以被表示为比率ED50/LD50。化合物的剂量通常在一定范围的循环浓度内，对于此浓度范围而言，ED50与毒性几乎无关或完全无关。根据所使用的剂型以及所应用的给药途径，剂量可以在此范围内变化。对于本文所述方法中使用的任何化合物，可以由细胞培养试验初步估计治疗有效剂量。有时，剂量被配制以获得这样的循环血浆浓度范围，该范围涵盖了如在体外试验中所确定的IC50(即测试化合物在实现半数最大症状抑制作用时的浓度)，此类信息通常被用来更加精确地确定在人类中的有用剂量。血浆中的水平可以通过例如高效液相色谱来加以测量。0102确定对于某对象的有效剂量的另一个实例是直接分析在测试对象的血清中“游离”化合物和“结合”化合物的水平的能力。此类试验可以利用抗体模拟物和/或通过分子印记技术(molecularimprintingtechniques)生成的“生物传感器”。化合物被用作模板或“印记分子”，在可聚合的单体通过催化剂进行聚合作用之前，将它们在空间上进行组织。随后去除印记分子，留下聚合物基质，其含有该化合物的重复的“负影像”并且能够有选择地在生物学试验条件下重新结合该分子(参见例如Ansell等，CurrentOpinioninBiotechnology(1996)789-94和Shea，TrendsinPolymerScience(1994)2166-173)。0103这样的“加以印记的”亲和性基质能够胜任配体结合试验，由此，固定化的单克隆抗体组分被适当印记的基质替代(参见例如Vlatakis等，Nature(1993)361645-647)。通过使用同位素标记，“游离”化合物的浓度可以被容易地被监测并用于计算IC50。这样的“加以印记的”亲和性基质也可以被设计成包含荧光基团，其光子发射特性在局部和选择性地结合于化合物时发生可测量的变化。这些变化可以容易地用适当的光纤设备进行实时分析，这继而又使测试对象的剂量能够基于其个体的IC50而被迅速最优化。此类“生物传感器”的实例在Kriz等，AnalyticalChemistry(1995)672142-2144中被讨论。0104示例性的剂量包括每千克对象重量或样品重量中毫克量或微克量的化合物，例如，每千克大约1微克至每千克大约500毫克，每千克大约100微克至每千克大约5毫克，或者每千克大约1微克至每千克大约50微克。应当理解，小分子的合适剂量取决于该小分子相对于将被调节的表达或活性的效价。当一种或多种这些小分子将被施用于动物(例如人)以便如本文所述调节多肽或核酸的表达或活性时，医生、兽医师或研究者可以，例如，先开出相对低剂量的处方，随后增加剂量直至获得适当的反应。此外，应当理解，对于任何具体的动物对象而言，具体的剂量水平将决定于各种因素，包括所应用的具体化合物的活性、对象的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食、给药的时间、给药的途径、排药速率、任合药物组合，以及将被调节的表达或活性的程度。0105提供下列实施例是为了举例说明而并非限制本发明。实施例0106向含氯化镁(6.74g，70.8mmol)和丙二酸乙酯钾(6.78g，39.8mmol)的0℃无水乙腈(100mL)中滴加2，4-二氯-5-氟苯甲酰氯(5.0g，22.1mmol)，并保持内部温度为5℃以下。将此混合物额外搅拌30分钟并滴加三乙胺(6.1mL，44.25mmol)，再次保持温度为5℃以下并将反应混合物搅拌过夜。将混合物真空浓缩，用甲苯(250mL)稀释并加入1NHCl(100mL)，将此混合物搅拌30分钟。分离出层，将有机层再用1NHCl(100mL)和盐水(200mL)洗涤一次，并在硫酸钠上干燥。然后将有机层过滤，真空浓缩并用硅胶纯化(1∶10乙酸乙酯/己烷)，从而得到静置后固化的油质酮酸酯(5.02g，81％)。0107向此酮酸酯(5.0g，18mmol)的二甘醇二甲醚溶液(50mL)中加入2-氯苯并噻唑(3.66g，21.6mmol)，随后在10分钟内分批加入氢化钠(1.52g，39.6mmol，60％的油溶液)。将反应加热至160℃24小时，并将其冷却至室温。通过小心加入水(250mL)将混合物淬灭，将所形成的棕色沉淀通过过滤移走并用水洗涤。然后将产物溶解于二氯甲烷(300mL)，用盐水洗涤并经C盐过滤。将所得的有机层在硫酸钠上干燥，过滤并真空浓缩。将产物用硅胶纯化(含7％乙酸乙酯的己烷)，从而得到一种固体环化物质(1.76g，26％)。实施例20108向含氯酯(250mg，0.66mmol)的N-甲基吡咯烷酮(NMP，2mL)溶液中加入2-吡嗪乙硫醇(81μL，0.66mmol)和碳酸钾(182mg，1.32mmol)，并将混合物加热至100℃2小时。将混合物冷却至室温，加入水(50mL)，继续搅拌过夜。过滤收集粗制产物并用制备型TLC纯化(含2％甲醇的二氯甲烷)，从而得到为棕褐色绒毛状固体的纯产物(122mg，38％)。实施例0109向酮酸酯(2.0g，7.2mmol)的二甘醇二甲醚溶液(20mL)中加入2，6-二氯苯并噻唑(1.76g，8.63mmol)，随后在10分钟内分批加入氢化钠(0.63g，15.8mmol，60％的油溶液)。将反应加热至160℃24小时，并将其冷却至室温。通过小心加入水(200mL)将混合物淬灭，并将所形成的棕色沉淀通过过滤移走并用水洗涤。然后将产物溶解于二氯甲烷(30mL)，用盐水洗涤并经C盐过滤。将所得的有机层在硫酸钠上干燥，过滤并真空浓缩。将产物用硅胶纯化(含5％乙酸乙酯的己烷)，从而得到一种固体环化物质(0.55g，18.8％)。实施例0110向含氯酯(250mg，0.61mmol)的N-甲基吡咯烷酮(NMP，2mL)溶液中加入2-吡嗪乙硫醇(75μL，0.61mmol)和碳酸钾(170mg，1.2mmol)，并将混合物加热至100℃2小时。将混合物冷却至室温，并加入水(50mL)，继续搅拌过夜。过滤收集粗制产物并用制备型TLC纯化(含2％甲醇的二氯甲烷)，从而得到棕褐色绒毛状固体的纯产物(125mg，40％)。实施例0111向酮酸酯(2.0g，7.2mmol)的二甘醇二甲醚溶液(20mL)中加入2-氯-6-甲氧基苯并噻唑(1.73g，8.63mmol)，随后在10分钟内分批加入氢化钠(0.63g，15.8mmol，60％的油溶液)。将反应加热至160℃24小时，并将其冷却至室温。通过小心加入水(200mL)将混合物淬灭，并将所形成的棕色沉淀过滤分离并用水洗涤。然后将产物溶解于二氯甲烷(30mL)，用盐水洗涤并经C盐过滤。将所得的有机层在硫酸钠上干燥，过滤并真空浓缩。将产物用硅胶纯化(含5％乙酸乙酯的己烷)，从而得到一种固体环化物质(0.23g，7.6％)。实施例0112向含氯酯(220mg，0.54mmol)的N-甲基吡咯烷酮(NMP，2mL)溶液中加入2-吡嗪乙硫醇(66μL，0.54mmol)和碳酸钾(150mg，1.1mmol)，并将混合物加热至100℃2小时。将混合物冷却至室温，并加入水(50mL)，继续搅拌过夜。过滤收集粗制产物并用制备型TLC纯化(含2％甲醇的二氯甲烷)，从而得到为棕褐色绒毛状固体的纯产物(75mg，28％)。实施例70113向含氯酯(0.25g，0.67mmol)的冰乙酸(5mL)悬浮液中加入甲酸铵(0.6g，4.0mmol)，并用氩气将混合物脱气2分钟。然后，加入木炭载铂(10％degussa型，0.6g)并将混合物加热至60℃1小时。加入更多甲酸铵(0.1g)和催化剂(0.1g)并继续加热过夜。最后，加入更多甲酸铵和催化剂(各150mg)并继续加热1.5小时。将混合物冷却至室温并用C盐过滤，真空除去溶剂并用二氯甲烷(100mL)代替。将有机相用水(100mL)和盐水(100mL)洗涤并在硫酸钠上干燥。真空除去溶剂，从而得到为棕褐色固体的苯并噻唑(153mg，67％)。实施例80114向含氟酯(50mg，0.15mmol)的N-甲基吡咯烷酮(NMP，0.5mL)溶液中加入2-吡嗪乙硫醇(126μL，1.0mmol)和碳酸钾(40mg，0.3mmol)，并将混合物加热至100℃2小时。将混合物冷却至室温，并加入水(50mL)，继续搅拌过夜。过滤收集粗制产物并用制备型TLC纯化(含2％甲醇的二氯甲烷)，从而得到为棕褐色绒毛状固体的纯产物(17mg，25％)。实施例90115将化合物1(1.0当量，399mg，1.06mmol)和1-异丙基哌嗪2(5.0当量，0.76ml，5.31mmol)溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP，5ml)。将所形成的混合物在120℃搅拌3天。LC监测表明形成了等量的两种主要产物3和4。将溶液倒入水中并过滤分离所产生的沉淀。通过SiO2急骤色谱分离两种化合物(梯度为含0.5％到7％MeOH的CH2Cl2)，从而得到3(135mg，27％收率)和4(135mg，26％)。01163Rf＝0.40(SiO2，含5％MeOH的CH2Cl2)，LCMS(ES)纯度95％，m/z468[M+H]+。01174Rf＝0.26(SiO2，含5％MeOH的CH2Cl2)，LCMS(ES)纯度95％，m/z484[M]+，486[M+2]+。实施例100118本实施例提供了两种具体化合物的活性数据四联体结合亲和力Km5.5uM肿瘤细胞平均时间存活(MeanTimeSurvival)(IC50)(Alamar蓝染色)Hela2.8uMPC32.7uMHCT-1161.1uM四联体结合亲和力Km4.5uM肿瘤细胞平均时间存活(IC50)(Alamar蓝染色)Hela2.7uMPC30.52uMHCT-1160.57uM实施例10119在配有氮气插入管的三颈瓶中，将丙二酸乙酯钾(1.5当量，32.8g，0.192mol)和MgCl2(1.5当量，18.4g，0.193mol)在机械搅拌状态下悬浮于乙腈(120ml)中。用冰浴冷却此悬浮液。滴加入2，4，5-三氟苯甲酰氯(1.0当量，25g，0.128mol)的乙腈溶液(60ml)。在30分钟内加入三乙胺(2.0当量，36ml，0.258mol)的乙腈溶液(50ml)，同时通过用冰盐混合物进行外部冷却来保持内部温度10℃以下。将所形成的非常浓稠的浆液加热至室温。加入额外量的乙腈(150ml)而使该浆液能够适当的搅拌。将反应搅拌2天并真空去除挥发物。加入10％的盐酸水溶液和EtOAc，并将混合物搅拌3小时。用EtOAc萃取该物质(3x)。将合并后的萃取物用盐水洗涤，并在Na2SO4上干燥。溶剂真空挥发后，将该物质在10％水/EtOH混合物中重结晶以提供化合物1，一种白色晶体物质(17.8g，56％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z269[M+23]+。两种互变异构体的混合物。0120将化合物1(1.0当量，3.27g，13.29mmol)溶解于无水DMF(30ml)中。将此溶液用冰冷却，加入K2CO3(3.0当量，5.51g，39.87mmol)并将溶液搅拌15分钟。向所形成的白色浆液中快速加入二硫化碳(1.5当量，1.20ml，19.86mmol)，并将混合物在0℃搅拌5分钟。经注射器滴加甲基碘(3.0当量，2.5ml，40.2mmol)，并在0℃将反应搅拌2小时。加入冰水后，用EtOAc萃取化合物(3x)。将合并的萃取物用水(1x)和盐水(2x)洗涤，在Na2SO4上干燥并真空去除挥发物。当加入己烷和少量EtOAc后，化合物开始结晶。过滤分离粗制物质并在己烷中重结晶，从而得到白色结晶固体(3.27g，70％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z373[M+23]+，351[M+1]+。0121将3-氧代-3-(2，3，4，5-四氟苯基)丙酸乙酯(1.0当量，5.77g，21.84mmol)溶解于DMSO(55ml)与水(12ml)的混合物中。滴加KOH(2.3当量，2.82g，50.26mmol)的水溶液(25ml)，同时使用冰浴保持内部温度在15℃以下。搅拌15分钟后，迅速加入二硫化碳(3.2当量，4.2ml，69.50mmol)和碘甲烷(3.8当量，5.2ml，83.35mmol)的混合物，并在室温下将形成的混合物搅拌过夜。加入水后，用EtOAc萃取该物质(2x)。将合并的萃取物用水洗涤，在Na2SO4上干燥并真空除去溶剂。用急骤层析在硅胶上纯化该化合物(梯度为含5％至15％的EtOAc的己烷)，从而得到一种黄色的油(1.69g，21％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z323[M+1-EtO]+；1HNMR(CDCl3，500MHz)δ1.15(t，J＝7.0，3H)，2.40(brs，6H)，4.18(q，J＝7.2，2H)，7.54-7.60(m，1H)ppm。0122将化合物2(1.0当量，993mg，2.84mmol)、2-氨基苯硫酚(5.0当量，1.52ml，14.2mmol)和NEt3(4.0当量，1.59ml，11.0mmol)混合于无水甲苯中(10ml)。将此混合物回流搅拌数小时。真空除去溶剂后，在EtOAc/己烷中通过超声波法纯化该物质，从而得到一种固体(724mg，53％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z485[M+1]+。0123将化合物4(1.0当量，70mg，0.144mmol)与含DBU(4.0当量，65μl，0.43mmol)的甲苯(1.5ml)混合。将该溶液回流搅拌45分钟。通过急骤色谱在硅胶上纯化该化合物(含1％MeOH的CH2Cl2)。LCMS(ES)95％纯度，m/z465[M+1]+。实施例10124将化合物3(1.0当量，347mg，0.942mmol)和2-氨基苯硫酚(1.0当量，0.10ml，0.934mmol)在甲苯(1ml)中混合并在130℃搅拌14小时。冷却后，过滤除去一些固体杂质。将此甲苯溶液倒在硅胶柱上。首先通过用己烷洗脱除去甲苯。然后用梯度为含10％至30％的EtOAc的己烷洗脱柱以提供所需化合物。挥发物蒸发后，进一步用EtOAc/己烷通过重结晶来纯化该固体。分离出化合物6，为灰色固体(62mg，18％收率)。LCMS(ES)90％纯度，m/z378[M+1]+。实施例10125将化合物2(1.0当量，3.15g，8.99mmol)和2-氨基苯硫酚(1.1当量，1.06ml，9.91mmol)在甲苯中(150ml)混合。将氮气充入该溶液10分钟。回流搅拌反应30小时(油浴T＝140℃)。真空除去挥发物并加入CH2Cl2。过滤除去固体杂质。通过急骤色谱在硅胶上纯化该物质(梯度为含10％至50％的EtOAc的己烷)，从而得到化合物7，为灰白色粉末(576mg，18％收率)。LCMS(ES)90％纯度，m/z360[M+1]+。实施例10126将化合物2(1.0当量，2.52g，7.20mmol)与N-甲基苯-1，2-二胺(1.2当量，0.98ml)和DIEA(1.2当量，1.5ml)在甲苯(10ml)中混合，并在120℃搅拌反应一天。待反应混合物冷却后过滤分离化合物8(679mg，26％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z358[M+1]+。实施例150127将化合物7(1.0当量，392mg，1.09mmol)与外消旋3-(吡嗪-2-基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(1.6当量，436mg，1.74mmol)悬浮于1mlNMP中。在150℃微波加热混合物20分钟。加入水并过滤分离所形成的固体。通过急骤色谱法进行纯化，得到化合物9(265mg，50％收率)，为固体。LCMS(ES)95％纯度，m/z489[M+1]+。实施例10128将化合物6(1.0当量，66mg，0.175mmol)和外消旋3-(吡嗪-2-基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(3.8当量，165mg，0.661mmol)在NMP(0.5ml)中混合。在200℃将此混合物搅拌23小时。加入水后，过滤分离形成的固体。通过急骤层析在硅胶上进行纯化(梯度为含1％至4％的MeOH的CH2Cl2)，得到化合物10，为棕色固体(70mg，79％收率)。LCMS(ES)90％纯度，m/z507[M+1]+。实施例10129按制备化合物10所用的方法制备化合物11。通过急骤层析在硅胶上纯化该化合物(梯度为含1％至10％的MeOH的CH2Cl2)，从而得到一种固体(220mg，47％)。LCMS(ES)95％纯度，m/z486[M+1]+。实施例180130将化合物8(1.0当量，202mg，0.56mmol)与2-(吡嗪-2-基)乙硫醇(1.05当量，76μl)和K2CO3(1.2当量，94mg)在NMP中混合。将混合物在80℃搅拌3小时。加入水后，将固体过滤并干燥，得到化合物12(202mg，85％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z477[M+1]+。实施例190131将化合物8(313mg)与N-异丙基哌嗪(1.5当量，188μl)在NMP中混合，并将混合物在90℃搅拌若干小时。加入水后过滤分离该化合物。通过急骤层析在硅胶上进行纯化(MeOH/CH2Cl2)，得到纯化合物13(222mg，54％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z465[M+1]+。实施例200132将化合物9(1.0当量，181mg，0.370mmol)和外消旋2(1-甲基吡咯烷-2-基)乙胺(4.0当量，0.21ml，1.449mmol)在CH2Cl2(1.5ml)中混合。加入AlCl3(2.9当量，142mg，1.06mmol)并将该溶液搅拌22小时。真空除去CH2Cl2后，将所形成的浆液用饱和酒石酸水溶液(大约1ml)处理并搅拌至所有固体消失(大约1小时完成水解)。加入水并通过加入NaOH将pH调至14。用CH2Cl2萃取该物质(3x)并用水洗涤合并的萃取物(2x)。在Na2SO4上干燥，并真空除去挥发物。通过急骤层析在氧化铝上纯化该物质(梯度为含0.1％至1％的MeOH的CH2Cl2)。该CH2Cl2/MeOH溶液被真空浓缩。加入EtOAc引发14的沉淀，为黄色固体(93mg，44％收率)。LCMS(ES)95纯度，m/z571[M+1]+。0133下列化合物是通过相同的方法，使用适当的胺和喹诺酮乙酯来制备的。实施例0134向喹诺酮酯(60mg，0.13mmol)和2-(2-氨基乙基)-1-甲基吡咯烷(30μL，0.19mmol)的二氯甲烷溶液(1.0mL)中，加入氯化铝(25mg，0.19mmol)，并将反应混合物搅拌30分钟。真空除去溶剂并加入饱和L-酒石酸(1.0mL)，搅拌45分钟直至所有固体溶解。将此水溶液用二氯甲烷(1.0mL)洗涤，用1NNaOH碱化并用二氯甲烷萃取。将所产生的萃取物用盐水洗涤，在硫酸钠上干燥、过滤并真空除去溶剂。用制备型TLC(氧化铝，含2％甲醇的CH2Cl2)将所形成的黄色物质纯化，得到产物，为淡黄色固体(30mg，43％)。实施例220135向喹诺酮酯(60mg，0.11mmol)和2-(2-氨基乙基)-1-甲基吡咯烷(25μL，0.17mmol)的二氯甲烷溶液(1.0mL)中，加入氯化铝(23mg，0.17mmol)，并将反应混合物搅拌30分钟。真空除去溶剂并加入饱和L-酒石酸(1.0mL)，搅拌45分钟直至所有固体溶解。将此水溶液用二氯甲烷(1.0mL)洗涤，用1NNaOH碱化并用二氯甲烷萃取。将所产生的萃取物用盐水洗涤，在硫酸钠上干燥、过滤并真空除去溶剂。用制备型TLC(氧化铝，含2％甲醇的CH2Cl2)将所形成的黄色物质纯化，得到产物，为淡黄色固体(30mg，46％)。实施例20136向喹诺酮酯(75mg，0.15mmol)和2-(2-氨基乙基)-1-甲基吡咯烷(32μL，0.22mmol)的二氯甲烷溶液(1.0mL)中，加入氯化铝(29mg，0.22mmol)，并将反应混合物搅拌30分钟。真空除去溶剂并加入饱和L-酒石酸(1.0mL)，搅拌45分钟直至所有固体溶解。将此水溶液用二氯甲烷(1.0mL)洗涤，用1NNaOH碱化并用二氯甲烷萃取。将所产生的萃取物用盐水洗涤，在硫酸钠上干燥、过滤并真空除去溶剂。用制备型TLC(氧化铝，含2％甲醇的CH2Cl2)将所形成的黄色物质纯化，得到产物，为淡黄色固体(30mg，34％)。实施例20137向喹诺酮酯(34mg，0.7mmol)和1-(2-氨基乙基)吡咯烷(15μL，0.11mmol)的二氯甲烷溶液(1.0mL)中，加入氯化铝(15mg，0.11mmol)，并将反应混合物搅拌30分钟。真空除去溶剂并加入饱和L-酒石酸(1.0mL)，搅拌45分钟直至所有固体溶解。将此水溶液用二氯甲烷(1.0mL)洗涤，用1NNaOH碱化并用二氯甲烷萃取。将所产生的萃取物用盐水洗涤，在硫酸钠上干燥、过滤并真空除去溶剂。用制备型TLC(氧化铝，含2％甲醇的CH2Cl2)将所形成的黄色物质纯化，得到产物，为淡黄色固体(28mg，73％)。实施例20138向喹诺酮酯(146mg，0.65mmol)和2-(2-氨基乙基)-1-甲基吡咯烷(1mmol)的二氯甲烷溶液(1.0mL)中，加入氯化铝(1mmol)，并将反应混合物搅拌30分钟。真空除去溶剂并加入饱和L-酒石酸(1.0mL)，搅拌45分钟直至所有固体溶解。将此水溶液用二氯甲烷(1.0mL)洗涤，用1NNaOH碱化并用二氯甲烷萃取。将所产生的萃取物用盐水洗涤，在硫酸钠上干燥、过滤并真空除去溶剂。用制备型TLC(氧化铝，含2％甲醇的CH2Cl2)将所形成的黄色物质纯化，得到产物，为淡黄色固体(1.7mg，5％)。实施例20139将化合物3(1.0当量，126mg，0.27mmol)和胺5(2.0当量，68μL，0.54mmol)溶解于无水CH2Cl2(1ml)中。加入AlCl3(2.0当量，72mg，0.54mmol)并在室温下将混合物搅拌3小时。真空除去挥发物。用饱和酒石酸水溶液(10ml)处理所形成的浆液并搅拌直至所有固体消失(大约1小时完成水解)。用1NNaOH中和溶液(达到pH＝14)，并用CH2Cl2萃取化合物(4x)。将有机相用浓酒石酸钾钠水溶液、水(2x)洗涤，并在Na2SO4上干燥。浓缩此CH2Cl2溶液。加入AcOEt，引发所需化合物结晶。过滤后，分离化合物6，为浅黄色绒毛状固体(76mg，53％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z536[M+H]+；1HNMR(CDCl3，500MHz)δ1.12(d，J＝6.6，6H)，1.80(brs，4H)，2.62(brs，4H)，2.79(m，7H)，3.36(m，4H)，3.67(q，J＝6.0，2H)，7.45(t，J＝7.2，1H)，7.53(td，J＝7.3，J＝1.3，1H)，7.84(dd，J＝7.8，J＝1.2，1H)，7.89(d，J＝6.9，1H)，8.16(d，J＝13.1，1H)，8.23(d，J＝8.5，1H)，10.46(brt，1H)ppm。实施例270140按实施例26中使用的方法，从4(101mg，0.21mmol)和7开始制备化合物，提供了化合物8，为白色绒毛状固体(37mg，31％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z566[M]+，568[M+2]+；1HNMR(CDCl3，500MHz)δ1.13(d，J＝6.5，6H)，1.57(m与水的信号重叠，2H)，1.71(m，1H)，1.81(m，1H)，2.04-2.18(m，4H)，2.34(s，3H)，2.78(m，5H)，3.06(brt，J＝8.6，1H)，3.27(brs，4H)，3.52-3.59(m，2H)，7.47(t，J＝7.3，1H)，7.57(td，J＝8.4，J＝1.1，1H)，7.84(d，J＝7.8，1H)，8.19(s，1H)，8.27(d，J＝8.4，1H)，8.57(s，1H)，10.38(brt，J＝5.6，1H)ppm。实施例280141实施例28描述了由相应的酯与胺和氯化铝进行反应以制备取代的苯并嗪类似物的方法。0142向2，3，4，5-四氟苯甲酸(100g，510mmol)的二氯甲烷溶液(0.5L)中加入草酰氯(68g，540mmol)和DMF(大约3滴)，并将反应混合物在室温下搅拌过夜以使所产生的气体散去。真空除去溶剂并将容器放置于高真空(大约0.5mmHg)上2小时，从而得到酰基氯，为粘性油(105g)，将其用于接下来的反应而无需进一步纯化。0143向丙二酸乙酯钾(97g，570mmol)和氯化镁(55g，570mmol)的乙腈悬浮液中，并将此悬浮液冷却至0℃。在5分钟内向此悬浮液中加入粗制2，3，4，5-苯甲酰氯(105g，520mmol)。以使反应温度足以保持在10℃以下的速率缓慢加入三乙胺，并将此混合物加热至室温，搅拌过夜。真空除去溶剂并用甲苯(300mL)代替，加入1NHCl(500mL)，将混合物搅拌1小时。分离有机层并用1NHCl(100mL)和盐水(100mL)洗涤，在硫酸钠上干燥，经硅胶垫(50×100mm)过滤，用乙酸乙酯洗脱。真空除去溶剂，将所产生的油溶解于乙醇/水(9∶1)中并使其结晶过夜。过滤分离所产生的结晶，用乙醇/水(8∶2)洗涤，得到酮酸酯(43.75g，166mmol)，为白色结晶固体。0144向250mL圆底烧瓶中加入四氟酮酸酯(10.0g，37.9mmol)、邻甲酸三乙酯(8.6mL，56.8mmol)和乙酸酐(7.15mL，75.8mmol)，并将反应混合物加热至145℃2小时。将反应冷却至室温并放置于高真空(大约0.5mmHg)上1小时。将所产生的油溶解于乙醇中(100mL)并在室温下加入2-氨基-1-萘酚(6.02g，37.9mmol)，溶液很快变清亮，然后产物开始沉淀。将反应搅拌2小时，然后过滤并用乙醇(100mL)洗涤，得到烯胺，为黄色固体(12.5g，28.9mmol)。0145向此烯胺(12.13g，27.95mmol)的无水DMF(50mL)溶液中加入碳酸钾(4.24g，1.1当量)，并将混合物加热至90℃，连续搅拌2小时。不加搅拌使该混合物冷却至室温，并使其在室温下再保持一小时。过滤收集结晶固体，用水洗涤。从THF中重结晶，得到二氟酯，为白色结晶固体(9.3g，23.6mmol)。0146向此二氟酯(1.0g，2.5mmol)的NMP(10mL)溶液中加入N-Boc-3-(2-吡嗪)吡咯烷(870mg，3.5mmol)，并将此混合物回流加热3小时。然后将反应混合物冷却至室温，并过滤收集产物。从THF中重结晶，得到吡嗪酯，为黄色固体(910mg，1.74mmol)。0147在室温下向吡嗪酯(250mg，0.48mmol)和2-(2-氨基乙基)-1-甲基吡咯烷(80mg，0.63mmol)的二氯甲烷溶液中加入氯化铝(83mg，0.63mmol)，并将反应混合物搅拌2小时。真空除去溶剂，加入饱和L-酒石酸(5mL)并将混合物搅拌1小时。然后加入二氯甲烷(10mL)并用1NNaOH将此混合物碱化。分离有机层，用Rochelle’s盐的饱和溶液、盐水洗涤，并在硫酸钠上干燥。真空除去溶剂，将所产生的固体溶解于THF中，过滤，并再次除去溶剂。将此粗制固体在乙酸乙酯中重结晶，得到酰胺，为黄色固体(225mg，0.37mmol，98.5％纯度)。实施例290148如实施例29所示，由所述相应的酯进行酰胺偶联，其反应轻微或不反应，其中氯化锌被用作路易斯酸。0149在室温下向该酯(100mg，0.19mmol)和2-(2-氨基乙基)-1-甲基吡咯烷(80mg，0.63mmol)的二氯甲烷溶液中加入氯化锌(86mg，0.63mmol)，并将反应混合物搅拌过夜。LCMS表明没有反应进行，该反应被停止。实施例300150实施例30描述了由相应的羧酸与胺进行反应以制备取代的苯并嗪类似物的方法。0151将吡嗪酯(2.0g，3.8mmol)溶解于乙醇(100mL)中，加入浓HCl(20mL)，并将混合物回流过夜。将混合物冷却至室温，真空过滤收集固体，用乙醇洗涤，得到吡嗪酸，为浅棕色粉末(1.6g，3.2mmol)。0152向氟代氨基酸(1.6g，3.2mmol)和HBTU(2.0g，5.3mmol)的NMP(20mL)混合物中加入N，N-二异丙基-N-乙胺(1.0mL，6mmol)，并在氩气下将混合物在室温下搅拌1小时(溶液变清亮)。加入(S)-2-(2-氨基乙基)-1-甲基吡咯烷(Mizuno，A.；Hamada，Y.；Shioiri，T.，Synthesis，1980，121007)(1.0mL，6.9mmol)，并将该混合物搅拌30分钟。加入水(200mL)，将所产生的固体通过真空过滤收集，用水洗涤，干燥，得到吡嗪，为黄色固体。将该黄色固体在硅胶上纯化(首先用10％MeOH/CH2Cl2洗脱杂质，然后用5％NH4OH/15％MeOH/CH2Cl2洗脱)。将合并的级分蒸发，得到为黄色固体的化合物(1.2g，2.0mmol，85％纯度)。实施例0153实施例31描述了Boc-保护吡咯烷试剂的制备，其被用作制备苯并嗪和苯并噻唑化合物的中间产物。0154将苄胺(90g，841mmol)与氯甲基三甲基硅烷(30g，246mmol)的混合物在200℃加热2.5小时。一般地，三甲代甲硅烷基基团可以用-SiR1R2R3部分代替，其中R1、R2和R3独立地是烷基或取代的烷基。苯甲基基团也可以用其它合适的保护基团代替。0155将混合物冷却至室温并用1N氢氧化钠(250mL)和醚(200mL)处理并搅拌。将含水层用醚萃取(3×100mL)并将合并的有机萃取物用盐水洗涤，在硫酸镁上干燥，在硅胶垫上(70×50mm)过滤并用醚洗脱。真空除去溶剂并将所产生的油真空蒸馏(bp＝70℃大约1mmHg)，得到胺，为无色的油(60.8g)，其含有大量苄胺。然后将所产生的油在单biotage柱(90g，硅胶，ANALOGIX)上进行层析并用乙酸乙酯洗脱。真空除去溶剂，得到纯胺，为无色的油(43.55g，225mmol)。然后将所产生的胺加入到37％甲醛溶液(25mL)中，并将混合物在室温下搅拌10分钟，随后加入甲醇(25mL)和碳酸钾(20g)。将所形成的混合物搅拌过夜，然后用二氯甲烷(3×100mL)萃取并将合并的有机萃取物用硫酸钠干燥。真空除去溶剂并将所得到的油真空蒸馏(bp＝80℃大约1mmHg)，得到胺，为无色液体(39.9g，168mmol)。0156在4小时内，向乙烯基吡嗪(10g，94.3mmol)的二氯甲烷(200mL)和三氟乙酸(2mL)溶液中滴加溶解于二氯甲烷(100mL)的甲硅烷化胺醚(24.33g，102.7mmol)溶液。然后将该体积缩减至100mL并用1NHCl(3×75mL)萃取。随后将含水层用NaOH碱化，用二氯甲烷萃取(3×100mL)，在硫酸镁上干燥并在硅胶垫(30×150mm)上用乙酸乙酯进行洗脱过滤。将溶剂蒸发，得到苄基化的吡嗪并吡咯烷(26.19g)，为浅棕色的清亮液体。一般地，吡嗪杂环可以用其它合适的杂环基团代替。0157向苄基吡咯烷(7.0g，29.3mmol)和二碳酸二叔丁酯(44.7g，205mmol)的甲醇溶液中加入10％Pd/C(degussa型，湿)，并振荡条件下用氢(50PSI)为容器加压。将容器排气3次以控制压力。5小时后，反应完成，过滤该混合物并真空除去溶剂。将所产生的物质在硅胶上层析(1∶1己烷/乙酸乙酯)，从而得到Boc保护的吡咯烷，为淡黄色的油(2.3g，9.2mmol)。TPC酰胺0158对映异构体之比可以通过制备TPC(N-三氟甲基乙酰基-L-脯氨酰氯，Regis#440001)并在PhenomenexZebron毛细管柱上(ZB-50，50％苯基、50％二甲基聚硅氧烷，30M×0.25mm，0.25uM膜厚度)使用GCMS(HP6890N/5973MSD)来确定。色谱条件1μL分流式进样50∶1。固定He流量＝1.0mL/分钟。炉100℃5分钟，5℃/分钟至300℃并保持8分钟。该化合物于39.08分钟和39.31分钟出现，但拆分效果非常好。实施例0159实施例32描述了用于酰胺偶联的手性胺试剂的制备。0160向羟甲基吡咯烷(50g，434mmol)的二氯甲烷溶液(1L)中加入三苯膦(148g，564mmol)，随后于室温下小心加入四溴化碳(187g，564mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。加入水并将有机层用盐水洗涤，在硫酸钠上干燥并真空除去溶剂。将所产生的油通过硅胶色谱(1∶1己烷/乙酸乙酯)纯化，得到溴化物，为清亮的油(35g，197mmol)。0161向此溴化物(23.0g，129mmol)的乙腈和水(75∶15，200mL)溶液中加入氰化钾(12.6g，194mmol)和18-冠-6(340mg，1.3mmol)，并将此反应在室温下搅拌过夜。然后将该体积在真空条件下减至50mL，并用二氯甲烷萃取两次(2×200mL)。将得到的萃取物合并，用盐水洗涤，在硫酸钠上干燥并将溶剂真空小心除去，得到氰化物，为清亮的油(17g)。0162向此氰化物(17g，137mmol)的甲醇溶液(90mL)中加入雷尼镍(RaneyNickel)(2.0g，水溶液)，并在振荡条件用氢(60PSI)为混合物加压24小时。将溶液过滤并真空除去溶剂。通过蒸馏(BP＝50℃，大约10mmHg)分离出纯胺，为清亮的油(7.54g，58.9mmol)。TPC酰胺0163对映异构体之比可以通过制备TPC(N-三氟甲基乙酰基-L-脯氨酰氯，Regis#440001)并在PhenomenexZebron毛细管柱上(ZB-50，50％苯基、50％二甲基聚硅氧烷，30M×0.25mm，0.25uM膜厚度)使用GCMS(HP6890N/5973MSD)来确定。色谱条件1μL分流式进样50∶1。固定He流量＝1.0mL/分钟。炉100℃5分钟，5℃/分钟至300℃并保持8分钟。该化合物于28.51分钟和28.68分钟出现，但拆分效果非常好。0164应当理解，前面的详述和所附实施例仅是举例说明，而不应被当作对本发明范围的限制。对所公开实施方式的各种变化和修改对于本领域的技术人员而言是显而易见的。在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以作出此类变化和修改，其包括但不限于那些涉及本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间产物、合成、配方和/或使用方法的变化和修改。本文所引用的美国专利和出版物被并入本文作为参考。实施例30165向2，6-二氯烟酸(1.0当量，31.24g，162.7mmol)的二氯甲烷溶液(500mL)中加入草酰氯(1.2当量，23.7g，187.5mmol)，随后加入3滴DMF并在室温下将混合物搅拌过夜。然后真空除去溶剂，得到粗制的油状酰基氯。在分离烧瓶中，将丙二酸乙酯钾(1.5当量，41.5g，244mmol)溶解于乙腈(500mL)中，并将此混合物冷却至5℃。然后在5分钟内加入氯化镁(1.5当量，23.4g，245.8mmol)，保持温度在25℃以下。随后将粗制酰基氯溶解于乙腈(50mL)中，并在30分钟内经滴液漏斗加入，保持温度为5℃以下。随后尽可能快地加入三乙胺(2.0当量，42.8ml，325mmol)，同时始终保持温度为10℃以下。当添加完毕后，使该反应升至室温，连续搅拌过夜。真空除去溶剂并用乙酸乙酯代替。加入1NHCl(500mL)并将此混合物额外搅拌30分钟。分离有机层，用盐水洗涤，在硫酸钠上干燥，并真空除去溶剂，得到酮酸酯，为橙色的油(35.04g)。将该产物通过从10％水/甲醇中重结晶而加以纯化，得到纯的酮酸酯1，为白色结晶固体(31.21g，74％)。LCMS(ES)95％纯度，2个峰的洗脱物，m/z216，262。实施例30166将酮酸酯1(1.0当量，11.45g，43.87mmol)溶解于DMF(60ml)并将此混合物用冰浴冷却至0℃。然后加入甲基碘(3.0当量，8.2ml，132.mmol)并将混合物冷却至-5℃。然后加入二硫化碳(1.5当量，4.0mL，65.8mmol)，随后加入碳酸钾(2.0当量，12.1g，88mmol)并保持温度为5℃以下。在2小时内使混合物在搅拌下升至室温，然后用乙酸乙酯萃取(5×100mL)，在硫酸钠上干燥。真空除去溶剂，并将所产生的油通过硅胶色谱(10％乙酸乙酯/己烷)纯化，得到双硫醚2，为黄色的油(70％收率)。LCMS(ES)90％纯度，m/z388[M+22]+，320[M+1-OEt]+。实施例30167将2，6-二氯-5-氟-3-吡啶-β-酮基丙酸乙酯(1.0当量，31.79g，0.113mol)溶解于DMF(180ml)中。用冰盐混合物将该溶液冷却。加入碘甲烷(3.0当量，21ml，0.887mol)和二硫化碳(1.5当量，10.3ml，0.170mol)，并搅拌混合物直至内部温度达到T＝-2℃。非常快地加入K2CO3(2.0当量，31.4g，0.227mmol)(2-3分钟内)，这引发内部温度达到T＝12℃。将混合物在冰浴中搅拌5小时。加入水和盐水后，用EtOAc萃取该化合物(3x)。将合并的萃取物用盐水洗涤(2x)，在Na2SO4上干燥，并真空除去挥发物。通过在硅胶上的急骤层析(梯度为含5％至30％EtOAc的己烷)进行纯化，得到化合物3，为浓稠的黄色油(22.86g，52％收率)。Rf＝0.14(含10％EtOAc的己烷)；LCMS(ES)95％纯度，m/z384[M]+，338[M-EtOH]+，340[M+2-EtOH]+，342[M+4-EtOH]+；1HNMR(CDCl3，500MHz)δ1.16(t，J＝7.4，3H)，2.43(s，6H)，4.18(q，J＝7.4，2H)，7.86(dd，J＝0.6，J＝7.4，1H)ppm。实施例30168将化合物3(1.0当量，18.93g，49.18mmol)溶解于甲苯(400ml)中。将此溶液通过充入氮气10分钟而小心脱气。在加入2-氨基苯硫酚(0.9当量，4.7ml，43.92mmol)后，将混合物在130-140℃(油浴温度)搅拌6小时，并持续向反应中通入氮气。加入DIEA(1.0当量，8.6ml，49.37mmol)并将混合物在140℃搅拌过夜。当冷却后，化合物4开始沉淀。过滤固体并用少量甲苯洗涤。将该物质悬浮于MeOH中并超声处理数分钟。过滤和干燥后，分离出化合物4，为棕褐色固体(9.19g，56％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z377[M+1]+，379[M+3]+，331[M+1-EtOH]+，333[M+3-EtOH]+；1HNMR(CDCl3，500MHz)δ1.50(t，J＝7.0，3H)，4.53(d，J＝7.0，2H)，7.52(td，J＝0.9，J＝7.1，1H)，7.63(td，J＝1.4，J＝6.0，1H)，7.84(dd，J＝1.2，J＝7.9，1H)，8.62(d，J＝7.4，1H)，9.49(d，J＝8.6，1H)ppm。实施例30169在反应管中，将化合物3(1.0当量，202mg，0.526mmol)和N-甲基-苯-1，2-二胺(1.0当量，60μl，0.528mmol)在无水甲苯(5ml)中在130℃搅拌16小时。真空除去挥发物后，将粗制混合物在硅胶上通过急骤层析(梯度为含0.5％至3％MeOH的CH2Cl2)加以纯化。在向所产生的油中加入MeOH后，纯的5沉淀出来。将此物质过滤并干燥，得到5，为黄色固体(29mg，15％收率)。Rf＝0.26(5％MeOH，在CH2Cl2中)；LCMS(ES)95％纯度，m/z374[M+1]+，376[M+3]+，328[M+1-EtOH]+，330[M+3-EtOH]+；1HNMR(CDCl3，500MHz)δ1.47(t，J＝7.0，3H)，3.70(s，3H)，4.50(q，J＝7.0，2H)，7.37(dd，J＝8.1，J＝1.0，1H)，7.44-7.51(m，2H)，8.55(d，J＝7.6，1H)，8.94(dd，J＝1.1，J＝8.1，1H)ppm。实施例380170在反应管中，将化合物3(1.0当量，221mg，0.575mmol)和2-氨基苯酚(1.1当量，70mg，0.641mmol)在无水甲苯(5ml)中在130℃搅拌6小时。在混合物冷却后，将形成的棕色沉淀过滤。将此物质溶解于CH2Cl2并经C盐垫过滤溶液。甲苯中重结晶，得到6(48mg，24％收率)，为浅棕色固体。LCMS(ES)95％纯度，m/z361[M+1]+，363[M+3]+，315[M+1-EtOH]+，317[M+3-EtOH]+；1HNMR(CDCl3，500MHz)表明纯度大约为80％，δ1.46(t，J＝7.0，3H)，4.50(q，J＝7.3，2H)，7.48-7.54(m，2H)，7.65(dd，J＝1.4，J＝7.9，1H)，8.57(d，J＝7.4，1H)，8.68(dd，J＝1.4，J＝7.9，1H)ppm。实施例390171在反应管中，将化合物3(1.0当量，266mg，0.692mmol)和3-氨基-4-(甲基氨基)苄腈(1.0当量，100mg，0.689mmol)在无水甲苯(5ml)中在130℃搅拌2天。待溶剂蒸发后，使粗制混合物通过硅胶柱(梯度为含0.5％至3％MeOH的CH2Cl2)。通过制备型TLC在硅胶上(1mm，两个盘，含4％MeOH的CH2Cl2)进行纯化，得到化合物7，为黄色固体(32mg，12％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z399[M+1]+，401[M+3]+，353[M+1-EtOH]+，355[M+3-EtOH]+；1HNMR(CDCl3，500MHz)δ1.47(t，J＝7.1，3H)，3.72(s，3H)，4.51(q，J＝7.3，2H)，7.42(d，J＝8.4，1H)，7.79(dd，J＝1.5，J＝8.4，1H)，8.55(d，J＝7.3，1H)，9.22(d，J＝1.4，1H)ppm。实施例400172在反应管中，将化合物3(1.0当量，288mg，0.749mmol)和2-氨基-4-氯苯硫醇(1.0当量，120mg，0.752mmol)在无水甲苯(5ml)中在130℃搅拌2天。将反应期间形成的固体过滤并溶解于MeOH与CH2Cl2的混合物(200ml)中。经C盐垫过滤所产生的混浊溶液。在挥发物蒸发后，将该物质在硅胶上通过急骤层析(CH2Cl2，然后是含0.5％MeOH的CH2Cl2)加以纯化。分离出化合物8，为黄色固体(20mg，6％收率)。LCMS(ES)＞85％纯度，m/z411[M]+，413[M+2]+，415[M+4]+，365[M-EtOH]+，367[M+2-EtOH]+，369[M+4-EtOH]+。实施例0173在反应管中，将化合物3(1.0当量，255mg，0.664mmol)和苯-1，2-二胺(1.0当量，72mg，0,666mmol)在无水甲苯(5ml)中在130℃搅拌5小时。真空除去挥发物并将该物质溶解于二甘醇二甲醚(2ml)中。加入60％NaH的油悬浮液(1.0当量，26mg，0.63mmol)并将混合物在130℃搅拌3小时。将形成的沉淀过滤并用水清洗。在MeOH中研碎并过滤，分离出化合物9，为棕色固体(91mg，38％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z360[M+1]+，362[M+3]+；1HNMR(CDCl3，500MHz)δ1.44(t，J＝7.1，3H)，4.44(q，J＝7.1，2H)，7.40-7.46(m，2H)，7.49(m，1H)，8.50(d，J＝7.7，1H)，8.81(d，J＝6.8，1H)ppm。实施例420174向双硫醚2(1.0当量，10.14g，27.7mmol)的甲苯溶液(300mL)中加入2-氨基苯硫酚(1.1当量，3.81g，30.5mmol)并将此混合物在连续的氮气脱气条件下回流过夜。然后使混合物冷却至室温，加入二异丙基乙胺(1.5当量，7.0mL，41.55mmol)并将此混合物加热回流3小时。使混合物冷却至室温，过滤收集产物，得到环化酯10，为棕褐色固体(6.6g，66％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z359[M+1]+。实施例0175向双硫醚2(1.0当量，5.0g，13.66mmol)的甲苯溶液(150mL)中加入N-甲基-1，2-邻苯二胺(1.2当量，2.0g，16.4mmol)并将此混合物在连续氮气脱气的条件下回流过夜。然后使混合物冷却至室温，加入二异丙基乙胺(1.5当量，3.5mL，20.75mmol)并将此混合物加热回流3小时。使混合物冷却至室温并加入甲醇。通过旋转蒸发将该体积减至大约100ml并将其放置2天。过滤收集产物并从乙醇中重结晶，得到环化酯11，为棕褐色固体(2.6g，53％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z356[M+1]+。实施例440176向双硫醚2(1.0当量，10.14g，27.7mmol)的甲苯溶液(300mL)中加入1，2-邻苯二胺(1.1当量，3.3g，30.5mmol)，并将此混合物在连续氮气脱气的条件下回流过夜。然后使混合物冷却至室温，加入二异丙基乙胺(1.5当量，7.0mL，41.55mmol)并将此混合物加热回流3小时。使混合物冷却至室温并过滤收集产物，得到环化酸12a，为棕褐色固体(3.5g，11.2mmol，40％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z314[M+1]+。真空浓缩所得到的滤液并用醚(100mL)研碎。过滤收集产物，得到环化酯12，为棕褐色固体(3.5g，10.3mmol，37％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z342[M+1]+。实施例40177将化合物4(1.0当量，1.57g，4.17mmol)悬浮于乙酸(15ml)中。将悬浮液充入氮气10分钟以脱气。加入甲酸铵(10当量，2.63g，41.6mmol)和Pd/C(10％湿degussa型，2.5g)，将混合物在60℃剧烈搅拌3小时。将混合物经C盐垫过滤。将该碳用CH2Cl2、MeOH和乙酸的热混合物处理若干次以实现彻底回收所期望的物质。将合并的滤液蒸发，加入CH2Cl2。将有机相用水洗涤(2x)，在Na2SO4上干燥并真空除去溶剂。将所产生的固体在EtOAc和己烷的混合物中超声处理，过滤并干燥，得到纯13，为灰白色固体(1.11g，78％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z343[M+1]+。实施例40178按照产物13所使用的方法，用更高的温度(80℃)和更长的反应时间制备化合物14。加入更加过量的试剂数次以便完成转化。分离出该化合物，为灰白色固体(41mg，15％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z325[M+1]+。实施例40179在反应管中，将化合物6(1.0当量，13mg，0.0360mmol)和N-异丙基哌嗪(4.0当量，21μl，0.147mmol)在DMF(0.1ml)中在90℃搅拌4.5小时。加入水后，将沉淀过滤并干燥。通过用AcOEt/己烷进行沉淀，纯化产物15，得到浅棕色固体(7mg，43％收率)。LCMS(ES)＞90％纯度，m/z453[M+1]+。0180通过相同的方法，使用合适的胺和氯-氮杂苯并芴酮(chloro-azabenzofluorenones)制备下列类似物。实施例480181在反应管中，将化合物4(1.0当量，14mg，0.0372mmol)和外消旋3-(吡嗪-2-基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(4.0当量，50mg，0.160mmol)在无水NMP(0.2ml)中在200℃搅拌1小时。加入水后，将沉淀过滤并干燥。将此物质通过制备型TLC在硅胶上(1mm盘，用含4％MeOH的CH2Cl2洗脱两次)加以纯化。分离化合物28，为棕色固体(9mg，50％收率)。LCMS(ES)90％纯度，m/z490[M+1]+。实施例490182在反应管中，将化合物5(1.0当量，21mg，0.0562mmol)和外消旋3-(吡嗪-2-基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(4.0当量，56mg，0.225mmol)在无水NMP(0.2ml)中在200℃搅拌3小时。加入水后，将沉淀过滤并干燥。将此物质通过在硅胶上(1mm盘，用含5％MeOH的CH2Cl2洗脱两次)的制备型TLC并通过使用CH2Cl2/己烷的沉淀作用加以纯化。分离化合物29，为浅棕色固体(15mg，55％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z487[M+1]+。实施例500183在反应管中，将化合物5(1.0当量，21mg，0.0562mmol)、2-(吡嗪-2-基)乙硫醇(1.1当量，8μl，0.0652mmol)和K2CO3(1.2当量，9mg，0.0651mmol)在无水DMF(0.2ml)中混合。将混合物在90℃搅拌3小时。加入水后，将沉淀过滤并干燥。将此物质在MeOH中研碎并过滤。分离化合物30，为黄色固体(19mg，71％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z478[M+1]+。0184按照相同的方法，用适当的氯-氮杂苯并芴酮(chloro-azabenzofluorenones)制备下列类似物实施例0185将化合物13(1.0当量，266mg，0.777mmol)悬浮于无水NMP(3ml)中。将氮气充入此混合物中数分钟。加入2-(吡嗪-2-基)乙硫醇(5.0当量，0.48ml，3.91mmol)和K2CO3(10.0当量，1.0g，7.23mmol)，并将反应混合物在100℃剧烈搅拌1小时。加水以溶解所有物质。通过加入3NHCl水溶液，将pH调节至1-2。将产生的橙色沉淀过滤，悬浮于少量MeOH中并再次过滤。分离出粗制化合物34，为橙棕色固体，不经任何进一步的纯化便被用于下面的步骤(188mg，68％收率)。LCMS(ES)80-90％纯度，m/z357[M+1]+。实施例0186将化合物34(1.0当量，188mg，0.527mmol)悬浮于CH2Cl2(4ml)。加入三乙胺(2.2当量，0.16ml，1.148mmol)和2-(溴甲基)溴化吡啶盐(1.2当量，160mg，0.6325mmol)，并将混合物在室温下搅拌15分钟。加入饱和NaHCO3水溶液后，将该物质用CH2Cl2萃取(3x)。将合并的萃取物在Na2SO4上干燥并真空除去溶剂。通过制备型HPLC纯化该化合物。浓缩所产生的溶液并通过加入NaOH水溶液将pH调至10。将化合物35过滤，在CH2Cl2/己烷混合物中研碎并过滤，得到浅棕色固体(59mg，25％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z448[M+1]+。实施例0187在圆底烧瓶中，将化合物4(1.0当量，1.28g，3.397mmol)和2-(吡咯烷-1-基)乙胺(2.0当量，0.86ml，6.786mmol)在CH2Cl2(50ml)中混合。加入AlCl3(1.5当量，680mg，5.10mmol)，并将此混合物在室温下剧烈搅拌1小时。真空除去CH2Cl2后，用饱和酒石酸水溶液(大约20ml)处理所形成的浆液并搅拌直至所有固体消失(大约1小时完成水解)。加水并通过加入NaOH将pH调至14。过滤黄色沉淀并用水洗涤。将固体溶解于大量CH2Cl2/MeOH混合物中，并经C盐垫过滤此混浊溶液。真空除去挥发物并在热MeOH中将固体物质研碎。过滤并干燥，得到化合物36(1.09g，72％收率)，为黄色固体。LCMS(ES)95％纯度，m/z445[M+1]+；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ1.84(m，4H)，2.65(m，4H)，2.80(t，J＝7.2，2H)，3.68(t，J＝7.2，2H)，7.52(td，J＝1.2，J＝7.2，1H)，7.62(td，J＝1.2，J＝8.4，1H)，7.81(dd，J＝0.8，J＝8.0，1H)，8.62(d，J＝7.2，1H)，9.49(d，J＝8.8，1H)ppm。0188下列化合物可以通过相同的方法，使用合适的胺和氮杂苯并芴酮乙酯加以制备。一些化合物可选地用CH2Cl2由碱性水溶液中萃取分离。一些化合物通过氧化铝上的制备型TLC(用含1至5％MeOH的CH2Cl2洗脱)、制备型HPLC或者在EtOAc或CH2Cl2/己烷混合物中研碎而加以纯化。实施例0189按照产品36所使用的方法制备Boc基团保护的化合物64。将粗制的boc-胺用纯三氟乙酸(0.5ml)处理45分钟。在酸蒸发后，加水并通过加入1NNaOH将pH调至14。用CH2Cl2萃取(4x)后，将萃取物用水洗涤(1x)并在Na2SO4上干燥。通过在氧化铝上的制备型TLC(1.5mm盘，用含4％MeOH的CH2Cl2洗脱3次)将外消旋化合物64加以纯化，得到黄色固体(6mg，37％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z509[M+1]+。实施例50190按产物64所用的方法制备化合物65。通过在氧化铝上的制备型TLC(1.5mm盘，用含4％MeOH的CH2Cl2洗脱两次，并用含5％MeOH的CH2Cl2洗脱四次)和用CH2Cl2/己烷进行沉淀，将化合物65纯化，得到黄色固体(2.7mg，12％收率)。LCMS(ES)＞85％纯度，m/z506[M+1]+。实施例50191将化合物63(300mg，0.523mmol)悬浮于纯三氟乙酸(2ml)中。将此混合物在大约50℃搅拌数分钟并真空除去挥发物。加入MeCN(5ml)，并用Et2O(200ml)萃出该物质。通过制备型HPLC将化合物66纯化，并经蒸发将其分离，为双TFA盐。(215mg，59％收率)。LCMS(ES)＞95％纯度，m/z474[M+1]+。实施例50192将化合物57(20mg)悬浮于NMP(0.2ml)和外消旋哌啶-3-基甲醇(0.2ml)中。将此混合物在200℃微波加热15分钟。经制备型HPLC纯化后，真空浓缩67的H2O/MeCN溶液，通过饱和NaHCO3将pH调至9并用CH2Cl2萃取该化合物(4x)。将合并的萃取物在Na2SO4上干燥并真空除去溶剂。将所产生的固体在EtOAc/己烷中研碎，从而得到外消旋的67，为棕褐色固体(13mg，54％收率)。LCMS(ES)＞95％纯度，m/z506[M+1]+。0193通过相同的方法，使用合适的胺和氟氮杂苯并芴酮制备下列化合物。当使用反应活性较小的胺时，反应在220℃进行20分钟。0194通过相同的方法，使用合适的胺和氯氮杂苯并芴酮制备下列化合物。用微波在100℃加热5分钟或者在150℃加热3分钟来进行该反应。实施例580195向含氯酯(1.0g，2.81mmol)和1-(2-氨基乙基)吡咯烷(0.50g，4.4mmol)的二氯甲烷(20mL)溶液中加入氯化铝(585mg，4.4mmol)，并将反应在室温下搅拌4小时。然后用Rochelle’s盐的饱和溶液淬灭反应，用1NNaOH使其保持碱性并再搅拌一小时。用二氯甲烷萃取混合物，在硫酸镁上干燥并真空除去溶剂。将所得到的粗制固体在乙酸乙酯中研碎，得到氯酰胺，为棕褐色固体(0.5g，1.1mmol)；LCMS(ES)95％纯度，m/z437[M+1]+。实施例590196向含氯酯(1.0g，2.81mmol)的N-甲基吡咯烷酮(10mL)溶液中加入N-乙酰基哌嗪(540mg，4.2mmol)，并将此混合物在110℃加热4小时。加水并过滤收集粗产物。将所得到的固体溶解于二氯甲烷中，在硫酸钠上干燥并真空除去溶剂。将所得到的粗制固体在乙酸乙酯中研碎，得到氨基酯，为棕褐色固体(0.70g，1.62mmol)；LCMS(ES)95％纯度，m/z434[M+1]+。实施例600197向含氯酯(1.0g，2.81mmol)的N-甲基吡咯烷酮(10mL)溶液中加入N-乙酰基哌嗪(540mg，4.2mmol)，并将此混合物在110℃加热4小时。加水并过滤收集粗制产物。将所得到的固体溶解于二氯甲烷中，在硫酸钠上干燥并真空除去溶剂。将所得到的粗制固体在乙酸乙酯中研碎，得到氨基酯，为棕褐色固体(0.75g，1.67mmol)；LCMS(ES)95％纯度，m/z451[M+1]+。实施例0198下列方法被用于生成类似物的文库。0199向氨基酯(200mg，0.46mmol)和1-(2-氨基乙基)吡咯烷(80mgg，1.5当量)的二氯甲烷溶液(3mL)中加入氯化铝(100mg，1.5当量)，并将反应在室温搅拌4小时。然后用Rochelle’s盐饱和溶液淬灭反应，用1NNaOH使其保持碱性并再搅拌一小时。用二氯甲烷萃取混合物，在硫酸镁上干燥并真空除去溶剂。将所得到的粗制固体用质量选择型LCMS加以纯化，得到酰胺，为白色固体(71mg，0.14mmol)；LCMS(ES)95％纯度，m/z502[M+1]+。实施例620200下列方法被用于生成类似物的文库。0201向氨基酯(200mg，0.46mmol)和1-(2-氨基乙基)吡咯烷(80mgg，1.5当量)的二氯甲烷溶液(3mL)中加入氯化铝(100mg，1.5当量)，并将反应在室温下搅拌4小时。然后用Rochelle’s盐饱和溶液淬灭反应，用1NNaOH使其保持碱性并再搅拌一小时。用二氯甲烷萃取混合物，在硫酸镁上干燥并真空除去溶剂。将所形成的粗制固体用质量选择型LCMS加以纯化，得到酰胺，为白色固体(200mg，0.38mmol)；LCMS(ES)95％纯度，m/z519[M+1]+。实施例0202下列方法被用于生成类似物的文库。0203向氯酰胺(350mg，0.83mmol)的N-甲基吡咯烷酮溶液(2mL)中加入N-乙酰基哌嗪(160mg，1.24mmol)，并将混合物在110℃加热4小时。加水并过滤收集粗制产物。将所产生的固体溶解于二氯甲烷中，在硫酸钠上干燥并真空除去溶剂。将所产生的粗制固体在乙酸乙酯中研碎，得到酰胺，为白色固体(200mg，0.4mmol)；LCMS(ES)98％纯度，m/z516[M+1]+。实施例02044-甲氧基-2-(甲基硫)嘧啶-5-羧酸.室温下向4-氯-2-(甲基硫)嘧啶-5-羧酸乙酯(24.40g，104.9mmol)的MeOH溶液(125mL)中加入固体甲醇钠(11.40g，211.0mmol)。将此反应混合物在室温下搅拌5小时，然后用NaOH(17.70g，315.5mmol)的水溶液(100mL)处理。随后将其在相同温度下再搅拌1小时。将反应混合物浓缩至一半体积，然后用HCl(6N)酸化至pH＝4。将反应用EtOAc萃取(5×200mL)，将有机层用盐水(200mL)洗涤，在Na2SO4上干燥并浓缩，产生所需的产物，为白色固体(19.28g，92％)。MS(m/z)201(MH+)。1HNMR(DMSO-d6)δ8.72(s，1H)，3.98(s，3H)，2.54(s，3H)。实施例02053-(4-甲氧基-2-(甲基硫)嘧啶-5-基)-3-氧代丙酸乙酯.将4-甲氧基-2-(甲基硫)嘧啶-5-羧酸(10.92g，54.6mmol)和草酰氯(19.0mL，217.8mmol)的甲苯溶液(100mL)在100℃加热1小时。在减压条件下将溶剂去除，无需纯化将该粗制酰基氯用于下一步骤。在0℃，向MgCl2(7.80g，81.9mmol)和丙二酸乙酯镁(14.10g，82.6mmol)的THF溶液(100mL)中加入上述酰基氯的THF(100mL)溶液，随后加入TEA(15.0mL，107.6mmol)。将此反应混合物在0℃搅拌30分钟并在室温下搅拌2小时。加入EtOAc(200mL)和H2O(100mL)并再搅拌30分钟。分离出层，并将有机层用盐水(100mL)洗涤，在Na2SO4上干燥并浓缩。将粗制品通过急骤层析(15％EtOAc/己烷)纯化，产生所需的化合物，为白色固体(7.73g，52％)。MS(m/z)271(MH+)。1HNMR(CDCl3)δ12.65(s，1Hx2/3)，8.85(s，1Hx1/3)，8.84(s，1Hx2/3)，6.03(s，1Hx2/3)，4.26(q，2Hx2/3)，4.19(q，2Hx1/3)，4.10(s，3Hx2/3)，4.09(s，3Hx1/3)，3.92(s，2Hx1/3)，2.60(s，3Hx1/3)，2.59(s，3Hx2/3)，1.34(t，3Hx2/3)，1.26(3Hx1/3)。实施例602062-(4-甲氧基-2-(甲基硫)嘧啶-5-羰基)-3，3-双(甲基硫)丙烯酸乙酯。在-5℃向3-(4-甲氧基-2-(甲基硫)嘧啶-5-基)-3-氧代丙酸乙酯的DMF(85mL)溶液中加入甲基碘(5.3mL，85.1mmol)、二硫化碳(2.6mL，43.0mmol)。缓慢加入固体K2CO3，保持内部温度为-3℃以下。将反应混合物在-5℃搅拌1小时并在室温搅拌1小时。将其用EtOAc(300mL)稀释，用H2O(2×200mL)洗涤，并在Na2SO4上干燥。在减压条件下除去溶剂，并将粗制品通过急骤层析(20％EtOAc/己烷)纯化，产生所需的产物，为黄色的油(7.60g，71％)。MS(m/z)375(MH+)。1HNMR(CDCl3)δ8.82(s，1H)，4.16(q，2H)，4.03(s，3H)，2.61(s，3H)，2.51(brs，3H)，2.28(brs，3H)，1.15(t，3H)。实施例602072-甲基硫烷基-5-氧代-5H-7-硫杂-1，3，11b-三氮杂-苯并[c]芴-6-羧酸乙酯。将2-(4-甲氧基-2-(甲基硫)嘧啶-5-羰基)-3，3-双(甲基硫)丙烯酸乙酯(475mg，1.27mmol)和2-氨基苯硫醇(200mg，1.60mmol)的甲苯溶液(5mL)加热至干，并继续在140℃加热纯物质1小时。向反应中加入甲苯(30mL)和K2CO3(350mg，2.53mmol)，并将其再加热1小时。反应混合物冷却至室温，加入EtOAc(100mL)和H2O(50mL)。分离出层，并将有机层用盐水(100mL)洗涤，在Na2SO4上干燥并浓缩。将此粗制固体在Et2O中研碎，得到所需的产物，为黄色固体(260mg，55％)。MS(m/z)372(MH+)。1HNMR(DMSO-d6)δ9.37(d，1H)，9.30(s，1H)，8.06(m，1H)，7.65(m，1H)，7.54(m，1H)，4.35(q，2H)，2.78(s，3H)，1.34(t，3H)。实施例6802082-甲基硫烷基-5-氧代-5H-7-硫杂-1，3，11b-三氮杂-苯并[c]芴-6-羧酸(2-环戊基-乙基)-酰胺。室温下向2-甲基硫烷基-5-氧代-5H-7-硫杂-1，3，11b-三氮杂-苯并[c]芴-6-羧酸乙酯(230mg，0.619mmol)和2-(吡咯烷-1-基)乙胺(0.24mL，1.854mmol)的DCM(15mL)溶液中加入固体AlCl3(250mg，1.875mmol)。将反应在室温下搅拌1小时并用DCM(100mL)、浓酒石酸钾(30mL)和NaOH(6N，10mL)稀释。将混合物搅拌15分钟并分离出层。将含水层用DCM(50mL)萃取，并用盐水(50mL)洗涤合并的有机层。将粗制反应混合物在Na2SO4上干燥并浓缩，产生所需的产物，为黄色固体(250mg，92％)。MS(m/z)440(MH+)。1HNMR(CDCl3)δ10.26(br，1H)，9.61(s，1H)，9.55(m，1H)，7.77(m，1H)，7.57(m，1H)，7.50(m，1H)，3.67(q，2H)，2.81(s，3H)，2.77(t，2H)，2.63(m，4H)，1.82(m，4H)。实施例6902092-(4-乙酰基-哌嗪-1-基)-5-氧代-5H-7-硫杂-1，3，11b-三氮杂-苯并[c]芴-6-羧酸(2-吡咯烷-1-基-乙基)-酰胺。将2-甲基硫烷基-5-氧代-5H-7-硫杂-1，3，11b-三氮杂-苯并[c]芴-6-羧酸(2-环戊基-乙基)-酰胺(25mg，0.057mmol)和1-(哌嗪-1-基)乙酮(75mg，0.585mmol)的NMP溶液(1.0mL)在200℃微波加热20分钟。通过反相HPLC纯化该粗制反应混合物。MS(m/z)520(MH+)。实施例7002107-甲基-2-甲基硫烷基-5，8-二氧代-7，8-二氢-5H-1，3，7，12b-四氮杂-苯并[c]菲-6-羧酸乙酯。将2-(4-甲氧基-2-(甲基硫)嘧啶-5-羰基)-3，3-双(甲基硫)丙烯酸乙酯(775mg，2.069mmol)和2-氨基-N-甲基苯甲酰胺(475mg，3.163mmol)的甲苯溶液(5mL)在氮气流下加热以使甲苯蒸发，并继续以纯化合物在140℃加热过夜。冷却至室温，将在DCM(10mL)中形成的沉淀滤出。将母液的溶剂在减压条件下除去，并用Et2O(10mL)重复该沉淀过程。在甲醇(10mL)中研碎，得到所需的产物，为黄色固体(30mg，4％)。MS(m/z)397(MH+)。1HNMR(CDCl3)δ9.37(s，1H)，8.37(d，1H)，8.26(dd，1H)，7.70(m，1H)，7.49(m，1H)，4.46(q，2H)，3.61(s，3H)，2.60(s，3H)，1.43(t，3H)。实施例7102112-甲基硫烷基-5，8-二氧代-7，8-二氢-5H-1，3，7，12b-四氮杂-苯并[c]菲-6-羧酸乙酯。将2-(4-甲氧基-2-(甲基硫)嘧啶-5-羰基)-3，3-双(甲基硫)丙烯酸乙酯(250mg，0.668mmol)和2-氨基苯甲酰胺(118mg，0.867mmol)的DCM溶液(5mL)在氮气流下加热以使DCM蒸发，并继续以纯化合物在140℃加热过夜。冷却至室温后，将残留物溶解于DCM(7mL)中，并用NaH(60mg，1.500mmol)处理。将反应在室温下搅拌1小时，并用DCM(20mL)和H2O(20mL)稀释。分离出层，并在减压条件下除去DCM。在Et2O(10mL)中研碎该粗制品，得到所需的产物，为黄色固体(50mg，20％)。MS(m/z)383(MH+)。1HNMR(CDCl3)δ13.58(brs，1H)，9.43(s，1H)，8.60(d，1H)，8.33(dd，1H)，7.79(m，1H)，7.59(m，1H)，4.48(q，2H)，2.62(s，3H)，1.46(t，3H)。实施例0212按照公开的方法，其被稍加修改(J.Med.Chem.2003，46，1661-1669)，制备该物质。在氮气环境下，将2-氨基苄胺(2.0当量，2.45g，20.05mmol)溶解于THF(25ml)中。在30分钟内，通过注射泵缓慢加入二碳酸二叔丁酯(1.0当量，2.19g，10.03mmol)的THF(25ml)溶液。数分钟后，加入额外的THF(25ml)以使该浓稠的悬浮液能够充分的搅拌。室温下搅拌过夜，滤出形成的白色固体。真空浓缩滤液，倒在硅胶柱顶部，通过色谱加以纯化(梯度为含10％至20％EtOAc的己烷)。将所产生的固体在EtOAc/己烷中重结晶，得到白色结晶固体(1.95g，87％收率，基于Boc2O)。LCMS(ES)95％纯度，m/z224[M+H]+，245[M+Na]+；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ1.44(s，9H)，4.23(d，J＝6.0，2H)，4.2(brs，2H)，4.80(brs，1H)，6.68(t，J＝7.6，2H)，7.02(d，J＝6.8，1H)，7.10(dt，J＝8.0，J＝1.6，1H)ppm。实施例730213将化合物1(1.22g，5.49mmol)和2(2.01g，5.49mmol)的DMF混合物(10ml)在80℃搅拌5小时，同时保持向溶液中充入氮气。加入K2CO3(1.2当量，910mg，6.58mmol)，并将混合物在80℃搅拌40分钟。加水并用CH2Cl2萃取所产生的胶状物质(3x)。将合并的萃取物用水洗涤(1x)，在Na2SO4上干燥并真空除去挥发物，得到浓稠的油(3.2g含溶剂的物质，＞100％收率)。所得的物质纯度85％以上，无需进一步纯化而被用于下面的步骤。一小份用制备型HPLC进行纯化用于表征。LCMS(ES)95％纯度，m/z504[M]+，506[M+2]+；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ1.38(s，9H)，1.40(m，3H)，2.32(s，3H)，3.93(dd，J＝15.2，J＝5.5，1H)，4.24(dd，J＝14.8，J＝4.2，1H)，4.43(m，2H)，4.84(brt，1H)，7.15(m，1H)，7.29(m，1H)，7.45(m，1H)，7.57(m，2H)，8.61(d，J＝8.8，1H)ppm。实施例0214将化合物3(1.5g，2.98mmol)溶解于5ml三氟乙酸中。室温下搅拌混合物2小时。真空除去挥发物，用加热枪加热所产生的浓稠的油并保持真空。一直进行此项操作直至通过环化作用使4的形成完毕(LCMS监测)。通过急骤层析(梯度为含30％至80％EtOAc的己烷)将此化合物在硅胶上纯化。将浓缩溶剂后沉淀的固体过滤并干燥，得到化合物4，为白色微晶体固体(434mg，41％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z356[M+H]+，378[M+Na]+，310[M+1-EtOH]+；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ1.43(t，J＝6.8，3H)，4.40(q，J＝7.2，2H)，4.46(d，J＝2.4，2H)，7.24-7.40(m，4H)，7.69(d，J＝8.4，1H)，8.62(d，J＝8.0，1H)，10.74(brs，1H)ppm。实施例750215将化合物4(1.0当量，198mg，0.556mmol)和K2CO3(2.0当量，154mg，1.11mmol)悬浮于DMF(1.5ml)中。加入碘甲烷(1.4当量，0.05ml，0.80mmol)并将混合物在70℃搅拌45分钟。加水并用CH2Cl2萃取该物质(3x)。将合并的萃取物用水洗涤，在Na2SO4上干燥并真空除去挥发物。在硅胶上通过急骤层析(梯度为含40％至80％EtOAc的己烷)纯化后，分离出化合物5，为灰白色固体(181mg，88％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z370[M+H]+，324[M+1-EtOH]+；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ1.41(t，J＝7.2，3H)，3.17(s，3H)，4.29(s，2H)，4.41(q，J＝7.2，2H)，7.27(d，J＝7.2，1H)，7.33(t，J＝7.6，1H)，7.36(d，J＝8.4，1H)，7.39(td，J＝7.2，J＝1.2，1H)，7.57(d，J＝8.4，1H)，8.61(d，J＝8.4，1H)ppm。实施例0216将化合物4(1.0当量，104mg，0.29mmol)悬浮于THF中。滴加DDQ(1.1当量，73mg，0.32mmol)的THF溶液(1ml)，并将所产生的混合物在70℃搅拌24小时。加入1NNaOH水溶液并用CH2Cl2萃取该溶液(4x)。将合并的萃取物用饱和NaHCO3水溶液清洗，在Na2SO4上干燥并真空除去溶剂。通过制备型HPLC(MeCN/水)纯化该化合物。蒸发MeCN，加入NaHCO3并用CH2Cl2萃取该物质。将合并的萃取物在Na2SO4上干燥并真空除去溶剂，得到6，为灰白色固体(18mg，17％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z372[M+H]+，326[M+1-EtOH]+；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ1.44(t，J＝6.8，3H)，4.42(q，J＝7.2，2H)，6.01(d，J＝4.4，1H)，7.4-7.55(m，4H)，7.98(d，J＝8.8，1H)，8.64(d，J＝8.4，1H)，11.53(brs，1H)ppm。实施例770217将化合物6(8mg，0.021mmol)悬浮于二烷(0.5ml)中。加入一滴含水浓HCl并将所形成的黄色溶液在室温下搅拌。2小时后，再加入一滴浓HCl，向该溶液中充入一些空气。将该溶液在室温下搅拌24小时。真空除去溶剂，加入NMP并通过制备型HPLC(MeCN/水)纯化该化合物。蒸发乙腈，用CH2Cl2萃取该产物(3x)并将合并的萃取物在Na2SO4上干燥。除去溶剂，得到7，为固体(5mg，62％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z370[M+H]+，392[M+23]，324[M+1-EtOH]+；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ1.46(t，J＝7.2，3H)，4.48(q，J＝7.2，2H)，7.52(d，J＝8.0，1H)，7.58(t，J＝6.8，1H)，7.81(dt，J＝6.8，J＝1.6，1H)，8.33(dd，J＝7.6，J＝1.2，1H)，8.56(d，J＝8.8，1H)，8.70(d，J＝8.0，1H)，13.58(brs，1H)ppm。实施例780218将化合物4(1.0当量，218mg，0.613mmol)和K2CO3(2.0当量，169mg，1.22mmol)悬浮于DMF(1.5ml)中。加入碘甲烷(1.2当量，0.059ml，0.74mmol)并将此混合物在70℃搅拌35分钟。加水并用CH2Cl2萃取该物质(4x)。将合并的萃取物在Na2SO4上干燥并真空除去挥发物。经制备型HPLC纯化后，通过加入NaHCO3调节所形成的MeCN/水溶液的pH，并蒸发MeCN。用CH2Cl2萃取该物质并将合并的萃取物在Na2SO4上干燥。用CH2Cl2/己烷沉淀，得到8，为灰白色固体(77mg，33％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z384[M+H]+，406[M+Na]+，338[M+1-EtOH]+。实施例790219将化合物4(1.0当量，110mg，0.309mmol)和N-乙酰基哌嗪(4.0当量，158mg，1.233mmol)在NMP(0.3ml)中混合，通过微波将所形成的溶液在100℃加热5分钟。加入EtOAc和己烷的混合物，将所产生的固体过滤并干燥。分离出化合物9，为灰白色固体(145mg，100％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z448[M+H]+。实施例800220按照制备化合物9所用的方法，制备化合物10。分离出化合物10，为灰白色固体(147mg，70％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z462[M+H]+，416[M+H-EtOH]+。实施例80221将化合物9(1.0当量，131mg，0.293mmol)和1-(2-氨基乙基)吡咯烷(1.5当量，0.05ml，0.394mmol)在CH2Cl2(5ml)中混合。加入AlCl3(2.0当量，80mg，0.60mmol)，并将所形成的溶液在室温下剧烈搅拌。3小时后，再加入0.1ml1-(2-氨基乙基)吡咯烷和2mlCH2Cl2，并将此反应搅拌过夜。真空除去CH2Cl2后，将所形成的浆液用饱和酒石酸水溶液处理，并搅拌直至所有固体消失(大约1小时完成水解)。加水并通过加入NaOH将pH调至14。用CH2Cl2萃取该产物(4x)。将合并的萃取物用盐水洗涤(1x)并在Na2SO4上干燥。除去溶剂后，将该粗制物质溶解于NMP和三氟乙酸的混合物中，并通过制备型HPLC(MeCN，水)纯化。用NaOH调节pH并蒸发MeCN以后，用CH2Cl2萃取该物质。在Na2SO4上干燥并将挥发物蒸发后，将化合物11用EtOAc/己烷沉淀，过滤并干燥，提供白色固体(60mg，40％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z516[M+H]+。实施例80222按照制备化合物11所用的方法，制备化合物12。分离出化合物12，为灰白色固体(28mg，17％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z530[M+H]+。实施例80223将化合物8(1.0当量，77mg，0.201mmol)和N-乙酰基哌嗪(4.0当量，103mg，0.803mmol)在NMP(0.5ml)中混合，并在100℃微波加热10分钟。加入水和盐水，并过滤分离胶状固体。将此粗制物质溶解于CH2Cl2，将溶液在Na2SO4上干燥并真空除去挥发物。然后按照制备化合物11所用的方法，对该粗制的酯进行最后的反应步骤。分离出化合物13，为灰白色固体(7mg，6％收率)。LCMS(ES)95％纯度，m/z544[M+H]+。实施例840224按照实施例83中所述的制备化合物13所用的方法，制备化合物14。分离出化合物14，为灰白色固体。LCMS(ES)91％纯度，m/z530[M+H]+。实施例80225按照Abbotto，Bradamanteet.al.(J.Org.Chem.2002，16，5753)的方法制备2-(4-氯-苯并噻唑-2-基)乙酸乙酯。将纯的4-氯-2-氨基苯硫酚(6.36g，40mmol)和氰基乙酸乙酯(6.8g，60mmol)的混合物在125℃加热2小时，此时TLC分析表明反应完成，如通过初始物质的消失所判断的。用乙醚和己烷研碎此混合物，得到第一批的7.91g黄色晶体和第二批的0.75g晶体，总共8.66g(85％)。LCMS.256.2(M+H)+。0226将2，6-二氯皮考啉酸(1.80g，9.5mmol)悬浮于二氯甲烷(10ml)中，并用草酰氯(1.53g，12.0mmol)处理。将此混合物在冰浴中冷却，加入2滴二甲基甲酰胺。经初始的剧烈脱气后，移去冰浴并将溶液在室温下搅拌18小时。用甲醇淬灭一小份样品并通过LCMS进行分析，表明所有的酸已被转化为酰基氯。将该溶液在旋转蒸发仪上浓缩，得到酰基氯，为浅棕色结晶固体，其无需进一步纯化而被用于下面的步骤。LCMS206.2(甲酯M+H)+。0227将四氢呋喃(25ml)加入到2-(4-氯-苯并噻唑-2-基)乙酸乙酯(2.2g，8.6mmol)、氯化镁(1.19g，12.9mmol)和来自前面步骤的2，6-二氯吡啶甲酰氯(2，6-dichloropicolinylchloride)的混合物中。将所形成的悬浮液在冰浴中冷却，并滴加三乙胺(2.4g，17.2mmol)，滴加速度使内部温度不超过10℃，如用内部热电耦探针所测。当添加完毕后，移去冰浴，并将混合物搅拌同时在2小时内升至室温。将此反应用二甲基甲酰胺和碳酸钾(1.19g，8.6mmol)稀释，并加热至80℃1小时，此时LCMS表明反应进行。用水稀释该反应并过滤。将固体溶解于二氯甲烷和氯仿的混合物中，用水清洗并将有机相在硫酸钠上干燥。经旋转蒸发仪浓缩后，通过用乙醚研碎来纯化产物，得到2.5g(74％)的二氯酯，为浅棕色固体。LCMS393.2(M+H)+。实施例80228将2-(1-甲基吡咯烷-2-基)乙胺(295mg，2.3mmol)的二氯甲烷溶液(5ml)用三甲基铝(0.99ml，25％，在己烷中，2.37mmol)处理。将此溶液加入到含有二氯-酯A(600mg，1.53mmol)和二氯甲烷(10ml)的溶液中，加入速度使内部温度不超过10℃。将此溶液搅拌18小时，此时LCMS判断反应完成。将该反应用Rochelle’s盐处理并用二氯甲烷萃取三次。将有机萃取物在硫酸钠上干燥，得到残留物，其通过用二氯甲烷和乙醚研碎来加以纯化，得到450mg(62％)二氯-酰胺B，为浅棕色固体。LCMS475.5(M+H)+。实施例80229将boc-胺(250mg，1.0mmol)的混合物通过用三氟乙酸(1ml)和二氯甲烷(1ml)在50℃处理2小时来脱保护。将所产生的残留物在旋转蒸发仪上浓缩，随后高真空处理。向此残留物中加入二氯-酰胺B(200mg，0.42mmol)、N-甲基吡咯烷酮(0.8ml)和二异丙基乙胺(0.5ml)。将该混合物在80℃搅拌72小时，此时LCMS表明反应进行。将混合物用水(含10％三氟乙酸)稀释，并通过制备型HPLC纯化，得到286mg(97％)化合物C，其为对应的三氟乙酸盐。LCMS588.3(M+H)+。实施例880230此实施例评价了如下静脉内施用的测试化合物的活性。方法02316周龄雌性nu/nu小鼠购自TaconicFarms，GermantownNY。将它们在右侧腹皮下注射以5×106个HCT116细胞。当肿瘤达到研究用的足够大小时，将它们随机分组。载体242.9mm3测试化合物251.0mm0232动物通过经尾部侧静脉的弹丸式静脉内注射来给药，连续给药五天。在第1、4和6天进行游标卡尺测量。图3表示了测试化合物在剂量为25mg/kg时的活性，并未观察到不良效应。实施例890233此实施例评价了如下静脉内施用的测试化合物的活性。方法02346周龄雌性nu/nu小鼠购自SimonsenLabs，Gilroy，CA。将它们在右侧腹皮下注射以5×106个HCT116细胞。当肿瘤达到研究用的足够大小时，将它们随机分组。载体101.9mm3测试化合物152.8mm0235动物通过经尾部侧静脉的弹丸式静脉内注射来给药，连续给药十四天。在第1、3、5、7、10、12、14和18天进行游标卡尺测量。图4表示了剂量为12.5mg/kg时的活性，并未观察到不良效果。实施例900236此实施例评价了以不同剂量水平静脉内施用的实施例89的测试化合物活性。方法02376周龄雌性nu/nu小鼠购自SimonsenLabs，Gilroy，CA。将它们右侧腹皮下注射以5×106个HCT116细胞。当肿瘤达到研究用的足够大小时，将它们随机分组。载体114.6mm3测试化合物106.1mm3测试化合物84.1mm0238动物通过经尾部侧静脉的弹丸式静脉内注射来给药，连续给药十四天。在第1、4、6、8、12和15天进行游标卡尺测量。图5表示了剂量依赖活性，未观察到不良效果。实施例90239此实施例评价了如下静脉内施用的测试化合物的活性。方法02406周龄雌性nu/nu小鼠购自TaconicFarms，GermantownNY。将它们右侧腹皮下注射以5×106个HCT116细胞。当肿瘤达到研究用的足够大小时，将它们随机分组。载体242.9mm3测试化合物252.1mm0241动物通过经尾部侧静脉的弹丸式静脉内注射来给药，连续给药五天。在第1、4和6天采用游标卡尺测量。图6表示了测试化合物在剂量为25mg/kg时的活性，并未观察到不良效果。实施例90242此实施例评价了如下静脉内施用的测试化合物的活性。方法02436周龄雌性nu/nu小鼠购自TaconicFarms，GermantownNY。将它们在右侧腹皮下注射以5×106个HCT116细胞。当肿瘤达到研究用的足够大小时，将它们随机分组。载体242.9mm3测试化合物236.1mm0244动物通过经尾部侧静脉的弹丸式静脉内注射来给药，连续给药五天。在第1、4和6天采用游标卡尺测量。图7表示了测试化合物在剂量为25mg/kg时的活性，并未观察到不良效果。实施例90245此实施例评价了以下静脉内施用的测试化合物的活性。方法02466周龄雌性nu/nu小鼠购自TaconicFarms，GermantownNY。将它们在右侧腹皮下注射以5×106个HCT116细胞。当肿瘤达到研究用的足够大小时，将它们随机分组。载体242.9mm3测试化合物254.7mm0247动物通过经尾部侧静脉的弹丸式静脉内注射来给药，连续给药五天。在第1、4和6天采用游标卡尺测量。图8表示了测试化合物在剂量为25mg/kg时的活性，并未观察到不良效果。实施例90248此实施例评价了以下静脉内施用的测试化合物的活性。方法02496周龄雌性nu/nu小鼠购自TaconicFarms，GermantownNY。将它们在右侧腹皮下注射以5×106个HCT116细胞。当肿瘤达到研究用的足够大小时，将它们随机分组。载体112.7mm3测试化合物113.1mm325mg/kg测试化合物110.1mm312.5mg/kgCPT11109.4mm0250动物通过经尾部侧静脉的弹丸式静脉内注射来给药，连续给药九天。在第1、3、5、7和9天采用游标卡尺测量。图9表示了高剂量时有限的活性以及中剂量时无活性，并未观察到不良效果。实施例90251此实施例评价了以下静脉内施用的测试化合物的活性。方法02526周龄雌性nu/nu小鼠购自TaconicFarms，GermantownNY。将它们在右侧腹皮下注射以5×106个HCT116细胞。当肿瘤达到研究用的足够大小时，将它们随机分组。载体112.7mm3测试化合物107.1mm325mg/kg测试化合物108.9mm312.5mg/kgCPT11109.4mm0253动物通过经尾部侧静脉的弹丸式静脉内注射来给药，连续给药七天。在第1、3、5和7天采用游标卡尺测量。图10显示了优良的活性，具有极小的剂量依赖性。未观察到不良效果。实施例96细胞增生和/或细胞毒性试验0254本发明化合物的抗增生作用可以按照下述方案用细胞增殖和/或毒性试验加以测试。0255细胞培养.人子宫颈上皮细胞(HeLa细胞)从美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)获得。在37℃5％CO2的加湿环境中，使细胞生长于Eagle′s低限基本培养基(MEM，Hyclone，Utah)，该培养基补加了2mM谷酰胺、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、1.5g/LNaHCO3、50mg/L庆大霉素和10％胎牛血清(Hyclone，USA)。0256MTS试验.抗癌药物的抗增生作用通过CellTiter96AQueous试验(Promega，WI)检测，该试验是用于确定活细胞数的比色试验。(参见例如Wang，L.，etal.，MethodsCellSci(1996)18249-255)。一般而言，在第0天将细胞(2,000至5,000个细胞/孔)接种于96孔平底培养板(Corning，NY)中的100μl不含任何抗癌药物的培养基中，在第1天将培养基更换为含各种浓度抗癌药物的培养基。在正常生长条件下培养3天后(第4天)，用PBS将单层细胞清洗一次，并将培养基换为96孔板中每孔100μlPBS。将MTS和PMS以20∶1的比例混合后，向96孔板的每孔中加入20μlMTS/PMS溶液，并在37℃5％CO2的加湿环境中温育4小时。用FLUOstarGalaxy96孔板读数器(BMGLabtechnologies，德国)读取490nm处的吸光度。实施例97在细胞分析中mRNA值的测量0257实时定量PCR(QPCR)法可以被用于在同一试管中检测靶c-myc以及内源性参照GAPDH基因拷贝的变化。一般地，将细胞(15,000个细胞/孔)接种于96孔平底培养板(Corning，NY)并在正常生长条件下过夜培养。第二天，用含各种浓度抗癌药物的培养基替换原培养基，并在37℃5％CO2的加湿环境中温育4小时。用RNeasy96Kit(QIAGEN，CA)提取总RNA(tRNA)。tRNA的浓度用RiboGreenRNA定量试剂(MolecularProbes，OR)来确定。0258可以在25μl反应体系中使用来自每孔的50ngtRNA进行反转录(RT)反应，该反应体系包含1xTaqManRT缓冲液、2.5uM随机六聚物、5.5mMMgCl2、0.5mM各种脱氧核苷三磷酸(dNTP)、30UMultiScribe反转录酶和10URNase抑制剂。将RT反应在25℃温育10分钟，在48℃反转录30分钟，在95℃灭活5分钟，并放置于4℃。所有RT试剂可从AppliedBiosystems，CA购得。0259可以在50μl反应体系中进行实时QPCR反应，该反应体系包含5μlcDNA、1xUniversalPCRMaster混合物、1xc-myc预制的引物和探针套装和0.8xGAPDH预制的引物和探针套装。因为Hela中的GAPDH基因相对丰富，所以可以调整GAPDH引物和探针浓度以得到对于同一试管中的两种基因而言准确的循环阈值(CT)。循环阈值(CT)代表了部分循环数(fractionalcyclenumber)，在该循环数时，扩增的靶的量达到一个固定阈值。通过这样做，GAPDH的扩增在其可能限制到c-myc的扩增可用的一般反应物之前即被终止。ΔRn值表示标准化的报告子信号减基线信号。在PCR期间，由于扩增子拷贝数的增加，ΔRn增大，直至反应达到平台。0260用6FAMTM染料-MGB标记c-myc探针，用VICTM染料-MGB标记GAPDH探针。在50℃预温育2分钟以激活AmpEraseUNG酶，然后在95℃预温育10分钟以激活AmpliTaqDNA聚合酶。将DNA在95℃15秒和60℃1分钟扩增40个循环。人c-myc和GAPDHcDNA被扩增、检测和实时定量，其中使用ABIPrism7000序列检测系统(AppliedBiosystems，CA)，该系统被设定为同时检测6-FAM和VIC两种报告子染料。0261可以使用ABIPRISM序列检测系统和MicrosoftExcel进行数据分析。使用标准曲线且同时使用比较CT法来完成相对定量，并且两种方法都产生了相等价的结果。已知扩增曲线与CT相交的循环准确地反映了相对mRNA值。(参见Heid，etal.，GenomeRes.(1996)6986-994；Gibson，etal.，GenomeRes.(1996)6995-1001)。对每个cDNA样品的QPCR反应进行三次重复并取三次的CT值的平均值。所有试剂，包括预制的引物与探针套装，可以从AppliedBiosystems，CA购得。实施例98体外表征0262多种方法可以用于体外表征本发明的化合物，包括但不限于i)中止试验(stopassays)；ii)四联体/双联体竞争试验；iii)quadrome足印(footprint)；和iv)在缺乏竞争物分子的情况下的直接试验。0263中止试验.中止试验是用于检测结合并稳定靶G-四联体的药物的高通量的一过性(first-pass)筛选法。一般地，DNA模板寡核苷酸被制成，其含有“靶”四联体核苷酸序列，针对该序列进行所需的药物筛选。然后将荧光标记的引物DNA退火至模板DNA的3’末端。随后将DNA聚合酶诸如Taq聚合酶导入，通过由荧光标记的引物进行延伸来合成DNA的互补链。当Taq聚合酶的行进不受阻碍时，其合成模板的全长拷贝。加入仅结合于双联体DNA而并非选择性地结合于四联体区域的测试药物导致了全长产物合成的减少以及相伴随的可变长度DNA拷贝的增加。但是，如果测试药物选择性地结合于四联体并将其稳定，则聚合酶的行进仅中止于四联体，并且合成出特征性的“中止产物”。0264最初以单一浓度筛选化合物，然后在一定的剂量范围内对“命中物”(hits)进行再分析，以确定IC50值(即，产生中止产物/全长产物之比为1∶1时所需的药物浓度)。通过毛细管电泳可观察这些产物。0265四联体/双联体竞争物试验.相对于双链DNA，化合物对于靶四联体序列的选择性可以用竞争试验(即，“选择性筛选”)加以测量。这种选择性筛选使用中止试验作为报告系统来测量外部添加的DNA序列与用以结合药物的DNA模板中形成的靶四联体结构相竞争的相对能力。例如，竞争物是c-myc四联体序列，其与模板DNA中存在的四联体序列相同；或者是一种模拟复杂基因组双链DNA的质粒DNA。每种竞争物成功地“吸收”溶液中药物的程度是通过中止产物合成中的数量减少来反映的。按这种方式，药物对于靶四联体和双链DNA两者的相对结合亲和力被测定。0266Quadrome足印.还可以对化合物结合于其它具有生物学相关性的天然四联体结构的能力进行评价，所述天然四联体结构包括调控大量不同的癌基因的四联体控制元件。得到的数据用于生成Quadrome足印。0267直接相互作用试验.可以通过化合物与能够形成四联体结构的核酸的直接相互作用能力对其进行评价，其中所述核酸不是端粒核酸。该试验可以在同一反应管或不同反应管中进行。例如，可以将化合物与每种核酸在同一反应管中相接触。可选地，可以将化合物与所测试的每种核酸在不同的反应管中单独接触。此处所用的端粒核酸代表染色体末端的高度重复核酸区域。如此处所用，直接相互作用是在没有竞争物核酸存在的情况下进行测量的。0268化合物与核酸之间的相互作用可以通过例如测量IC50值来加以确定，IC50值为结合作用和/或四联体稳定作用的指标。相互作用的选择性可以通过例如比较所测的IC50值来加以确定。例如，最低IC50值可以用来表示化合物与核酸之间强烈的相互作用，而最高IC50值表示相互作用差；因此，说明了相互作用的选择性。反应产物可以通过毛细管电泳来加以表征。实施例99直接相互作用实验0269一般地，将5’-荧光标记(FAM)引物(P45，15nM)与模板DNA(15nM)混合于Tris-HCL缓冲液(15mMTris，pH7.5)中，此Tris-HCL缓冲液含有10mMMgCl2、0.1mMEDTA和0.1mM混合的脱氧核苷三磷酸(dNTP’s)。将混合物在95℃变性5分钟，冷却至室温后，在37℃温育15分钟。冷却至室温后，加入1mMKCl2和测试化合物(各种浓度)，并将此混合物在室温温育15分钟。0270通过加入13mMKCl和TaqDNA聚合酶(2.5U/反应，Promega)并在70℃温育20分钟，进行引物延伸。通过将1μl的该反应混合物加入到10μl去离子甲酰胺(Hi-DiFormamide)与0.25μlLIZ120尺寸标准的混合物中，终止反应。通过在第一步加入各种不同浓度的竞争物核酸，随之加入引物和模板序列来重复此方法。以之前确立的用来产生1∶1比例的中止产物和全长产物的浓度加入G-四联体结合配体。每种核酸竞争物的CC50被定义为将中止产物与全长产物之比从1∶1改变为1∶2所需的竞争物浓度。可以用于本试验的四联体核酸序列在表4中阐明。表4(中止模板(STOPTEMPLATES))TGFB3-81TATACGGGGTGGGGGAGGGAGGGATTAGCGACACGCAATTGCTATAGTGAGTCGTATTAGCTACGTACAGTCAGTCAGACTHRAS-85TATACCGGGGCGGGGCGGGGGCGGGGGCTTAGCGACACGCAATTGCTATAGTGAGTCGTATTAGCTACGTACAGTCAGTCAGACTBCL2-97(全长)TAGGGGCGGGCGCGGGAGGAAGGGGGCGGGAGCGGGGCTGTTAGCGACACGCAATTGCTATAGTGAGTCGTATTAGCTACGTACAGTCAGTCAGACTHMGA-97TTAGAGAAGAGGGGAGGAGGAGGAGGAGAGGAGGAGGCGCTTAGCGACACGCAATTGCTATAGTGAGTCGTATTAGCTACGTACAGTCAGTCAGACTMYC99TCCAACTATGTATACTGGGGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAAGGTTAGCGACACGCAATTGCTATAGTGAGTCGTATTAGCTACGTACAGTCAGTCAGACTIMOTIF99TCCAACTATGTATACCCTTCCCCACCCTCCCCACCCTCCCCATTAGCGACACGCAATTGCTATAGTGAGTCGTATTAGCTACGTACAGTCAGTCAGACTHumtel-95TCATATATGACTACTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTACTGCCACGCAATTGCTATAGTGAGTCGTATTAGCTACGTACAGTCAGTCAGACTSRC89ATGATCACCGGGAGGAGGAGGAAGGAGGAAGCGCGCTGCCACGCAATTGCTATAGTGAGTCGTATTAGCTACGTACAGTCAGTCAGACT引物(45MER)AGTCTGACTGACTGTACGTAGCTAATACGACTCACTATAGCAATT实施例100细胞色素P450(CYP450)抑制试验0271可以评价本发明的化合物针对细胞色素P450同工酶的潜在抑制活性。一般地，将六支装有100μL溶液的反应管连同六管1∶6系列稀释的合适的阳性对照抑制物一起制备，所述溶液含有50mM磷酸钾，pH7.4、2.6mMNADP+，6.6mM6-磷酸葡萄糖、0.8U/mL6-磷酸葡糖脱氢酶以及1∶6系列稀释的测试化合物。通过向反应管中加入100μL预热的酶/底物溶液启动反应。通过向100μL辅因子溶液中加入50μL乙腈以便灭活酶，然后加入100μL酶/底物溶液，从而制备零时间点对照反应。还可以制备不含抑制物的对照反应。在37℃适当温育后，通过加入50μL乙腈终止反应。使用LC/MS/MS分析反应中代谢物形式的探针底物。实施例101评价化合物在肿瘤抑制中的功效0272评价本发明化合物在人类癌的无胸腺裸鼠模型中的功效的典型实验可以被设计如下。将使用五至六周龄、体重20克以上的雄性或雌性动物(小鼠，Sim)(NCR，nu/nu)。这些动物将被专门饲养，并且在研究开始时未经过实验处理。肿瘤将由注射的细胞或者由肿瘤碎块的传代细胞增殖而来。所要使用的细胞系包括，但不限于，aliaPaca-2、HPAC、Hs700T、Panc10.05、Panc02.13、PL45、SW190、Hs766T、CFPAC-1和PANC-1。0273细胞移植.将悬浮于含有或不含有Matrigel(CollaborativeBiomedicalProducts，Inc，Bedford，MA)的0.1ml培养基的一百万至一千万个细胞皮下接种于六十只动物的右肋处。每只动物只注射一次。在注射的7-14天内，肿瘤将生长到大约1.0cm3的研究用尺寸。将考虑一小部分的动物(＜10/60)。将使供体和肿瘤生长10-28天，至1.5cm3大小，以便用于连续移植。0274碎块移植.供体动物将被处安乐死，手术切除肿瘤并用无菌技术切成2mm3大小的碎块。用异氟烷把将要接受移植的动物轻度麻醉。用70％酒精和聚维酮碘清洁将移植的区域。然后用套管针将单个碎块皮下植入。0275功效研究.将50-60只携带肿瘤的动物随机分组。例如，在典型的研究中，可以将动物随机划分为三至八组，每组7只动物，如表5中所述。表5*载体/稀释剂**可商业获得的抗癌化合物，包括但不限于紫杉醇、CPT11和吉西他滨，将被用作阳性对照。0276给药方法.通过腹膜内(IP)、静脉内(IV)(尾部侧静脉)或口服(PO)的方式按每天一次(QD)、隔日一次(QOD)、每三天一次(Q3D)或每周一次施用化合物。动物将按系统化的顺序服药，该顺序为所有的组分配了相似的服药时程。对于弹丸式IP以及PO给药，将用手保定动物。对于IV弹丸式给药或短时间IV输注(一分钟)，将用器械保定动物而不服用镇静剂。每只动物每次给药将使用一次性消毒注射器。测试化合物与大约10-100mg/kg(例如大约40mg/kg)化学治疗剂诸如吉西他滨的联合，也将被检测，正常情况下通过IP每周给药一次。实施例102评价最大耐受剂量0277评价本发明化合物的最大耐受剂量(MTD)的典型实验可以被设计如下。对动物模型的选择如实施例101中所述。0278急性毒性研究.在测定单剂量后的MTD的典型研究中，六十只未经实验处理的动物，例如，将被随机分组，每组10只动物(5雄5雌)，将通过两种服药途径接受一种化合物或者通过单一的服药途径接受两种化合物。单次50mg/kgIV给药已表明其可被耐受，并被用作初步的低剂量水平。口服研究中的低剂量以预计的耐受能力为根据，如果有必要将会被下调。剂量水平、剂量体积以及给药溶液浓度的典型设计如表6中所述。表60279亚慢性研究.在表征重复给药后的剂量-反应关系的典型研究中，二十五只未经实验处理的动物，例如，将被随机分组，每组5只动物，如表7中所述。每两周的研究将只检测通过单一的服药途径以优化剂量服用的一种化合物，该优化剂量来自于从之前的急性毒性研究中搜集到的数据。表70280给药程序.化合物将通过IV(尾部侧静脉)或PO以QD、QOD、Q3D或Q7D的方式施用。动物将按系统化的顺序服药，该顺序为所有的组分配了相似的给药时程。对于PO给药，将用手保定动物。对于IV弹丸式给药或短时间IV输注(一分钟)，将用器械保定动物而不服用镇静剂。每只动物每次给药将使用一次性消毒注射器。实施例103评价药物动力学特性0281评价本文化合物的药物动力学特性的典型药物动力学研究可以被设计如下。雄性动物(Balb/c小鼠或SD大鼠)为五至六周龄。对于大鼠模型，使用体重在200克以上的大鼠。在典型的研究中，二十只动物，例如，将被随机分成4组，如表8中所述。一组不做处理，并采集样品用作基线。其它三组将通过静脉内注射给予单剂量的化合物。表80282给药程序.化合物将通过IV(尾部侧静脉)、IP或PO施用。动物将按系统化的顺序服药，该顺序为所有的组分配了相似的给药时程。对于IP和PO给药，将用手保定动物。对于IV弹丸式给药或短时间IV输注(一分钟)，将用器械保定动物而不服用镇静剂。每只动物每次给药将使用一次性消毒注射器。0283在第一次给药前，通过心脏穿刺从未经实验处理的动物中采集大约0.5ml血液。根据上表，通过心脏穿刺在每一时间点从每组的两只动物中定期采集血液样品(0.5ml)。所有样品将被放入含肝素锂抗凝剂的管中并立即颠倒混匀。将它们离心并将血浆在液氮中速冻，储存于-70℃或者更低的温度下并分析其药物水平。实施例104测定在肝细胞中的体外代谢稳定性0284确定新的化学实体在存在肝细胞(人类、大鼠、犬、猴)的情况下在体外温育过程中的稳定性的典型方案可以被设计如下。测试样品将与肝细胞以及合适的培养基一起在37℃温育不同的时间。将提取反应混合物并通过LC/MS/MS分析母体化合物和预期的代谢物。如果适用，将计算测试样品消耗的半衰期。进行代谢对照物实验，以便将其半衰期值与测试样品所得的半衰期值进行比较。代谢对照物可以是甲苯磺丁脲、地昔帕明(desipramine)和纳洛酮，这些化合物分别具有对应于低、中、高体内清除值的限定的药物动力学。0285代谢稳定性研究.一般而言，测试化合物的溶液将与代谢对照物的鸡尾酒溶液一起制备，所述代谢对照物意欲为酶活性提供一种参照。通过将这些预热的溶液与肝细胞悬浮液以及与培养基对照溶液合并在一起从而启动反应。启动后，立即从这些反应中采集对照零点样品。其它样品可以在适当的时间点取出。将每一样品立即放入终止溶液(含IS的酸化MeCN)中以终止反应。肝细胞空白悬浮液和测试化合物标准溶液将被制备。0286测试化合物的样品和标准品以及适当的空白可以经过常规的样品制备流程，并使用偶联于串连型质谱仪的HPLC对测试化合物的母体形式和/或代谢物形式进行分析。代谢对照物的样品和标准品可以经历此处所述的分析方法。在将加入KrebsHenseleit缓冲液的情况下，在室温下空气中用5％CO2为该缓冲液鼓泡5-10分钟，再加入BSA至0.2％w/v的终浓度。终止溶液的体积和样品制备方法将由方法开发过程中的测试样品决定。0287测试样品/培养基溶液.通过向含0.2％BSA的经含5％CO2的空气平衡的KrebsHenseleit缓冲液中加入适当体积的储液来制备测试样品溶液。终浓度将为5μM至20μM，且反应启动时的最终试验浓度将为1μM至10μM。0288代谢对照物/培养基溶液.通过向含0.2％BSA的经含5％CO2的空气平衡的KrebsHenseleit缓冲液中加入适当体积的每种代谢对照物的10mM储液来制备甲苯磺丁脲、地昔帕明和纳洛酮的溶液。每种代谢对照物的终浓度为20μM，且反应启动时的最终试验浓度将为10μM。0289肝细胞悬浮溶液.按照供货商(Invitrotech，Inc.)说明书，将肝细胞解冻并分离。在该方法的最后一步，用台盼蓝染色法确定细胞活力。然后，将肝细胞重悬于含0.2％BSA的经含5％CO2的空气平衡的KrebsHenseleit缓冲液中，使终浓度为500,000个活细胞/mL。反应启动时的浓度将是250,000个活细胞/mL。0290启动测试样品的温育.将步骤2.1.3中制备的等体积的测试样品溶液分装入四支聚丙烯闪烁管中。将所述管在37℃用95％的湿度和5％CO2预热5-10分钟。将等体积的含0.2％BSA的经含5％CO2的空气平衡的KrebsHenseleit缓冲液加入其中两支管中并充分混匀。开始反应后立即启动计时器，并从每管中取出100μL样品，放入装有适当体积的终止液的1.7mL离心管中。将这些样品用作培养基对照以检测非酶促降解以及对容器的非特异性结合。0291将上面制备的等体积的肝细胞悬浮液加入其中两支管中并充分混匀。开始反应后立即启动计时器，并从每管中取出100μL样品，放入装有适当体积的终止液的1.7mL离心管中。将所有的管放入保持于37℃、95％湿度和5％CO2的培养箱中。0292启动代谢对照物的温育.将上面制备的等体积的代谢对照物溶液分装入两支聚丙烯闪烁管中。将所述管在37℃用95％的湿度和5％CO2预热5-10分钟。将上面制备的等体积的肝细胞悬液加入两支管中的每一支中并充分混匀。开始反应后立即启动计时器，并从每管中取出100μL样品，放入装有等体积终止液的1.7mL离心管中。将所有的管放入保持于37℃、95％湿度和5％CO2的培养箱中。0293样品的收集.温和摇动反应管，按照下列方案，取出样品(100μL)，放入装有适当体积终止液的1.7mL离心管中5、10、15、30、60、90和120分钟后取出测试样品；30、60、90和120分钟后，取出代谢对照物样品。取样后立即将反应管放回培养箱直至收集完最后的样品。0294空白的制备.将肝细胞悬液样品(100μL)加入到等体积的含0.2％BSA的KrebsHenseleit缓冲液中并充分混匀。取出100μL的该溶液样品，放入装有测试样品反应所用的等体积终止液的1.7mL离心管中。将温育培养基样品(含0.2％BSA的KrebsHenseleit缓冲液)放入装有测试样品反应所用的等体积终止液的1.7mL离心管中。0295样品的制备与分析.将所有反应管在16,000g离心3分钟。将上清液放入聚丙烯自动采样管中，并储存于4℃(＜1天)或-70℃(＞1天)直至被分析。应用按照标准程序的HPLC/MS/MS条件对测试样品溶液进行分析。在一个实施例中，可以使用下列HPLC条件柱(PhenomenexSynergiHydro-RP，100.0×2.0mm，5μm)；保护柱(PhenomenexC18，4.0×2.0mm，5μm)；流速(0.3mL/min)；柱温45℃；注入体积10μL；自动采样器为室温。实施例105测定在微粒体中的体外代谢稳定性0296确定新的化学实体在存在肝脏微粒体(人类、大鼠、犬、猴)的情况下在体外温育过程中的稳定性的典型方案可以被设计如下。测试样品将与微粒体以及合适的培养基一起在37℃温育不同的时间。将提取反应混合物并通过LC/MS/MS分析母体化合物和预期的代谢物。如果适用，将计算测试样品消耗的半衰期。进行代谢对照物实验，以便将其半衰期值与测试样品所得的半衰期值进行比较。代谢对照物为甲苯磺丁脲、地昔帕明和睾酮，这些化合物分别具有对应于低、中、高体内清除值的限定的药物动力学。0297代谢稳定性研究.一般而言，准备六个装有100μL溶液的预热反应管，所述溶液含有50mM磷酸钾，pH7.4、2.6mMNADP+、6.6mM6-磷酸葡萄糖、0.8U/mL6-磷酸葡糖脱氢酶以及1、10或50μM的测试化合物。应用相同的酶溶液，同时用代谢对照物进行相似的反应，所述代谢对照物代表了低清除化合物(甲苯磺丁脲)、中度清除化合物(地昔帕明)和高清除化合物(睾酮)。通过加入100μL预热酶溶液启动反应并在37℃温育。在加入所述酶溶液之前，通过向测试化合物/辅因子溶液中加入50μL乙腈(含内标)来制备零时点反应。在15、30、60、90和120分钟后，从水浴中取出反应管并用50μL含内标的乙腈终止反应。提取反应并用带有MS/MS检测的C18柱对测试化合物的母体形式和一种代谢物进行样品分析。每项试验重复两次。0298辅因子/测试化合物溶液浓度.在10％DMSO(v/v)中制备10mMNCE储液。对于所有试验，在50mM磷酸钾，pH7.4、2.6mMNADP+、6.6mM6-磷酸葡萄糖和0.8U/mL6-磷酸葡糖脱氢酶(辅因子溶液)中制备2、20或100μM测试样品溶液。0299辅因子/代谢对照物溶液浓度.代谢对照物(甲苯磺丁脲、地昔帕明和睾酮)的储液将被用来在上面步骤中所述的辅因子溶液中制备6μM的代谢对照物溶液。0300酶溶液浓度.通过向50mM磷酸钾，pH7.4中加入肝脏微粒体至终浓度1mg/mL来制备酶溶液。所有的微粒体购自XenoTech或者InvitroTech，Inc.。0301启动反应.将所有反应管在37℃水浴中预热大约3-5分钟。向100μL辅因子溶液中加入50μL含15.9μM水松蕈素(nebularine)(内标)的乙腈以灭活各种酶，然后涡旋振荡混匀，从而为每一重份组制备了零时点对照反应。将通过向每一管中加入100μL酶溶液并涡旋振荡混匀而启动反应。将所有的试管，包括零时点对照，在37℃水浴中温育。在启动反应后试管中所有组分的最终浓度为50mM磷酸钾，pH7.4、1.3mMNADP+、3.3mM6-磷酸葡萄糖、0.4U/mL6-磷酸葡糖脱氢酶、0.5mg/mL肝脏微粒体以及1、10或50μM测试样品。0302终止与提取反应.在37℃15、30、60、90和120分钟后，通过加入150μL含15.9μM水松蕈素(内标)的乙腈来终止反应。120分钟后，从水浴中取出零时点对照。将所有的管在16,000g离心3分钟。将上清液放入聚丙烯自动采样管并储存于4℃(＜1天)或-70℃(＞1天)直至被分析。0303测试样品溶液的分析.应用按照标准程序的HPLC/MS/MS条件，诸如实施例39中所述，对测试样品溶液进行分析。实施例106细菌诱变力测试0304此诱变力评价试验(Ames试验)将评价测试样品抽提物诱导鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸(his)回复突变(由his-至his+)或者大肠杆菌的色氨酸(trp)回复突变(由trp-至trp+)的潜力，这些回复突变是由受试生物的基因组中的碱基变化或阅读框移码突变引起的。一般地，平板混合试验(plateincorporationassay)将使用五种鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)菌株(TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535)和一种大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株(WP2-uvrA-)在存在和不存在外源性哺乳动物激活系统(S9)的情况下进行。将测试样品溶解于5％的葡萄糖中。然后在临测试之前，在盐水中制成一系列稀释物。此外，将针对此试验进行范围确定研究(RangeFindingStudy)，以确定出用于明确的诱变力评价的合适剂量。测试物质的制备0305测试样品的储液将以20.0mg/mL被制备如下将1.0g测试样品加入到15.0mL0.1HCl，1分钟。室温下将测试样品搅拌15分钟。再加入33.0mL去离子水，并将其搅拌30分钟。然后将pH调至3.53。通过将此储液在使用前即刻稀释入5％葡萄糖中而制成较低的剂量。为了使任何由于降解作用而产生的变化最小化，将测试样品溶液在制备后保存于冰上并直至给药程序之前。测试样品将在体外通过与该测试系统相容的溶剂被施用。测试菌株的基因型表征0306将确认测试菌株工作储液的基因型标记和可接受的自发回复突变率。所有的工作储液应当显示出对组氨酸或色氨酸(仅大肠杆菌)的需求。此外，如果适当，将用各种试验确认下列一致性由于rfa细胞壁突变而造成的对结晶紫的敏感性；由于uvrB基因(大肠杆菌中为uvrA)缺失而造成的对紫外光的敏感性；由于pKM101质粒的存在而对氨苄青霉素的抗性；以及由于pAQ1质粒的存在而对四环素的抗性。对于各菌株而言，自发回复突变率将使用阴性对照来加以确定。0307水溶性测试样品将被溶解于等渗盐水溶液或其它合适的溶剂中。非水溶性测试样品将被溶解于二甲亚砜(DMSO)或其它合适的溶剂中。如果预料DMSO会引起与测试样品的不良反应，则将测试样品悬浮于羧甲基纤维素中。为帮助溶解，可以采用加热、剧烈涡旋振荡或其它可选溶剂。测试体系0308本试验将按照Ames(Amesetal，MutationResearch(1975)31347-364)所原始描述的并由Maron和Ames(Maronetal.，MutationResearch(1983)113173-215)更新的平板混合试验法来进行。在历史上，此试验已被用于检测组氨酸需求型菌株的基因中的突变，以产生非组氨酸依赖型菌株，或者与之相一致地，用于检测色氨酸需求型菌株的基因中的突变，以产生出非色氨酸依赖型菌株。此外，此方法已表明可以检测不同种类的化学诱变剂，这些化学诱变剂产生与不良效应相关的某类型的可遗传的DNA突变。0309Maron和Ames，supra；Greenetal.，MutationResearch(1976)3833-42以及Brusicketal.，MutationResearch(1980)76169-190描述了可用于本试验的鼠伤寒沙门氏菌菌株，TA97a、TA98、TA100和TA102。鼠伤寒沙门氏菌菌株TA1535和大肠杆菌菌株Wp2-uvrA-可以从美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)，Manassas，VA获得(ATCC号分别为29629和49979)。将验证所有测试菌株的工作储液，以确定其基因型标记和可接受的自发回复突变率。工作储液应当显示出对组氨酸或色氨酸(仅大肠杆菌)的需求。实验方法0310由冻存的工作储液制备受试菌株的母板。为制成用于本试验的每种细菌菌株的工作培养物，将单个菌落从母板上转移至牛肉膏营养肉汤中，并在37±2℃振荡培养直至光密度(650nm)达到0.6-1.6。此过夜培养物将被用于诱变力测试以及用于基因型鉴定。将进行基因型测试，如该实验方案中所述。0311为了对剂量范围和诱变力进行测试，将由含有0.6％Difco琼脂的0.5％NaCl构成的顶部琼脂熔化，并向熔化的顶部琼脂中按每100mL琼脂10mL的比例加入0.5mML-组氨酸/0.5mM生物素或0.5mML-色氨酸溶液。将补充后的琼脂按每管2mL等分并保存于45-47℃。为制备用于处理的顶部琼脂，向熔化的琼脂中加入0.1mL测试样品或对照、0.1mL细菌培养物和0.5mL磷酸缓冲盐溶液。将此混合物短暂涡旋振荡后，倒在室温的基本葡萄糖琼脂板上(1.5％Difco琼脂、2％葡萄糖，在Vogel-Bonner培养基E中)。通过加入0.5mLS9混合物代替PBS，提供代谢激活作用。让平板变硬，然后在37±2℃培养48-72小时。用自动图像分析系统对所有平板进行计数。阴性对照平板和测试样品处理的平板也将被检查细菌菌苔的存在情况。外源性代谢激活0312用于本试验的体外代谢激活系统包括多种SpragueDawley大鼠肝脏酶和多种辅因子。这些酶将包含在来自大鼠的肝脏微粒体(S9部分)制品中，所述大鼠用Arochlor处理以诱导多种酶的合成，这些酶能够将化学药品转化为更具活性的形式。使用前即刻将S9融解并与多种辅因子混合，从而在pH7.4的200mM磷酸盐缓冲液中包含了5％S9、5mM6-磷酸葡萄糖、4mMβ-烟碱-腺嘌呤二核苷酸磷酸、8mMMgCl2和33mMKCl。剂量水平和重复实验0313测试样品按一份三式以五个剂量水平(20.0、10.0、5.0、2.5和1.25mg/mL)与适当的载体(5％葡萄糖)和阳性对照一起在剂量范围试验中进行测试。这相当于2.0、1.0、0.5、0.25和0.125mg/板。0314为了精确的试验，将选择三个剂量水平(20.0、10.0和5.0mg/mL)，其相当于2.0、1.0和0.5mg/板。所有的处理，包括阴性对照和阳性对照，将会以重复三次的方式在存在和不存在代谢激活作用的情况下被铺板于测试菌株TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535和WP2-uvrA-上。这些剂量将根据诱发一定范围的测试样品毒性以及使所应用的剂量最大化来加以选择。对照物质0315对照物质可以被制备并应用于如表9所述的诱变力试验中。表9阴性(载体)对照0316将测试菌株以对应的最大浓度(0.1mL)与未处理的葡萄糖溶液，带有或者不带有S9，一起铺板。这些平板用作阴性对照，并提供了关于背景菌苔和回复突变型菌落形成的信息。剂量范围试验0317最初的剂量范围试验从2.0mg/板的最大浓度开始。四个将被测试的较低剂量将按1∶2的稀释系列进行稀释。回复突变试验0318每个单独的细菌菌株，带有和不带有S9，与其自身的同时的阳性对照和载体对照一起被当作一个独立的实验。将所有平板用自动菌落计数仪打分，并打印输出数据。阳性对照包括直接作用的诱变剂和需要进行代谢转化的诱变剂。对于使用了适当的阳性对照物的所有菌株而言，可以观察到回复突变率有两倍或者更高倍数的增长。对于每个菌株而言，阴性对照样品的回复突变率应当在实验室历史数据的预期范围内或者略低于该范围。对于任何菌株而言，诱导后的阳性结果将表现为每板中回复突变型菌落数相对于阴性对照值有至少2倍的增长。实施例107体外的CHO细胞染色体畸变分析0319染色体畸变分析可以是可被用于筛查具有潜在遗传毒性的物质的若干种体外检测方法之一。染色体畸变是与癌发生相关的突变。因此，染色体突变分析关系到潜在诱变剂和致癌物的检测(Gallowayetal.，Environ.Mut.(1985)71-51；Gallowayetal.，Environ.Mut.(1987)101-175)。这种染色体畸变分析对测试样品抽提物诱发中国仓鼠卵巢细胞(CHO)损伤的潜力进行评价。此项检测将会在存在和不存在外源的哺乳动物激活系统(S9)的情况下分三个处理阶段进行。所有的阴性对照处理的制备物应当表现出正常水平的自发发生的染色体畸变，而阳性对照处理的培养物应当表现出畸变染色体有显著的剂量依赖型增加。0320用以确定测试物质是否为断裂剂，即其是否具有使染色体断裂的能力的典型试验可以被设计如下。断裂性是一个重要的端点(endpoint)，因为正是通过染色体的断裂和不适当的再连接可以将某些癌基因(例如myc)激活，并可以使某些肿瘤抑制基因(例如抑制成视网膜细胞瘤的那些基因)失活。在此项测试中，哺乳动物中国仓鼠卵巢(CHO)细胞将被暴露于测试物质并用纺锤体毒剂将其阻滞于中期。在将处理后的CHO细胞低渗膨胀、固定并染色后，通过显微镜对染色体进行观察。被发现能够诱发染色体断裂的试剂有高度的可能性成为致癌物，同时具有诱发可遗传的染色体缺陷的潜力。0321CHO-K1细胞系(ATCC号CCL-61)是脯氨酸营养缺陷型，染色体众数为20，群体倍增时间为10-14小时。已表明此系统对于各种化学药品的诱裂活性敏感(Prestonetal.，MutationRes.(1981)87143-188)。CHO细胞将在补加有10％胎牛血清、1％L-谷酰胺(2mM)、青霉素(100单位/mL)和链霉素(100μg/mL)的McCoy’s5A培养基中生长并维持。在加湿的培养箱中，将培养物温育于37±2℃，5-7％CO2中，并宽松地盖上盖子。测试程序0322储液将被制备成5mg/mL。将通过在使用之前即刻将此储液稀释于5％的葡萄糖中来制备较低的剂量。为使任何降解的几率最小化，测试样品溶液将在制成后保存于冰上直至给药程序前。在处理前一天，将细胞以每75cm2组织培养瓶大约1-1.5×106个细胞接种于10mL新鲜培养基中。为了进行处理，将用新鲜的生长培养基替换消耗的培养基，并将向每个摇瓶中加入测试样品抽提物、阴性对照或者阳性对照。阳性对照将按0.1mL的体积给药以使载体毒性最小化。测试样品稀释物和阴性对照将按1mL的体积给药。加入新鲜的培养基以使总处理体积达到10mL。对于应用了代谢激活的测试部分，将S9激活混合物以1.5％(v/v)的终浓度加入无血清培养基中。所有的处理将重复进行。细胞将在存在测试样品抽提物、S9反应混合物(仅仅该研究的代谢激活部分)和生长培养基的条件下培养于37±2℃。该试验将被分为三个处理阶段3小时、用S9激活的3小时，以及20小时。0323在经过处理阶段后，所有摇瓶将通过显微镜观察来评价其毒性的宏观表现，即，细胞的形态变化或明显的细胞脱离。将所有摇瓶用磷酸平衡盐溶液(PBS)清洗两次。将含10％胎牛血清(FBS)的标准生长培养基加入到新洗过的细胞中，并将摇瓶放回培养箱中再培养14.5-15.5小时。在收集之前即刻进行显微观察评价。收集前两小时，将向所有摇瓶中加入1μg秋水仙酰胺(0.1μg/mL终浓度)以积蓄分裂中的细胞。0324测试样品抽提物将以六个剂量水平(在培养物中0.5、0.16、0.05、0.016、0.005和0.0016ml/mL的终浓度)与适当的载体和阳性对照一起进行测试，测试被重复一次。代谢激活系统0325代谢激活系统的使用对于评价测试样品而言是一个重要的方面，因为有些化合物只是以诱变剂原的状态存在。也就是说，它们只有在与外部的代谢源发生作用后才会变为诱变剂。体外测试系统缺乏此种使化合物代谢的能力，除非加入外部系统诸如S9。0326将被用于此项试验的体外代谢激活系统可以包括多种SpragueDawley大鼠肝脏酶以及对于发挥其功能所必需的产能系统(NADP和异柠檬酸；核心反应混合物)。这些酶将被包含在大鼠肝脏微粒体(S9部分)制剂中，所述大鼠用Arochlor1254处理以诱导出能够将化学药物转化为更具活性的形式的多种酶。S9可以从Moltox(Boone，NC)购得并冻存于-70℃以下直至使用。此S9部分现用现融，并被加入所述的核心反应混合物中。细胞固定、染色和评分0327中期细胞将通过有丝分裂抖落(mitoticshakeoff)加以收集，用75mMKCl溶胀，并在甲醇∶冰乙酸(3∶1v/v)中固定。在细胞重悬于新鲜的固定剂后，移至载玻片上并风干。将载片用盲码标记。每个被处理的摇瓶将制备三张载片。将载片用吉姆萨染色并制成永久标本。所有载片除高剂量阳性对照外都将在盲码下读取，而高剂量阳性对照被首先评价以保证染色体畸变频率是足够的。对于每种剂量，将读取每一剂量的200个细胞(一式两份的摇瓶中的每一瓶挑100个)。按照下列定义，从每个高剂量阳性对照中读取100个细胞并按此打分。染色单体类型TG(染色单体间隙)“TidGap”。一条染色单体中的一种非染色质(不着色)区，其尺寸等于或小于染色单体的宽度。这些应引起注意但通常不包括在最终的畸变总数内，因为它们可能不完全是真正的断裂。IG(异染色单体间隙)“染色体间隙(ChromosomeGap)”。此间隙位于两条姊妹染色单体的相同位点。这些应引起注意但通常不包括在最终的畸变总数内，因为它们可能不完全是真正的断裂。TB(染色单体断裂)一条染色单体中的一种非染色质区，大于染色单体的宽度。相关片段可能被部分地或完全地被置换或者丢失。ID(染色单体缺失)从染色单体中部区域“切下”的染色单体长度，产生了位于缩短的染色单体或者染色单体中的缺口旁边的小片段或环。TR(三射染色体)两条染色体之间的交换，其产生一种三臂结构。可能会产生相关的无着丝粒断片。QR(四射染色体)与三射染色体相同，但产生的是四臂结构。CR(复杂重排)两条以上的染色体间的交换，其为若干次断裂和交换的结果。TI(染色单体互换)一条染色体内的交换，涉及一条或者两条臂。染色体类型SB(染色体断裂)末端缺失。染色体具有清晰的断裂，形成畸变的(缺失的)染色体，其带有离位的无着丝粒断片，该断片可能保持着关联，或者可能在细胞中的任何地方出现。DM(双微体片段)染色体中间缺失。它们以微小的双“点(dots)”形式出现，或者可以是成对的环。在有些情况下，它们无法与源自交换或末端缺失的无着丝粒断片相区别。D(双着丝粒)两条染色体之间的一种交换，其导致带有两个着丝粒的染色体。这通常伴随有无着丝粒断片，其中它被归类为带断片的双着丝粒染色体(DicentricwithFragment，DF)。MC(多着丝粒染色体)多条染色体间的一种交换，其导致带有两个以上着丝粒的染色体。R(环)形成含有着丝粒的环的染色体。这通常伴随有无着丝粒断片，在这种情况下它被归类为带断片的环(RingwithFragment，RF)。无着丝粒的环也被包括在此类中。Ab(畸变单着丝粒染色体)这是一种染色体，其核型的形态学发生畸变，通常是由于诸如易位或臂间倒位事件。如果畸变的话，所采用的分类法则不能归结为例如相互易位。T(易位)两条染色体间明显的物质交换，其导致两条畸变染色体的产生。当可确认时，记分为“T”，而不是“2Ab”。其它SD(严重受损细胞)带有10个或更多个任何类型畸变的细胞。严重受损的细胞应当被分析以确定畸变的类型，该细胞可能并不含有10个或更多个畸变，例如原因在于多重片段，诸如被发现的与三着丝粒染色体相关的那些多重片段。PU(粉末化染色体)解螺旋的或者片段化的染色体。这可能只是处于染色体聚缩的不同阶段。P(+粉末化细胞)一个以上的染色体，甚至是整个细胞核，被“粉末化”。PP(多倍体细胞)含有单倍体染色体数的多个拷贝的细胞。多倍体细胞在正常的骨髓中或者细胞培养物中偶尔会被观察到。这些被记录下来，但并不包括在最终的结构畸变总数内。对照物0328对照物质被制备并应用于此试验中，如已公开的报道中所述。可以使用的阳性对照是环磷酰胺-高剂量15μg/mL；环磷酰胺-低剂量5μg/mL；丝裂霉素C-高剂量1.0μg/mL；以及丝裂霉素C-低剂量0.25μg/mL。对于阴性(载体)对照，将CHO细胞用带有和不带有S9激活作用的5％葡萄糖阴性对照进行处理。这些处理提供了关于背景畸变细胞数的信息。试验有效性评估和统计分析0329溶剂对照培养物的畸变总数(％CA)应当在1-14％以内。高剂量阳性对照应当在畸变数上产生统计学上显著的增加，95％的置信度水平(p＜0.05)，如通过统计分析所确定的。方差分析(ANOVA)可以被用来鉴定阳性对照组与阴性对照组或者测试样品组与阴性对照组之间的显著性差异。当所得p值小于0.05时，则该差异被认为是显著的。实施例108在犬中的安全性和耐受性测定0330测定化合物的安全性和耐受性的典型研究，例如以各种剂量水平向比格犬(beagledogs)静脉内施用，每日一次，连续五日，可以被设计如下。将通过观察、临床病理学和显微组织病理学评估对安全性参数进行监测。实验设计0331表10概括了典型的研究。例如，将使用三个(3)测试样品组和一个(1)对照样品组进行该项研究。对照样品将是在给药前用来稀释测试样品的溶液(5％葡萄糖水溶液)，并且以与高剂量组相同的体积加以施用。本研究的测试样品剂量水平将是大约12、3.8和1.2mg/kg。测试样品和对照样品将通过连续五天每天一次在大约一小时期间内静脉内(IV)输注的方式加以施用。0332用于测试样品血液水平分析的血样将以如下方式采集(即pk/tk采样)。第一次和第五次给药后，从输注开始的大约20分钟和40分钟，然后在输注结束时(时间0)以及从输注结束后5、10、15和30分钟以及1、2、4、8、12和24小时，从低剂量组中的三只雄犬和三只雌犬采集大约1.0mL血液。同时，对于所有动物，在第一次给药和第五次给药之前和之后立刻，以及对于康复动物，在验尸前，获得大约5-10秒的II导联ECG记录图。最后一次给药之后一(1)天或15天，动物将被停止饲养。在给药前以及停止饲养处安乐死之前，将抽取血液用于血液学和临床化学分析。安乐死之后，将进行验尸，包括收集主要器官用于显微评价。表10a以大约1小时输注的方式给药检测方法0333在典型的研究中，动物将如下地被分组将某一性别最重的犬分配到组1，该性别下一个最重的犬分配到组2，下一个最重的分配到组3，下一个最重的分配到组4，然后按组2、3、4和1继续，然后按组3、4、1和2继续，继续以此方式进行分配直至每一组都完全补足了动物。测试样品和对照样品将在每次给药时以向头部静脉或隐静脉在大约一小时内进行静脉内输注的方式施用。0334在给药前以及在验尸前每日对动物称重。给药后立即观察以及一小时后观察所有动物的药理学活性、行为变化和毒性特征征状。在康复期间，也将每天观察康复的动物一次。对于所有动物，在第一次给药和第五次给药之前和之后立刻，以及对于康复动物，在验尸前，获得大约5秒的II导联ECG记录图。这些记录图将被用于为解释QRS波群和T波的节律和幅度变化提供数据，并将用于测量每张记录图中大量节段的QT间隔(大约5-10)。血液采集0335PK/TK.采集血样用于测试样品血液水平分析。从输注开始后大约20分钟和40分钟，然后在输注结束时(时间0)以及第一次和第五次给药后从输注结束后5、10、15和30分钟以及1、2、4、8、12和24小时，从低剂量组中的三只雄犬和三只雌犬采集大约1mL血液。血浆(肝素锂抗凝剂)样品将被制备以用于分析。0336临床病理学.禁食过夜后在第一次给药以前(基线；全部动物)，以及然后在每次验尸前，采血液样品用于血液学和临床化学。对于血液学试验而言，分析在基线处以及在验尸前(被禁食)采集的血液的红细胞计数、血细胞比容、MCH、白细胞计数、微分WC、MCHC、血红蛋白、MCV、血小板计数、PT和APTT。对于临床化学试验而言，将化验在基线处以及在验尸前(被禁食)采集的血液检测其天冬氨酸氨基转移酶(ASP)、球蛋白与A/G比率、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、钠、碱性磷酸酶、钾、γ谷氨酰转移酶(GGT)、氯化物、葡萄糖、钙、血脲氮(BUN)、总胆红素、肌酐、无机磷、总蛋白、胆固醇、白蛋白和甘油三酯。验尸0337采集血样后，将初步处理组和康复组动物在其各自的终止时间处死并验尸。收集主要器官，称重并保存以用于显微评价。验尸将包括检查颅腔、胸腔、腹腔和盆腔、其内脏、组织、器官和屠体。统计方法0338将进行临床化学和血液学数值以及器官重和体重数据的统计学分析以比较测试样品组和对照组。用于所述数据的统计方法被合适地选择将使用单因素方差分析对参量数据加以分析，将使用Kurskai-Wallis检验分析非参量数据。成对t-检验也将被用于比较每只动物的基线和处理后的临床化学和血液学数值。对于所有的统计学检验而言，0.05或更小的概率(p)值将被认为是显著的。实施例109在大鼠中的安全性和耐受性研究0339测定测试化合物的安全性和耐受性的典型研究，例如以三种剂量水平向大鼠静脉内施用，每日一次，连续五日，可以被设计如下。将通过观察、临床病理学和显微组织病理学评估对安全性参数进行监测。所选的动物也将接受血样采集用于药物动力学/毒物动力学评价。实验方法0340表11概括了典型的研究。使用三个(3)测试样品组和一个(1)对照样品组进行该项研究。高剂量测试样品组、低剂量测试样品组和对照组每组将包括28只动物，将用于评价耐受性。中剂量测试样品组将包括64只动物，其中的28只动物将被用于评价耐受性，而36只动物将被用于在本研究的PK/TK部分中测定第一次和第五次给药后测试样品在多个时间点在血液中的水平。对照样品将是在给药前用来稀释测试样品的溶液(5％葡萄糖水溶液；D5W)，并且以与高剂量测试样品组相同的体积加以施用。本研究的测试样品剂量水平将是24、7.6和2.4mg/kg。测试样品和对照样品将通过连续五天在一分钟内向尾静脉进行静脉内(IV)注射的方式加以施用。0341用于测试样品血液水平分析的血样将以如下方式采集。在给药前的每一个采样时间点，以及在注射结束时(时间0)和在第一次和第五次给药后从注射结束后的大约0.08、0.25、0.5、1、2、4、8、12和24小时，从麻醉状态下的三只雄性大鼠和三只雌性大鼠采集大约0.3-0.5mL血液。最后一次服药之后1天(对于最初组)或15天(对于康复组)，用于评价耐受性的动物将被处死。在耐受性测试的动物处死时，在安乐死之前以及安乐死之后，抽取血液用于血液学和临床化学分析。将进行验尸，包括收集主要器官用于显微评价。仅用于pk/tk血液采样以确定测试样品水平的动物将在采集完最后一次血样后被处安乐死，而不再进行任何进一步的采样或观察。表11a以大约1小时输注的方式给药检测方法0342在每次给药时将测试样品和对照样品以向尾静脉内进行大约一分钟内的静脉内输注的方式施用。在给药前以及在验尸前每日将动物称重。给药后立即观察以及一小时后观察所有动物的药理学活性、行为变化和毒性征状。在康复期间，也将每天观察康复的动物一次。对照动物将被给予大约6mL/kgD5W。高、中和低剂量测试样品的动物将分别按大约24mg/kg、7.6mg/kg和2.4mg/kg的剂量给药。血液采集0343PK/TK.采集用于测试样品血液水平分析的血样。使用18只雄性和18只雌性中剂量动物，在给药前的每一个采样时间点、在注射结束时(时间0)以及在第一次和第五次给药后从注射结束后大约0.08、0.25、0.5、1、2、4、8、12和24小时，从麻醉状态下的三只雄性大鼠和三只雌性大鼠采集大约0.3-0.5mL血液。对于动物的末期采样，将通过眼窝采血或心脏穿刺采血来进行血液采样。制备用于进行分析的血浆(肝素锂抗凝剂)样品。将遵循一般性的化学病理学、验尸和组织病理学方法以及统计学方法，诸如前面所描述的那些。实施例110磷酶化p53和总p53分析方案0344磷酸化p53和总p53分析方案可以被设计如下。第一天，将细胞按2×106个细胞/10cm培养皿/10mL培养基进行接种。第二天，细胞将被如下地处理对照＝0.05％DMSO(5μlDMSO储液/10ml培养基)；1μM测试化合物(1μl储液(10mM)/10ml培养基)；2μM测试化合物(2μl储液(10mM)/10ml培养基)；3μM测试化合物(3μl储液(10mM)/10ml培养基)；4μM测试化合物(4μl储液(10mM)/10ml培养基)和5μM测试化合物(5μl储液(10mM)/10ml培养基)。0345第三天，将收获细胞并收集贴壁的细胞和漂浮的细胞。将细胞用PBS清洗两次，计数并按4×106个细胞/样品收集。将细胞沉淀物冻存于-80℃直至进一步使用。在当天或者第四天，用细胞抽提缓冲液抽提细胞(3mL细胞抽提缓冲液，300μl蛋白酶抑制剂和10μl0.3MPMSF)。向每一样品中加入200μl缓冲液，将溶液涡旋混合并在冰上放置30分钟，随后每10分钟涡旋混合一次。然后将溶液在13,000rpm离心10分钟，将上清液按每管100μl进行等分并储存于-80℃。0346分析用制备品(第五天).通过用1mlHRP稀释液稀释10μl100x浓缩溶液制备出用于每一8孔条的抗兔IgGHRP溶液。洗涤缓冲溶液将通过用蒸馏水稀释原初小瓶(x25)以制成x1溶液来加以制备。p53标准品溶液或p53总溶液的稀释物可以按照表12的典型参数所述来加以制备。为确保充分的重构，标准品1将被温和混匀并将其在室温下放置10分钟。表120347检测程序.使用前，使所有溶液达到室温并温和混匀。取出并插上8-孔条。向标准8孔中加入100μl标准品稀释缓冲液(0ng/ml/孔或0单位/孔)。在生色团空白孔中不加入任何样品。向合适的微量滴度孔中加入100μl标准品或稀释的样品。一般地，样品应当用标准品稀释缓冲液以至少1∶10或者更高的比例稀释。每一样品将一式两份。温和拍打平板侧面以充分混匀。盖上板盖并在室温下温育2小时或者在4摄氏度温育过夜。用400μl工作洗涤缓冲液清洗培养孔4次。浸泡15-30秒，然后吸去液体。清洗后，将板倒置并将吸水纸上拍打干燥。除生色团空白外，向每孔中加入100μl抗p53[pS15]或抗p53(总)(检测抗体)。温和拍打混匀；盖上板盖并在室温下温育1小时。从孔中彻底吸去溶液。0348用400μl工作洗涤缓冲液清洗培养孔4次。浸泡15-30秒，然后吸去液体。清洗后，将板倒置并在吸水纸上拍打干燥。除生色团空白外，向每孔中加入100μl抗兔IgGHRP工作液。盖上板盖并在室温下温育30分钟。用400μl工作洗涤缓冲液清洗培养孔4次。浸泡15-30秒，然后吸去液体。清洗后，将板倒置并在吸水纸上拍打干燥。向每孔中加入100μlTMB(稳定的生色团底物)并在黑暗处于室温下温育30分钟。颜色将会变蓝。加入100μl终止液。温和拍打培养板以混匀。颜色应当变黄。将生色团空白(＝100μlTMB+100μl终止液)设为空白，在A450nm对培养板进行读数。在试验完成的2小时内读取吸光度。实施例111Caspase-3/7分析方案0349典型的Caspase-3/7分析试验方案可以被设计如下。第一天，接种0.015×106个HCT-116细胞/50ul/孔。在37℃CO2培养箱中温育过夜。第二天，从培养孔中移去25ul培养基。用1、3和5uM测试化合物处理HCT-116细胞。用星形孢菌素0.01、0.1、1uM处理阳性对照组。六个阴性对照孔仅用培养基处理(向适当的孔中加入25ul稀释后的样本)。在37℃CO2培养箱中温育24小时。第三天，准备Apo-ONEHomogeneousCaspase-3/7分析试剂(Promega)，10ul试剂/1ml缓冲液。加入50ul稀释的试剂。室温下温育1小时。在485/520处测量荧光强度。实施例112AnnexinV-Alexa488染色方案0350典型的AnnexinV-Alexa488染色方案可以被设计如下。在每个10cm培养皿中的10ml培养基中接种1.5-2.0×106个HCT-116细胞。在37℃CO2培养箱中温育过夜或直至24小时。次日，用1、2、3、4和5μM测试化合物处理细胞。留一个或两个未处理的板(只加入培养基)作为对照板。使用下列对照未处理的样本(无Alexa或碘化丙啶)、仅用碘化丙啶或Alexa488处理的对照以及用Alexa488和碘化丙啶两者进行处理的对照。收获细胞(收集贴壁的以及漂浮的细胞)。用冷PBS清洗细胞两次。将细胞重悬于1xAnnexin结合缓冲液中。0351对细胞进行计数，并在1xAnnexin结合缓冲液中将其稀释至～1×106个细胞/0.1ml，准备好充足的体积使每一试验有100μl。向每100μl的细胞悬液中加入5μl的AnnexinV偶联物。向每100μl的细胞悬液中加入4μl的碘化丙啶溶液(储液＝1mg/ml)。室温下将样品温育15分钟。加入400μlAnmexin结合缓冲液，温和混匀并将样品静置于冰上。立即通过流式细胞仪分析染色后的细胞。实施例113DNA细胞周期分析方案0352典型的DNA细胞周期分析方案将被设计如下。在每个10cm培养皿中接种1.5-2.0×106个细胞(额外地接种一个皿用于未染色的细胞)。在37℃加湿的5％CO2培养箱中温育细胞24小时。为了使细胞在低生长状态同步化以使其静止，移去培养基并用无血清培养基漂洗一次，向每一个皿中加入10ml的无血清培养基。在37℃加湿的5％CO2培养箱中温育细胞24小时。移去培养基并加入处理(用含血清培养基稀释，10ml)1-5μM测试化合物，以及对照。在37℃加湿的5％CO2培养箱中温育细胞24小时。0353为了胰蛋白酶化/分离细胞，移去处理。加入3ml胰蛋白酶/EDTA溶液。保持漂浮的细胞并与贴壁的细胞合并。在37℃加湿的5％CO2培养箱中温育5分钟。向孔中加入3ml培养基(含FBS)并用移液管转入离心管中。1000rpm离心5分钟。弃去上清并将沉淀重悬于2-3mlPBS中。对细胞计数，并通过在每管中放入2×1O6个细胞，加入2mlPBS并在1000rpm离心5分钟来清洗细胞一次。将沉淀的细胞重悬于0.3ml冷PBS中。0354为了固定细胞，向装有0.3ml的细胞PBS悬液的管中温和滴加0.7ml冰冷的70％乙醇，并同时涡旋摇振。在冰上放置1小时(或者在4℃可直至数天)。在1000rpm离心5分钟。用冷PBS(1-2ml)清洗一次。在1000rpm离心5分钟。将细胞沉淀重悬于0.25ml冷PBS中，加入5μl的10mg/mlRNAseA(终浓度为0.2-0.5mg/ml)。在37℃温育1小时。加入10μl1mg/ml的碘化丙啶的去离子水溶液(终浓度为10μl/ml)，保存于4℃黑暗处直至被分析。通过在细胞仪上在488nm处读数对FACS进行分析。细胞可以在分析的当天用碘化丙啶染色。0355应当理解，前面的详细描述和所附实施例仅是举例说明，而不应当作为对本发明范围的限定。对所公开的实施方式的各种变化和修改对于本领域的技术人员而言将是显而易见的。在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明做出此类变化和修改，其包括而不限于涉及本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间产物、合成、制剂和/或使用方法的那些变化和修改。本文所引用的美国专利和出版物被并入本文作为参考。权利要求1.化合物，具有式(1)及其药物学上可接受的盐、酯和前体药物；其中如果Z2、Z3和Z4分别是N，则B、X、A或V不存在，而当Z2、Z3和Z4是C时，则B、X、A或V独立地是H、卤素、叠氮、R2、CH2R2、SR2、OR2或NR1R2；或者A和V、A和X、或X和B可以形成碳环、杂环、芳基或杂芳基，它们的每一个可以任选地被环取代和/或与环稠合；Z是O、S、NR1、CH2或C＝O；Z1、Z2、Z3和Z4是C或N，条件是任何两个N不相邻；W与N和Z一起形成任选取代的五元环或六元环，其被稠合至任选取代的饱和或不饱和环；所述饱和或不饱和环可以包含杂原子，并且是单环或者与单个或多个碳环或杂环相稠合；U是R2、OR2、NR1R2、NR1-(CR12)n-NR3R4或N＝CR1R2，其中在N＝CR1R2中，R1和R2可以与C一起形成环，条件是U不是H，并且当U是OH、OR2或NH2时，Z1-Z4中的至少一个是N；在各个NR1R2中，R1和R2与N一起可以形成任选取代的环；在NR3R4中，R3和R4与N一起可以形成任选取代的环；R1和R3独立地是H或C1-6烷基；每一个R2是H、或C1-10烷基或C2-10烯基，每一个任选地被卤素、一个或多个非相邻杂原子、碳环、杂环、芳基或杂芳基取代，其中每一个环被任选地取代；或者R2是任选取代的碳环、杂环、芳基或杂芳基；R4是H、C1-10烷基或C2-10烯基，其任选地含有一个或多个选自N、O和S的非相邻杂原子，且任选地被碳环或杂环取代；或者R3和R4与N一起形成任选取代的环；每一个R5是位于环W上任何部位的取代基；且是H、OR2、氨基、烷氧基、酰氨基、卤素、氰基或无机取代基；或者R5是C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、-CONHR1，每一个任选地被卤素、羰基或者一个或多个非相邻杂原子取代；或者两个相邻的R5相连形成5-6元任选取代的碳环或杂环，所述环可以被稠合至其它任选取代的碳环或杂环；且n是1-6。2.权利要求1所述的化合物，其中W与N和Z一起形成任选取代的5元环或6元环，所述环被稠合至任选取代的芳基或杂芳基，所述任选取代的芳基或杂芳基选自其中每一个Q、Q1、Q2和Q3独立地是CH或N；Y独立地是O、CH、C＝O或NR1；且R5如权利要求1中所定义；或者W与N和Z一起形成环，所述环选自其中Z是O、S、CR1、NR1或C＝O；每一个Z5是CR6、NR1或C＝O，条件是如果Z和Z5相邻，则两者不都是NR1；每一个R1是H、C1-6烷基、COR2或S(O)pR2，其中p是1-2；R6是H或者本领域已知的取代基，包括但不限于羟基、烷基、烷氧基、卤素、氨基或酰氨基；且环S和环T可以是饱和的或不饱和的。3.权利要求1所述的化合物，其中W与N和Z一起形成稠合于苯基的5元环或6元环。4.权利要求1所述的化合物，其中U是NR1R2，其中R1是H，R2是由杂原子、C3-6环烷基、芳基或者含有一个或多个N、O或S的5-14元杂环任选取代的C1-10烷基；或者R1和R2与N一起形成任选取代的哌啶、吡咯烷、哌嗪、吗啉、硫代吗啉、咪唑或氨基二噻唑。5.权利要求4所述的化合物，其中R2是被吗啉、硫代吗啉、咪唑、氨基二噻唑、吡咯烷、哌嗪、吡啶或哌啶取代的C1-10烷基。6.权利要求1所述的化合物，其中U是NR1-(CR12)n-NR3R4；n是1-4；且NR3R4中的R3和R4一起形成任选取代的哌啶、吡咯烷、哌嗪、吗啉、硫代吗啉、咪唑或氨基二噻唑。7.权利要求1所述的化合物，其中U是NH-(CH2)n-NR3R4，其中R3和R4与N一起形成任选取代的吡咯烷。8.权利要求1所述的化合物，其中U是2-(N-甲基吡咯烷-2-基)乙氨基或者(2-吡咯烷-1-基)乙氨基。9.权利要求1所述的化合物，其中A和X独立地是卤素或SR2，其中R2是由杂原子、碳环、杂环、芳基或杂芳基任选取代的C0-10烷基或者C2-10烯基。10.权利要求9所述的化合物，其中R2是由苯基或吡嗪取代的C0-10烷基。11.权利要求1所述的化合物，其中每一个Z1、Z2、Z3和Z4是C。12.权利要求1所述的化合物，其中Z1、Z2、Z3和Z4中的三个是C，而剩下的一个是N。13.权利要求1所述的化合物，其中Z1、Z2、Z3和Z4中的两个是C，而剩下的两个是非相邻的氮。14.权利要求11所述的化合物，其中Z1和Z3是C，Z2和Z4是N；其中Z1和Z3是N，Z2和Z4是C；或者其中Z1和Z4是N，Z2和Z3是C。15.权利要求1所述的化合物，其中Z1是N。16.权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式(2A)或(2B)其中A、B、V、X、U、Z、Z1、Z2、Z3、Z4和n如上所述；Z5是O、NR1、CR6或C＝O；R6是H、C1-6烷基、羟基、烷氧基、卤素、氨基或酰氨基；且Z和Z5可以任选地形成双键。17.权利要求1所述的化合物，其中Z是NR1且R1是C1-6烷基。18.权利要求17所述的化合物，其中R1是甲基。19.权利要求1所述的化合物，其中B、A、X或V中的至少一个是卤素，并且相应的毗邻的Z1-Z4是C。20.权利要求1所述的化合物，其中V是H。21.权利要求1所述的化合物，其中U不是OH。22.药物组合物，包括权利要求1所述的化合物，和制药上可接受的载体。23.减少细胞增殖和/或改善细胞增生性病症的方法，包括向有此需要的体系或对象施用有效量的权利要求1化合物或其药物组合物，并且任选地使用一种方法和/或化学治疗剂，从而减少细胞增殖和/或改善细胞增生性病症。24.权利要求23所述的方法，其中所述的细胞增生性病症是肿瘤或癌症。25.权利要求23所述的方法，其中所述的体系是细胞或组织，所述的对象是人或动物。26.降低微生物滴度和/或改善微生物感染的方法，包括将有此需要的体系或对象与有效量的权利要求1化合物或其药物组合物接触，并且任选地与抗微生物制剂接触，从而降低微生物滴度和/或改善所述的微生物感染。27.权利要求26所述的方法，其中所述的体系是细胞或组织，所述的对象是人或动物。28.权利要求26所述的方法，其中所述的微生物滴度和/或微生物感染是病毒滴度、细菌滴度或真菌滴度。29.诱导细胞死亡和/或诱导凋亡的方法，包括向有此需要的体系或对象施用有效量的包含权利要求1化合物的组合物或其药物组合物，并且任选地使用一种方法和/或化学治疗剂，从而诱导细胞死亡和/或诱导凋亡。30.权利要求29所述的方法，其中所述的体系是细胞或组织，所述的对象是人或动物。31.权利要求29所述的方法，其中所述的化学治疗剂是吉西他滨。32.权利要求29所述的方法，其中所述的方法是放射疗法或外科手术法。33.化合物，具有式34.药物组合物，包括权利要求33所述的化合物和制药上可接受的载体。35.制备具有式(1)或(1A)的化合物的方法，包括使具有式3或4的酯、具有式NHR1R2的胺以及具有式MLn的路易斯酸相接触，其中L是卤素原子或有机基团，n是3-5，M是第III族元素的原子、第IV族元素的原子、As、Sb、V或Fe，其中A、V和X独立地是H、卤素、叠氮、R2、CH2R2、SR2、OR2或NR1R2；或者其中A和X或者A和V可以形成碳环、杂环、芳基或杂芳基，它们的每一个可以任选地被环取代和/或与环稠合；其中在NR1R2中，R1和R2可以形成任选取代的环；每一个Z是CH2、O、S或NR1；Z1、Z2、Z3、Z4、Z6、Z7和Z8独立地是C或N，条件是任何两个N是非相邻的；Z5是C或N，条件是如果Z是O、S或NR1，则Z5是C，且进一步的条件是如果Z5是N，则Z和Z6不是N；每一个R1是H或C1-6烷基；每一个R2是H或C1-10烷基或C2-10烯基，其任选地含有一个或多个选自N、O和S的非相邻杂原子，且任选地被碳环或杂环取代；或者R2是任选取代的碳环、杂环、芳基或杂芳基；每一个B是H或卤素；W与N和Z一起形成任选取代的五元环或六元环，其被稠合至任选取代的芳基或杂芳基；其中所述芳基或杂芳基可以是单环或者是与单个或多个环相稠合，并且其中所述的环任选地含有杂原子；W1是任选取代的芳基或杂芳基，其可以是单环或者是与单个或多个环相稠合，且任选地含有杂原子；且每一个R5是位于W或W1上任何部位的取代基；且是H、OR2、NR1R2、C1-6烷基、C2-6烯基，每一个任选地被卤素、C＝O或一个或多个杂原子取代；或者R5是无机取代基；或者两个相邻的R5相连形成5-6元取代或未取代的碳环或杂环，所述环被任选地稠合至其它取代或未取代的碳环或杂环。36.权利要求35所述的方法，其中所述的酯、胺和路易斯酸是在室温下进行接触的。37.权利要求35所述的方法，包括在有机溶剂中使所述的酯与胺相接触，从而形成溶液，并将所述溶液与路易斯酸相接触。38.权利要求37所述的方法，其中所述的有机溶剂是二氯甲烷。39.权利要求35所述的方法，其中使用相对于所述酯而言过量的胺。40.权利要求39所述的方法，其中所述酯与所述胺的比率是1∶2、1∶1.5或1∶1.25。41.权利要求35所述的方法，其中使用与所述胺等摩尔量的路易斯酸。42.权利要求35所述的方法，进一步包括分离具有式1或式2的化合物，并任选地纯化所分离的具有式1或式2的化合物。43.权利要求42所述的方法，其中所述的分离的化合物是通过柱色谱、重结晶或两者来纯化的。44.权利要求43所述的方法，其中所述分离的化合物的纯度是在90％至99％之间或者在90％至95％之间。45.权利要求33所述的方法，其中所述的酯与所述具有式NHR1R2的胺相接触，其中R1是(CR32)n基团；R2是NR3R4；R3是H或C1-6烷基；n是1-6；且R4是H或C1-10烷基或C2-10烯基，其任选地含有一个或多个选自N、O和S的非相邻杂原子，且任选地被碳环或杂环取代；并且其中在NR3R4中，R3和R4可以形成任选取代的环。46.权利要求35所述的方法，其中所述的路易斯酸是BL3、AlL3、FeL3、GaL3、SbL5、InL3、ZrL4、SnL4、TiL4、TiL3、AsL3或SbL3，其中L是卤素或烷基。47.权利要求46所述的方法，其中所述的路易斯酸是氯化铝。48.权利要求35所述的方法，用于制备选自下列的化合物全文摘要本发明提供了式(I)的喹诺酮类似物，其可以抑制细胞增殖和/或诱导细胞凋亡。本发明还提供了制备喹诺酮类似物的方法及其使用方法。文档编号C07D471/14GK101060843SQ200580039209公开日2007年10月24日申请日期2005年9月16日优先权日2004年9月17日发明者J·P·惠顿,F·皮埃尔,C·里甘,M·施瓦伯,G·P·扬尼科乌诺斯,M·容,J·Y·长泽,P·蔡申请人:赛宁制药公司