细胞粘附抑制剂及其用途的制作方法

专利名称：细胞粘附抑制剂及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的癌症预防/治疗剂、癌细胞的细胞粘附抑制剂。具体来说，本发明涉及含有新的、调节目标蛋白质的表达和/或活性的物质的癌症预防/治疗剂、癌细胞的细胞粘附抑制剂。另外，本发明涉及癌症诊断剂，所述癌症诊断剂含有可检测出上述目标蛋白质或编码所述目标蛋白质的基因(多核苷酸)表达的物质。本发明还涉及使用上述目标蛋白质或编码所述目标蛋白质的核酸的、用于癌症的预防/治疗的物质或癌细胞的细胞粘附抑制物质的筛选方法。
背景技术：
近年来，伴随着分子生物学的迅速发展，被称为“分子靶向药物”的新型药物的开发得到发展，已经有一些商品上市。例如，以癌症为例，现有的抗癌剂主要是以DNA合成或细胞周期的特定阶段作为靶点。这是利用癌细胞的与正常细胞相比其增殖更为活跃的性质，发挥对癌细胞的特异性毒性。因此，虽然并非癌细胞、但与癌细胞具有同等增殖速度的细胞(例如骨髓中的幼稚造血细胞、口腔粘膜细胞、消化道上皮细胞、毛囊细胞)等会由于以往的抗癌剂而受到侵害， 由此发生骨髓抑制(白细胞减少、血小板减少)、消化系统障碍、毛发脱落等副作用。与此相对，上述的“分子靶向药物”是以在癌细胞中特异性(或过剩地)表达的分子作为靶点，通过对这种分子的选择性的作用来发挥抗癌性。因此，使用分子靶向药物的癌症治疗与使用现有的抗癌剂相比，具有可以抑制上述副作用发生的优点。作为以分子靶向药物形式开发新的抗癌剂的措施，对癌细胞/癌组织中的基因/ 蛋白质进行表达分析/功能分析是有效的。通过上述分析，可以判断特定的治疗剂/治疗方法的有效性、或探索新的药物发现靶点。急性骨髓性白血病(AML)是作为血癌的白血病的一种，是骨髓系统的造血细胞肿瘤化并丧失分化/成熟能力的疾病。丧失了分化/成熟能力的造血细胞保持幼稚的形态， 因此被称为“胚细胞”。在AML中，这种胚细胞蓄积在骨髓内，使正常的血细胞的生产能力降低。结果，表现出由于红细胞不足而引起的贫血/呼吸短促/心慌/脸色苍白等症状，或因血小板不足而引起的牙龈出血、鼻血、消化道出血或吐血、脑出血等症状。另外，由于白细胞的不足而对感染的免疫力降低，表现出高热或倦怠等症状。根据1976年提出的FAB (法国-美国-英国)分型，AML被定义为胚细胞在骨髓细胞中所占的比例为30%或更多的状态。另一方面，作为包含染色体或基因突变的新的白血病分型方法，根据世界卫生组织(WHO)发表的WHO分型，胚细胞的比例为20%或更高的状态即定义为AML。为了说明白血病的发病机理，近年来提出了所谓的“白血病干细胞”的概念。根据这一概念，在自我复制能力显著增强的造血干细胞中，极少数的细胞发挥用于供给白血病细胞的“干细胞”功能，反复进行自我复制与定向分化，持续供给白血病细胞，由此表现出白血病的病态。
有报道指出，AML中的白血病干细胞经由细胞粘附分子固定在骨髓的骨内膜区域， 从而可以逃过化学疗法药物所诱发的细胞凋亡，即，获得对化学疗法药物的抗药性(例如参照非专利文献1)。在现有技术中，已知在经过了化学疗法的AML患者中，会由于微小残留病变(MRD) 而使病态复发。已经明确的是，导致上述复发的抗药性的获得的原因之一在于，存在于白血病细胞表面的VLA(极晚抗原，very late antigen) _4参与了与骨髓间质细胞(成骨细胞) 表面的纤连蛋白的粘附。基于上述认识，人们提出了以VLA-4为靶点的AML治疗方法/复发预防方法。例如，通过给予VLA-4特异性抗体(VLA-4中和抗体)来抑制VLA-4与纤连蛋白的粘附，由此可以进行AML的治疗/预防(例如参照非专利文献2)。VLA-4是由整联蛋白家族的α4亚基与β 1亚基构成的杂二聚体蛋白，其中的β 1亚基参与了与骨髓的成骨细胞的粘附。另外，作为小鼠骨髓瘤(白血病)中的反转录病毒掺入位点，本发明人对Evil (同向性病毒整合-1)基因进行了鉴定(参照非专利文献3)。如上所述，Evil基因含有从小鼠白血病的病毒插入位点分离的3099bp基因(参考序列登录号NM_007963)，编码有含有1032个氨基酸的蛋白质(Evil蛋白)(参考序列登录号NP_031908)。人的同源基因(EVI1基因)含有4873bp基因(参考序列登录号 ΝΜ_001105077，序列号1)，编码有含有1115个氨基酸(参考序列登录号NP_0010985478，序列号2)的蛋白质(EVI1蛋白质)。可以确认，Evil蛋白质/EVIl蛋白质分别主要在小鼠/ 人的造血干细胞或白血病细胞的核内表达。这里，关于EVIl基因与癌症的关系，本发明人发现，在人的AML中，由于EVIl基因所位于的3号染色体长臂(3q26)上的转位而可见EVIl基因的激活(参照非专利文献4)。 然后，又明确了 EVIl基因在各种类型细胞的细胞增殖/分化中担负着的重要作用，还明确了，EVIl基因也在骨髓的造血干细胞中表达并参与造血干细胞的控制(例如参照非专利文献5)。本发明人了解到，所述EVIl基因通过控制GATA-2基因的表达来参与造血干细胞的增殖(参照非专利文献6)。另外，近年来有报告指出，EVIl基因是造血干细胞或转化白血病细胞的增殖中的重要控制因子(参照非专利文献7)。不过，尚未提出基于上述认识的关于AML等癌症的治疗/预防相关的具体方法的提案。另外，已知的是，人的AML中约2 3 成中可见EVIl基因激活，上述AML是难治性的，并且复发的频率也高。现有技术文献非专利文献非专利文献1 Jshikawa 等，Nature Biotechnology 25，1315-1321 (2007)非专利文献2 :Matsunaga 等，Nature Medicine 9，1158-1165 (2003)非专利文献3 :Morishita 等，Cell 54 (6)，831-840 (1988)非专利文献4 :Morishita 等 A, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 89 (9), 3937-3941(1992)非专利文献5 =Phillips 等，Science 288，1635-1640 (2000)非专利文献6 :Yuasa 等，The EMBO Journal 24，1976-1987 (2005)非专利文献7 :Goyama 等，Cell Stem Cell 3 (2), 207-220 (2008)

发明内容
发明所要解决的问题如上所述，在现有技术中，提出了以VLA_4( α 4/β 1整联蛋白)为靶点的AML的治疗法/复发预防方法。但是，尚不了解以EVIl基因或该基因直接编码的mRNA/蛋白质、其它与EVIl基因相关的基因或该基因编码的mRNA/蛋白质为靶点的AML的治疗方法/复发预防方法。从增加更有效且副作用小的治疗方法/复发预防方法的变种来对医疗技术的进步作出贡献的观点出发，目前仍盼望能够开发以VLA-4以外的分子作为靶点的新的分子靶向疗法。因此，本发明的目的在于提供一种利用对与以往不同的目标分子的表达/功能进行控制的癌症的预防/治疗手段，作为癌症的分子靶向疗法的新的措施。本发明的目的还在于提供一种使用上述目标分子来筛选具有癌症的预防/治疗活性的物质的措施。解决问题的措施本发明人为解决上述课题进行了深入的研究。结果发现，通过抑制EVIl基因或 EVIl蛋白质的表达/功能，被抑制的细胞的细胞粘附能力降低。同样还发现，通过抑制现有已知的形成二聚体的整联蛋白的构成α 6亚基和β 4亚基的各个蛋白质(分别为ITGA6蛋白质和ITGB4蛋白质)的表达/功能，或抑制编码所述蛋白质的基因(分别为ITGA6基因和ITGB4基因)的表达/功能，所抑制的细胞的细胞粘附能力也降低。这样，本发明证明了 EVIl基因/蛋白质或ITGA6/ITGB4基因/蛋白质可以作为癌症的预防/治疗癌症的靶点， 从而完成了本发明。S卩，根据本发明的一个实施方式，提供一种癌细胞的细胞粘附抑制剂，所述抑制剂包含针对含有与序列号2、序列号4或序列号6所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽的抗体。根据本发明的另一个实施方式，提供一种癌细胞的细胞粘附抑制剂，所述抑制剂含有反义多核苷酸，所述反义多核苷酸含有与编码含有与序列号2、序列号4或序列号6所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的碱基序列互补或实质上互补的碱基序列或其一部分。根据本发明的又一个实施方式，提供一种癌细胞的细胞粘附抑制剂，所述抑制剂包含抑制含有与序列号2、序列号4或序列号6所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质的表达和/或活性的物质。这里，上述抑制剂例如用于癌症的预防或治疗。上述抑制剂在与其它抗癌药合并使用时，可以用于提高癌细胞对上述抗癌药的敏感性。上述癌症可以是白血病(例如急性骨髓性白血病(AML))。根据本发明的又一个实施方式，提供一种癌细胞的细胞粘附抑制方法，所述方法包括抑制含有与序列号2、序列号4或序列号6所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质的表达和/或活性。根据本发明的又一个实施方式，提供一种癌细胞的细胞粘附抑制方法，所述方法包括抑制编码含有与序列号2、序列号4或序列号6所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的表达和/或活性。根据本发明的又一个实施方式，提供一种抑制含有与序列号2、序列号4或序列号6所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质的表达和/或活性的物质在制造癌细胞的细胞粘附抑制剂中的应用。根据本发明的又一个实施方式，提供一种抑制编码含有与序列号2、序列号4或序列号6所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的表达和/ 或活性的物质在制造癌细胞的细胞粘附抑制剂中的应用。根据本发明的又一个实施方式，提供一种抑制癌细胞的细胞粘附的物质的筛选方法，所述筛选方法使用含有与序列号2、序列号4或序列号6所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽。这里，含有与序列号2、序列号4或序列号6所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽可以以生产所述蛋白质或其部分肽的细胞的形态提供。此时，还可以使用从对于含有与序列号2、序列号4或序列号6所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽的抗体、 以及含有编码所述蛋白质的多核苷酸或其碱基序列的一部分的多核苷酸中选择的任意一种。另外，上述筛选方法可以用于癌症的预防或治疗物质的筛选。发明的效果根据本发明，作为癌症的分子靶向疗法中的新的方法，可以通过控制与现有技术不同的目标分子的表达、功能，来提供癌症的预防/治疗措施。另外，根据本发明，还可以提供使用了上述目标分子的、筛选具有癌症的预防/治疗活性的物质的措施。


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1中的琼脂糖凝胶电泳的结果的图.
图20 (a)是表示培养AMLl(shLuc)的结果的图，图20(b)是表示培养AMLl (shEVIl)的结果的图。图21是表示参考例6中，从NCBI的基因表达库(GEO)中采集人AML患者的骨髓细胞中的基因表达数据得到的结果的图。图21 (a)表示ITGA6基因的表达量数据，图21 (b) 表示ITGB4基因的表达量数据。图22是表示参考例7中，从NCBI的基因表达库(GEO)中采集人的各种骨髓/末梢血细胞中的基因表达数据，并对ITGA6基因的表达量进行比较的结果的图。图M是表示参考例8中的琼脂糖凝胶电泳的结果的图。图25是表示实施例5中的FACS法测定结果的图表。图25 (a)表示使用 AMLl (shLuc)细胞的FACS结果，图25 (b)表示使用AMLl (shEVIl)细胞的FACS结果。
具体实施例方式本发明人首先简略介绍一下完成本方式的原委，首先，本发明人发现通过抑制 EVIl基因的表达，各种人白血病细胞中的整联蛋白的表达受到抑制，所述胞的细胞粘附能力降低。具体来说，明确了通过抑制EVIl基因的表达，整联蛋白的α6亚基和β4亚基的表达受到抑制。这里，构成人整联蛋白α 6亚基的蛋白质(ITGA6蛋白质)由含有5680bp的ITGA6 基因(参考序列登录号NM_001079818，序列号3)编码，含有1091个氨基酸(参考序列登录号NP_001073^6，序列号4)。小鼠的同源蛋白质(Itga6蛋白质)由含有4205bp的Itga6基因(参考序列登录号NM_008397)编码，含有1073个氨基酸(参考序列登录号NP_032423)。另外，构成人整联蛋白β 4亚基的蛋白质(ITGB4蛋白质)由含有5695bp的ITGB4 基因(参考序列登录号NM_001005619，序列号5)编码，含有1805个氨基酸(参考序列登录号NP_001005619，序列号6)。小鼠的同源蛋白质(Itgb4蛋白质)由含有6160bp的 Itgb4基因(参考序列登录号NM_001005608)编码，含有1802个氨基酸(参考序列登录号 ΝΡ_001005608)。本发明人确认，上述ITGA6基因和ITGB4基因在EVIl阳性细胞中特异性地表达。根据上述结果，本发明人提出了 ITGA6基因/蛋白质、以及ITGB4基因/蛋白质可能与白血病细胞等癌细胞的细胞粘附能力的发挥有关的假说。据此，确认了通过抑制ITGB4 基因的表达、或利用中和抗体抑制ITGB4蛋白质的活性，来降低人白血病细胞的细胞粘附能力，从而验证了上述假说。另外，关于ITGA6基因或ITGA6蛋白质，虽未进行上述的确认试验，但是考虑到ITGA6基因的表达会由于EVIl的表达抑制而与ITGB4基因同样地受到抑制、以及ITGA6基因在各种细胞中的表达特异性与ITGB4基因相同，可以认为在ITGA6基因 /蛋白质中，得到与上述的ITGB4基因/蛋白质同样的结果的概率极高。这里，已知在EVIl基因表达的AML细胞中，整联蛋白的表达亢进。因此，本发明人鉴于上述认识，提出了整联蛋白可能参与了白血病细胞与骨髓的细胞粘附能力的发挥的假说。在此基础上，确认了通过向EVIl阴性细胞中导入EVIl基因，所述细胞的细胞粘附能力升高，此时ITGA6基因和ITGB4基因的表达也增加。与此同时，在使用AML的临床检样的试验中，确认了 EVIl基因的表达与ITGA6基因/ITGB4基因的表达之间的相关性，从而验证了上述假说。根据上述几种认识，本发明人完成了本发明。以下详细说明用于实施本发明的方式。本发明的技术范围并不只限定为下述方式。本发明中使用的蛋白质(也称为“本发明的蛋白质”)是含有与序列号2、序列号4、 或序列号6表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质。本发明的蛋白质可以是从人或其它温血动物(例如豚鼠、大鼠、小鼠、鸡、兔、猪、绵羊、牛、猴等)的细胞(例如肝细胞、脾细胞、神经细胞、神经胶质细胞、胰腺β细胞、骨髓细胞、系膜细胞、朗格汉斯细胞、表皮细胞、上皮细胞、杯状细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、纤维细胞、肌细胞、脂肪细胞、免疫细胞(例如巨噬细胞、T细胞、B细胞、天然杀伤细胞、肥大细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞)、巨核细胞、滑膜细胞、软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、乳腺细胞或间质细胞、或这些细胞的前体细胞、干细胞或癌细胞等)或存在这些细胞的所有组织(例如脑、脑的各部位(例如嗅球、扁桃核、基底核、海马体、丘脑、下丘脑、大脑皮质、延髓、小脑)、脊髓、脑下垂体、胃、胰腺、肾脏、肝脏、生殖腺、甲状腺、胆囊、 骨髓、副肾、皮肤、肌肉(例如平滑肌、骨骼肌)、肺、消化道(例如大肠、小肠)、血管、心脏、 胸腺、脾脏、颂下腺、末梢血、前列腺、睾丸、卵巢、胎盘、子宫、骨骼、关节、脂肪组织(例如白色脂肪组织、褐色脂肪组织)等)等中分离/纯化得到的蛋白质。另外，也可以是化学合成或利用无细胞翻译系统而生化合成的蛋白质，或者是由导入了核酸的转化体而生产的重组蛋白，其中所述核酸具有编码上述氨基酸序列的碱基序列。作为与序列号2、序列号4、或序列号6表示的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列，可以举出与序列号2、序列号4、或序列号6表示的氨基酸序列具有约50%或更高、优选地约60%或更高、更优选约70%或更高、进一步优选约80%或更高、特别优选约90%或更高、最优选约95%或更高的同源性的氨基酸序列等。这里，“同源性”是指采用在所述技术领域中公知的数学算法，将两个氨基酸序列进行比对时，最佳的比对(优选地，为了获得最佳的比对，所述算法考虑了向序列的一方或双方导入空位)中的相同的氨基酸和类似氨基酸残基相对于重叠的全部氨基酸残基的比例(％)。“类似氨基酸”是指物理化学性质类似的氨基酸，例如可以举出芳族氨基酸(Phe、Trp、Tyr)、脂肪族氨基酸(Ala、Leu、Ile、Val)、 极性氨基酸(GlruAsn)、碱性氨基酸(Lys、Arg、His)、酸性氨基酸(Glu、Asp)、含羟基的氨基酸(kr、Thr)、小支链的氨基酸(Gly、Ala、Ser, Thr, Met)等被分类为相同类型的氨基酸。 可以预见的是，上述的类似氨基酸的置换不会带来蛋白质表型的变化(即，为保守性的氨基酸置换)。保守性的氨基酸置换的具体例子在所述技术领域是周知的，记载于各种文献 (例如参照 Bowie 等著，Science, 247 1306-1310 (1990))。 本说明书中的氨基酸序列的同源性可以使用同源性计算算法NCBI BLAST (美国国立生物技术信息中心碱基局部比对检索工具(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool))，按以下的条件(期望值=10 ；允许空位；矩阵=BL0SUM62 ；过滤=OFF)计算。用于确定氨基酸序列的同源性的其它算法例如可以举出Karlin 等著，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :5873-5877 (1993)中记载的算法(所述算法包含在NBLAST和XBLAST程序(版本2. 0)中(Altschul等著，Nucleic Acids Res.，25 :3389-3402 (1997))) ,Needleman 等著，J. Mol. Biol.，48 :444-453 (1970)中记载的算法(所述算法包含在GCG软件包中的GAP程序中)、Myers和Miller，CABI0S，4 11-17(1988)中记载的算法(所述算法包含在CGC序列比对软件包的一部分即ALIGN程序 (版本 2.0)中)、Pearson 等著，Proc. Natl. AcacUci. USA，85 :2444-2448(1988)中记载的算法(所述算法包含在GCG软件包的FASTA程序中)等，它们也可以同样地优选采用。更优选地，与序列号2、序列号4、或序列号6表示的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列是与序列号2、序列号4、或序列号6表示的氨基酸序列具有约50%或更高、优选约 60%或更高、更优选约70%或更高、进一步优选约80%或更高、特别优选约90%或更高、最优选约95%或更高的同一性(identity)的氨基酸序列。本发明中使用的蛋白质是含有与序列号2、序列号4、或序列号6表示的氨基酸序列实质上同一的氨基酸序列、且与含有序列号2、序列号4、或序列号6表示的氨基酸序列的蛋白质具有实质上同质的活性的蛋白质。实质上同质的活性例如可以举出配体结合活性或信号信息传递作用等。这里，“实质上同质”表示它们的性质在定性上(例如生理学上或药理学上)同质。因此，本发明的蛋白质活性优选为同等，而它们的活性程度(例如约0.01 约100倍，优选约0. 1 约10 倍，更优选0. 5 2倍)、或蛋白质的分子量等量的要素可以不同。配体结合活性或信号信息传递作用等活性的测定可以按照其本身公知的方法进行。例如可以按照在后述的抑制本发明中使用的蛋白质活性的化合物或它的盐的筛选方法中采用的方法等进行。作为本发明中使用的蛋白质，例如也可以包含所谓的突变蛋白，即含有(i)在序列号2、序列号4、或序列号6表示的氨基酸序列中的缺失了 1个或2个或更多(例如1 50个左右，优选1 30个左右，更优选1 10个左右，进一步优选数个(1 5、4、3或2 个))氨基酸的氨基酸序列、(ii)在序列号2、序列号4、或序列号6表示的氨基酸序列上附加了 1个或2个或更多个(例如1 50个左右，优选1 30个左右，更优选1 10个左右，进一步优选数个(1 5、4、3或2个))氨基酸的氨基酸序列、(iii)在序列号2、序列号4、或序列号6表示的氨基酸序列中插入了 1个或2个或更多个(例如1 50个左右，优选1 30个左右，更优选1 10个左右，进一步优选数个(1 5、4、3或2个))氨基酸的氨基酸序列、(iv)在序列号2、序列号4、或序列号6表示的氨基酸序列中的1个或2个或更多个(例如1 50个左右，优选1 30个左右，更优选1 10个左右，进一步优选数个 (1 5、4、3或2个)氨基酸被其它氨基酸置换的氨基酸序列、或(ν)将它们组合而得到的氨基酸序列的蛋白质等。如上所述，在对氨基酸序列进行插入、缺失或置换的情况下，其插入、缺失或换的位置没有特别限定。作为本发明中使用的蛋白质的优选例子，例如可以举出含有序列号2表示的氨基酸序列的人EVIl (参考序列登录号NP_001098M7)或其它哺乳动物的同系物(例如 GenBank中以参考序列登录号NP_031989登录的小鼠同系物)、含有序列号4表示的氨基酸序列的人ITGA6 (参考序列登录号NP_001073^6)或其它哺乳动物的同系物(例如GenBank 中以参考序列登录号NP_03M23登录的小鼠同系物)、含有序列号6表示的氨基酸序列的人ITGB4(参考序列登录号NP_001005619)或其它哺乳动物的同系物(例如GenBank中以参考序列登录号NP_001005608登录的小鼠同系物)等。在本说明书中，按照肽标记的惯例，蛋白质和肽的左端记载为N末端(氨基末端)， 右端记载为C末端(羧基末端)。以含有序列号2、序列号4、或序列号6表示的氨基酸序列的蛋白质为代表的、本发明中使用的蛋白质可以是C末端为羧基(-C00H)、羧酸盐基(-C00-)、酰胺基(-CONH2)或酯(-C00R)的任意一种。这里，在C末端为酯(-C00R)的情况下，R例如可以使用甲基、乙基、正丙基、异丙
基、正丁基等Cp6烷基；环戊基、环己基等C3_8环烷基；苯基、α -萘基等C6_12芳基；苄基、苯乙基等苯基-C"烷基或者α -萘基甲基等α -萘基-Cl_2烷基等的C7_14芳烷基、新戊酰氧甲基等。在本发明中使用的蛋白质在C末端以外具有羧基(或羧酸盐基)的情况下，羧基被酰胺化或酯化了的蛋白质也包含在本发明使用的蛋白质中。在此情况下的酯例如可以使用上述的C末端的酯等。另外，本发明中使用的蛋白质还可以包含N末端的氨基酸残基(例如蛋氨酸残基) 的氨基被保护基团(例如甲酰基、乙酰基等Cp6烷酰基等的Ch6酰基等)保护的蛋白质、在生物体内切断而生成并且将N末端的谷氨酰胺残基进行了焦谷氨酸化的蛋白质、分子内的氨基酸支链上的取代基(例如_0H、-SH、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)被适当的保护基团 (例如甲酰基、乙酰基等Cp6烷酰基等的Ch6酰基等)保护的蛋白质、或糖链键合了的所谓糖蛋白等复合蛋白等。作为本发明中使用的蛋白质的部分肽，是具有上述本发明中使用的蛋白质的部分氨基酸序列的肽，且只要与所述蛋白质实质上具有同质活性即可，可以是任何的肽。这里， “实质上同质的活性”与上述的含义相同。“实质上同质的活性”的测定可以与上述本发明中使用的蛋白质的情形同样进行。例如可以使用具有本发明中使用的蛋白质的构成氨基酸序列中的至少20个或更多、优选50个或更多、进一步优选70个或更多、更优选100个或更多、最优选150个或更多的氨基酸序列的肽等。另外，在本发明中使用的部分肽中，氨基酸序列中缺失了 1个或2个或更多个(优选1 20个左右，更优选1 10个左右，进一步优选数个(1 5、4、3或2个))氨基酸、 在氨基酸序列中附加了 1个或2个或更多个(优选1 20个左右，更优选1 10个左右， 进一步优选数个(1 5、4、3或2个))氨基酸、或在氨基酸序列中插入了 1个或2个或更多个(优选1 20个左右，更优选1 10个左右，进一步优选数个(1 5、4、3或2个)) 氨基酸、或氨基酸序列中的1个或2个或更多个(优选1 20个左右，更优选1 10个左右，进一步优选数个(1 5、4、3或2个))氨基酸被其它氨基酸置换。在本发明中使用的部分肽中，C末端可以是羧基(-C00H)、羧酸盐基(-C00-)、酰胺基(-CONH2)或酯(-C00R)的任意一种。这里，在C末端为酯(-C00R)的情况下，作为R可以举出与关于本发明使用的蛋白质的上述同样的基团。在本发明的部分肽在C末端以外具有羧基(或羧酸基)的情况下，羧基被酰胺化或酯化了的蛋白质也包含在本发明的部分肽中。 此时的酯例如可以使用与C末端的酯同样的酯等。另外，在本发明中使用的部分肽中，与上述本发明中使用的蛋白质同样地，也包括 N末端的氨基酸残基(例如蛋氨酸残基)的氨基被保护基团所保护的部分肽、将N末端一侧在生物体内切断而生成的谷氨酰胺残基进行了焦谷氨酸化的部分肽、分子内的氨基酸的支链上的取代基被适当的保护基团所保护的部分肽、或者是糖链键合了的所谓糖肽等的复合
月太等。本发明中使用的部分肽可以作为制作抗体用的抗原使用。
本发明中使用的蛋白质或其部分肽可以是游离体，也可以是盐(如无特别限定， 以下均同样)。上述盐可以使用与生理学可接受的酸(例如无机酸、有机酸)或碱(例如碱金属盐)等形成的盐，尤其优选生理学可接受的酸加成盐。上述盐例如可以使用与无机酸 (例如盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)形成的盐，或与有机酸(例如乙酸、蚁酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲烷磺酸、苯磺酸)形成的盐等。本发明中使用的蛋白质可以从上述人或其它温血动物的细胞或组织中，利用其本身公知的蛋白质的纯化方法进行纯化来制备。具体来说，例如，在存在表面活性剂的条件下，将哺乳动物的组织或细胞勻浆，将所得的组织的粗提取物组分进行反相层析、离子交换层析、亲和层析等层析等，由此可以制备本发明中使用的蛋白质。本发明中使用的蛋白质或其部分肽可以按照公知的肽合成方法来制造。作为肽的合成法，例如可以是固相合成法、液相合成法的任意一种。即，将可构成本发明中使用的蛋白质或其部分肽的部分肽或氨基酸与残余部分缩合，在产物具有保护基团的情况下脱去保护基团，据此可以制造目标蛋白质(肽)。公知的缩合法或保护基团的脱去例如可举出以下(i) (ν)的方法。(i)M. Bodanszky 禾口 M. A. Ondetti,月太合成(Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York(1966 年)(ii)Schroeder 禾口 Luebke,肽(The Peptide), Academic Press, New York (1965 年)(iii)泉屋信夫等著，肽合成的基础和实验，丸善(株)(1975年)(iv)矢岛治明和榊原俊平，生化学实验讲座1，蛋白质化学IV，205 (1977年)(ν)矢岛治明监修，续医药品的开发，第14卷，肽合成，广川书店据此得到的蛋白质(肽)可以利用公知的纯化方法纯化分离。这里，作为纯化方法，例如可以举出溶剂萃取/蒸馏/柱层析/液相层析/重结晶等。在利用上述方法得到的蛋白质(肽)为游离体的情况下，可以按照公知的方法或基于这种的方法来变换成适当的盐，相反，在蛋白质(肽)是以盐的方式获得的情况下，可按照公知的方法或基于这种方法来变换成游离体或其它盐。在本发明中使用的蛋白质或其部分肽、或者其酰胺化合物的合成中，可以使用通常市售的蛋白质合成用树脂。上述树脂例如可以举出氯甲基树脂、羟基甲基树脂、二苯甲基胺树脂、氨基甲基树脂、4-苄基氧基苄基醇树脂、4-甲基二苯甲基胺树脂、PAM树脂、4-羟基甲基甲基苯基乙酰胺甲基树脂、聚丙烯酰胺树脂、4-(2’，4’_ 二甲氧基苯基-羟基甲基)苯氧基树脂、4-(2’，4’_ 二甲氧基苯基-Fmoc氨基乙基)苯氧基树脂等。使用上述树脂，按照目标蛋白的序列，按照其本身公知的各种缩合方法，使α-氨基和适当保护了支链官能基团的氨基酸在树脂上缩合。反应的最后，从树脂上切取蛋白质或部分肽，同时除去各种保护基团，进一步在高稀释溶液中实施分子内二硫键的形成反应，可以取得目标蛋白或部分肽或它们的酰胺化合物。关于上述保护氨基酸的缩合，可以使用能够在蛋白质合成中使用的各种活化试剂，特别地，可以使用碳二亚胺类。作为碳二亚胺类，可以使用DCC、N，N’ - 二异丙基碳二亚胺、N-乙基-N’ -(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺等。在通过它们进行的活化中，可以在添加外消旋化抑制添加剂(例如H0Bt、H00Bt)的同时，在树脂中直接添加保护氨基酸，或者预先进行保护氨基酸的活化，制成对称酸酐或HOBt酯或HOOBt酯的形式，然后添加到树脂中。作为在保护氨基酸的活化或者与树脂的缩合中使用的溶剂，可以从在蛋白质缩合反应中能够使用的已知的溶剂中适当选择。例如，可以使用N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等酰胺类；二氯甲烷、氯仿等卤代烃类；三氟乙醇等醇类；二甲基亚砜等亚砜类；吡啶、二氧杂环乙烷、四氢呋喃等醚类；乙腈、丙腈等腈类；乙酸甲酯、 乙酸乙酯等酯类或它们的适当的混合物等。反应温度可以从在蛋白质键形成反应中采用的已知的范围内适当选择，通常为约-20 约50°C的范围。被活化的氨基酸衍生物通常以 1. 5 4倍过量地使用。使用茚三酮反应进行测试，结果，在缩合不充分的情况下，无需进行保护基团的脱去，通过反复进行缩合反应就可以进行充分的缩合。在即使反复进行反应也未获得充分的缩合时，可以使用乙酸酐或乙酰基咪唑，使未反应氨基酸乙酰化，这样可以不对之后的反应产生影响。对于不应参与原料反应的官能基团的保护以及保护基团、以及这些保护基团的脱去、参与反应的官能基团的活化等，可以从公知的基团或公知的措施中适当地选择。作为原料的氨基的保护基团例如可以使用Z、Boc、叔戊基氧基羰基、异冰片基氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、Cl-Z、Br-Z、金刚烷基氧基羰基、三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、甲酰基、2-硝基苯基亚磺酰基、二苯基膦基硫酰基、Fmoc等。羧基例如可以通过烷基酯化(例如甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、2-金刚烷基等直链状、支链状或环状烷基酯化)、芳烷基酯化(例如苄基酯、4-硝基苄基酯、4-甲氧基苄基酯、4-氯苄基酯、二苯甲基酯化)、苯酰甲基酯化、苄氧基羰基酰胼化、叔丁氧基羰基酰胼化、三苯甲基酰胼化等来保护。丝氨酸的羟基例如可以通过酯化或醚化来保护。适合酯化的基团例如可以使用 乙酰基等低级(Ch6)烷酰基、苯甲酰基等芳酰基；苄氧基羰基、乙氧基羰基等由碳酸衍生的基团等。另外，适合醚化的基团例如为苄基、四氢吡喃基、叔丁基等。酪氨酸的酚式羟基的保护基团例如可以使用Bzl、Cl2-Bzl、2_硝基苄基、Br-Z、叔
丁基等。组氨酸的咪唑的保护基团例如可以使用Tos、4_甲氧基-2，3，6_三甲基苯磺酰基、 DNP、苄氧基甲基、Bum、Boc JrtJmoc 等。保护基团的去除(脱去)方法例如可以采用在Pd黑或Pd碳等催化剂的存在的条件下，在氢气流中进行接触还原；或可以通过无水氟化氢、甲烷磺酸、三氟甲烷磺酸、三氟乙酸或它们的混合液等进行酸处理；或进行二异丙基乙胺、三乙胺、哌啶、哌嗪等的碱处理； 还可以在液氨中通过钠进行还原等。上述利用酸处理的脱去反应通常在约-20°C 约40°C 的温度下进行；在酸处理中，例如添加茴香醚、苯酚、硫代茴香醚、间甲酚、对甲酚、二甲硫、 1，4_ 丁烷二硫醇、1，2_乙烷二硫醇等的阳离子捕获剂是有效的。另外，作为组氨酸的咪唑保护基团使用的2，4-二硝基苯基可以通过硫苯酚处理来去除，作为色氨酸的吲哚保护基团使用的甲酰基可以通过在上述1，2_乙烷二硫醇、1，4_ 丁烷二硫醇等存在的条件下的酸处理来脱保护，除此之外还可以通过稀氢氧化钠溶液、稀氨水等的碱处理来去除。原料的羧基的活化产物例如可以使用对应的酸酐、迭氮化物、活性酯(与醇(例如五氯苯酚、2，4，5-三氯苯酚、2，4-二硝基苯酚、氰基甲基醇、对硝基苯酚、Η0ΝΒ、Ν-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基邻苯二甲酰亚胺、HOBt)形成的酯)等。原料的氨基的活化产物例如可以使用对应的磷酸酰胺等。作为获得蛋白质或部分肽的酰胺化合物的其它方法，例如可以是首先将羧基末端的氨基酸的α-羧基进行酰胺化来保护，然后在氨基一侧将肽(蛋白质)链延长至所需的链长，然后制造只去除了所述肽链的N末端的α-氨基的保护基团的蛋白质或部分肽、以及只除去了 C末端的羧基保护基团的蛋白质或部分肽，使这些蛋白质或肽在上述混合溶剂中缩合。具体的缩合反应与上述相同。将通过缩合得到的保护蛋白质或肽纯化，然后按照上述方法去除所有的保护基团，可以得到所需的粗蛋白质或肽。所述粗蛋白质或肽可以采用已知的各种纯化手段纯化，并将主要组分冷冻干燥，从而可以获得所需的蛋白质或肽的酰胺化合物。为了获得蛋白质或肽的酯化物，例如可以将羧基末端的氨基酸的α-羧基与期望的醇类缩合，制成氨基酸酯，然后与蛋白质或肽的酰胺化合物同样地，获得期望的蛋白质或肽的酯化物。本发明中使用的蛋白质的部分肽可以通过用适当的肽酶切断本发明使用的蛋白质来制造。另外，本发明使用的蛋白质或其部分肽可以通过培养含有编码所述蛋白质或其部分肽的多核苷酸的转化物，从所得的培养物中分离纯化所述蛋白质或其部分肽来制备。编码本发明使用的蛋白质或其部分肽的多核苷酸可以是DNA也可以是RNA，或者可以是DNA/ RNA嵌合物。优选为DNA。另外，所述多核苷酸可以是双链，也可以是单链。在双链的情况下，可以是双链DNA、双链RNA、或DNA:RNA的杂合物。在单链的情况下，可以是有义链(即编码链)，也可以是反义链(即非编码链)。作为编码本发明使用的蛋白质或其部分肽的多核苷酸，可以举出基因组DNA、基因组DNA文库、来自哺乳动物(例如人、牛、猴、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫、豚鼠、大鼠、小鼠、兔、 仓鼠等)的所有细胞(例如肝细胞、脾细胞、神经细胞、神经胶质细胞、胰腺β细胞、骨髓细胞、系膜细胞、朗格汉斯细胞、表皮细胞、上皮细胞、杯状细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、纤维细胞、肌细胞、脂肪细胞、免疫细胞(例如巨噬细胞、T细胞、B细胞、天然杀伤细胞、肥大细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞)、巨核细胞、滑膜细胞、软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、乳腺细胞或间质细胞、或这些细胞的前体细胞、 干细胞或癌细胞等)或存在这些细胞的所有组织(例如脑、脑的各部位(例如嗅球、扁桃核、基底核、海马体、丘脑、下丘脑、大脑皮质、延髓、小脑)、脊髓、脑下垂体、胃、胰腺、肾脏、 肝脏、生殖腺、甲状腺、胆囊、骨髓、副肾、皮肤、肺、消化道(例如大肠、小肠)、血管、心脏、胸腺、脾脏、颂下腺、末梢血、前列腺、睾丸、卵巢、胎盘、子宫、骨骼、关节、脂肪组织(例如褐色脂肪组织、白色脂肪组织)、骨骼肌等)的cDNA、合成DNA等。编码本发明使用的蛋白质或其部分肽的基因组DNA和cDNA可以是分别将由上述细胞/组织制备的基因组DNA组分和总RNA或mRNA组分作为模板，通过使用聚合酶链反应(以下也称为“PCR法”)和反转录酶的RT-PCR法来直接扩增。或者，编码本发明使用的蛋白质或其部分肽的基因组DNA和cDNA 可以通过集落或噬菌体杂交法或者PCR法等，分别由基因组DNA文库和cDNA文库中克隆， 其中，所述基因组DNA文库和cDNA文库是将由上述细胞/组织制备的基因组DNA和总RNA 或mRNA的片段插入到适当的载体中制备的。文库中使用的载体可以是噬菌体、质粒、粘粒、 噬粒等的任意一种。
编码本发明中使用的蛋白质的DNA可以是含有与例如包含序列号1、序列号3、或序列号5表示的碱基序列的DNA在严谨条件下杂交的碱基序列，并编码与含有序列号2、序列号4、或序列号6表示的氨基酸序列的蛋白质具有实质上同质的活性的蛋白质的DNA。作为可以与序列号1、序列号3、或序列号5表示的碱基序列在严谨条件下杂交的 DNA，例如可使用含有与序列号1、序列号3、或序列号5表示的碱基序列具有约50%或更高、 优选约60%或更高、更优选约70%或更高、进一步优选约80%或更高、特别优选约90%或更高、最优选约95%或更高的同源性(homology)的碱基序列的DNA。本说明书中的碱基序列的同源性例如可以使用同源性计算算法NCBI BLAST (美国国立生物技术信息中心碱基局部比对检索工具(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool))，按以下的条件(期望值=10 ；允许空位；过滤=ON ；匹配打分=1 错配打分=-3)计算。用于确定碱基序列的同源性的其它算法同样优选地例举上述的氨基酸序列的同源性计算算法。杂交可以按照其本身公知的方法或基于它的方法、例如分子克隆第2版 (Molecular Cloning 2nd ed. (J\ Sambrook 等著，Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)) 等进行。在使用市售的文库的情况下，可以按照所附使用说明书的方法进行。更优选按照严谨的条件进行。杂交的条件是指例如钠浓度约19 约40mM、优选约19 约20mM，温度为约50 约70°C、优选约60 约65°C的条件。特别地，优选钠盐浓度约19mM、温度为约65°C的情形。本领域技术人员可以通过适当改变杂交溶液的盐浓度、杂交反应的温度、探针浓度、探针的长度、错配数目、杂交反应时间、洗涤液的盐浓度、洗涤温度等，来容易地调节期望的严谨性。优选地，编码本发明中使用的蛋白质的DNA可以举出含有序列号1表示的碱基序列的DNA(参考序列登录号NM_001105077)或其它哺乳动物的同系物(例如GenBank 中以参考序列登录号NM_007963登录的小鼠同系物)、含有序列号3表示的碱基序列的 DNA(参考序列登录号NM_001079818)或其它哺乳动物的同系物(例如GenBank中以参考序列登录号NM_008397登录的小鼠同系物)、含有序列号5表示的碱基序列的DNA (参考序列登录号NM_001005619)或其它哺乳动物的同系物(例如GenBank中以参考序列登录号 ΝΜ_001005608登录的小鼠同系物)等。编码本发明中使用的蛋白质的部分肽的多核苷酸(例如DNA)可以是含有编码上述本发明中使用的蛋白质的部分肽的碱基序列的任何多核苷酸。另外，还可以是基因组 DNA、基因组DNA文库、来自上述细胞/组织的cDNA、来自上述细胞/组织的cDNA文库、合成 DNA的任意一种。作为编码本发明中使用的蛋白质的部分肽的DNA，例如可以使用含有序列号1、序列号3、或序列号5表示的碱基序列的部分碱基序列、或者与含有序列号1、序列号3、或序列号5表示的碱基序列的多核苷酸在严谨的条件下杂交的碱基序列，且编码与本发明使用的蛋白质具有实质上同质的活性的肽的DNA。可以与序列号1、序列号3、或序列号5表示的碱基序列杂交的DNA与上述含义相同。杂交的方法和严谨的条件可以与上述相同样。作为编码本发明中使用的蛋白质及其部分肽(以下，在编码它们的DNA的克隆和表达的说明中，可以将它们简称为“本发明的蛋白质”)的DNA的克隆手段，可以使用合成DNA引物，通过PCR法扩增，其中所述合成DNA引物具有编码本发明的蛋白质的碱基序列的一部分；或者可以通过使嵌入到适当的载体中的DNA与使用编码本发明的蛋白质的一部分或全部区域的DNA片段或合成DNA进行标记的DNA杂交来选别。杂交的方法例如可以按照分子克隆第 2 版(Molecular Cloning 2nd ed. (J. Sambrook 等著，Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989))中记载的方法等进行。在使用市售的文库的情况下，可以按照所附的使用说明书记载的方法进行。DNA的碱基序列的变换可以使用PCR、公知的试剂盒、例如Mutan TM-super Express Km(宝酒造(株))、Mutan TM-K (宝酒造(株))等，按照 0DA-LAPCR 法、Gapped duplex法、Kunkel法等其本身公知的方法或基于它们的方法进行。所克隆的编码蛋白质的DNA可以根据目的，直接或根据期望用限制酶消化、或附加接头来使用。所述DNA可以在其5’末端一侧具有作为翻译起始密码子的ATG，并在3’末端一侧具有作为翻译终止密码子的TAA、TGA或TAG。这些翻译起始密码子或翻译终止密码子可以使用适当的合成DNA连接物进行附加。本发明的蛋白质的表达载体例如可以通过从编码本发明的蛋白质的DNA中切取作为目标的DNA片段，将所述DNA片段与适当的表达载体中的启动子下游连接来制造。作为载体，可以使用来自大肠杆菌的质粒(例如pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)、 来自枯草杆菌的的质粒(例如PUB110、pTP5、pC194)、来自酵母菌的质粒(例如pSH19、 PSH15), λ噬菌体等的噬菌体、反转录病毒、牛痘病毒、杆状病毒等动物病毒等，除此之外还可以使用 pAl-ll、pXTl、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo 等。本发明中使用的启动子只要是与基因表达中使用的宿主对应的、适当的启动子即可，可以使任何启动子。例如，在使用动物细胞作为宿主的情况下，可以举出SRa启动子、 SV40启动子、LTR启动子、CMV启动子、HSV-TK启动子等。其中，优选使用CMV(巨细胞病毒)启动子、SRa启动子等。在宿主为埃希氏杆菌属菌的情况下，优选trp启动子、Iac启动子、recA启动子、λ PL启动子、Ipp启动子、Τ7启动子等；在宿主为芽孢杆菌属菌的情况下，优选SPOl启动子、SP02启动子、penP启动子等； 在宿主为酵母菌的情况下，优选PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子等。在宿主为昆虫细胞的情况下，优选多角体蛋白启动子、PlO启动子等。在表达载体中，除以上之外，还可以根据需要使用含有增强子、剪接信号、polyA附加信号、选择标志、SV40复制起始点(以下也称为“SV40ori”)等的载体。作为选择标志， 例如可以举出二氢叶酸还原酶(以下称为“dhfr”)基因(甲氨喋呤(MTX)抗性)、氨苄青霉素抗性基因(以下称为“Ampr”)、新霉素抗性基因(以下也称为“Neor”，G418抗性)等。 特别地，在使用dhfr基因缺损中国仓鼠细胞、使用dhfr基因作为选择标志的情况下，可以通过不含有胸苷的培养基来选择目标基因。另外，还可以根据需要将与宿主适合的信号序列附加在本发明的蛋白质的N末端一侧。在宿主为埃希氏杆菌属菌的情况下，可以利用WioA信号序列、OmpA信号序列等；在宿主为芽孢杆菌属菌的情况下，可以利用α-淀粉酶信号序列、枯草芽孢杆菌素信号序列等； 在宿主为酵母菌的情况下，可以利用MFa信号序列、SUC2信号序列等；在宿主为动物细胞的情况下，可以利用胰岛素信号序列、α -干扰素信号序列、抗体分子信号序列等。使用如上构建的、含有编码本发明的蛋白质的DNA的载体，可以制造转化体。作为宿主，例如可以使用埃希氏杆菌属菌、芽孢杆菌属菌、酵母菌、昆虫细胞、昆虫、动物细胞等。作为埃希氏杆菌属菌的具体例子，例如可以使用大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)K12 · DHl (Proc.Natl. Acad. Sci. USA,60, 160(1968)) 、 JM103 (Nucleic Acids Research,9，309 (1981))、JA221(Journal of Molecular Biology,120，517 (1978))、 HBlOl(Journal of Molecular Biology，41，459 (1969))、C600 (Genetics，39，440(1954))寸。作为芽孢杆菌属菌，例如可以使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) MI114 (Gene,24,255 (1983)),207-21 (Journal of Biochemistry,95,87(1984))等。作为酵母菌，例如可以使用啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH22、 AH22R-、NA87-11A、DKD_5D、20B_12、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe) NCYC1913、NCYC2036、毕赤酵母(Pichia pastoris)KM71 等。作为昆虫细胞，例如，在病毒为AcNPV的情况下，可以使用来自甘蓝夜蛾幼虫的株化细胞(草地贪夜蛾细胞(Spodoptera frugiperda cell)，Sf细胞)、来自粉纹夜蛾 (Trichoplusiani)的中肠的MGl细胞、来自粉纹夜蛾的卵的High FiveTM细胞、来自甘蓝夜蛾的细胞或来自盐泽灯蛾^stigmena acrea)的细胞等。在病毒为BmNPV的情况下，可以使用来自蚕的株化细胞(家蚕N细胞(Bombyx mori N细胞)，BmN细胞)等。所述Sf细胞例如可以使用Sf9细胞(ATCC CRL1711)、Sf21细胞(以上记载于Vaughn, J. L.等著，In Vivo, 13,213-217(1977))等。作为昆虫，例如可以使用蚕的幼虫等(Maeda等著，Nature，315卷，592 (1985))。作为动物细胞，例如可以使用猴细胞C0S-1、C0S-3、C0S_7、Vero、中国仓鼠卵巢细胞(以下也称为“CH0细胞”)、dhfr基因缺损CHO细胞(以下也称为CHO(dhfr-)细胞)、小鼠L细胞、小鼠AtT-20、小鼠骨髓瘤细胞、小鼠ATDC5细胞、大鼠GH3、人FL细胞、人293细胞、人HeLa细胞等。为了转化埃希氏杆菌属菌，例如可以按照Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69， 2110(1972)或 Gene，17，107 (1982)等记载的方法进行。为了转化芽孢杆菌属菌，例如可以按照Mol. Gen. Genet.，168，111 (1979)等记载的方法进行。为了转化酵母菌，例如可以按照Meth. Enzymol.，194，182-187 (1991)、以及 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75，1929 (1978)等记载的方法进行。为了转化昆虫细胞或昆虫，例如可以按照Bio/Technology，6，47-55 (1988)等记载的方法进行。为了转化动物细胞，例如可以按照《细胞工学别册8新细胞工学实验手册》， 263-267 (1995)(秀润社发行)、以及Virology, 52，456 (1973)中记载的方法进行。这样，可以得到用含有编码蛋白质的DNA的表达载体转化了的转化体。在培养宿主为埃希氏杆菌属、枯草杆菌属菌的转化体时，在培养中使用的培养基为液体培养基是适合的，其中可以含有所述转化体的生长发育所必需的碳源、氮源、无机物等。作为碳源，例如可以举出葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、以及蔗糖等；作为氮源，例如可以举出铵盐类、硝酸盐类、玉米浆、胨、酪蛋白、肉提取物、大豆粕、以及马铃薯提取液等无机或有机物质；作为无机物，例如可以举出氯化钙、磷酸二氢钠、以及氯化镁等。另外，还可以添加酵母提取物、维生素类、以及生长因子等。培养基的PH优选为约5 约8。作为培养埃希氏杆菌属菌时的培养基，例如优选葡萄糖、含有水解酪蛋白氨基酸的 M9 培养基(Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory,New York 1972)。其中，为了根据需要使启动子高效率发挥作用，可以加入诸如3 β -吲哚丙烯酸等的试剂。在宿主为埃希氏杆菌属菌的情况下，培养通常在约15 约43°C下进行约3 约 24小时，可以根据需要进行通气或搅拌。在宿主为芽孢杆菌属菌的情况下，培养通常在约30 约40°C下进行约6 约M 小时，可以根据需要进行通气或搅拌。在培养宿主为酵母的转化体时，作为培养基，例如可以举出BurW10Ider最小培养基(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77,4505 (1980))或含有0. 5%水解酪蛋白氨基酸的SD培养基(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)) 培养基的 pH 优选调节为约 5 约 8。培养通常在约20 约35°C下进行约M 约72小时，可以根据需要进行通气或搅拌。在培养宿主为昆虫细胞的转化体时，作为培养基，可以使用在Grace’ s昆虫培养基(Nature，195，788 (1962))中适当加入灭活的10%牛血清等添加物所得的培养基等。培养基的PH优选调节为约6. 2 约6. 4。培养通常在约27°C下进行约3 约5天，可以根据需要进行通气(例如5% CO2)或搅拌。在培养宿主为动物细胞的转化体时，作为培养基，例如可以使用含有约5 约 20% 胎牛血清的 MEM 培养基(Science，122,501 (1952))、DMEM 培养基(Virology,8, 396(1959))、RPMI 1640 培养基(J. Am. Med. Assoc.，199，519 (1967))、199 培养基(Proc. Soc. Biol. Med.，73，1(1950))等。pH优选约6 约8。培养通常在约30 约40°C下进行约15 约60小时，可以根据需要进行通气或搅拌。如上所述，可以在转化体的细胞内、细胞膜或细胞外生成本发明的蛋白质。从上述培养物中分离纯化本发明的蛋白质例如可以按照以下方法进行。在从培养菌体或细胞中提取本发明的蛋白质时，可以适合采用在培养后用公知的方法收集菌体或细胞并将其悬浮于适当的缓冲液中，利用超声波、溶菌酶和/或冷冻融解等破坏菌体和细胞，然后利用离心或过滤获得蛋白质的粗提取液的方法等。在缓冲液中可以含有尿素或盐酸胍等蛋白质改性剂、或Triton X-100TM等表面活性剂。蛋白质分泌到培养液中时，可以在培养结束后，按照其本身的公知方法将菌体或细胞与上清分离并收集上清。关于如此得到的培养上清或提取液中所含的本发明的蛋白质的纯化，可将其本身公知的分离/纯化方法适当地组合进行。这些自身公知的分离、纯化方法可以采用盐析或溶剂沉淀法等利用溶解度的方法；透析法、超滤法、凝胶过滤法以及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法等主要利用分子量之差的方法；离子交换层析等利用电荷差的方法；亲和层析等利用特异性的亲和性的方法；反相高效液相层析等利用疏水性之差的方法；等电位点电泳法等利用等电位点之差的方法等。在如此得到的本发明的蛋白质以游离体的形式获得的情况下，可以按照其本身公知的方法或基于它的方法来变换成盐；相反，在以盐的形式获得的情况下，可以按照其本身公知的方法或与基于它的方法来变换成游离体或其它的盐。
通过在纯化前或纯化后使适当的蛋白质改性酶发生作用，可以对重组体所生产的蛋白质任意加入修饰，也可以部分地区除多肽。作为蛋白改性酶，例如可以使用胰蛋白酶、 胰凝乳蛋白酶、精氨酸内肽酶、蛋白激酶、糖苷酶等。如此生成的本发明的蛋白质的存在可以通过使用特异性抗体的酶联免疫测定或蛋白质印迹等来测定。另外，本发明中使用的蛋白质或其部分肽可以以编码所述蛋白质或部分肽的DNA 所对应的RNA为模板，使用含有兔网织红细胞溶胞产物、小麦胚芽溶胞产物、大肠杆菌溶菌产物等无细胞蛋白质翻译系统，通过体外翻译来合成。或者，还可以进一步使用含有RNA聚合酶的无细胞转录/翻译系统，以编码钙调蛋白及其部分肽的DNA为模板进行合成。无细胞蛋白质(转录/)翻译系统可以使用市售商品，还可以按照其本身已知的方法来制备，具体来说，大肠杆菌提取液可以按照I^ratt J.M.等著，“Transcription and TranIation", Hames B. D.和 Higgins S.J.编著，IRL Press, Oxford 179-209 (1984)记载的方法制备。作为市售的细胞溶胞产物，来自大肠杆菌的可以举出E. coli S30提取系统(extract system) (Promega 制造)或 RTS 500 快速翻译系统(Rapid Tranlation System) (Roche 制造)等； 来自兔网织红细胞的可以举出兔网织细胞溶胞产物系统(Rabbit Reticulocyte Lysate Ssystem) (Promega制造)等；而来自小麦胚芽的可以举出PR0TEI0S ΤΜ(Τ0Υ0Β0制造) 等。其中，优选使用小麦胚芽溶胞产物。作为小麦胚芽溶胞产物的制作方法，例如可以采用 Johnston F. B.等著，Nature，179，160-161 (1957)或Erickson A. H.等著，Meth. Enzymol.， 96,38-50(1996)等记载的方法。作为用于蛋白质合成的系统或装置，可以举出间歇法(如上述的ft~att，J. Μ.等著(1984))、或者将氨基酸、能量源等连续地供给反应系统的连续式无细胞蛋白质合成系统 (Spirin A. S.等著，Science，242，1162-1164 (1988))、透析法(木川等著，第 21 届日本分子生物学会，WID6)、或重层法(PR0TEI0S TM小麦培养无细胞蛋白质合成核心试剂盒使用说明书Τ0Υ0Β0制造)等。另外，还可以使用如下方法等根据需要向合成反应系统供给模板 RNA、氨基酸、能量源等，根据需要排出合成产物或分解产物(日本特开2000-333673)。针对本发明中使用的蛋白质或其部分肽的抗体(以下也称为“本发明的抗体”)只要是可以识别本发明中使用的蛋白质或其部分肽的抗体即可，可以是多克隆抗体、单克隆抗体的任意一种。抗体的同型没有特别限定，优选IgG、IgM或IgA，特别优选IgG。本发明的抗体只要至少具有用于特异性识别目标抗原并结合的互补决定区(CDR) 即可，没有特别限定；除完全抗体分子之外，例如可以是用？油1油，1(油，)2等片段、8冲1 scFv-Fc、微抗体(minibody)、双特异抗体(diabody)等基因工程制作的共轭分子或它们的用聚乙二醇(PEG)等具有蛋白质稳定作用的分子等改良了的衍生物等。本发明中使用的蛋白质或其部分肽(以下在抗体的说明中将它们简称为“本发明的蛋白质”)的抗体可以按照其本身公知的抗体或抗血清的制造方法制造。以下对本发明的抗体的免疫原制备法、以及所述抗体的制造方法进行说明。(1)抗原的制备为了制备本发明的抗体而使用的抗原可以使用上述本发明的蛋白质或其部分肽、 或具有1种或2种或更多种的与其相同的抗原决定基的(合成)肽等的任意一种(以下将它们简称为“本发明的抗原”)。
如上所述，本发明的蛋白质或其部分肽例如可以利用如下方法制造(a)使用公知的方法或基于该方法的方法，从人、猴、大鼠、小鼠、鸡等温血动物的组织或细胞中制备； (b)按照使用肽合成器等的公知的肽合成方法进行化学合成；(c)对含有编码本发明的蛋白质或其部分肽的DNA的转化体进行培养；或者(d)以编码本发明的蛋白质或其部分肽的核酸为模板，使用无细胞转录/翻译系统进行生化合成。(a)在由温血动物的组织或细胞制备本发明的蛋白质的情况下，可以在将所述组织或细胞勻浆后，直接使用粗组分(例如膜组分、可溶性组分)作为抗原。或者用酸、表面活性剂或醇等进行提取，将盐析、透析、凝胶过滤、反相色谱、离子交换层析、亲和层析等层析法组合来对所得的提取液进行纯化分离。可以将所得的本发明的蛋白质直接用作免疫原， 也可以通过使用肽酶等的有限酶解来制备部分肽，并将其作为免疫原。(b)在化学制备本发明的抗原的情况下，所述合成肽例如可以使用采用上述(a) 的方法，使用利用天然材料纯化了的、与本发明的蛋白质具有相同结构的合成肽，具体来说，可以使用的肽等是含有1种或2种或更多种与所述蛋白质的氨基酸序列中含有3个以上、优选6个以上的氨基酸的任意位置的氨基酸序列为相同的氨基酸序列的肽。(c)在使用含有DNA的转化体制造本发明的抗原的情况下，所述DNA可以按照公知的克隆方法(例如分子克隆第2版(Molecular Cloning 2nd ed.) (J. Sambrook等著，Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)中记载的方法等)制作。作为所述克隆方法，可以举出以下的方法(1)使用根据编码本发明的蛋白质的基因序列而设计的DNA探针，利用杂交法， 从cDNA文库中分离编码所述抗原的DNA;或者(2)使用根据编码本发明的蛋白质的基因序列而设计的DNA引物，以cDNA为模板，利用PCR法制备编码所述抗原的DNA，将所述DNA插入到与宿主适合的表达载体中等。可以利用所述表达载体转化宿主，将所得的转化体在适当的培养基中培养，据此来获得期望的抗原。(d)在利用无细胞转录/翻译系统的情况下，可以举出以下方法等以插入了编码按照与上述(c)同样的方法制备的抗原的DNA的表达载体为模板(例如为所述DNA在 T7、SP6启动子等控制下的表达载体等)，使用含有与所述启动子适合的RNA聚合酶和底物(NTP)的转录反应液来合成mRNA，然后以所述mRNA为模板，使用公知的无细胞翻译系统 (例如大肠杆菌、兔网织红细胞、小麦胚芽等的提取液)进行翻译反应。可以通过适当调节盐浓度等，使转录反应和翻译反应在同一反应液中一并进行。作为免疫原，可以使用本发明的蛋白质的完全分子或具有其部分氨基酸序列的肽。作为部分氨基酸序列，例如可以举出含有3个或更多个连续的氨基酸残基的氨基酸序列，优选含有4个或更多个、更优选5个或更多个、最优选6个或更多个连续的氨基酸残基的氨基酸序列。或者，作为所述氨基酸序列，例如可以举出含有20个或更少个连续的氨基酸残基的氨基酸序列，优选含有18个或更少个、更优选15个或更少个、最优选12个或更少个连续的氨基酸残基的氨基酸序列。这些氨基酸残基的一部分(例如1个 数个)可以被可取代的基团(例如Cys残基、羟基等)取代。作为免疫原使用的肽具有含1个 数个上述部分氨基酸序列的氨基酸序列。或者，可以将表达本发明的蛋白质的温血动物细胞本身直接作为本发明的抗原使用。作为温血动物细胞，可以使用上述(a)项所述的天然细胞、或由上述(c)项所述的方法转化的细胞等。作为转化中使用的宿主，只要是从人、猴、大鼠、小鼠、仓鼠、鸡等采集的细胞即可，可以是任何细胞,优选使用 HEK293、C0S7、CHO-KU NIH3T3、Balb3T3、FM3A、L929、 SP2/0、P3U1、B16或P388等。表达本发明的蛋白质的天然温血动物细胞或转化的温血动物细胞可以以悬浮于在组织培养中使用的培养基(例如RPMI1640)或缓冲液(例如Hanks缓冲盐类溶液，HBSS)的状态下注射到免疫动物中。免疫方法只要是可以促进抗体生成的方法即可，可以是任何方法，优选使用静脉内注射、腹腔内注射、肌肉注射或皮下注射等。本发明的抗原只要具有免疫原性即可，可以将不溶物质直接免疫，但在使用分子内只具有1个 数个抗原决定基的低分子量(例如分子量约为3，000或更低)的抗原(即本发明的蛋白质的部分肽)的情况下，这些抗原通常是免疫原性低的半抗原分子，因此可以以与适当的担体(carrier)结合或吸附的复合物的形式进行免疫。作为担体，可以使用天然或合成的高分子。天然高分子例如可使用牛、兔、人等哺乳动物的血清白蛋白、或例如牛、兔等哺乳动物的甲状腺球蛋白、例如鸡的卵清白蛋白、例如牛、兔、人、绵羊等哺乳动物的血红球蛋白、匙孔血蓝蛋白(KLH)等。作为合成高分子，例如可以举出聚氨基酸类、聚苯乙烯类、聚丙烯酸类、聚乙烯基类、聚丙烯类等的聚合物或共聚物等各种胶乳等。所述担体与半抗原的混合比例只要是可以高效率地生产与担体结合或吸附的抗原所对应的抗体即可，可以将任何抗原或担体以任何比例结合或吸附，可以使用在通常制造半抗原的抗体时常用的上述天然或合成高分子担体，使其按照重量比为相对于半抗原 0.1-100的比例结合或吸附。另外，半抗原与载体的偶联可以使用各种缩合剂。例如可以根据情况使用将酪氨酸、组胺酸、色氨酸交联的双重氮化联苯胺等的重氮化合物；将氨基之间交联的戊二醛等二醛化合物；甲苯-2，4-二异氰酸酯等二异氰酸酯化合物；将硫醇基之间交联的N，N’ -邻苯二马来酰亚胺等二马来酰亚胺化合物；将氨基与硫醇基交联的马来酰亚胺活性酯化合物； 将氨基与羧基交联的碳二酰亚胺化合物等。另外，在将氨基之间进行交联时，通过使具有二硫吡啶基的活性酯试剂(例如3-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺基(SPDP)等)与一个氨基反应后进行还原，由此导入硫醇基，然后通过马来酰亚胺活性酯试剂将马来酰亚胺基导入另一个氨基，可以使两者都发生反应。(2)单克隆抗体的制备(a)单克隆抗体生成细胞的制备关于本发明的抗原，可以将其本身单独或者与载体、稀释剂一起，通过腹腔注入、 静脉注入、皮下注射、皮内注射等的给予方法给予到温血动物的能够生成抗体的部位。在给予时，为了提高抗体生成能力，可以给予完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂。给予通常是每 1 6周进行1次，共进行2 10次左右。作为所使用的温血动物，例如可以举出猴、兔、 狗、豚鼠、小鼠、大鼠、仓鼠、绵羊、山羊、驴、以及鸡。为了避免抗Ig抗体生成的问题，优选使用与给予对象相同的哺乳动物，不过，在单克隆抗体制备中通常优选使用小鼠和大鼠。由于对人的人工免疫致敏存在伦理上的困难，因此在本发明的抗体以人作为给予对象的情况下，优选(i)对按照后述方法制备的人抗体生成动物(例如小鼠)进行免疫来获得人抗体；( )按照后述方法制作嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体；或者(iii)将体外免疫法和利用病毒的细胞无限增殖化、人-人(或小鼠)杂交瘤制作技术、噬菌体展示法等组合来获得人抗体。另外，体外免疫法由于具有在通常的免疫中能够获得抗体生成得到抑制的抗原的抗体的可能性，或可以以ng-μ g级的抗原量获得抗体、且免疫在几天内即可结束等，因此作为获得不稳定且难以大量制作的抗原的抗体的方法，在制备来自非人动物的抗体时优选使用。作为在体外免疫法中使用的动物细胞，可以举出从人和上述温血动物(优选小鼠、大鼠)的末梢血、脾脏、淋巴结等中分离的淋巴细胞，优选B淋巴细胞等。例如，在小鼠细胞或大鼠细胞的情况下，可以从4 12周龄左右的动物中摘除脾脏、分离脾细胞，并用适当的培养基(例如Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、RPMI1640培养基、Ham F12培养基等)洗涤，然后在添加了含有抗原的胎牛血清(FCS，5-20%左右)的培养基中悬浮，采用 4 10天左右的CO2孵育等进行培养。作为抗原浓度，例如可以举出0.05 5yg，但并不限于此。优选按照常规方法制备同一系统的动物(优选1 2周龄左右)的胸腺细胞培养上清并添加到培养基中。在人细胞的体外免疫中，难以获得胸腺细胞培养上清，因此优选将IL-2、IL-4、 IL-5、IL-6等几种细胞因子和根据需要使用的佐剂物质(例如胞壁酰二肽等)与抗原一起添加到培养基中进行免疫致敏。在制备单克隆抗体时，从免疫了抗原的温血动物(例如小鼠、大鼠)或动物细胞 (例如人、小鼠、大鼠)中选择确认了抗体滴度升高的个体或细胞集团，在最终免疫的2 5天后采集脾脏或淋巴结、或者在体外免疫后培养4 10天，然后回收细胞并分离抗体生成细胞，并将其与骨髓瘤细胞融合，从而可以制备生产抗体的杂交瘤。血清中的抗体滴度的测定例如可以在标记化抗原与抗血清反应后，通过测定与抗体结合的标记试剂的活性来进行。骨髓瘤细胞只要是能够生产可分泌大量抗体的杂交瘤的细胞即可，没有特别限定，优选自身不生产或分泌抗体的，更优选细胞融合效率高的骨髓瘤细胞。为了容易地进行杂交瘤选择，优选使用HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)敏感性细胞株。例如，作为小鼠骨髓瘤细胞可以举出NS-1、P3U1、SP2/0、AP-1等，作为大鼠骨髓瘤细胞可以举出R210. RCY3、 Y3-Agl. 2. 3 等，作为人骨髓瘤细胞可以举出 SK0-007、GM1500-6TG-2、LICR-LON-HMy2、 UC729-6 等。融合操作可以按照已知的方法、例如K6hler和Milstein的方法(Nature，256， 495(1975))实施。作为融合促进剂，可以举出聚乙二醇(PEG)或仙台病毒等，优选使用PEG 等。对PEG的分子量没有特别限定，优选为低毒性且粘性比较低的PEG1000 PEG6000。作为PEG浓度，例如可以举出10 80%左右，优选30 50%左右。作为PEG的稀释用溶液， 可以使用无血清培养基(例如RPMI1640)、含5 20%左右的血清的完全培养基、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris缓冲液)等各种缓冲液。还可以根据需要添加DMSO(例如10 20%左右)。融合液的pH例如可以举出4 10左右，优选6 8左右ο抗体生成细胞(脾细胞)数目与骨髓细胞数目的优选比例通常为1 1 20 1 左右，通过通常在20 40°C、优选30 37°C下、通常进行1 10分钟的孵育(例如(X)2孵育)，可以实施高效率的细胞融合。抗体生成细胞株还可以通过使抗体生成细胞感染可转化淋巴细胞的病毒而使所述细胞无限增殖化来获得。上述病毒例如可以举出Epstein-Barr(EB)病毒等。作为传染性单核细胞增多症的无症状感染，大多数的人都有感染过这种病毒的经验，因此已具有免疫力，但在使用通常的EB病毒的情况下也会生成病毒颗粒，因此应当进行适当的纯化。作为没有病毒混入可能性的EB系统，还优选使用保持有使B淋巴细胞无限增殖化的能力、但病毒颗粒复制能力缺损的重组EB病毒(例如由潜伏感染状态向溶解感染状态转移的开关基因的缺损等)。来自绒猴的B95-8细胞分泌EB病毒，因此，如果使用它的培养上清，可以容易地转化B淋巴细胞。将所述细胞在例如添加了血清和青霉素/链霉素(P/S)的培养基(例如 RPMI1640)或添加了细胞生长因子的血清培养基中培养，然后通过过滤或离心等将培养上清分离，使生成抗体的B淋巴细胞以适当的浓度(例如约IO7细胞/mL)悬浮于其中，在通常20 40°C、优选30 37°C下进行通常0. 5 2小时左右的孵育，由此可以获得抗体生成B细胞株。在人的抗体生成细胞是以混合淋巴细胞的形式提供的情况下，大部分的人具有对EB病毒感染细胞显示伤害性的T淋巴细胞，因此为了提高转化频率，优选利用绵羊红细胞等和形成E玫瑰花结来预先除去T淋巴细胞。另外，还可以将结合了可溶性抗原的绵羊红细胞与抗体生成B淋巴细胞混合，使用Percoll等的密度梯度来分离玫瑰花结，由此可以选别对目标抗原具有特异性的淋巴细胞。另外，添加极过量的抗原则抗原特异性的B淋巴细胞被覆盖，在表面无法呈递IgG，因此，如果与结合了抗IgG抗体的绵羊红细胞混合，则只有抗原非特异性的B淋巴细胞形成玫瑰花结。因此，通过使用Percoll等的密度梯度来收集玫瑰花结非形成层，可以选别抗原特异性的B淋巴细胞。在通过转化获得了无限增殖能力的人抗体分泌细胞中，为了使抗体分泌能力稳定持续，可以反复与小鼠或人的骨髓瘤细胞融合。骨髓瘤细胞可以使用与上述同样的骨髓瘤细胞。杂交瘤的筛选、育种通常是添加HAT((次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)，在含有5 20% FCS的动物细胞用培养基(例如RPMI1640)或添加了生长因子的无血清培养基中进行。次黄嘌呤、氨基蝶呤、以及胸苷的浓度例如可以分别举出约0. ImM、约0.4μΜ和约 0.016mM等。人-小鼠杂交瘤的选择可以采用乌本苷抗性。人细胞株与小鼠细胞株相比，对乌本苷的敏感性高，因此通过以10_7 IO3M左右添加到培养基中，可以排除未融合的人细胞。在杂交瘤的选择中，优选使用饲养细胞或某种细胞培养上清。作为饲养细胞，可以使用帮助杂交瘤的出现但其自身死亡的存活期间有限的不同系统的细胞种类、以及对可以大量产生对杂交瘤的出现有用的生长因子的细胞照射放射线等来使其增殖能力降低的细胞等。例如，作为小鼠的饲养细胞，可以举出脾细胞、巨噬细胞、血液、胸腺细胞等，作为人的饲养细胞可以举出末梢血单核细胞等。作为细胞培养上清例如可以举出上述各种细胞的初代培养上清或各种株化细胞的培养上清。杂交瘤可以通过将抗原进行荧光标记并与融合细胞反应、然后使用荧光激活性细胞分离器(FACS)将与抗原结合的细胞分离来选择。在这种情况下，可以直接选择生成目标抗原的抗体的杂交瘤，因此可以大大降低克隆的劳动强度。生成目标抗原的单克隆抗体的杂交瘤克隆可以采用各种方法。氨基蝶呤由于会抑制很多细胞功能，因此优选尽早从培养基中去除。在采用小鼠或大鼠的情况下，几乎所有的骨髓瘤细胞都会在10 14天以内死亡，因此可以在融合2周后除去氨基蝶呤。然而，对于人杂交瘤，通常在融合后可以在添加了氨基蝶呤的培养基中维持4 6周左右。次黄嘌呤、胸苷优选在去除氨基蝶呤后1周或更长时间以后除去。即，在采用小鼠细胞的情况下，例如在融合7 10天后进行添加了次黄嘌呤和胸苷(HT)的完全培养基(例如添加10% FCS的RPMI1640)的添加或更换。在融合后8 14天左右，出现可以目视观察到的克隆。如果克隆的直径达到Imm左右，则可以测定培养上清中的抗体量。抗体量的测定例如可以按照以下的方法等进行向直接或与担体一起吸附有目标抗原或其衍生物或其部分肽(包含作为抗原决定基使用的部分氨基酸序列)的固相(例如微量滴定板)中添加杂交瘤培养上清，接着，加入用放射性物质(例如125I、131I、3H、14C)、酶 (例如β -半乳糖苷酶、β -葡糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、苹果酸脱氢酶)、荧光物质 (例如荧光胺、荧光素异硫氰酸酯)、发光物质(例如发光氨、发光氨衍生物、荧光素、光泽精 (Lucigenin))等标记的抗免疫球蛋白(IgG)抗体(使用与原有抗体生成细胞的来源动物为同一种动物来源的IgG的抗体)或蛋白酶Α，检测与固相结合的目标抗原(抗原决定基) 的抗体的方法；或在吸附有抗IgG抗体或蛋白酶A的固相中添加杂交瘤培养上清，加入用与上述同样的标记试剂标记的目标抗原或其衍生物或其部分肽，检测与固相结合的目标抗原 (抗原决定基)的抗体的方法。作为克隆方法，通常采用极限稀释法，也可以采取使用软琼脂的克隆或使用FACS 的克隆(如上所述)。极限稀释法克隆例如可以按以下步骤进行，但并不限于此。如上所述那样测定抗体量并选择阳性滴定孔。选择适当的饲养细胞并添加到 96孔板上。由抗体阳性孔中吸取细胞，在完全培养基(例如添加了
RMPI1640)中悬浮，使细胞密度为30个细胞/mL，在添加了饲养细胞的孔板中加入0. ImL (3 个细胞/孔)，将残余的细胞悬浮液稀释为10个细胞/mL，同样地接种于其它的孔中(1个细胞/孔)，进一步将残余细胞悬浮液稀释为3个细胞/mL并接种于其它的孔中(0. 3个细胞/孔)。培养2 3周左右，直至目视可见的克隆出现为止，测定抗体量/选择阳性孔， 再次克隆。在人细胞的情况下，克隆比较困难，因此可以制作10个细胞/孔的板，通常通过 2次亚克隆就可以获得单克隆抗体生成杂交瘤，为了确认其稳定性，优选进一步在几个月内定期地进行再克隆。杂交瘤可在体外或体内培养。体外的培养法是将上述得到的单克隆抗体生成杂交瘤保持细胞密度为例如IO5 IO6个细胞/mL左右，同时缓慢降低FCS浓度，并从孔板慢慢进行等比例放大的方法。作为体内的培养方法，例如可以举出对于腹腔内注射了矿物油而诱导了浆细胞瘤(MOPC)的小鼠(与杂交瘤的母株具有组织适应性的小鼠)，在5-10天后，向腹腔内注射 IO6 IO7个细胞左右的杂交瘤，在2 5周后在麻醉下采集腹水。(b)单克隆抗体的纯化单克隆抗体的分离纯化可按照其本身公知的方法、例如免疫球蛋白的分离纯化法 (例如盐析法、醇沉淀法、等电位点沉淀法、电泳法、利用离子交换体(例如DEAE、QEAE)的脱吸附法、超离心法、凝胶过滤法、利用抗原结合固相或A蛋白或G蛋白等活性吸附剂只采集抗体将结合解离来获得抗体的特异性纯化法等)进行。如此，将杂交瘤在温血动物的生物体内或生物体外培养，从其体液或培养物中采集抗体，由此可以制造单克隆抗体。在将本发明的抗体用于癌症的预防/治疗的情况下，所述抗体必须具有抗肿瘤活性，因此必须对所得的单克隆抗体的抗肿瘤活性的程度进行调查。抗肿瘤活性可以通过在抗体的存在下和非存在下对癌细胞的增殖、细胞粘附、诱导编程性细胞死亡等进行比较来测定。在优选实施方式中，本发明的抗体用作以人为给予对象的药物。因此，本发明的抗体(优选为单克隆抗体)为降低了在给予人的情况下显示抗原性的危险性的抗体(具体来说，是完全人抗体、人源化抗体、小鼠-人嵌合抗体等)，特别优选完全人抗体。人源化抗体和嵌合抗体可以按照后述的方法，通过基因工程制备。另外，完全人抗体也可以通过上述人-人(或小鼠)杂交瘤来制备；为了稳定且低成本地提供大量抗体，优选使用后述的生成人抗体的动物(例如小鼠)或噬菌体展示法来制备。(i)嵌合抗体的制备在本说明书中，“嵌合抗体”是指H链和L链的可变区域(Vh和的序列来自某种哺乳动物种类，而恒定区域(C1^nq)的序列来自其它哺乳动物种类的抗体。可变区域的序列例如优选来自小鼠等可容易地制作杂交瘤的动物种类，恒定区域的序列优选来自作为给予对象的哺乳动物种类。作为嵌合抗体的制作方法，例如可以举出美国专利第6，331，415号说明书中记载的方法或将其一部分进行变化得到的方法等。具体来说，首先，按照常规方法，从上述得到的单克隆抗体生成杂交瘤(例如小鼠-小鼠杂交瘤)中制备mRNA或总RNA，并合成cDNA。 接着，以所述cDNA为模板，使用适当的引物(例如有义引物采用含有编码Vh和\的各N末端序列的碱基序列的寡DNA，反义引物采用含有与编码Ch和Q的N末端序列的碱基序列杂交的寡DNA (例如参照Bio/Technology, 9 :88-89,1991))，并按照常规方法，利用PCR将编码Vh和&的DNA扩增/纯化。利用同样的方法，通过RT-PCR法从由其它哺乳动物(例如人)的淋巴细胞等制备的RNA中将编码Ch和Q的DNA扩增/纯化。使用常规方法分别将 Vh与CH、Vl与Q连接，将所得的嵌合H链DNA和嵌合L链DNA分别插入到适当的表达载体 (例如含有在CHO细胞、COS细胞、小鼠骨髓瘤细胞等中具有转化活性的启动子(例如CMV 启动子、SV40启动子等)的载体等)中。编码双链的DNA可以插入到不同载体中，也可以串联地插入到同一载体中。用所得的嵌合H链和嵌合L链表达载体转化宿主细胞。作为宿主细胞，除动物细胞、例如上述小鼠骨髓瘤细胞之外，还可以举出中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、 来自猴的C0S-7细胞、Vero细胞、来自大鼠的GHS细胞等。在转化中，可以采用可适合动物细胞的任何方法，优选地可以举出电穿孔法等。在适合宿主细胞的培养基中培养一定期间后回收上清，按照与上述同样的方法纯化，由此可以分离嵌合单克隆抗体。或者，使用牛、山羊、鸡等确立了转基因技术、且使用作为家畜(家禽)已经积累了大量繁殖技术的动物的生殖系列细胞作为宿主细胞，按照常规方法制备转基因动物，据此可以容易且大量地从所得动物的乳汁或卵中获得嵌合单克隆抗体。另外，也可以使用玉米、水稻、小麦、大豆、烟草等确立了转基因技术、且作为主要作物而大量栽培的植物细胞作为宿主细胞，采用对原生质体的微注射或电穿孔、对完整细胞的基因枪法或Ti载体法等来制备转基因植物，并从所得的种子或叶等中大量地获得嵌合单克隆抗体。如果将所得的嵌合单克隆抗体用木瓜蛋白酶分解，则可以得到Fab，而如果用胃蛋白酶分解，则可以得到F(ab，)2。将编码小鼠V1^Pt的DNA经由适当的接头、例如编码含有1 40个氨基酸、优选3 30个氨基酸、更优选5 20个氨基酸的肽(例Ber-(Gly)1Jn或[(Gly)m-Ser]n(m ^ 0 10的整数，η为1 5的整数)等)的DNA连接，可以制成scFv ；进一步地，也可以将编码C03的DNA经由适当的接头连接来制成微抗体(minibody)，或将编码Ch全长的DNA经由适当的接头连接来制成scFv-Fc。编码上述在基因工程学上改良(共轭)了的抗体分子的 DNA通过在适当的启动子的控制下，可以在大肠杆菌或酵母等微生物中表达，从而可以大量生产抗体分子。如果将编码小鼠V1^P \的DNA串联插入1个启动子的下游并导入大肠杆菌，则由于单顺反子的基因表达而形成被称为Fv的二聚体。另外，如果使用分子建模，将Vh和八的FR中的适当的氨基酸置换为Cys，则通过两链的分子间二硫键而形成被称为dsFv的二聚体。(ii)人源化抗体在本说明书中，“人源化抗体”是指存在于可变区域的互补决定区(CDR)以外的所有区域(即，恒定区域和可变区域中的支架区(FR))的序列来自人，而只有CDR的序列来自其它哺乳动物种类的抗体。作为其它哺乳动物种类，例如优选小鼠等可以容易地制作杂交瘤的动物种类。作为人源化抗体的制备方法，例如可举出美国专利第5，225，539号、第5，585，089 号、第5，693，761号和第5，693，762号的方法或将它们部分改变后得到的方法等。具体来说，与上述嵌合抗体的情形同样地，将编码来自人以外的哺乳动物种类(例如小鼠)的 Vh和Vl的DNA分离后，按照常规方法，使用自动DNA测序仪(例如Applied Biosystems 制造等)进行测序，使用公知的抗体序列数据库(例如参照Kabat数据库(Kabat等著， "Sequences of Proteins of Immunological Interest，，，US Department of Health and Human Services, Public Health Service, NIH 编，第 5 版，1991)等)对得到的碱基序列或由其推定的氨基酸序列进行分析，确定两链的CDR和FR。设计将编码具有与所确定的FR 序列类似的FR序列的人抗体的L链和H链的碱基序列(例人κ型L链亚群I和人H链亚群II或III (参照Kabat等著，1991 (如上所述)))的CDR编码区用编码所确定的不同种类CDR的碱基序列置换而得到的碱基序列，将所述碱基序列分成20 40个碱基左右的片段，进一步将与所述碱基序列互补的序列以与上述片段相互重叠的方式分成20 40个碱基左右的片段。使用DNA合成仪合成各个片段，按照常规方法将它们杂交、连接，由此可以构建编码具有来自人的FR和来自其它哺乳动物种类的CDR的Vh和\的DNA。为了更迅速且高效率地将来自其它哺乳动物种类CDR移植到来自人的Vh和\上，优选采用利用PCR法诱发位点专一性突变。上述方法例如可以举出日本特开平5-227970号公报中记载的逐次 CDR移植法等。按照与上述嵌合抗体同样的方法，将如此得到的编码Vh和\的DNA分别与编码来自人的C0和Q的DNA连接并导入到适当的宿主细胞中，由此可以得到生产人源化抗体的细胞或转基因动植物。人源化抗体也与嵌合抗体同样，可以采用基因工程的方法，改变为SCFV、SCFV-FC、 微抗体、dSFv、Fv等，而通过使用适当的启动子，也可以在大肠杆菌或酵母等微生物中生产。人源化抗体制作技术例如也可应用于制备优选地可以给予尚未确立杂交瘤制备技术的其它的动物种类的单克隆抗体。例如可以举出牛、猪、绵羊、山羊、鸡等作为家畜(家禽)广泛繁殖的动物、或者狗或猫等宠物动物等作为对象。
(iii)使用生成人抗体的动物制备完全人抗体向敲除(KO) 了内源性免疫球蛋白(Ig)基因的非人温血动物中导入功能性的人Ig 基因，并利用抗原对其免疫，则可以代替所述来自动物的抗体而生成人抗体。因此，如果像小鼠等那样确立了杂交瘤制作技术的动物，则可以按照与以往的小鼠单克隆抗体制备相同的方法获得完全人单克隆抗体。首先，已经有若干种使用采用通常的转基因(Tg)技术导入了人Ig的H链和L链的小基因的小鼠与使用通常的KO技术使内源性小鼠Ig基因失活了的小鼠进行交配而得到的生成人抗体的小鼠(参照Immunol. Today, 17,391-397(1996))而制备的人单克隆抗体已经处于临床阶段，但到目前为止尚未见到生产抗人Ig人抗体(HAHA) 的报道。后来，Abgenix公司(商品名XenoMouse (参照 Nat. Genet.，15，146-156(1997)； 美国专利第5，939，598号等))或Medarex公司(商品名Hu_Mab Mouse (参照Nat. Biotechnol.，14，845-851 (1996)；美国专利第5，545, 806号等))使用酵母人工染色体(YAC)载体制备了导入了更大的人Ig基因的Tg小鼠，得到了可以生成组成成分 (repertory)丰富的人抗体。但是，在人Ig基因中，例如在H链的情况下，是通过将约80 种V片段、约30种D片段和6种J片段进行各种组合得到的VDZ外显子来编码抗原结合部位而实现其多样性的，因此在其全长方面，H链达到约1.5Mb (14号染色体)，κ L链达到约 2MM2号染色体)，入1^链达到约11&(22号染色体)。为了将与人的同样多样的抗体组成成分在其它动物种类中再现，人们希望导入各个Ig基因的全长，但可以插入到现有的基因导入载体(质粒、粘粒、BAC、YAC等)中的DNA通常为数1Λ 数百1Λ，在现有的将克隆了的 DNA注入到受精卵中的转基因动物制备技术中，难以导入全长。Tomizuka 等人(Nat. Genet.，16，133-143 (1997))将担载有 Ig 基因的人染色体的自然片段(hCF)导入小鼠(染色体导入(TC)小鼠)，制备了具有全长的人Ig基因的小鼠。 即，首先，用纺锤丝形成抑制剂(例如秋水仙酰胺)，将含有用例如试剂抗性标志等标记了含有H链基因的14号染色体和含有κ L链基因的2号染色体的人染色体的人-小鼠杂交瘤细胞处理48小时左右，制备1条 多条染色体或其片段被核膜包覆的微细胞，利用微核融合法向小鼠ES细胞中导入染色体。使用含有试剂的培养基，选择保持有人Ig基因的染色体或其片段的杂交瘤ES细胞，按照与通常制备KO小鼠时同样的方法显微注入到小鼠胚胎中。 以涂布颜色为指标等，从所得的嵌合小鼠中选择生殖系列嵌合物，建立传递人14号染色体片段的TC小鼠系统(TC(hCF14))和传递人2号染色体片段的TC小鼠系统(TC(hCF2))。按照常规方法制备敲除(KO) 了内源性H链基因和KL链基因的小鼠(KO(IgH) ^P KO(IgK)), 将这4个系统的交配反复进行，由此可以建立具有所有四种遗传变异的小鼠系统(双TC/ K0)。如果对上述制备的双TC/K0小鼠采用与制备通常的小鼠单克隆抗体时同样的方法，则可以制备生成抗原特异性的人单克隆抗体的杂交瘤。但是，含有KL链基因的hCF2 在小鼠细胞内不稳定，因此杂交瘤的取得效率比通常的小鼠的情形低。另一方面，上述的Hu-Mab小鼠含有κ L链基因的约50 %，但具有可变区域决定簇成倍增加的结构，因此显示与含有全长时同等的κ链的多样性(而H链基因只含有约 10%，因此H链的多样性低，对抗原的响应性不足)，且是利用YAC载体(IgK-YAC)插入到小鼠染色体中的，因此在小鼠细胞内稳定地保持。禾U用这一优点，使TC(hCF14)小鼠与Hu-Mab小鼠交配，制作可以稳定地保持hCF14和Ig κ -YAC的小鼠(商品名=KM小鼠)，由此可以得到与通常的小鼠同等的杂交瘤取得效率和抗体与抗原的亲和性。另外，为了更完全地再现人的多样的抗体组成成分，可以制备进一步导入了 XL 链基因的生成人抗体的动物。所述动物可以这样获得按照与上述同样的方法制备导入了担载有λ L链基因的人22号染色体或其片段的TC小鼠(TC(hCF22))，并使其与上述双TC/ KO小鼠或KM小鼠交配；或者例如构建含有H链基因座和λ L链基因座的人类人工染色体 (HAC)，并导入到小鼠细胞中(Nat. Biotechnol.，18，1086-1090 (2000))。在本发明的抗体用作药物的情况下，优选为单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。 在本发明的抗体为多克隆抗体的情况下，不需要利用杂交瘤，因此，可以使用虽然未建立杂交瘤制作技术但已建立转基因技术的动物种类、优选牛等偶蹄动物，并按照与上述同样的方法制备生成抗体的动物，这样就可以以低价格制造更大量的人抗体(例如参照Nat. Biotechnol.，20，889-894 (2002))。所得的人多克隆抗体可以通过采集生成人抗体的动物的血液、腹水、乳汁、或卵等、优选为乳汁或卵，并结合与上述同样的纯化技术来纯化。(iv)使用噬菌体展示人抗体文库制备完全人抗体制备完全人抗体的另一个途径是采用噬菌体展示的方法。这种方法存在在CDR以外导入因PCR产生的突变的情况，因此，虽然在临床阶段有少数的生成HAHA的报道，但另一方面它具有以下优点没有来自宿主动物的不同种间的病毒感染的危险性，或者抗体的特异性是无限的(对于禁止克隆或糖链等的抗体也可以容易地制备)。噬菌体展示人抗体文库的制作方法例如可以例举如下，但并不限于此。所使用的噬菌体没有特别限定，优选使用通常纤维状的噬菌体(Ff噬菌体)。作为在噬菌体表面展示外源蛋白质的方法，可以举出以与g3p、g6p g9p的衣壳蛋白质的任意一种融合的融合蛋白质的形式在所述衣壳蛋白质上表达/展示的方法，常用的是在g3p或 g8p的N末端一侧融合的方法。作为噬菌体展示载体，可以举出1)以在噬菌体基因组的衣壳蛋白质基因上融合了外源基因的形式导入，作为将在噬菌体表面上展示的衣壳蛋白质与全部外源蛋白质融合的融合蛋白质来形式展示；此外还有2、将编码融合蛋白质的基因与野生型衣壳蛋白质基因分别插入，同时地表达融合蛋白质和野生型衣壳蛋白质；或幻使具有野生型衣壳蛋白质基因的辅助噬菌体感染大肠杆菌，所述大肠杆菌具有包含编码融合蛋白质的基因的噬菌粒载体，生成使融合蛋白质与野生型衣壳蛋白质同时表达的噬菌体颗粒等，但在1)的情况下，如果融合较大的外源蛋白质则会丧失感染能力，因此，为了制作抗体文库，可以采用2)或3)的类型。具体的载体可例举Holt 等人(Curr· Opin. Biotechnol.，11,45-449(2000))所记载的载体。例如pCESl (参照J. Biol. Chem.，274，18218-18230 (1999))是在1个乳糖启动子的控制下，在g3p的信号肽的下游配置编码κ L链恒定区域的DNA、在g3p信号肽的下游配置编码CH3的DNA、以及经由His-tag、c-myc tag、琥珀终止密码子(TAG)来配置g3p编码序列而成的Fab表达型噬菌粒载体。如果导入到具有琥珀突变的大肠杆菌中，则在g3p衣壳蛋白质上展示Fab，但如果用不具有琥珀突变的HB2151株等表达，则会生成可溶性Fab抗体。作为scFv表达型噬菌粒载体，例如可以使用pHENl (J. Mol. Biol.，222，581-597 (1991))寸。另一方面，作为辅助噬菌体，例如可以举出M13_K07、VCSM13等。
另外，作为其它的噬菌体展示载体，还可举出被设计为在抗体基因的3’末端和衣壳蛋白质基因的5’末端分别连接含有编码半胱氨酸的密码子的序列，将两个基因同时地分别(而不是以融合蛋白的形式)表达，并经由所导入的半胱氨酸残基之间的S-S键而在噬菌体表面的衣壳蛋白质上展示抗体(Morphosys公司的CysDisplay TM技术)的载体。作为人抗体文库的种类，可以举出初始/非免疫(non-immunized)文库、合成文库、以及免疫文库等。初始/非免疫文库是利用RT-PCR法取得正常人所保有的VH和VL基因，将它们随机地克隆在上述噬菌体展示载体上而得到的文库。通常，来自正常人的末梢血、骨髓、扁桃腺等淋巴细胞的mRNA等作为模板使用。为了消除病史等的V基因的偏好性，只扩增来自未因抗原致敏而发生类别转换的IgM的mRNA，将其特别地称为初始文库。代表的初始文库可以举出 CAT 公司的文库(参照 J. Mol. Biol.，222，581-597 (1991) ；Nat. Biotechnol.， 14，309-314 (1996) )、MRC 公司的文库(参照 Annu. Rev. Immunol.，12，433-455 (1994))、 Dyax 公司的文库(参照 J. Biol. Chem.，1999 (如上所述)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 14， 7969-7974(2000))等。合成文库是选择人B细胞内的功能性特定抗体基因，将V基因片段的例如CDR3等的抗原结合区域的部分用适当长度的编码随机的氨基酸序列的DNA置换来制成文库。最初是利用生产功能性的scFv或Fab的VH和VL基因的组合来构建文库，因此抗体的表达效率或稳定性优良。作为代表的合成文库，可以举出M0rph0SyS公司的HuCAL文库(参照 J. Mol. Biol.，296，57-86 (2000))、BioInvent 公司的文库(参照 Nat. Biotechnol.， 18,852(2000))、Crucell 公司的文库(参照 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 3938 (1995)； J. Immunol. Methods, 272, 219-233 (2003))等。免疫(immunized)文库是与上述非免疫文库的情形同样地，由从癌症、自身免疫疾病、感染症等患者或接受了疫苗接种的人等血液中对目标抗原的抗体滴度升高了的人中采集的淋巴细胞、或者通过上述体外免疫法人工免疫了目标抗原的人淋巴细胞等中制备 mRNA，利用RT-PCR法扩增V1^Pt基因，并制成文库。由于目标抗体基因在最初就包含在文库中，因此从较小型的文库中也可以获得目标抗体。文库的多样性越大越好，但在现实中，考虑到以下淘选操作可能涉及的噬菌体数 (1011 1013个噬菌体)和通常的淘选操作中的克隆的分离和扩增所必须的噬菌体数 (100 1，000个噬菌体/克隆)，IO8-IO11个克隆程度是适当的，在约IO8个克隆的文库中， 通常可以筛选具有10_9量级的Kd值的抗体。将针对目标抗原的抗体通过噬菌体展示法进行筛选的步骤称作淘选。具体来说， 例如，将固定有抗原的载体与噬菌体文库接触，洗涤除去非结合噬菌体，然后从抗体中洗脱结合的噬菌体，感染大肠杆菌并使所述噬菌体增殖，将上述一系列的操作反复进行3 5次左右，由此可以使展示抗原特异性抗体的噬菌体浓缩。作为固定有抗原的担体，可以举出 通常的抗原抗体反应或亲和层析中使用的各种担体，例如琼脂糖、葡聚糖、纤维素等不溶性多糖类，聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、硅等的合成树脂，或者含有玻璃、金属等的微量板、管、膜、 柱、珠等，还可以进一步举出表面等离子体共振(SPR)的传感芯片等。抗原固定也可以使用物理性吸附，通常还可以使用使蛋白质或酶等不溶解、固定时使用的化学结合的方法。例如，优选使用生物素_(链霉)抗生物素蛋白系统等。在作为目标抗原的内源性配体为肽等小分子的情况下，必须特别注意作为抗原决定基使用的部分不会由于与担体的结合而被覆盖。为了非结合噬菌体的洗涤，可以依次使用BSA溶液等的封闭液(1 2次)、含有吐温等表面活性剂的PBS(3 5次)等。也有报道称可以优选使用柠檬酸缓冲液(pH5)等。为了特异性噬菌体的洗脱，通常使用酸(例如0. IM盐酸等)，也可以通过特异性蛋白酶的切断(例如可以向抗体基因与衣壳蛋白质基因的连接部位导入编码胰蛋白酶切位点的基因序列。在此情况下，在洗脱的噬菌体表面上展示野生型衣壳蛋白质，因此，即使全部衣壳蛋白质均以融合蛋白质的形式表达，也可以对大肠杆菌感染/增殖)或可溶性抗原导致的竞争性洗脱、或者S-S键的还原(例如，在上述的CysDisplay TM中，在淘选后，通过使用适当的还原剂使抗体与衣壳蛋白质解离，可以回收抗原特异性的噬菌体)进行洗脱。在用酸洗脱的情况下，可以用Tris等中和，然后使洗脱的噬菌体感染大肠杆菌，并培养后利用常规的方法回收噬菌体。如果通过淘选来浓缩展示抗原特异性抗体的噬菌体，则在使它们感染大肠杆菌以后接种于板上来进行克隆。再次回收噬菌体，利用上述抗体滴度测定方法(例如ELISA、 RIA, FIA等)或利用FACS或SPR的测定，可以确认抗原结合活性。在从展示所选择的抗原特异性抗体的噬菌体克隆中分离/纯化抗体时，例如，在使用向抗体基因和衣壳蛋白质基因的连接部位导入了琥珀终止密码子的载体作为噬菌体展示载体的情况下，如果使所述噬菌体感染不具有琥珀突变的大肠杆菌(例如HB2151株)， 则生成可溶性抗体分子并分泌于周质或培养基中，因此，可以将细胞壁用溶菌酶等溶解并回收胞外组分，采用与上述同样的纯化技术进行。如果导入His-tag或c-myc tag，则可以使用IMAC或抗c-myc抗体柱等，容易地进行纯化。另外，在淘选时利用特异性蛋白酶切断的情况下，如果使所述蛋白酶发生作用，则抗体分子从噬菌体表面分离，因此，可以通过实施同样的纯化操作来纯化目标抗体。使用生成人抗体的动物和噬菌体展示人抗体文库而进行的完全人抗体制备技术也可以应用于制备其它动物种类的单克隆抗体。例如牛、猪、绵羊、山羊、鸡等作为家畜(家禽)较多繁殖的动物或狗或猫等宠物动物等可以作为对象。在非人类的动物中，目标抗原人工免疫的伦理问题少，因此免疫文库的利用更为有效。(3)多克隆抗体的制备本发明的多克隆抗体可以按照其本身公知的方法或基于它的方法制备。例如，制造免疫抗原(蛋白质或肽抗原)本身、或者其与载体蛋白的复合物，与上述单克隆抗体的制造方法同样地对温血动物进行免疫，由所述免疫动物中采集本发明蛋白质的抗体含有物， 并通过进行抗体的分离纯化来制备。关于用于免疫温血动物的免疫抗原与载体蛋白质的复合物，载体蛋白质的种类以及载体蛋白质与半抗原的混合比只要可以高效地获得与载体蛋白交联并免疫的抗体即可， 可以以任何比例使任何物质交联，例如可以采用以下的方法按照重量比，对于1份半抗原，将牛血清白蛋白或牛甲状腺球蛋白、血蓝蛋白等以约0. 1 约20、优选约1 约5的比例进行偶联。另外，半抗原与载体蛋白质的偶联可以使用各种缩合剂，可使用戊二醛或碳二酰亚胺、马来酰亚胺活性酯、硫醇基、含有二硫吡啶基的活性酯试剂等。将缩合产物本身或者与担体、稀释剂一起给予温血动物中可生成抗体的部位。在给予时，为了提高抗体生成能力，可以给予完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂。给予通常是每约1 约6周给予1次，共给予约2 约10次左右。多克隆抗体可以从用上述方法免疫了的温血动物的血液、腹水等中、优选从血液中采集。抗血清中的多克隆抗体滴度的测定可以与上述抗血清中抗体滴度的测定同样地进行。多克隆抗体的分离纯化可以按照与上述单克隆抗体的分离纯化同样的免疫球蛋白的分离纯化方法进行。含有与目标多核苷酸的目标区域互补的碱基序列的多核苷酸、S卩、可以与目标多核苷酸杂交的多核苷酸可以称为关于所述目标多核苷酸为“反义”。作为具有与编码本发明蛋白质的多核苷酸(例如DNA(以下，在反义多核苷酸的说明中，将编码本发明蛋白质的DNA称为“本发明的DNA”))的碱基序列互补或实质上互补的碱基序列或其一部分的反义多核苷酸，只要是含有与编码本发明蛋白质的多核苷酸(例如 DNA)的碱基序列互补或实质上互补的碱基序列或其一部分并具有可抑制所述多核苷酸的表达的作用的即可，可以使任何反义多核苷酸。与本发明的DNA实质上互补的碱基序列例如是关于与本发明的DNA互补的碱基序列(即，本发明的DNA的互补链)中的碱基序列相重叠的区域具有约70%或更高、优选约 80%或更高、更优选约90%或更高、最优选约95%或更高的同源性(homology)的碱基序列。这里，“同源性与上述的本发明的DNA的情形相同。特别地，在本发明的DNA的互补链的全部碱基酸序列中，(a)在面向于抑制翻译的反义多核苷酸的情况下，适合采用与编码本发明蛋白质的N末端部位的部分碱基序列(例如起始密码子附近的碱基序列等)的互补链具有约70%或更高、优选约80%或更高、更优选约90%或更高、最优选约95%或更高的同源性的反义多核苷酸；(b)在面向于利用foiaseH的RNA分解的反义多核苷酸的情况下，适合采用与含有内含子的本发明的DNA的全部碱基序列的互补链具有约70%或更高、优选约 80%或更高、更优选约90%或更高、最优选约95%或更高的同源性的反义多核苷酸。具体来说，可以举出含有与序列号1、序列号3、或序列号5表示的碱基序列互补或实质上互补的碱基序列或其一部分的反义多核苷酸，优选含有例如与序列号1、序列号3、 或序列号5表示的碱基序列互补的碱基序列或其一部分的反义多核苷酸等。具有与本发明的DNA的碱基序列互补或实质上互补的碱基序列或其一部分的反义多核苷酸(以下称为“本发明的反义多核苷酸”)可以基于克隆的或确定的编码本发明蛋白质的DNA的碱基序列信息来设计/合成。所述的反义多核苷酸可以抑制编码本发明蛋白质的基因(以下也简称为“本发明的基因”)的复制或表达。即，本发明的反义多核苷酸可以与由本发明的基因转录的RNA(mRNA或初期转录产物)杂交，可以抑制mRNA的合成(加工)或功能(翻译为蛋白质)，或经由与本发明的基因相关的RNA的相互作用来调节/控制本发明的基因的表达。与本发明的基因相关的RNA的选择的序列互补的多核苷酸、以及可以与本发明的基因相关的RNA特异性杂交的多核苷酸可以用于在生物体内和生物体外调节/控制本发明的基因的表达，还可以用于疾病等的治疗或诊断。本发明的反义多核苷酸的目标区域只要是可以通过反义多核苷酸的杂交、结果可以对翻译成本发明的蛋白质进行抑制的即可，其长度没有特别限定，可以是编码所述蛋白质的mRNA全部序列，也可以是部分序列，短的可以举出约10个碱基左右，长的可以举出mRNA或初期转录产物的全部序列。考虑到合成的容易程度或抗原性的问题，优选含有约 10 约40个碱基、特别是约15 约30个碱基的寡核苷酸，但并不限于此。具体来说，本发明的基因的5’端发夹环、5’末端6-碱基对重复、5’末端非翻译区、翻译起始密码子、蛋白质编码区、ORF翻译终止密码子、3’末端非翻译区、3’末端回文区或3’末端发夹环等均可以作为反义多核苷酸的优选目标区域来选择，但本发明的基因内的任何区域均可作为对象来选择。例如，可以将所述基因的内含子部分作为目标区域。另外，本发明的反义多核苷酸不仅可以与本发明的蛋白质的mRNA或初期转录产物杂交、对翻译成蛋白质进行抑制，还可以与双链DNA形式的本发明的基因结合而形成三链体，抑制RNA的转录。或者，形成DNA: RNA杂合体，诱导foiaseH的分解。为了防止因核酸酶等水解酶造成的分解，构成反义多核苷酸的各核苷酸的磷酸残基(磷酸酯)例如可以被硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯等的化学改性磷酸残基置换。另外，各个核苷酸的糖(脱氧核糖)可以被2’-0_甲基化等的化学改性糖结构置换，碱基部分(嘧啶、嘌呤)也可以进行化学改性，只要是能够与具有序列号1、序列号3、或序列号5表示的碱基序列的DNA杂交即可，可以是任何反义多核苷酸。反义多核苷酸可以举出含有2-脱氧-D-核糖的多核苷酸、含有D-核糖的多核苷酸、作为嘌呤或嘧啶碱基的N-葡糖苷噁的其它类型的多核苷酸、具有非核苷酸骨架的其它聚合物(例如市售的蛋白质核酸以及合成序列特异性的核酸聚合物)或含有特殊键的其它聚合物(所述聚合物含有可以在DNA或RNA中见到的、具有允许碱基配对或碱基附着的配置的核苷酸)等。它们可以是双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA、DNAiRNA杂合体， 还可以是非改性多核苷酸(或非改性寡核苷酸)；附加了公知的改性的，例如具有本领域已知的标记的、带帽的、甲基化的、将1个或更多个天然核苷酸用类似物置换了的；进行了分子内核苷酸改性的，例如具有非离子键(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、亚磷酰胺、氨基甲酸酯等)的；具有带电荷的键或含硫键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的；例如蛋白质(例如核酸酶、核酸酶抑制剂、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)或糖(例如单糖等) 等具有支链基的；具有嵌入化合物(例如吖啶、补骨脂素等)的；含有螯合化合物(例如金属、具放射活性的金属、硼、氧化性的金属等)的；含有烷基化剂的；具有改性了的键的(例如α成苷异构物型的核酸等)。这里，“核苷”、“核苷酸”和“核酸”不仅含有嘌呤和嘧啶碱基，也可以含有改性了的其它杂环型碱基。上述的改性物可以含有甲基化了的嘌呤和嘧啶、 酰基化了的嘌呤和嘧啶、或其它杂环。在改性了的核苷以及改性了的核苷酸中，糖部分也可以被改性，例如1个或更多个羟基可以被卤素或脂族基团等置换，或变换为醚、胺等官能基团。本发明的反义多核苷酸为RNA、DNA或改性了的核酸(RNA、DNA)。作为改性了的核酸的具体例，可以举出核酸的硫衍生物、硫代磷酸酯衍生物、对于聚核苷酰胺或寡核苷酰胺的分解为抵抗性的核酸等。本发明的反义多核苷酸例如可如下设计。即，使细胞内的反义多核苷酸更稳定，使反义多核苷酸的细胞渗透性提高，使其对作为目标的有义链的亲和性更大，并且，在有毒性的情况下使反义多核苷酸的毒性更小。上述改性已有很多报道，例如 Pharm Tech Japan, 8, 247 页或 395 页(1992)、Antisense Research and Applications, CRC Press (1993)等。本发明的反义多核苷酸可以加入变异、或可以以像脂质体、微球体等那样的特殊形态供给，其中可以含有改性的糖、碱基、键；或可以通过基因治疗来应用、以附加的形态提供。作为在上述的附加形态中采用的材料，可以举出发挥中和磷酸基骨架的电荷的作用的聚赖氨酸那样的聚阳离子体；可以提高与细胞膜的相互作用、或使核酸的摄取增大的脂质 (例如磷脂、胆留醇等)等的疏水性物质。作为在附加时优选的脂质，可以举出胆留醇或其衍生物(例如氯甲酸胆留醇酯、胆酸等)。这些物质可以附着于核酸的3’末端或5’末端， 可以经由碱基、糖、分子内核苷键付着。作为其它的基团，可以举出利用在核酸的3’末端或 5’末端特异性地配置的帽用基团来抑制因外切核酸酶、RNase等核酸酶导致的分解的物质。 作为上述帽用基团，可以举出以聚乙二醇、四甘醇等二醇为代表的、本领域已知的羟基的保护基团，但并不限于此。可以将编码本发明蛋白质的mRNA或初期转录产物在编码区内部(在初期转录产物的情况下，包含内含子部分)可以特异性地切断的核酶也包含在本发明的反义多核苷酸中。“核酶”是指具有切断核酸的酶活性的RNA，最近已经证实，具有这种酶活性部位的碱基序列的寡DNA也同样具有核酸切断活性，因此，在本说明书中，只要具有序列特异性的核酸切断活性即可，DNA也可以包含在“核酶”的概念中。作为核酶最常用的有可以在类病毒或拟病毒等感染性RNA中出现的自剪接RNA，已知为锤头型或发夹型等。锤头型是以约40个碱基左右发挥酶活性，通过使与锤头结构的部分相邻的两端的数个碱基的每个(合计约10 个碱基左右)与mRNA的期望切断部位为互补的序列，可以只特异性地切断目标mRNA。这种类型的核酶只是以RNA作为底物，因此还具有不攻击基因组DNA的优点。在本发明的蛋白质的mRNA本身为双链结构的情况下，通过使用将可以与RNA解旋酶特异性地结合的、来自病毒核酸的RNA基序进行连接的复合核酶，可以使目标序列为单链(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98 (10)，5572-5577 (2001))。另外，在以含有编码所述核酶的DNA的表达载体的形式使用核酶的情况下，为了促进转录产物向细胞质移动，可以进一步连接使tRNA发生了变异的序列，制成复合核酶(Nucleic Acids Res. , 29 (13), 2780-2788 (2001)) 在本说明书中，含有与本发明的蛋白质的mRNA或初期转录产物的编码区内部分序列(在初期转录产物的情况下，包含内含子部分)互补的寡RNA及其互补链的双链RNA、 即所谓的siRNA也被定义为包含在本发明的反义多核苷酸中。如果将短的双链RNA导入细胞内则与所述RNA互补的mRNA被分解的、所谓的RNA干扰(RNAi)的现象以往在线虫、昆虫、植物等中已知，从明确了这种现象在动物细胞中也广泛发生以来(Nature，411(6836)， 494-498(2001))，其作为核酶的替代技术得到了广泛应用。SiRNA可以基于作为目标mRNA 的碱基序列信息，使用市售的软件(例如RNAi Designer ；Invitrogen)来适当地设计。本发明的反义寡核苷酸和核酶可以根据本发明的基因的cDNA序列或基因组DNA 序列来确定mRNA或初期转录产物的目标序列，并使用市售的DNA/RNA自动合成仪(应用生物系统公司、贝克曼公司等制造)，通过合成与其互补的序列来制备。可以利用DNA/RNA自动合成仪分别合成有义链和反义链，在适当的退火缓冲液中、在约90 约95°C下进行约1 分钟左右的变性，然后在约30 约70°C下退火约1 约8小时来制备SiRNA。另外，将互补的寡核苷酸链以交替重叠的方式合成，并将它们退火，然后用连接酶连接，从而可以制备更长的双链多核苷酸。或者，可以以这样的方式设计siRNA 作为经由适当长度(例如约3 约10个碱基)的接头将有义链和反义链连接起来的RNA(shRNA)来合成，并利用要导入的动物细胞内的dicer酶等进行加工。另外，还可以制备为编码有义链和反义链的DNA处于不同的TO或Hl等Pol III系启动子分别控制下的表达载体、或编码经由接头将上述有义链和反义链连接而成的RNA链的DNA处于Pol III系启动子控制下的表达载体，并在动物细胞内表达，从而形成siRNA。本发明的反义多核苷酸的抑制活性可以使用导入了本发明的基因的转化体、生物体内或生物体外的本发明的基因表达系统、或者生物体内或生体外的本发明的蛋白质翻译系统进行研究。以下，对本发明的蛋白质或其部分肽(以下可以简称为“本发明的蛋白质”)、编码本发明的蛋白质或其部分肽的DNA(以下可以简称为“本发明的DNA”)、上述本发明的抗体、 上述本发明的反义多核苷酸的用途进行说明。本发明的蛋白质在癌组织中的表达增加，因此可以用作疾病标志。即，可以用作癌组织的早期诊断、症状的重症度的判定、疾病进展的预测的标志。另外，关于本发明的蛋白质伍￥11、几6六6、几684)，通过抑制其表达和/或活性，可以抑制癌细胞的细胞粘附。因此，含有本发明的反义多核苷酸、本发明的抗体、或抑制上述蛋白质的表达和/或活性的物质(例如低分子化合物)的药物可以用作癌细胞的细胞粘附抑制剂，因而可以用作癌症(例如大肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、胰腺癌、脑肿瘤、造血系统肿瘤(例如急性骨髓性白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病等)等)的预防/治疗药物(优选作为造血系统肿瘤的预防/治疗药物，更优选作为急性骨髓性白血病(AML)的预防/治疗药物)。另外，作为其它的实施方式，在将上述药物与所述药物以外的抗癌药物结合使用时，也可作为用于使癌细胞对上述抗癌药物的敏感性提高的药剂(药物敏感性提高剂)使用。在本说明书中，“癌细胞”是以包含未来朝癌化方向发展的细胞的概念来使用。如后述实施例中所记载的那样，本发明人在人造血干细胞和人白血病细胞中对 ITGA6基因/蛋白质以及ITGB4基因/蛋白质的表达进行比较后，证实了这些基因/蛋白质在造血干细胞中不表达，而只在白血病细胞中高度表达。因此，本发明中，特别地以 ITGA6(蛋白质=序列号4，基因=序列号3)和ITGB4(蛋白质=序列号6，基因=序列号5) 为目标，这从也可以得到降低副作用的效果出发来考虑是更为优选的。这在以下的关于本发明的抗体或本发明的反义多核苷酸的方式中也同样。本发明的抗体(中和抗体)可以中和本发明的蛋白质的活性。因此，本发明的抗体(中和抗体)可以用作癌细胞的细胞粘附抑制剂、癌症(例如大肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、胰腺癌、脑肿瘤、造血系统肿瘤等)的预防/治疗药物(优选用作造血系统肿瘤(例如急性骨髓性白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病等)等)的预防/治疗药物(优选用作造血系统肿瘤的预防/治疗药物，更优选用作急性骨髓性白血病(AML)的预防/治疗药)。另外，作为其它实施方式，本发明的抗体(中和抗体)在与所述抗体以外的抗癌药物结合使用时，也可作为用于使癌细胞对上述抗癌药的敏感性提高的药剂(药物敏感性提高剂)使用。在本发明中，“中和”被定义为包括抗体依赖性细胞毒活性(ADCC活性)、补体依赖性细胞毒活性(CDC活性)、癌细胞增殖信号的抑制(狭义的中和活性)、编程性细胞死亡的诱导等(并不限于这些)的概念。
含有本发明的抗体的上述疾病预防/治疗药物、细胞粘附抑制剂、试剂敏感性提高剂是低毒性的，可以直接制成液体制剂、或制成适当剂型的药物组合物，对人或哺乳动物 (例如大鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴等)口服或非口服(例如血管内给予、皮下给予、肌肉内给予等)给予。本发明的抗体可以是给予其本身，或制成适当的药物组合物来给予。给予中使用的药物组合物可以含有本发明的抗体及其盐和药理学可接受的担体、稀释剂或赋型剂。上述药物组合物可以以适合口服或非口服给予的剂型提供。作为用于非口服给予的组合物，例如可以使用注射剂、栓剂等，注射剂可以包含静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、输液注射剂等剂型。上述注射剂可以按照公知的方法制备。作为注射剂的制备方法，例如可以通过将上述本发明的抗体或其盐溶解、 悬浮或乳化于通常用于注射剂的无菌的水性液或油性液中来制备。注射用的水性液例如可以使用生理盐水、葡萄糖或含有其它辅助药物的等渗液等，可以与适当的溶解助剂、例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂(例如聚山梨醇80、 HC0-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物))等合并使用。作为油性液，例如可以使用芝麻油、大豆油等，可以合并使用苯甲酸苄基酯、苄基醇等作为溶解助剂。所制备的注射液优选填充于适当的安瓿瓶中。用于直肠给予的栓剂可以通过将上述抗体或其盐与通常的栓剂基质混合来制备。作为用于口服给予的组合物，可以举出固体或液体的剂型，具体来说，可以举出片剂(包含糖衣片、薄膜衣片)、丸剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂(包含软胶囊剂)、糖浆剂、乳剂、 混悬剂等。上述组合物可以按照公知的方法制造，可以含有制剂领域中通常使用的担体、稀释剂或赋型剂。片剂用的担体、赋型剂例如可以使用乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁。上述的非口服用或口服用药物组合物优选制备成适合活性成分的给予量的单位给药剂型。作为上述单位给药剂型，例如可以举出片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿瓶)、 栓剂。作为抗体的含量，优选每单位给药剂型通常含有5 500mg、尤其是在注射剂中含有 5 lOOmg、在其它剂型中含有10 250mg的上述抗体。含有本发明的抗体的上述制剂的给予量根据给予对象、对象疾病、症状、给予途径等而不同，例如，在用于成人乳腺癌的治疗/预防的情况下合适的是，1次量通常是0.01 20mg/kg体重左右、优选0. 1 10mg/kg体重左右、进一步优选0. 1 5mg/kg体重左右，以 1天1 5次左右、优选1天1 3次左右通过静脉注射给予本发明的抗体；在其它非口服给予和口服给予的情况下，也可以参考上述的量给予。在症状特别严重的情况下，可以根据其症状增量。本发明的抗体可以以其本身或适当的药物组合物的形式给予。上述给予中使用的药物组合物含有上述抗体或其盐和药理学可接受的担体、稀释剂或赋型剂。所述组合物以适合口服或非口服给予(例如血管内注射、皮下注射等)的剂型提供。另外，只要与上述抗体的配合不会发生不优选的相互作用，上述各组合物就可以含有其它的活性成分。另外，本发明的抗体可以进一步与其它试剂、例如烷基化剂(例如环磷酰胺、异环磷酰胺等)、代谢拮抗剂(例如甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶等)、抗癌性抗生素(例如丝裂霉素、 阿霉素等)、来自植物的抗癌药(例如长春新碱、长春地辛、泰素等)、顺钼、卡钼、依托泊甙、伊立替康等合并使用。本发明的抗体和上述试剂可以是同时或在不同的时间给予患者。在上述方式中，本发明的抗体可以发挥用于使癌细胞对上述药物的敏感性提高的药剂(药物敏感性提高剂)的功能。不过，本发明的技术范围并不只限定为发挥上述功能。(2)含有反义多核苷酸的药物本发明的反义多核苷酸可与本发明的基因的转录产物互补性结合、抑制所述基因的表达，并且是低毒性的，可以抑制生物体内的本发明的蛋白质或本发明的基因的功能或作用，抑制癌细胞的细胞粘附。因此，本发明的反义多核苷酸可以作为癌细胞的细胞粘附抑制剂、癌症(例如大肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、胰腺癌、脑肿瘤、造血系统肿瘤(例如急性骨髓性白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病等)等)的预防/治疗药物(优选用作造血系统肿瘤的预防/治疗药物，更优选用作急性骨髓性白血病(AML)的预防/治疗药物)使用。在其它实施方式中，本发明的反义多核苷酸在与所述反义多核苷酸以外的抗癌药合并使用时，可以作为使癌细胞对上述抗癌药的敏感性提高的药剂(药物敏感性提高剂)使用。使用本发明的反义多核苷酸作为上述预防/治疗药、细胞粘附抑制剂、药物敏感性提高剂等的情况下，可以按照其本身公知的方法制成制剂并给予。另外，例如，可以将上述反义多核苷酸单独地或在插入到反转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体等的适当的载体中后，按照常规方法对人或哺乳动物(例如大鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴等)进行口服或非口服给予。所述反义多核苷酸可以直接地、 或者为了促进摄取而与助剂等生理学可接受的担体一起制成制剂，通过基因枪或水凝胶导管等导管给予。或者，也可以制成气溶胶，以吸入剂的形式局部给予气管内。另外，为了改善体内药代动力、延长半衰期、改善细胞内的摄入效率，可以将上述反义多核苷酸单独地或与脂质体等担体一起制成制剂(注射剂)，给予静脉、皮下等。所述反义多核苷酸的给予量根据对象疾病、给予对象、给予途径等而有差异，例如，在为了治疗乳腺癌而给予本发明的反义多核苷酸的情况下，对于一般的成人(体重 60kg)，每天给予约0. 1 约IOOmg的所述反义多核苷酸。含有编码本发明蛋白质的碱基序列或其一部分的多核苷酸(也称为“本发明的有义多核苷酸”)以及本发明的反义多核苷酸可以作为用于调查组织或细胞中的本发明的基因表达状況的诊断用核苷酸探针(或引物)使用。(3)针对疾病的药物候选化合物的筛选本发明的蛋白质在癌组织中表达亢进，并且，如果抑制EVI1、ITGA6、或ITGB4蛋白质的表达和/或活性，则可以抑制癌细胞的细胞粘附。因此，抑制EVI1、ITGA6、或ITGB4蛋白质的表达和/或活性的化合物或其盐可以作为癌细胞的细胞粘附抑制剂、癌症(例如大肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、 卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、胰腺癌、脑肿瘤、造血系统肿瘤(例如急性骨髓性白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病等)等)的预防/治疗药物(优选作为造血系统肿瘤的预防/治疗药物、更优选作为急性骨髓性白血病(AML)的预防/治疗药物)使用。因此，本发明的蛋白质(EVI1、ITGA6和ITGB4)可以作为用于筛选抑制所述蛋白质的表达和/或活性的化合物或其盐的试剂使用。S卩，根据本发明的另一个实施方式，提供一种使用本发明的蛋白质、筛选抑制所述蛋白质的表达和/或活性的化合物或其盐的方法。在筛选抑制本发明的蛋白质的活性的化合物或其盐的情况下，所述筛选方法大致分为(a-Ι)在被检物质的存在下和非存在下，对所分离出的本发明的蛋白质活性进行比较的方法；和(a-2)在被检物质的存在下和非存在下，培养具有生成本发明的蛋白质的能力的细胞，对两种条件下本发明的蛋白质的活性进行比较的方法。在上述(a-Ι)的筛选方法中使用的本发明的蛋白质可以采用上述本发明的蛋白质或其部分肽的制造方法，来进行分离、纯化。在上述(a-2)的筛选方法中使用的具有生成本发明的蛋白质的能力的细胞只要是生来就表达所述能力的人或其它温血动物细胞或含有所述细胞的生物体试样(例如血液、组织、器官等)即可，没有特别限定，例如可以举出人乳腺癌细胞株MCF7、T47D等。在来自非人动物的血液、组织、器官等的情况下，可以从活体中将它们分离并培养，或者对活体给予被验物质，经过一定时间后将它们从活体试样中分离。作为具有生成本发明的蛋白质的能力的细胞，可以例举出上述通过基因工程方法制作的各种转化体。作为宿主，例如优选使用C0S7细胞、CHO细胞、HEK293细胞等的动物细胞。作为被验物质，例如可以举出蛋白质、肽、非肽性化合物、合成化合物、发酵产物、 细胞提取液、植物提取液、动物组织提取液等，这些物质可以是新型物质，也可以是公知的。在上述(a-Ι)的筛选方法中，本发明的蛋白质的活性测定例如可以如下进行将 (i)本发明的蛋白质或(ii)本发明的蛋白质和被验物质与通过本发明的蛋白质激活细胞粘附的温血动物细胞接触，测定所述细胞的细胞粘附的程度。另外，在上述(a-幻的筛选方法中，本发明的蛋白质的活性测定可以通过测定所述具有生成本发明的蛋白质的能力的细胞的细胞粘附来进行。在以细胞粘附的程度为指标的情况下，可以将细胞悬浮于适当的培养基或缓冲液中，添加(或者不添加)被验物质，进一步加入氧化应激物(例如添加H2O2)等的刺激，通常在约20 40°C、优选约30 37°C下孵育约6 72小时，然后测定编程性细胞死亡的诱导率。细胞粘附例如可以通过检测被验物质存在下/非存在下的细胞数来进行调查。具体来说，例如可以测定PBS洗涤后的残留细胞数，对细胞粘附程度进行比较。例如，在上述(a-Ι)的筛选方法中，在被验物质存在下本发明的蛋白质活性与被验物质非存在下的活性相比抑制了约20%或更高、优选30%或更高、更优选约50%或更高的情况下，可以选择所述被验物质作为本发明的蛋白质活性抑制物质。如上所述，抑制本发明的蛋白质(EVI1、ITGA6和ITGB4蛋白质)的表达的物质对于抑制癌细胞的细胞粘附、因而对于癌症的预防/治疗是有效的。S卩，根据本发明的又一个实施方式，提供一种筛选癌细胞的细胞粘附抑制物质、癌症的预防/治疗物质的方法，所述方法是在被验物质的存在下和非存在下，对具有生成本发明的蛋白质的能力的细胞中的所述蛋白质的表达进行比较。本发明的蛋白质的表达量可以使用可在严谨条件下与编码本发明蛋白质的多核苷酸杂交的多核苷酸(即，含有编码上述本发明的蛋白质的碱基序列或其一部分的多核苷酸(本发明的有义多核苷酸)、或本发明的反义多核苷酸)，通过检测其mRNA，以转录水平来测定。或者，所述表达量可以使用上述本发明的抗体，通过检测本发明的蛋白质，以翻译水平来测定。因此，更具体来说，本发明提供(b)癌细胞的细胞粘附抑制物质、癌症的预防/治疗物质的筛选方法，所述方法是在被验物质存在下和非存在下，培养具有生成本发明蛋白质的能力的细胞，使用本发明的有义或反义多核苷酸，对两种条件下的编码本发明蛋白质的mRNA的量进行测定/比较。(c)癌细胞的细胞粘附抑制物质、癌症的预防/治疗物质的筛选方法，所述方法是在被验物质存在下和非存在下，培养具有生成本发明蛋白质的能力的细胞，使用本发明的抗体，对两种条件下的编码本发明蛋白质的mRNA的量进行测定/比较。在上述(b)和(C)的筛选方法中，具有生成本发明蛋白质的能力的细胞优选使用与在上述(a_2)的筛选方法中使用的相同的细胞。例如，关于本发明的蛋白质的mRNA量或蛋白质量的测定，具体地可以如下进行。(i)对正常或疾病模型非人温血动物(例如小鼠、大鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、狗、 猴、鸡等)给予药物(例如TNF- α、IL-1、!^s、抗癌药剂)或物理化学应激(例如UV、活性氧、缺血等)等，经过一定时间后，获得血液、或特定的器官(例如脑、肝脏、肾脏等)、或由器官分离出的组织或细胞。对于所得细胞中所含的本发明的蛋白质的mRNA，例如可以按照常规方法，由细胞等中提取mRNA，采用例如RT-PCR法等方法定量，或者通过其本身公知的RNA印迹分析进行定量。本发明的蛋白质量可以采用蛋白质印迹分析或以下详述的各种免疫测定法进行定量。(ii)按照上述方法，制作导入了编码本发明蛋白质的多核苷酸的转化体，并与上述(i)同样地对所述转化体中所含的本发明的蛋白质或编码所述蛋白质的mRNA进行定量、 分析。使本发明的蛋白质的表达量发生变化的物质的筛选可以通过以下进行(i)在对正常或疾病模型非人温血动物给予药物或物理化学应激等的一定时间之前(30分钟前 M小时前，优选30分钟前 12小时前，更优选1小时前 6小时前)或一定时间之后(30分钟后 3天后，优选1小时后 2天后，更优选1小时后 M小时后)、 或在给予药物或物理化学应激的同时给予被验物质并从给予后经过一定时间之后(30分钟后 3天后，优选1小时后 2天后，更优选1小时后 M小时后)，对从所述动物中分离出的细胞中所含的、编码本发明蛋白质的mRNA量、或本发明的蛋白质量进行定量、分析; 或(ii)在按照常规方法培养转化体时，在培养基中添加被验物质，在培养一定时间后(1天后 7天后，优选1天后 3天后，更优选2天后 3天后)，对所述转化体中所含的本发明的蛋白质的mRNA量或本发明的蛋白质量进行定量、分析。作为被验物质，可以举出肽、蛋白质、非肽性化合物、合成化合物、发酵产物等，它们可以是新型物质，也可以是公知的物质。在上述(c)的筛选方法中，关于本发明的蛋白质量的测定，具体地例如可以举出以下的方法等(i)使本发明的抗体与试样液和标记的本发明的蛋白质进行竞争性反应，通过检测与所述抗体结合的、标记了的本发明的蛋白质，对试样液中的本发明的蛋白质进行定量； 或(ii)将试样液和不溶解于担体上的本发明的抗体以及标记了的另一个本发明的抗体同时或连续地反应，然后，通过测定不溶于载体上的标记试剂的量(活性)，对试样液中的本发明的蛋白质进行定量。在上述(ii)的定量法中，优选2种抗体来识别本发明的蛋白质的不同部分。例如， 如果一种抗体是识别本发明的蛋白质的N末端部位的抗体，则可以使用与本发明的蛋白质的C末端部位反应的抗体作为另一种抗体。作为在使用标记物的测定方法中所使用的标记试剂，例如可以使用放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质等。作为放射性同位素，例如可以使用[125I]、[131I]、[3H]、[14C] 等。作为上述的酶，优选稳定、比活性大的酶，例如可以使用半乳糖苷酶、葡糖苷酶、 碱性磷酸酶、过氧化物酶、苹果酸脱氢酶等。作为荧光物质，例如可以使用荧光胺、荧光素异硫氰酸酯等。作为发光物质例如可使用发光氨、发光氨衍生物、荧光素、光泽精(Lucigenin) 等。另外，为了抗体或抗原与标记试剂的结合，可以使用生物素_(链霉)抗生物素类。作为试样液，在本发明的蛋白质局部存在于细胞内的情况下，可以使用在将细胞悬浮于适当的缓冲液后，通过超声波处理或冷冻融解等破坏细胞而得到的细胞破碎液；而在本发明的蛋白质分泌到细胞外的情况下，可以使用细胞培养上清。根据需要，可以从破碎液或培养上清中分离/纯化本发明的蛋白质，然后进行定量。在可以检测出标记试剂的范围内，还可以使用完整细胞作为试样。使用本发明的抗体的本发明的蛋白质定量方法没有特别限定，只要是通过化学或物理手段检测试样液中与抗原量对应的抗体、抗原或抗体-抗原复合物的量，通过使用含有已知量抗原的标准液制成的标准曲线来计算上述量的测定法即可，可以采用任何测定方法。例如优选使用比浊法、竞争法、免疫法和夹层法。在灵敏度、特异性方面，优选使用例如后述的夹层法。在抗原或抗体不溶时，可以采用物理吸附，还可以采用通常使蛋白质或酶等不溶/ 固定时所使用的化学键。作为担体，可以举出琼脂糖、葡聚糖、纤维素等的不溶性多糖类、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、硅等的合成树脂、或玻璃等。在夹层法中，使试样液与不溶的本发明的抗体反应(1次反应)，进一步使标记了的另外的本发明的抗体反应O次反应)，然后，通过测定不溶的担体上标记试剂的量或活性，可以对试样液中的本发明的蛋白质进行定量。1次反应和2次反应可以以相反的顺序进行，还可以同时进行，也可以将时间错开进行。标记试剂和不溶的方法可以参照上述的这些方法。在夹层法的免疫测定法中，固相化抗体或标记化抗体中使用的抗体不必是1种，为了提高测定灵敏度等，可以使用2种或更多种抗体的混合物。本发明的抗体也可以在夹层法以外的测定系统、例如竞争法、免疫法或比浊法等中使用。
在竞争法中，使试样液中的本发明的蛋白质和标记了的本发明的蛋白质与抗体竞争性反应，然后将未反应的标记抗原(F)、和与抗体结合了的标记抗原(B)分离(B/F分离)，通过测定B、F的任意一种的标记量，可以对试样液中本发明的蛋白质进行定量。在本反应方法中，可以采用以下的方法液相法，使用可溶性抗体作为抗体，使用聚乙二醇或上述抗体(1次抗体)的2次抗体等进行B/F分离；以及固相化法，使用固相化抗体作为1次抗体(直接法)，或者1次抗体使用可溶性的，2次抗体使用固相化抗体(间接法)。在免疫法中，使试样液中的本发明的蛋白质与固相的本发明的蛋白质与一定量的标记化抗体进行竞争反应，然后将固相和液相分离，或使试样液中的本发明的蛋白质与过量的标记化抗体反应，接着，加入固相的本发明的蛋白质，使未反应的标记化抗体与固相结合，然后将固相和液相分离。接着，测定任意相的标记量，对试样液中的抗原量进行定量。另外，在比浊法中，测定凝胶内或溶液中的抗原抗体反应产生的不溶性沉淀物的量。在试样液中本发明的蛋白质的量很少并只得到少量的沉淀物的情况下，也可优选采用利用激光散射的激光比浊法等。在将每一种免疫学的测定方法用于本发明的定量方法时，不需要特别的条件、操作等的设定。在每一种方法中，只要在常规条件、操作方法的基础上加入本领域的常规技术考虑，即可以构建本发明的蛋白质测定系统。这些常规技术手段的详细内容可参照概述、现
有著作等。例如可参照入江宽编著的《放射免疫测定》(，夕才4 A 7 7 7七(讲谈社， 1974年发行)、入江宽编著的《放射免疫测定续编》(続，7才^ A 7 7 ^七^ )(讲谈社， 1979年发行)、石川荣治等人编著《酶免疫测定法》(酵素免疫测定法)(医学书院，1975年发行)、石川荣治等人编著《酶免疫测定法》(酵素免疫测定法)(第2版)(医学书院，1982 年发行)、石川荣治等人编著《酶免疫测定法》(酵素免疫测定法)(第3版)(医学书院， 1987 年发行)、“Methods in ENZYM0L0GY"Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A))、 同上书 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、同上书 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C))、同上书 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D-Selected Immunoassays))> 同上书 Vol. 92(Immunochemical Techniques (Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同上书 Vol. 121(Immunochemical Techniques (Part I Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上由学术出版社(Academic Press)发行)等。如上所述，通过使用本发明的抗体，可以灵敏度良好地对细胞中本发明的蛋白质
的生产量进行定量。例如，在上述(b)和(C)的筛选方法中，在被验物质存在下本发明的蛋白质(EVI1、 ITGA6和ITGB4)的表达量(mRNA量或蛋白质量)与被验物质非存在下的情形相比抑制约 20%或更高、优选约30%或更高、更优选约50%或更高的情况下，可以选择所述被验物质作为本发明的蛋白质表达抑制物质。本发明的筛选用试剂盒含有本发明的蛋白质或其部分肽(以下可简称为“本发明的蛋白质”)。本发明的蛋白质可以是采用上述的任何方法方法进行分离/纯化所得，也可以如上所述，以生产本发明的蛋白质的细胞(温血动物细胞)的形式提供。为了测定生产本发明的蛋白质的细胞中所述蛋白质的表达量，本发明的筛选用试剂盒可以进一步含有上述本发明的抗体、或本发明的有义或反义多核苷酸。所述筛选用试剂盒除上述之外，可以任意含有反应缓冲液、封闭液、洗涤用缓冲液、标记试剂、标记检测试剂等。使用本发明的筛选方法或筛选用试剂盒得到的、本发明的蛋白质表达和/或活性抑制物质(可以是游离体，也可以是盐的形式)作为癌细胞的细胞粘附抑制剂、癌症(例如大肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、胰腺癌、脑肿瘤、造血系统肿瘤(例如急性骨髓性白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病等)等) 的预防/治疗药物(优选作为造血系统肿瘤的预防/治疗药物，更优选作为急性骨髓性白血病(AML)的预防/治疗药物)，作为低毒性且安全的药物的有用的。在将采用本发明的筛选方法或筛选用试剂盒得到的化合物或其盐用作上述预防/ 治疗药物的情况下，可以按照常规方法制成制剂。例如，作为用于口服给予的组合物，可以举出固体或液体的剂型，具体来说，可以举出片剂(包含糖衣片、薄膜衣片)、丸剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂(包含软胶囊剂)、糖浆剂、 乳剂、混悬剂等。所述组合物可按照本身公知的方法制造，可以含有制剂领域中通常使用的担体、稀释剂或赋型剂。例如，作为片剂用的担体、赋型剂，可以使用乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂
酸镁等。作为用于非口服给予的组合物，例如可以使用注射剂、栓剂等，注射剂包含静脉注射齐IJ、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、输液注射剂、关节内注射剂等的剂型。所述的注射剂可以按照本身公知的方法，例如通过将上述化合物或其盐溶解、悬浮或乳化于通常用于注射剂的无菌的水性液或油性液中来制备。作为注射用的水性液，例如可以使用生理盐水、葡萄糖或含有其它辅助药物的等渗液等，可以与适当的溶解助剂、例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂(例如聚山梨醇80、HC0_50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物))等合并使用。作为油性液，例如可以使用芝麻油、 大豆油等，可以合并使用苯甲酸苄基酯、苄基醇等作为溶解助剂。所制备的注射液通常填充于适当的安瓿瓶中。用于直肠给予的栓剂可以通过将上述化合物或其盐与通常的栓剂基质混合来制备。上述的口服用或非口服用药物组合物优选制备成适合活性成分的给予量的单位给药剂型。上述单位给药剂型例如可举出片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿瓶)、栓剂等。 优选每单位给药剂型通常含有5 500mg、尤其是注射剂中含有5 lOOmg、其它剂型中含有10 250mg的上述抗体。只要与上述化合物的配合不会发生不优选的相互作用，上述各组合物可以含有其它的活性成分。另外，如上所述得到的制剂安全且毒性低，因此可以对例如人或温血动物(例如小鼠、大鼠、兔、绵羊、猪、牛、马、鸡、猫、狗、猴、黑猩猩等)口服或非口服给予。所述化合物或其盐的给予量根据其作用、对象疾病、给予对象、给予途径等而有差异，例如，为了治疗乳腺癌而口服给予本发明的蛋白质表达和/或活性抑制物质时，通常对于成人(体重60kg)，每天可以给予约0. 1 约lOOmg、优选约1. O 约50mg、更优选约 1. O 约20mg的所述化合物或其盐。在非口服给予的情况下，所述抑制物质的1次给予量根据给予对象、对象疾病等而不同，例如在以治疗乳腺癌为目的将本发明的蛋白质表达和/或活性抑制物质以注射剂的形式给予通常成人(体重60kg)的情况下，优选每天将约 0. 01 约30mg、优选约0. 1 约20mg、更优选约0. 1 约IOmg的所述化合物或其盐通过注射给予癌变部位。在其它动物的情况下，也可以按照体重60kg的量进行换算来给予。(4)癌症的诊断试剂本发明的抗体可以特异性地识别本发明的蛋白质。因此，所述抗体可以用于被验液中的本发明蛋白质的定量等。因此，在使用上述本发明的抗体筛选本发明的蛋白质表达抑制物质的方法，通过使用由被验温血动物采集的生物体试样(例如血液、血浆、尿、活检等)来代替具有生成本发明蛋白质的能力的细胞，实施免疫测定，则可以调查所述动物体内的本发明蛋白质的表达程度，继而可以用于癌症的诊断。作为免疫测定的结果，当检测出所述试样中本发明的蛋白质增加时，可以诊断为发生了癌症(例如大肠癌、乳腺癌、肺癌、 前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、胰腺癌、脑肿瘤、造血系统肿瘤(特别是AML)等)，或将来发病的可能性高。同样地，通过将上述本发明的有义或反义多核苷酸用作探针或引物，可以检测人或其它温血动物(例如大鼠、小鼠、仓鼠、兔、绵羊、山羊、猪、牛、马、猫、狗、猴、黑猩猩、鸡等)的编码本发明蛋白质的DNA或mRNA的异常(基因异常)。因此，所述多核苷酸可以作为例如所述DNA的扩增或mRNA的表达过多等的基因诊断试剂、特别是癌症的诊断试剂。编码本发明蛋白质的多核苷酸或对应的反义多核苷酸只要具有作为探针或引物所必须的长度(例如约15个碱基或更多)即可，没有特别限定。使用本发明的有义或反义多核苷酸进行的上述基因诊断例如可以通过其本身公知的Northern杂交法、定量RT-PCR法、PCR-SSCP法、等位基因特异性PCR法、PCR-SSOP法、 DGGE法、Rnase保护法、PCR-RFLP法等实施。例如，对于从被验的温血动物的细胞提取的RNA组分，通过Northern杂交法或定量RT-PCR法进行诊断，在检测出本发明蛋白质的表达增加的情况下，可以诊断为发生了癌症(例如大肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、胰腺癌、脑肿瘤、造血系统肿瘤(特别是AML)等)，或将来发病的可能性高。(5)含有本发明蛋白质的药物本发明的蛋白质在癌细胞中过量表达，因此为了激活癌症患者的免疫系统，可以使用本发明的蛋白质作为癌症疫苗。例如，可以优选采用所谓的过继免疫疗法等，S卩，在本发明蛋白质的存在下，培养强力的抗原呈递细胞(例如树状细胞)，使其吞噬所述蛋白质后，然后再次返回患者体内。 返回体内的树状细胞通过诱导、激活癌症抗原特异性的细胞毒性T细胞，可以杀灭癌细胞。本发明的蛋白质例如可以作为用于癌症(例如大肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、 食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、胰腺癌、脑肿瘤、造血系统肿瘤(特别是AML)等)的预防或治疗的疫苗制剂，安全地给予哺乳动物(例如人、猴、小鼠、大鼠、兔、猪)。所述疫苗制剂通常含有本发明的蛋白质和生理学可接受的担体。作为担体，例如可以举出水、盐水(包含生理盐水)、缓冲液(例如磷酸缓冲液)、醇(例如乙醇)等液体的担体。疫苗制剂可以按照常规的疫苗制剂的制造方法制备。通常，本发明的蛋白质溶解或悬浮于生理学可接受的担体中。另外，还可以分别制备本发明的蛋白质和生理学可接受的担体，在使用时将它们混合使用。在疫苗制剂中，除了本发明的蛋白质和生理学可接受的担体之外，还可以配合佐剂(例如氢氧化铝凝胶、血清白蛋白等)、防腐剂(例如硫柳汞等)、止痛剂(例如葡萄糖、 苄基醇等)等。另外，为了促进本发明的蛋白质的抗体的生成，例如可以进一步配合细胞因子(例如白细胞介素-2等的白细胞介素类、干扰素-Y等的干扰素类等)。在作为疫苗制剂使用时，本发明的蛋白质可以作为活性体使用；为了提高抗原性， 可以使所述蛋白质改性。本发明的蛋白质的改性通常通过加热处理、蛋白质改性剂(例如甲醛、盐酸胍、尿素)的处理来进行。所得的疫苗制剂的毒性低，通常作为注射剂，例如可以给予皮下、皮内、肌内，还可以局部给予癌细胞块或其附近。本发明蛋白质的给予量根据例如对象疾病、给予对象、给予途径等而不同，例如将本发明的蛋白质以注射剂的形式皮下给予罹患癌症的成人(体重60kg)时，每次通常为 0. 1 300mg左右，优选100 300mg左右。疫苗制剂的给予次数可以是1次，担为了提高抗体生产量，可以以约2周 约6个月的间隔，给予所述疫苗制剂2 4次。(6) DNA转移动物本发明提供具有外源性的编码本发明蛋白质的DNA(以下也称为“本发明的外源性DNA”)或其变异DNA(也称为“本发明的外源性变异DNA”)的非人哺乳动物。S卩，根据本发明的又一实施方式，可以提供(1)具有本发明的外源性DNA或其变异DNA的非人哺乳动物；(2)如第(1)项所记载的动物，其中，非人哺乳动物是啮齿动物；(3)如第⑵项所记载的动物，其中，啮齿动物是小鼠或大鼠；以及(4)重组载体，其含有本发明的外源性DNA或其变异DNA并可以在哺乳动物中表达。具有本发明的外源性DNA或其变异DNA的非人哺乳动物(以下可称为“本发明的 DNA转移动物”)可如下制备对于未受精卵、受精卵、精子及其含有原始细胞的胚母细胞等，优选在非人哺乳动物发育中的胚胎发生阶段(更优选在单细胞或受精卵细胞的阶段、 且通常为8细胞期以前)，采用磷酸钙法、电脉冲法、脂转染法、凝聚法、微注射法、基因枪法、DEAE-葡聚糖法等将作为目标的DNA转移。通过所述DNA转移方法，可以将作为目标的本发明的外源性DNA体细胞、活体的器官、组织细胞等转移，可以用于细胞培养、组织培养等，进而，通过其本身公知的细胞融合法，可以将细胞与上述胚母细胞融合，制备本发明的 DNA转移动物。作为非人哺乳动物，例如可以使用牛、猪、绵羊、山羊、兔、狗、猫、豚鼠、仓鼠、小鼠、 大鼠等。其中，从病态动物模型体系的制作方面考虑，优选个体发生和生物周期比较短、繁殖容易的啮齿动物，尤其是小鼠(例如作为纯系有C57BL/6系统、DBA2系统等，作为杂交系有B6C3F1系统、BDFl系统、B6D2F1系统、BALB/c系统、ICR系统等)或大鼠(例如Wistar、 SD等)等。
作为可以在哺乳动物中表达的重组载体的“哺乳动物”，可以举出上述的非人哺乳动物之外的人等。本发明的外源性DNA是指并不是非人哺乳动物原本具有的本发明的DNA，而是从哺乳动物中分离/提取的本发明的DNA。本发明的变异DNA是指在原本的本发明的DNA的碱基序列中发生了变异(例如突变等)的DNA，具体来说，可以使用发生了碱基的附加、缺失、与其它碱基置换等的DNA等，还包含异常DNA。所述异常DNA是指表达异常的本发明蛋白质的DNA，例如，可以使抑制正常的本发明蛋白质功能的蛋白质表达的DNA。本发明的外源性DNA可以来自与对象动物同种或异种的任何的哺乳动物。在将本发明的DNA转移至对象动物时，制成与可以使所述DNA在动物细胞中表达的启动子下游结合的DNA构建物，这通常是有利的。例如，在转移本发明的人DNA的情况下，可以将在可表达来自与其同源性高、具有本发明的DNA的各种哺乳动物(例如兔、狗、猫、豚鼠、仓鼠、大鼠、 小鼠等)的DNA的各种启动子下游结合有本发明的人DNA的DNA结构(例如载体等)微注射到对象哺乳动物的受精卵、例如小鼠受精卵中，来制备高度表达本发明的DNA的DNA转移哺乳动物。作为本发明蛋白质的表达载体，可以使用来自大肠杆菌的质粒、来自枯草杆菌的质粒、来自酵母的质粒、λ噬菌体等的噬菌体、莫洛尼式白血病病毒等的反转录病毒、痘苗病毒或杆状病毒等动物病毒等。其中，优选使用来自大肠杆菌的质粒、来自枯草杆菌的质粒或来自酵母的质粒等。作为上述进行DNA表达调节的启动子，例如可以使用(i)来自病毒(例如猿猴病毒、巨细胞病毒、莫洛尼式白血病病毒、JC病毒、乳腺癌病毒、脊髓灰质炎病毒等)的DNA的启动子；(ii)来自各种哺乳动物(人、兔、狗、猫、豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠等)的启动子，例如白蛋白、胰岛素II、尿溶蛋白II、弹性蛋白酶、红细胞生成素、内皮缩血管肽、肌肉肌酸激酶、胶质纤维性酸性蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、来自血小板的生长因子β、角蛋白Kl、KlO 和Κ14、胶原I型和II型、依赖环AMP的蛋白激酶β I亚基、肌营养不良蛋白、抗酒石酸碱性磷酸酶、心房利尿钠因子、内皮细胞受体酪氨酸激酶(通常简称为“Tie2”)、钠钾腺苷3 磷酸酶(Na，K-ATPase)、神经丝轻链、金属硫蛋白I和IIA、金属蛋白酶1组织抑制剂、MHC I类抗原(H-2L)、H-ras、肾素、多巴胺羟化酶、甲状腺过氧化物酶(ΤΡ0)、肽链延长因子 la (EF-1 α ), β肌动蛋白、α和β肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链1和2、髓鞘质基础蛋白、 甲状腺球蛋白、Thy-Ι、免疫球蛋白、H链可变部位(VNP)、血清淀粉样蛋白P成分、肌红蛋白、 肌钙蛋白C、平滑肌α疫苗、前脑啡肽原Α、前血管升压素等的启动子等。其中，优选可以在全身高度地表达的巨细胞病毒启动子、人肽链延长因子la (EF-Ia)的启动子、人和鸡β 肌动蛋白启动子等。在DNA转移哺乳动物中，优选上述载体具有使目标mRNA转录终止的序列(通常称为“终止子”)，例如可以使用来自病毒和来自各种哺乳动物的各个DNA序列，优选使用猿猴病毒的SV40终止子等。除此之外，为了进一步高度地表达作为目标的外源性DNA，可以根据目的，将各个 DNA的剪接信号、增强子区、真核DNA的内含子的一部分等与启动子区的5’上游、启动子区与翻译区之间或者翻译区的3’下游连接。正常的本发明蛋白质的翻译区可以作为来自人或各种哺乳动物(例如兔、狗、猫、 豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠等)的肝脏、肾脏、甲状腺细胞、成纤维细胞的DNA以及市售的各种基因组DNA文库的基因组DNA的全部或一部分来获得，或者利用公知的方法，以来自肝脏、肾脏、甲状腺细胞、成纤维细胞的RNA制备的互补DNA为原料来获得。对于外源性的异常DNA， 可以制成利用点突变诱发法而使由上述细胞或组织得到的正常蛋白质的翻译区变异了的翻译区。所述翻译区可以通过常规基因工程的方法制成，S卩，以可以在转移动物中表达的 DNA构建物的形式，与上述启动子的下游以及根据期望与转录终止位点的上游连接。受精卵细胞阶段的本发明的外源性DNA的转移可以以存在于对象哺乳动物的所有胚母细胞和体细胞中的方式来保证。在DNA转移后的培育动物的胚母细胞中存在本发明的外源性DNA是指培育动物的后代全部在其所有胚母细胞和体细胞中保有本发明的外源性DNA。继承了本发明的外源性DNA的所述种类的动物的后代也会在其所有胚母细胞和体细胞中具有本发明的外源性DNA。通过确认转移了本发明的外源性正常DNA的非人哺乳动物可以通过交配来稳定地保持外源性DNA，保有所述DNA的动物可以在通常的培育环境下继代培育。受精卵细胞阶段的本发明外源性DNA的转移可以以过量存在于对象哺乳动物的所有胚母细胞和体细胞中的方式来保证。在DNA转移后的培育动物的胚母细胞中过量存在本发明的外源性DNA是指培育动物的后代全部在其所有胚母细胞和体细胞中过量地具有本发明的外源性DNA。继承了本发明的外源性DNA的所述种类的动物的后代也会在其所有胚母细胞和体细胞中过量地具有本发明的外源性DNA。获得在同源染色体的两方具有导入DNA的纯合体动物，通过使这样的雌雄动物交配，可以以使所有的后代都过量地具有所述DNA的方式来繁殖继代。在具有本发明的正常DNA的非人哺乳动物中，本发明的正常DNA高度地表达，通过促进内源性正常DNA的功能，最终使得本发明蛋白质机能亢进症发病，可以作为这种病态的模型动物利用。例如，使用本发明的正常DNA转移动物，可以了解本发明蛋白质机能亢进症或本发明蛋白质相关的疾病的病态机理，以及进行这些疾病的治疗方法的研究。转移有本发明的外源性正常DNA的哺乳动物具有游离的本发明的蛋白质的增加症状，因此可以用于对本发明蛋白质相关的疾病的预防/治疗药物、例如癌症(例如大肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、胰腺癌、脑肿瘤、造血系统肿瘤(特别是AML)等)的预防/治疗药物的筛选试验。另一方面，对于具有本发明的外源性异常DNA的非人哺乳动物，通过确认可以通过交配来稳定地保有外源性DNA，可以在通常的饲养环境下继代饲养来作为保有这种DNA 的动物。另外，还可以将作为目标的外源DNA掺入上述的质粒中，作为原料使用。与启动子形成的DNA构建物可以按照常规基因工程方法制备。在受精卵细胞阶段，本发明的异常DNA 的转移可以以存在于对象哺乳动物的所有胚母细胞和体细胞中的方式保证。在DNA转移后培育动物的胚母细胞存在本发明的异常DNA是指培育动物的后代全部在其所有的胚母细胞和体细胞中具有本发明的异常DNA。继承了本发明的外源性DNA的这种动物的后代在其所有胚母细胞和体细胞中具有本发明的异常DNA。获得在同源染色体的两方具有导入DNA 的纯合体动物并使这样的雌雄动物交配，可以以全部的后代都具有这种DNA的方式来繁殖继代。具有本发明的异常DNA的非人哺乳动物高度地表达本发明的异常DNA，通过抑制内源性的正常DNA的功能，最终形成本发明的蛋白质的功能钝化型不敏感症，可以作为这种病态模型动物利用。例如，使用本发明异常DNA转移动物，可以了解本发明的蛋白质的功能钝化性不敏感症的病态机理的以及进行这种疾病治疗方法的研究。另外，作为具体的利用可能性，本发明的异常DNA高度表达动物可以作为了解本发明的蛋白质的功能钝化型不敏感症中，本发明的异常蛋白质对正常蛋白质的功能抑制 (显性负作用)的模型。转移有本发明的外源异常DNA的哺乳动物可以用作对本发明的蛋白质的功能钝化型不敏感症的预防/治疗药，例如癌症(例如大肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、 胃癌、肝癌、胆道癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、胰腺癌、脑肿瘤、造血系统肿瘤(特别是AML)等)的预防/治疗药物的筛选试验。另外，上述2种本发明的DNA转移动物及其它利用可能性例如可以考虑；(i)作为组织培养中的细胞源使用；(ii)通过直接对本发明的DNA转移动物组织中的DNA或RNA进行分析、或对DNA 所表达的肽组织进行分析而进行的、对与本发明的蛋白质特异性地表达或激活的肽的相关性的分析；(iii)利用标准的组织培养技术来培养具有DNA的组织的细胞并使用它们来进行的来自通常难以培养的组织的细胞的功能的研究；(iv)通过使用上述(iii)的细胞进行的诸如提高细胞的功能这样的药物的筛选； 以及(ν)进行本发明的突变蛋白质的分离纯化及其抗体制备等。另外，使用本发明的DNA转移动物，可以进一步研究包含本发明的蛋白质功能钝化型不敏感症等在内的、与本发明的蛋白质相关的疾病的临床症状，还可以得到与本发明的蛋白质相关的疾病模型的各器官的更详细的病理学认识，可以对新的治疗方法的开发、 进一步对这种疾病导致的继发性疾病的研究和治疗做出贡献。另外，在从本发明的DNA转移动物取出各器官并细细切碎后，可以利用胰蛋白酶等的蛋白质分解酶，来获得游离的DNA转移细胞、对其进行培养，或进行其培养细胞的系统化。另外，可以对生成本发明蛋白质的细胞的确定、与细胞粘附等的相关性、或它们的信号传递机制、它们的异常等进行研究，作为用于了解本发明的蛋白质及其作用的有效的研究材料。另外，为了使用本发明的DNA转移动物，进行包含本发明的蛋白质功能钝化型不敏感症在内的、与本发明的蛋白质相关的疾病的治疗药的开发，使用上述检查方法和定量法等，可以提供这种疾病治疗药物的有效、迅速的筛选方法。使用本发明的DNA转移动物或本发明的外源性DNA表达载体，可以研究、开发与本发明的蛋白质相关的疾病的DNA治疗方法。(7)敲除动物
本发明提供本发明的DNA发生了钝化的非人哺乳动物胚胎干细胞和本发明的DNA 表达不完全的非人哺乳动物。即，根据本发明，提供(1)非人哺乳动物胚胎干细胞，其中，本发明的DNA发生了钝化；(2)如第⑴项记载的胚胎干细胞，其中，所述DNA通过导入报道基因(例如来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因)而被钝化；(3)如第(1)项记载的胚胎干细胞，其中，所述胚胎干细胞具有新霉素抗性；(4)如第(1)项记载的胚胎干细胞，其中，非人哺乳动物为啮齿动物；(5)如第(4)项记载的胚胎干细胞，其中，啮齿动物为小鼠；(6) DNA表达不完全的非人哺乳动物，其中，所述本发明的DNA被钝化；(7)如第(6)项记载的非人哺乳动物，其中，所述DNA通过导入报道基因(例如来自大肠杆菌的半乳糖苷酶基因)而被钝化，所述报道基因可以在本发明的DNA的启动子的控制下表达；(8)如第(6)记载的非人哺乳动物，其中，非人哺乳动物为啮齿动物；(9)如第⑶项记载的非人哺乳动物，其中，啮齿动物为小鼠；以及(10)对如第(7)项记载的动物给予试验化合物并检测报道基因的表达的、促进本发明的DNA的启动子的活性的化合物或其盐的筛选方法。本发明的DNA发生了钝化的非人哺乳动物胚胎干细胞是指，通过对所述非人哺乳动物所具有的本发明的DNA时实施人工变异来抑制DNA的表达能力、或者通过使所述DNA 所编码的本发明的蛋白质的活性实质性地丧失使DNA实质上不具有表达本发明的蛋白质的能力(以下也称为“本发明的敲除DNA”)的非人哺乳动物的胚胎干细胞(以下也称为 “ES细胞”)。作为非人哺乳动物，可以使用上述同样的材料。作为对本发明的DNA实施人工变异的方法，例如可以通过基因工程的手段，删除所述DNA序列的一部分或全部，插入或置换为其它DNA来进行。利用这些变异，例如通过使密码子的阅读框偏移、破坏启动子或外显子的功能，可以制备本发明的敲除DNA。作为本发明的DNA发生了钝化的非人哺乳动物胚胎干细胞(以下也称为“本发明的DNA钝化ES细胞”或“本发明的敲除ES细胞”)的具体例子，例如可以如下获得将以分离作为目标的、非人哺乳动物所具有的本发明的DNA、在其外显子部分插入以新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因为代表的药物抗性基因、或以IacZ ( β -半乳糖苷酶基因)、cat (氯霉素乙酰转移酶基因)为代表的报道基因等来破坏外显子的功能、或者在外显子之间的内含子部分插入使基因转录终止的DNA序列(例如polyA附加信号等)以无法合成完全的mRNA、 从而将基因破坏的方式构建的DNA序列的DNA链(以下也称为“目标载体”)例如通过同源重组法导入所述动物的染色体中，对于所得ES细胞，通过以本发明的DNA上或其邻近的DNA 序列为探针进行DNA杂交分析、或以目标载体上的DNA序列和在目标载体的制备中使用的本发明的DNA以外邻近区域的DNA序列为引物，进行PCR法分析，通过选别本发明的敲除ES 细胞来获得。另外，通过同源重组法等使本发明的DNA钝化的原来的ES细胞可以使用例如上述的已经建立的ES细胞，还可以是按照公知的Evans和Kaufma的方法新建立的。例如，在目前通常使用的小鼠ES细胞的情况下，由于免疫学背景尚不清楚，因此，为了取得可替代所述细胞的纯系、免疫学遗传背景明确的ES细胞等，例如利用C57BL/6小鼠或通过DBA/2杂交而改善了 C57BL/6的采卵数少的问题的BDFl小鼠(C57BL/6与DBA/2的Fl)而建立的细胞系等也可以良好地使用。BDFl小鼠的采卵数多，且卵健康，并且具有C57BL/6小鼠的背景，因此，在使用这种BDFl小鼠得到的ES细胞制作病态模型小鼠时，通过与C57BL/6小鼠回交，可以使其遗传背景取代为C57BL/6小鼠，在这方面有利于应用。另外，在建立ES细胞的情况下，通常使用受精后第3. 5天的胚泡，除此之外，采集 8细胞期胚胎并培养至胚泡来使用可以高效率地获得大量的初期胚胎。另外，雌雄ES细胞均可以使用，但通常雄ES细胞适合制备种系嵌合体。另外，为了减少繁杂的培养劳动，优选尽早进行雌雄判别。作为ES细胞雌雄的判定方法，作为一个例子例如可以举出利用PCR法扩增并检测 Y染色体上的性别決定区的基因的检测方法。现有的核型分析需要约106个细胞，而如果采用上述的方法，用1个集落左右的ES细胞数(约50个)即可完成，因此，可以通过雌雄判别进行培养初期的ES细胞的初次选择，可以尽早地选定雄细胞，由此可以大幅削减培养初期的工作量。另外，第二次选择例如可以通过利用G显带法的染色体数的确认等来执行。优选所得ES细胞的染色体数为正常数的100%，但在建立时由于物理操作等的关系困难的情况下，优选在敲除了 ES细胞的基因后在正常细胞(例如在小鼠的情况下染色体数为2n = 40 的细胞)上再次克隆。通常，上述得到的胚胎干细胞株的增殖性很好，但容易丧失个体发生的能力，因此需要小心地进行继代培养。例如，可以通过以下的方法培养在诸如STO成纤维细胞这样的适当的饲养细胞上、在LIF(1 10000U/ml)存在下、在二氧化碳气培养器内(优选5% 二氧化碳气、95%空气或5%氧、5%二氧化碳气、90%空气)、在约37°C下培养等方法进行培养；在继代时，例如，可以采取通过胰蛋白酶/EDTA溶液(通常0. 001 0.5%胰蛋白酶 /0. l-5mM EDTA、优选约0. 胰蛋白酶/ImM EDTA)处理来进行单细胞化，在新准备的饲养细胞上接种的方法等。上述继代通常每1 3天进行，此时进行细胞观察，在观察到形态异常的细胞的情况下最好放弃所述培养细胞。ES细胞可以在适当的条件下单层培养至高密度，或者悬浮培养至形成细胞团块， 由此可以分化成颞顶肌、内脏肌、心肌等各种类型的细胞(M. J. Evans和M. H. Kaufman, Nature.，第四2 卷，54 页，1981 年；G. R. Martin.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.第 78 卷， 7634 页，1981 年；Τ. C. Doetschman 等诸，夕 Y — f A ·才 7. ·工 > 7.· 'J 才口夕一 · 7 > F ·工夕7">」>>夕义.毛义7才口夕一，第87卷，27页，1985年)，使本发明的ES细胞分化得到的本发明的DNA表达不完全的细胞在体外本发明蛋白质的细胞生物学研究中有用。本发明的DNA表达不完全的非人哺乳动物通过按照公知的方法测定所述动物的 mRNA量，间接地对其表达量进行比较，可以与正常动物进行区别。作为所述非人哺乳动物，可以使用与上述同样的材料。本发明的DNA表达不完全的非人哺乳动物例如通过将如上所述制备的目标载体导入小鼠胚胎干细胞或小鼠卵细胞中，通过导入，目标载体的本发明的DNA被钝化了的DNA 序列通过基因同源重组而与小鼠胚胎干细胞或小鼠卵细胞染色体上的本发明的DNA交换而发生同源重组，由此可以敲除本发明的DNA。敲除了本发明的DNA的细胞可以通过DNA杂交分析和PCR法分析来进行判定，其中，DNA杂交分析是以本发明的DNA上或其附近的DNA序列作为探针，PCR法分析是以目标载体上的DNA序列、和目标载体上使用的来自小鼠的本发明的DNA以外的附近区域的DNA 序列作为引物。在使用非人哺乳动物胚胎干细胞的情况下，通过基因同源重组，克隆本发明的DNA被钝化了的细胞株，将所述细胞注入适当时期、例如8细胞期的非人哺乳动物胚或胚泡，将制成的嵌合胚胎移植到假孕的所述非人哺乳动物的子宫。培育的动物是由具有正常的本发明的DNA座的细胞和具有人工变异的本发明的DNA座的细胞两者构成的嵌合体动物。在所述嵌合体动物的生殖细胞的一部分具有变异的本发明的DNA座的情况下，例如通过毛色(二一卜力，一)的判定等，可以由上述嵌合体个体与正常个体交配得到的个体群得到所有的组织是由具有实施了人工变异的本发明的DNA座的细胞构成的个体。上述得到的个体通常是本发明的蛋白质异源表达不完全的个体，使本发明的蛋白质的异源表达不完全的个体之间进行交配，可以由它们的后代获得本发明的蛋白质的同源表达不完全的个体。在使用卵细胞的情况下，例如通过微注射法向卵细胞核内注入DNA溶液，可以获得在染色体内导入了目标载体的转基因非人哺乳动物，与这些转基因非人哺乳动物相比， 由于基因同源重组而在本发明的DNA座上具有突变的动物可以通过选择来获得。如上所述，对于敲除了本发明的DNA的个体，可以确认通过交配得到的动物个体的所述DNA也被敲除，并可以在通常的饲养环境下进行饲养继代。另外，种系的取得和保持可以按照常规方法进行。即，通过使保有所述钝化DNA的雌雄动物交配，可以获得在同源染色体的双方都具有所述钝化DNA的纯合体动物。对于所得的纯合体动物，相对于母本动物，通过以正常个体为1、纯合体为多个的状态进行饲养，可以高效率地获得。通过杂合体动物的雌雄交配，可以使具有所述钝化DNA的纯合体以及杂合体动物繁殖继代。本发明的DNA被钝化的非人哺乳动物胚胎干细胞在培育本发明的DNA表达不完全的非人哺乳动物方面非常有用。另外，本发明的DNA表达不完全的非人哺乳动物是使由本发明的蛋白质诱导的各种生物活性缺失，因此，可以制成以本发明蛋白质的生物活性钝化为原因的疾病模型，因此，可以用于这些疾病原因的探究以及治疗方法的研究。(9a)对于起因于本发明DNA缺失或损伤等的疾病具有治疗/预防效果的化合物的筛选方法本发明的DNA表达不完全的非人哺乳动物可以用于对于起因于本发明的DNA缺失或损伤等的疾病具有治疗/预防效果的化合物的筛选。S卩，本发明提供一种对本发明的DNA表达不完全的非人哺乳动物给予试验化合物，并观察/测定该动物的变化、对于起因于本发明的DNA缺失或损伤等的疾病(例如癌症等)具有治疗/预防效果的化合物或其盐的筛选方法。作为所述筛选方法中使用的本发明的DNA表达不完全的非人哺乳动物，可以举出与上述同样的材料。
作为试验化合物，例如可以举出肽、蛋白质、非肽性化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取液、植物提取液、动物组织提取液、血浆等，它们可以是新的化合物，也可以是公知的化合物。具体来说，将本发明的DNA表达不完全的非人哺乳动物用试验化合物进行处理， 与未处理的对照动物进行比较，以所述动物的各器官、组织、疾病的症状等的变化为指标， 可以对试验化合物的治疗/预防效果进行试验。作为利用试验化合物对试验动物进行处理的方法，例如可以采用口服给予、静脉注射等，结合试验动物的症状、试验化合物的性质等适当地选择。另外，试验化合物的给予量可以结合给予方法、试验化合物的性质等适当地选择。例如，在筛选对于癌症(例如大肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、胰腺癌、脑肿瘤、造血系统肿瘤等)具有治疗/预防效果的化合物的情况下，对本发明的DNA表达不完全的非人哺乳动物给予试验化合物，在上述组织中，随着时间的推移而观察与试验化合物非给予组的癌症发病程度的不同或癌症治愈程度的不同。在所述筛选方法中，在对试验动物给予试验化合物的情况下，如果所述试验动物的上述疾病症状改善了约10%或更高、优选约30%或更高、更优选约50%或更高，则可以选择所述试验化合物作为对上述疾病具有治疗/预防效果的化合物。采用所述筛选方法得到的化合物是选自上述试验化合物的化合物，对于由于本发明蛋白质的缺失或损伤等引起的疾病具有治疗/预防效果，因此，可以作为对所述疾病较为安全、低毒性的预防/治疗药等的药物使用。另外，由上述筛选得到的化合物所衍生的化合物也同样可以使用。所述筛选方法所得的化合物可以形成盐，所述化合物的盐可以使用与生理学可接受的酸(例如无机酸、有机酸等)或碱(例如碱金属等)等形成的盐，尤其优选生理学可接受的酸加成盐。上述盐例如可以使用与无机酸(例如盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸等)形成的盐、或与有机酸(例如乙酸、蚁酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、 草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸等)形成的盐等。含有由所述筛选方法得到的化合物或其盐的药物可以与上述的含有本发明的蛋白质的药物同样地制造。上述得到的制剂安全、毒性低，因此可以给予例如人或哺乳动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、绵羊、猪、牛、马、猫、狗、猴等)。所述化合物或其盐的给予量根据对象疾病、给予对象、给予途径等而有差异，例如，在口服给予所述化合物的情况下，通常对成人(体重按照60kg计算)乳腺癌患者，每天给予约0. 1 约lOOmg、优选约1. O 约50mg、更优选约1. O 约20mg的所述化合物。在非口服给予的情况下，所述化合物的1次给予量根据给予对象、对象疾病等而不同，例如， 将所述化合物以注射剂的形式给予通常的成人(体重按照60kg计算)乳腺癌患者时，优选每天通过静脉注射给予约0. 01 约30mg、优选约0. 1 约20mg、更优选约0. 1 约IOmg 的所述化合物。在其它动物的情况下，可以给予按体重60kg换算的量。(9b)促进或抑制本发明的DNA的启动子活性的化合物的筛选方法本发明可以提供一种对本发明的DNA表达不完全的非人哺乳动物给予试验化合物并检测报道基因的、表达促进或抑制本发明的DNA启动子活性的化合物或其盐的筛选方法。在述筛选方法中，作为本发明的DNA表达不完全的非人哺乳动物，可以使用在上述的本发明的DNA表达不完全的非人哺乳动物中、本发明的DNA通过导入报道基因进行钝化、所述报道基因可以在本发明的DNA的启动子的控制下表达的材料。作为试验化合物，可以举出与上述同样的化合物。作为报道基因，可以使用与上述同样的报道基因，优选半乳糖苷酶基因 (IacZ)、可溶性碱性磷酸酶基因或荧光素酶基因等。在将本发明的DNA用报道基因置换了的本发明的DNA表达不完全的非人哺乳动物中，报道基因在本发明的DNA的启动子支配下存在，因此，通过追踪报道基因所编码的物质的表达，可以检测启动子的活性。例如，在将编码本发明蛋白质的DNA区域的一部分用来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因(IacZ)置换的情况下，在原本表达本发明的蛋白质的组织中，半乳糖苷酶代替本发明的蛋白质而表达。因此，例如，使用诸如5-溴-4-氯-3-昭丨哚基- β -吡喃半乳糖苷(X-gal)这样的以半乳糖苷酶为底物的试剂进行染色，由此可以简便地观察本发明的蛋白质在动物机体内的表达状态。具体来说，可以将本发明的蛋白质缺失的小鼠或其组织切片用戊二醛等固定，用磷酸缓冲生理盐液(PBQ洗涤，然后用含有X-gal的染色液、在室温或37°C附近反应约30分钟至1小时，然后将组织标本用ImM EDTA/PBS溶液洗涤，使 β-半乳糖苷酶反应停止，观察呈色。另外，还可以按照常规方法，检测编码IacZ的mRNA。采用上述筛选方法得到的化合物或其盐是选自上述的试验化合物的化合物，是促进或抑制本发明的DNA启动子活性的化合物。由所述筛选方法得到的化合物可以形成盐，所述化合物的盐可以使用与生理学可接受的酸(例如无机酸等)或碱基(例如碱金属等)等形成的盐，尤其优选生理学可接受的酸加成盐。上述盐例如可以使用与无机酸(例如盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸等)形成的盐、或与有机酸(例如乙酸、蚁酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、 苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸等)形成的盐等。抑制本发明的DNA启动子活性的化合物或其盐可以抑制本发明的蛋白质的表达， 或抑制所述蛋白质的功能，因此，可以用作例如癌症(例如大肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、 胰腺癌、脑肿瘤、造血系统肿瘤(特别是AML)等)的预防/治疗药物。另外，由上述筛选得到的化合物所衍生的化合物也可以同样地使用。含有由所述筛选方法得到的化合物或其盐的药物可以与含有上述本发明的蛋白质或其盐的药物同样地制造。上述得到的制剂安全、毒性低，因此可以给予例如人或哺乳动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、绵羊、猪、牛、马、猫、狗、猴等)。所述化合物或其盐的给予量根据对象疾病、给予对象、给予途径等而有差异，例如，在口服给予抑制本发明的DNA的启动子活性的该化合物的情况下，通常对于成人(体重按照60kg计算)乳腺癌患者，每天给予约0. 1 约lOOmg、优选约1. O 约50mg、更优选约 1. O 约20mg的所述化合物。在非口服给予的情况下，所述化合物的1次给予量根据给予对象、对象疾病等而不同，例如，将抑制本发明的DNA的启动子活性的所述化合物以注射剂的形式给予通常的成人(体重按照60kg计算)乳腺癌患者时，优选每天通过静脉注射给予约0. 01 约30mg、优选约0. 1 约20mg、更优选约0. 1 约IOmg的所述化合物。在其它动物的情况下，可以给予按体重60kg换算的量。这样，本发明的DNA表达不完全的非人哺乳动物在筛选促进或抑制本发明的DNA 的启动子活性的化合物或其盐上极为有用，对于起因于本发明的DNA表达不完全的各种疾病的原因探究或预防/治疗药物的开发有很大贡献。如果使用含有本发明的蛋白质启动子区域的DNA，在其下游连接编码各种蛋白质的基因，并将其注入动物的卵细胞中而制成所谓的转基因动物(基因移植动物)，则可以特异性地合成所述蛋白质，研究在所述生物体中的作用。另外，如果将适当的报道基因与上述启动子部分连接，建立表达所述基因的细胞株，则可以作为具有特异性地促进或抑制本发明的蛋白质本身在体内的生产能力的作用的低分子化合物研究系统来使用。在本说明书中，在以简略符号表示碱基或氨基酸等的情况下，是基于IUPAC-IUB 生物化学命名委员会制定的简略符号或本领域的常用简略符号。在氨基酸具有光学异构体的情况下，如无特别明示，表示L体。本说明书的序列表的序列号表示以下的序列。[序列号1]表示编码EVI1的DNA (⑶S)的碱基序列。[序列号2]表示编码EVI1的氨基酸序列。[序列号3]表示编码ITGA6的DNA (⑶S)的碱基序列。[序列号4]表示编码ITGA6的氨基酸序列。[序列号5]表示编码ITGB4的DNA(CDS)的碱基序列。[序列号6]表示编码ITGB4的氨基酸序列。[序列号7]表示与序列号8 —起形成shEVIl的RNA序列。[序列号8]表示与序列号7 —起形成shEVI 1的RNA序列。[序列号9]表示人EVIl基因扩增中使用的正向引物的碱基序列。[序列号10]表示人EVIl基因扩增中使用的反转引物的碱基序列。[序列号11]表示人β-肌动蛋白基因扩增中使用的正向引物的碱基序列。[序列号I2]
表示人肌动蛋白基因扩增中使用的反转引物的碱基序列。[序列号I3]表示与序列号14 一起形成shEVIl的RNA序列。[序列号14]表示与序列号13 —起形成shEVIl的RNA序列。实施例以下，通过实施例和参考例更具体地说明本发明，但本发明的技术范围并不受其限定。在以下的例子中使用的细胞株中，U937、Κ562、ΗΝΤ34、HL60、293T、MC3T3购自独立行政法人理化学研究所的细胞库。另外，MOLMl购自株式会社林原生物化学研究所。另外，AMLl由加利福尼亚大学圣迭戈分校(UCSD)提供。其中，关于冊37、1(562、!1附34、160、 M0LM1、AML1，在添加了 10%胎牛血清(FCS)(日冷株式会社制造)的RPMI1640 (189-02025， 和光纯药工业株式会社制造)进行了培养。关于MC3T3，在添加了 10%胎牛血清(FCS)(日冷株式会社制造)的aMEM(12561，hvitrogen公司制造)中进行了培养。关于^3T，在 DMEM/10% FCS中进行了培养。实施例1-1 因EVIl基因的shRNA导入导致的AMLl细胞株中的整联基因的表达抑制(抑制EVIl表达的AMLl细胞的建立)通过对来自人急性骨髓性白血病(AML)的AMLl细胞株转染shEVIl，建立抑制 EVIl表达的AMLl细胞株(以下也称为‘11^1(81^￥11)”)，其中，shEVIl是具有切断EVIl 基因的mRNA的活性的短发夹RNA(shRNA)。具体来说，首先，在RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-hGreen (Clontech 公司制造)的 PSIREN-RetroQ-ZsGreen 载体的 BamHl-EcoRl 位点插入 shEVIl (有义链GAUCUCUCUAAGGC UGAACUAGCA⑶CAAGAGACUGCUAGUUCAGCCUUAGAUUUUUUG(序列号 7)、反义链AAUUCAAMAAUCUA AGGCUGAACUAGCAGUCUCUUGAACUGCUAGUUCAGCCUUAGAGA (序列号幻，Oncogene, 2006 Jun 15; 25(25) :3565-75中公开)，制备shEVIl反转录病毒载体。接着，使用Hylimax脂质体试剂 (同仁科学研究所制造)，向细胞株导入10 μ g的所述shEVIl反转录病毒载体、以及 IOyg的plOAl包装载体(Clontech公司制造)，制成含有shEVIl的反转录病毒。使所得的反转录病毒感染IO5个AMLl细胞，建立AMLl (shEVIl)。另外，作为对照细胞，建立按照同样地方法转染的、附属于RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen(Clontech公司制造)的对照载体(shLuc)(以下也称为"AML1 (shLuc)，，)。(抑制整联表达的确认)通过离心，分别回收将上述建立的AMLl (shEVIl)和AMLl (shLuc)的细胞稳定培养所得的细胞，除去培养基，然后添加ImL的TRIZOL(注册商标)anvitrogen公司制造)。 接着，添加500 μ L氯仿，以15000rpm离心15分钟，然后将上层转移至另外的试管中，添加500 μ L的2-丙醇，以15000rpm离心10分钟，并使用80%的乙醇洗涤。将所得的RNA 溶解于不含RNase的水中，用分光光度计、以波长260nm测定RNA量，然后使用反转录酶 (superscripts (Invitrogen 公司制造))，将 1 μ g 的所述 RNA 变换为 cDNA。以所得的各个cDNA作为模板，将其通过PCR法扩增，通过琼脂糖凝胶电泳确认基因的表达量。具体来说，使用TaKaRa Extaq(宝生物工程公司制造)作为聚合酶，PCR装置使用PCR Thermal Cycler DICE (宝生物工程公司制造)。另外，在利用PCR的扩增前，通过 β-肌动蛋白对各个cDNA进行补正。在PCR时使用的引物的碱基序列如下所示(AEVIl)正向CGAAAGCGAGAATGATCTCC(序列号 9)反转GGAAGACGTAGTGCTGAACA(序列号10)(人β-肌动蛋白)正向AAGAGATGGCCACGGCTGCT(序列号 11)反转TCCTTCTGCATCCTGTCGGC(序列号 12)(整联家族)Journal of Biomedical Science Q005) 12 :803-813 中公开的材料。琼脂糖凝胶电泳的结果如图1所示。如图1所示，在AMLl (shEVIl)中，与 AMLl(shLuc)相比，EVIl基因的表达受到抑制。这可以认为是由于shEVIl的添加导致RNA 干扰(RNAi)的作用所致。另外，如图1所示，在AMLl (shEVIl)中，与AMLl (shLuc)比较，含有ITGA6基因和ITGB4基因的各种整联家族的基因表达受到抑制。进一步可知，钙粘着蛋白家族的1种——VE钙粘着蛋白基因的表达也受到抑制。这可能是由于EVIl基因的表达受到抑制所导致。另外，将既未给予shLuc也未给予shEVIl的AMLl细胞作为对照加入，对于AMLl (shEVIl)，进行一式三份的试验，结果如图2所示。如图2所示，与上述同样， AMLl (shEVIl)中可见EVIl基因的表达抑制，和与其相伴的各种整联家族和VE钙粘着蛋白的基因表达的抑制。实施例1-2 由EVIl基因的shRNA给予而导致的AMLl细胞株的细胞粘附能力的降低对于上述建立的AMLl (shEVIl)(三份)和AMLl (shLuc)，评价其细胞粘附能力。具体来说，分别向96孔板的各孔中加入100μ L用RPMI1640/10% FCS稀释为40 倍的生长因子降低基质胶(BD Biosciences公司制造)，在4°C下孵育6小时，然后用PBS 洗涤2次。分别向各孔中加入10000个/100 μ L上述的细胞。在37°C下孵育2小时，然后用PBS洗涤3次。然后，向各孔中分别加入90μ L的RPMI1640/10% FCSUOyL的细胞计数试剂盒8 (同仁科学研究所制造)，在37°C下孵育30分钟，然后使用分光光度计，以波长 450nm进行测定。图3是表示上述细胞粘附测定结果的图。如图3所示可知，AMLl (shEVIl)的细胞粘附能力(粘附细胞数与总细胞数之比)比AMLl (shLuc)下降约31 60%。由此，本发明者建立了 EVIl基因或其所编码的蛋白质、各种整联家族的基因或它们所编码的蛋白质可能参与了急性骨髓性白血病细胞的细胞粘附能力的发挥的假说。参考例1 各种细胞间的整联蛋白家族基因表达的比较准备将来自人的HL60细胞株、来自人的U937细胞株、以及来自人的K562细胞株稳定培养所得的细胞株，作为不表达EVIl基因的细胞株。另一方面，准备将来自人急性骨髓性白血病的AMLl细胞株(如上所述)、来自人的M0LM1细胞株、以及来自人的HNT34细胞株稳定培养所得的细胞株，作为表达EVIl基因的细胞株。对于这些细胞株，按照与上述实施例1-1同样的方法，确认EVIl基因和各种整联蛋白家族基因的表达。琼脂糖凝胶电泳的结果如图4所示。如图4所示可知，在EVIl阳性的细胞株 (AMLUM0LM1和HNT34)中，ITGA6基因和ITGB4基因特异性地表达。基于上述结果，本发明人提出了这样的假说除EVIl基因之外，整联蛋白家族的特别是ITGA6基因和ITGB4基因以及它们所编码的蛋白质可能参与了急性骨髓性白血病的细胞粘附能力的表达。实施例2-1 因shEVIl导入导致的HNT34细胞株中的整联蛋白基因的表达抑制使用基因导入系统Nucleofector (Amaxa Biosystems公司制造)，对来自人的 HNT34细胞株导入在上述实施例1-1中使用的shEVI 1，建立抑制EVIl表达的HNT34细胞株 (以下也称为“HNT34(shEVIl) ”)。同样地，作为对照细胞，建立导入shLuc的细胞株(以下也称为“HNT34(shLuc) ”)。对于这些细胞株，按照与上述实施例1同样的方法，确认EVIl 基因和各种整联蛋白家族基因的表达。琼脂糖凝胶电泳的结果如图5所示。如图5所示，通过NucIeofector向HNT34细胞株导入shEVI 1，与上述实施例1-1或实施例1-2同样地，可以确认EVIl基因或各种整联蛋白家族基因的表达受到抑制。实施例2-2 因EVIl基因的shRNA给予导致HNT34细胞株的细胞粘附能力的降低对于上述建立的HNT34 (shEVIl)和HNT34 (shLuc)，按照与上述实施例1_2同样的方法评价其细胞粘附能力。图6是表示上述细胞粘附测定结果的图。如图6所示可知，HNT34(shEVIl)的细胞粘附能力(粘附细胞数与总细胞数之比)相对于HNT34(ShLuc)降低约76%。如上所述， 在HNT34细胞株中得到了与上述实施例1-2同样的结果。参考例2 因EVI1基因的shRNA给予导致的对HNT34细胞株的细胞增殖能力的影响对于上述建立的HNT34(shEVIl)和HNT34(shLuc)评价了其细胞增殖能力。具体来说，分别向96孔板的各孔中加入1000个/100 μ L用RPMI1640/10% FCS稀释了的细胞。在37°C下孵育适当的时间，然后分别加入10 μ L的细胞计数试剂盒8(同仁科学研究所制造)，在37°C下孵育30分钟，然后用分光光度计、以波长450nm进行测定。图7是表示上述的细胞增殖测定结果的图。如图7所示，在对照细胞株 HNT34(shLuc)和抑制EVIl表达的细胞株HNT34(shEVIl)之间，细胞增殖能力未见显著差异。由此可以认为EVIl基因未参与细胞的增殖。实施例3-1 因ITGB4基因的shRNA给予所导致的AMLl细胞株的细胞粘附能力的降低按照与上述实施例2-1同样的方法，通过对AMLl细胞株转染具有切断ITGB4基因的mRNA的活性的shRNA(以下也称为“shITGB4”)，建立抑制ITGB4表达的AMLl细胞株(以下也称为“AML1 (shITGB4) ”)。所用的shITGB4的碱基序列如下所示。有义链GAUCUCCGAGUUGC⑶GGGGUGUGUCUUCAAGAGAGACACACUCCGUGCAGCUCUUUUUG( 序列号1 反义链AAUUCAAAAAGAGCUGCACGGAGUGUGUCUCUCUUGAAGACACACCCCACGCAACUCGGA( 序列号14)对照细胞使用在上述实施例1-1中建立的AMLl (shLuc)。
对于上述建立的AMLl (shITGB4)和AMLl (shLuc)，按照与上述实施例1_2同样的方法评价其细胞粘附能力。图8是表示上述的细胞粘附测定结果的图。如图8所示可知，AMLl (shITGB4)的细胞粘附能力(粘附细胞数与总细胞数之比)相对于AMLl (shLuc)降低至几乎为零。由上述结果证实了 ITGB4基因参与了急性骨髓性白血病细胞中的细胞粘附能力的发挥的假说。按照与上述实施例1-1同样的方法确认AMLl (shITGB4)中的ITGB4基因的表达。 结果，如图9的PCR-琼脂糖凝胶电泳结果所示，在AMLl (shITGB4)中，与AMLl (shLuc)相比， ITGB4基因的表达受到了抑制。实施例3-2 因β4整联蛋白中和抗体所导致的AMLl细胞株的细胞粘附能力的降低对来自人的AMLl细胞株给予β 4整联蛋白中和抗体，评价对所述细胞株的细胞粘附能力的影响。具体来说，对10000个/100 μ L细胞加入β 4整联蛋白克隆ASC3抗体(默克密理博公司制造，ΜΑΒ2058)作为中和抗体，使终浓度为20μ g/mL，在4°C下孵育30分钟，然后用 RPMI1640/10% FCS洗涤。接着，用100 μ L的RPMI1640/10% FCS使其悬浮，加入到涂敷有 Matrigel (注册商标)的96孔板的孔中，在37°C下孵育2小时，然后用PBS洗涤3次。分别加入90μ L的RPMI1640/10% FCSUOyL的细胞计数试剂盒8 (同仁科学研究所制造)，在 37°C下孵育30分钟，然后使用分光光度计，在波长450nm下测定。对照是使用给予抗FLAG M2抗体或抗β 1整联蛋白抗体、以此代替日4整联蛋白克隆六503抗体的细胞株。图10是表示上述的细胞粘附测定结果的图。如图10所示，AMLl细胞的细胞粘附能力(粘附细胞数与总细胞数之比)相对于抗FLAG M2给予组和抗β 1整联蛋白抗体给予组分别降低约90%和约94%。由上述结果证实了这样的假说ITGB4蛋白质参与了急性骨髓性白血病细胞的细胞粘附能力的发挥。参考例3-1 因EVIl基因的导入所导致的U937细胞株中的整联蛋白基因表达的
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几进 向不表达EVI1基因的U937细胞株中导入EVI1基因，研究各种整联蛋白家族基因的表达是否增加。具体来说，通过将EVIl基因导入U937细胞，建立表达EVIl基因的U937细胞(以下也称为“冊37伍￥11)”)，研究所述冊37伍￥11)中的各种整联蛋白家族基因的表达。对照使用导入了 GFP基因的U937细胞(以下也称为“U937 (GFP) ”)。琼脂糖凝胶电泳的结果如图11所示。如图11所示可知，通过向EVIl阴性的U937 细胞株导入EVIl基因，ITGA6基因、ITGB3基因、和ITGB4基因的表达亢进。参考例3-2 因EVIl基因的导入而导致的U937细胞株的细胞粘附能能力的提高对于U937细胞株、以及上述建立的对照U937(GFP)以及导入EVIl的细胞株 U937 (FLAG-EVI1)，按照与上述实施例2_1同样的方法，评价EVIl基因的导入对细胞粘附能力的影响。图12是表示上述的细胞粘附测定结果的图。如图12所示可知，U937(FLAG_EVI1) 的细胞粘附能力(粘附细胞数与总细胞数之比)相对于U937细胞株和U937 (GFP)分别提高至约2. 3倍和约3. 0倍。由此显示，EVIl基因的表达经由整联蛋白的表达，参与了细胞粘附能力的提高。参考例3-3 因EVIl基因的导入造成的对U937细胞株的细胞增殖能力的影响对于U937细胞株、以及上述建立的对照U937(GFP)和导入了 EVIl的细胞株 U937 (FLAG-EVI1)，按照与上述参考例2同样的方法，评价EVIl基因的导入对细胞增殖能力的影响。图13是表示上述细胞增殖测定结果的图。如图13所示，在作为对照细胞株U937 细胞株以及U937 (GFP)与EVIl表达亢进细胞株U937(FLAG-EVI1)之间，细胞增殖能力未见显著差异。由此可以认为，EVIl基因未参与细胞的增殖的可能性高。参考例4-1 各种细胞株的EVIl基因以及ITGA6基因和ITGB4基因表达的相关性准备U937、K562、KG1、HEL、HL-60、K052、THP-1、FKH-1、K051、NH、以及 0IH-1 作为完全或几乎不表达EVI1基因的细胞株。另一方面，准备AML-I、HNT-;34、Kasumi 3和M0LM-1EVI1 基因作为高度表达EVIl基因的细胞株。对于上述准备的各种细胞株，确认了 EVIl基因和各整联蛋白家族基因的表达。琼脂糖凝胶电泳的结果如图14所示。如图14所示，在高度表达EVIl基因的细胞株(AMLl、HNT34、kasumi3、M0LMl)中，可见ITGA6基因和ITGB4基因双方的表达，显示它们之间存在相关性。参考例4-2 临床检体的EVIl基因以及ITGA6基因和ITGB4基因表达的相关性准备3个检样的不表达EVIl基因的急性骨髓性白血病(AML)细胞、4个检样的作为高度表达EVIl基因的AML的一种的t (3 ；7)的AML细胞、以及3个检样的作为同样地高度表达EVI1基因的AML的一种的3q21 q26综合征的AML细胞，作为临床检体。另外，一并地准备了不表达EVIl基因的骨髓(BM)细胞、以及高度表达EVIl基因的CD34阳性细胞作为细胞株对照。对于上述准备的检样和细胞株对照，确认了 EVIl基因和各整联蛋白家族基因的表达。琼脂糖凝胶电泳的结果如图15所示。如图15所示，在高度表达EVIl基因的临床检体检样中，可以发现ITGA6基因和ITGB4基因双方的表达的倾向，显示它们之间存在相关性。参考例4-3 使用DNA微阵列的各种细胞株的ITGA6基因和ITGB4基因表达的确认(图16)准备了HEL、HL60、K052、THP-I、FKH-I、K051、NH、0IH-1 作为不表达 EVIl 基因的细胞株。另一方面，准备了 AML1、HNT34、MOLMU Kasumi3作为高度表达EVIl基因的细胞株。 对于这些细胞株，按照昂飞公司(Affymetrix)制造的基因芯片(Gene-chip)手册，通过DNA 微阵列检测ITGA6基因和ITGB4基因的表达。具体来说，首先由各个细胞制成cDNA，通过One-cycle目标标记试剂盒(昂飞公司制造)进行生物素标记的cRNA的合成。接着，将制成的30 μ L的cRNA(15 μ g)在94°C下反应35分钟而片段化，并添加到杂交溶液(300yL)中。然后进行99°C下5分钟、和45°C 下5分钟的反应，离心，将上清与人基因组基因芯片(U133A)杂交。在洗涤后，通过基因芯片扫描仪(gene-chip scanner)(昂飞公司制造)进行扫描，进行数据的数值化。另外，在进行数据的数值化时，使用β肌动蛋白作为标准，进行补正。
上述的DNA微阵列的结果如图16所示。如图16所示可以确认，在表达EVIl基因的细胞群中，ITGA6基因和ITGB4基因高表达，显示出它们之间存在相关性。参考例4-4 使用DNA微阵列的临床检体的ITGA6基因和ITGB4基因表达的确认 (图 17)准备了 10个检样的不表达EVIl基因的急性骨髓性白血病(AML)细胞、12个检样的高度表达EVIl基因的AML细胞，作为临床检体。对于上述准备的检样和细胞株对照，按照与上述参考例4-3同样的方法，通过DNA 微阵列确认ITGA6基因和ITGB4基因的表达。上述DNA微阵列的结果如图17所示。如图17所示，在高表达EVIl基因的临床检体中，检测出ITGA6基因和ITGB4基因的表达亢进，显示它们之间存在相关性。参考例5 =AMLl细胞株的细胞粘附与药物(VP16、Ara-C)抗性研究了成骨细胞的存在对于来自人急性骨髓性白血病(AML)的AMLl细胞株的药物抗性的影响。具体来说，通过生成水溶性甲臜的WST法，对于培养基中存在和不存在成骨细胞的情形，评价在作为依托泊苷系抗癌药的一种的VP16 (5 μ M)的存在下的AMLl细胞株的存活能力。另外，如果在培养基中存在成骨细胞，则AMLl细胞株经由成骨细胞固定在培养皿上。另一方面，如果在培养基中不存在成骨细胞，则AMLl细胞株以悬浮状态增殖而不固定在培养皿上。图18是表示上述WST法的药物抗性测定结果的图。如图18所示，在VP16存在下进行培养时，如果培养基中存在成骨细胞，与不存在时相比较，可知AMLl细胞株的存活率显著提高。换言之，显示AMLl细胞株在获得对VP16的药物抗性时，成骨细胞的存在(即， 细胞粘附)是必要的。研究使用作为分化诱导型抗癌药的一种的Ara-C来代替VP16作为抗癌药物的情况下，成骨细胞的存在对AMLl细胞株的药物抗性的影响。具体来说，使用Ara-C(l μ g/mL) 代替VP16作为抗癌药物，除此之外，按照与上述同样的方法，进行WST法的药物抗性测定。图19是表示上述WST法的药物抗性测定结果的图。如图19所示，即使在Ara-C 存在下进行培养，如果培养基中存在成骨细胞，则与不存在时的情形相比较，可知AMLl细胞株的存活率显著提高。换言之，显示AMLl细胞株在获得对Ara-C的药物抗性时，成骨细胞的存在(即，细胞粘附)是必要的。实施例4 因ShEVIl的RNA干扰作用而导致的成骨细胞介质性药物抗性的消失在上述的参考例5 (在Ara-C存在下)中，分别使用上述建立的AMLl (shEVIl)细胞和AMLl (shLuc)细胞代替AMLl细胞株，按照同样的方法进行WST法的药物抗性测定。图20表示上述WST法的药物抗性测定结果的图。图20(a)是表示培养 AMLl(shLuc)的结果的图，图20(b)是表示培养AMLl (shEVIl)的结果的图。根据图20(a)、 (b)所示的结果可知，在AMLl (shLuc)中，与参考例5同样地，由于成骨细胞的存在，可以获得对Ara-C的药物抗性(图20(a))，而与此相对地，在AMLl (shEVIl)中，所述药物抗性消失。这可以认为是由于在AMLl (shEVIl)中，被视为白血病的病因基因的EVIl基因的表达由于shEVIl的RNA干扰作用而受到抑制，结果，经由成骨细胞的细胞粘附受到抑制。上述结果显示，如本实施例那样的、含有与EVIl基因的碱基序列互补的碱基序列的反义多核苷酸发挥细胞粘附抑制剂的作用，在降低癌细胞的药物抗性方面是有用的。参考例6 =AML患者的整联蛋白基因的表达从美国国家生物工程信息中心(NCBI)的基因表达库(GEO)收集了 55例人AML患者骨髓细胞的基因表达数据。将这些数据分为AML治愈组(30例)和AML复发组(25例)， 并通过不对应的t检验，在各组之间统计学评价ITGA6基因和ITGB4基因的表达量是否有
显著差异。图21是收集的表达量数据的图。图21 (a)表示ITGA6基因的表达量数据，图21 (b) 表示ITGB4基因的表达量数据。由图21所示的结果可知，在复发组中，ITGA6基因的表达量明显地多。参考例7 人骨髓/末梢血细胞的整联蛋白基因的表达从NCBI基因表达库(GEO)中收集了 30例(15种X 2)人的各种骨髓/末梢血细胞的基因表达数据。对这些数据中的ITGA6基因和ITGB4基因的各个的表达量进行了比较。图22和图23是收集的表达量数据的图。图22表示ITGA6基因的表达量数据，图 23表示ITGB4基因的表达量数据。由图22和图23所示的结果可知，ITGA6基因和ITGB4 基因在CD34阳性的造血干细胞中的表达量低。由此，本发明的细胞粘附抑制剂不作用于正常的造血干细胞，而只对AML细胞发生特异性作用，有望抑制在骨髓内的粘附。参考例8 人⑶34阳性细胞/白血病细胞的整联蛋白基因的表达根据上述参考例7所示的结果，对来自人脐带血的⑶34阳性细胞(造血干细胞) 和AMLl细胞的整联蛋白家族基因的表达进行了比较。这里，关于⑶34阳性细胞(也称为 “CD34+”)，从人脐带血中分离，并使用Methoculture (STEMCELL公司制造)作为培养基进行了培养。关于整联蛋白基因表达量的比较，按照与上述实施例1-1同样的PCR法进行。本参考例中的琼脂糖凝胶电泳结果如图M所示。另外，如上所述，图M中的U937 和K562是来自人的EVIl非表达细胞株，HNT34是来自人的EVIl表达细胞株。如图M所示，可以确认CD34阳性细胞(造血干细胞)中的ITGB4基因表达量低，上述结果是与上述参考例7的结果整合得出的。实施例5 =AMLl细胞在AMLl细胞移植NOG小鼠大腿骨中的聚集将上述建立的AMLl(ShEVIl)细胞移植到NOG小鼠(注册商标)中，研究了 AMLl(ShEVIl)细胞在移植后的小鼠大腿骨中的聚集。这里，NOG小鼠是适合人化模型小鼠制作的重度免疫缺陷小鼠，可以由实验动物中央研究所获得。具体来说，由静脉向NOG小鼠分别注入600万个AMLl (shLuc)细胞和 AMLl(ShEVIl)细胞，1个月后回收大腿骨骨髓。通过FACS制成横轴为荧光强度的图，分析荧光强度低(更接近于0的峰)至荧光强度高的细胞以怎样的程度存在。图25是FACS法测定结果的图。图25(a)表示使用AMLl (shLuc)细胞的FACS结果， 图25(b)表示使用AMLl (shEVIl)细胞的FACS结果。如图25所示可知，AMLl (shEVIl)细胞的存在率(9. 5% )比AMLl (shLuc)细胞(33% )的情况低。这可以认为，在AMLl (shEVIl) 细胞中，EVIl基因的表达由于shEVIl的RNA干扰作用而受到抑制，结果，ITGA6/B4的表达低下，在小鼠大腿骨骨髓上的成活率低。由所述结果显示，如本实施例中的、含有与EVIl基因的碱基序列互补的碱基序列的反义多核苷酸发挥细胞粘附抑制剂的作用，对于防止白血病细胞在骨髓的聚集是有用的。
本申请基于2009年2月24日提出的日本国专利申请第2009-041204号，其公开的内容通过参照而整体地弓I用到本说明书中。
权利要求
1.一种癌细胞的细胞粘附抑制剂，所述抑制剂包含对于具有与序列号2所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽的抗体。
2.一种癌细胞的细胞粘附抑制剂，所述抑制剂包含反义多核苷酸，所述反义多核苷酸含有与编码含有与序列号2所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的碱基序列互补或实质上互补的碱基序列或其一部分。
3.一种癌细胞的细胞粘附抑制剂，所述抑制剂包含对于具有与序列号4或序列号6所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽的抗体。
4.一种癌细胞的细胞粘附抑制剂，所述抑制剂包含反义多核苷酸，所述反义多核苷酸含有与编码含有与序列号4或序列号6所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的碱基序列互补或实质上互补的碱基序列或其一部分。
5.一种癌细胞的细胞粘附抑制剂，所述抑制剂包含抑制含有与序列号2所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质的表达和/或活性的物质。
6.一种癌细胞的细胞粘附抑制剂，所述抑制剂包含抑制含有与序列号4或序列号6所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质的表达和/或活性的物质。
7.如权利要求1 6中任一项所述的抑制剂，所述抑制剂用于癌症的预防或治疗。
8.如权利要求1 7中任一项所述的抑制剂，所述抑制剂在与其它抗癌剂合并使用时， 用于提高癌细胞对所述抗癌剂的敏感性。
9.如权利要求1 8中任一项所述的抑制剂，其中，癌症为白血病。
10.如权利要求9所述的抑制剂，其中，所述白血病为急性骨髓性白血病。
11.一种癌细胞的细胞粘附的抑制方法，所述抑制方法包括抑制含有与序列号2所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质的表达和/或活性。
12.—种癌细胞的细胞粘附的抑制方法，所述抑制方法包括抑制编码含有与序列号2 所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的表达和/或活性。
13.—种癌细胞的细胞粘附的抑制方法，所述抑制方法包括抑制含有与序列号4或序列号6所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质的表达和/或活性。
14.一种癌细胞的细胞粘附的抑制方法，所述抑制方法包括抑制编码含有与序列号4 或序列号6所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的表达和/或活性。
15.如权利要求11 14中任一项所述的抑制方法，所述抑制方法用于癌症的预防或治疗。
16.一种抑制含有与序列号2所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质的表达和/或活性的物质在制造癌细胞的细胞粘附抑制剂中的应用。
17.—种抑制含有与序列号4或序列号6所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质的表达和/或活性的物质在制造癌细胞的细胞粘附抑制剂中的应用。
18.—种抑制编码含有与序列号2所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的表达和/或活性的物质在制造癌细胞的细胞粘附抑制剂中的应用。
19.一种抑制编码含有与序列号4或序列号6所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的表达和/或活性的物质在制造癌细胞的细胞粘附抑制剂中的应用。
20.如权利要求16 19中任一项所述的应用，其中，所述细胞粘附抑制剂用于癌症的预防或治疗。
21.—种抑制癌细胞的细胞粘附的物质的筛选方法，所述筛选方法使用含有与序列号 2所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽。
22.如权利要求21所述的筛选方法，其中，含有与序列号2所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽是以生产所述蛋白质或其部分肽的细胞的形态提供的。
23.如权利要求22所述的筛选方法，所述筛选方法还使用从对于含有与序列号2所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽的抗体、以及含有编码所述蛋白质的多核苷酸或其碱基序列的一部分的多核苷酸中选择的任意一种。
24.一种抑制癌细胞的细胞粘附的物质的筛选方法，所述筛选方法使用含有与序列号 4或序列号6所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽。
25.如权利要求M所述的筛选方法，其中，含有与序列号4或序列号6所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽是以生产所述蛋白质或其部分肽的细胞的形态提供的。
26.如权利要求25所述的筛选方法，所述筛选方法还使用从对于与序列号4或序列号 6所示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽的抗体、以及含有编码所述蛋白质的多核苷酸或其碱基序列的一部分的多核苷酸中选择的任意一种。
27.如权利要求21 沈中任一项所述的筛选方法，所述筛选方法用于预防或治疗癌症的物质的筛选。
全文摘要
本发明通过控制与现有的不同的目标分子的表达/功能来提供癌症的预防/治疗手段，以此作为癌症的分子靶向疗法的新的方法。另外，本发明还提供使用上述目标分子来筛选具有癌症的预防/治疗活性的物质的手段。本发明的一个实施方式提供一种癌细胞的细胞粘附抑制剂，所述癌细胞的细胞粘附抑制剂包括对于含有与序列号2、序列号4或序列号6表示的碱基序列相同或实质上相同的碱基序列的蛋白质或其部分肽的抗体。本发明的另一个实施方式提供一种癌细胞的细胞粘附抑制剂，所述癌细胞的细胞粘附抑制剂含有反义多核苷酸，所述反义多核苷酸包括与编码含有与序列号2、序列号4或序列号6所示的碱基序列相同或实质上相同的碱基序列的蛋白质的多核苷酸的碱基序列互补或实质上互补的碱基序列或其一部分。本发明的又一个实施方式提供一种癌细胞的细胞粘附抑制剂，所述癌细胞的细胞粘附抑制剂包括抑制含有与序列号2、序列号4或序列号6所示的碱基序列相同或实质上相同的碱基序列的蛋白质的表达和/或活性的物质。
文档编号A61P35/02GK102333543SQ20108000914
公开日2012年1月25日 申请日期2010年1月28日 优先权日2009年2月24日
发明者山川哲生, 森下和广 申请人:国立大学法人宫崎大学