专利名称：STAT3磷酸化抑制剂和Notch1表达抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及作为决定细胞命运的因子的低分子量非肽化合物。该化合物通过STAT信号和Notch信号，减少STAT3的磷酸化并抑制Notch1受体的表达，作用于转导系统。因此，该化合物可作为未分化细胞(干细胞)的分化诱导剂。基于这些特征，该化合物适合用作STAT信号和Notch信号转导系统二者功能异常引起的临床病症的预防或治疗剂。
背景技术：
Notch信号转导在青年和成年人中与决定细胞命运有关，并且是改变不大的机制(非专利文献1)。Notch信号转导参与决定许多组织中细胞的命运。Notch的功能作用在具有同样功能的邻近细胞上。
很多情况下，它抑制分化趋向最初的分化命运。反之，它把细胞分化成第二种备选命运，或者保持细胞的未分化状态。这种功能是细胞多样性的起源。除了这个功能，Notch信号还积极促进各种类型细胞的分化。例如，在神经系统中，Notch信号促进分化成星形细胞。
分子学上，Notch信号首先在果蝇中，然后在脊椎动物中得以证实。它依赖于Notch基因编码的跨膜受体(非专利文献1-3)，并且被跨膜配体(由基因如Delta或Jagged所编码)活化。这种活化调节了一系列Notch蛋白的降解和切割，以及存在于分子内并与CBF蛋白结合的片段转录到细胞核中。它们还作为活化HES基因转录的转录复合体发挥作用。由于HES抑制前神经元基因MASH1的转录，细胞内Notch的活化抑制了神经干细胞分化为神经细胞。
由于它的多功能，Notch信号转导的功能异常将引起各种疾病，如肿瘤、癌症、和神经变性疾病如阿尔茨海默症(非专利文献2-3)。作用于Notch信号转导系统的决定细胞命运的因子成为新药的靶标。由于所采用的策略针对的是，通过把存在于Notch信号系统下游的因子作为靶标(如，抑制配体结合，抑制受体的蛋白降解和切割，抑制其转录到细胞核，等等)，控制Notch功能，它们不会抑制Notch的表达。
非专利文献1S.Artavanis-Tsakonsa，M.Rand，R.Lake，NotchSignalingCell Control and Signal Integration in Development(Notch信号转导发育过程中的细胞控制和信号整合).Science Vol.284p770-776(1999)非专利文献2A Zlobin，M.Jang，L.Miele，Toward the rationaldesign of cell fate modifiersNotch signaling as a target for novelbiopharmacerticals.(合理设计细胞命运修饰剂Notch信号转导用于新的生物药物)Current Pharmaceutical Biotechnology July(1)p86-106(2000)非专利文献3B.Nickoloff，B.Osborne，L.Miele Notch signalingas a therapeutic target in cancera new approach to the development ofcell fate modifying agents.(Notch信号转导作为癌症的治疗靶标开发细胞命运修饰剂的新方法)Oncogene Vol 22(42)p6598-6608决定细胞命运在青年人和成人年中一样，是重要的事件。它控制了如细胞的增殖、分化和凋亡的过程。所述过程的失调是很多临床病症的起源。
因此，开发细胞命运决定的因子是药物开发的主要目的之一。
发明内容
发明要解决的问题本发明的目的是提供特异作用于Notch1基因表达的低分子量化合物。
解决问题的方法已经有报告称环己烯酮长链醇具有神经营养活性，促进了神经细胞的存活和神经突的延伸(Gonzales de Aguilar等，Brain Res(2001)920，65-73)。
另外，本发明的发明人在使用神经球的实验中证明，该化合物抑制神经干细胞分化成星形细胞，并促进分化为神经细胞(PCTWO02/29014A2)。
STAT3被大量细胞因子(生长因子和激素)的磷酸化作用活化。迄今，已经确定了7种STAT家族，它们中的一些能相当特异性地被活化。STAT3的生物作用已经被利用基因剔除小鼠(knockout mice)和通过Cre-LoxP重组的研究所阐明，显示了STAT3在各种生物功能如细胞增殖、抑制凋亡和细胞运动性中发挥着重要作用。另一方面，STAT3对ES(胚胎干细胞)细胞的活性是抑制ES细胞的自身繁殖和促进其分化。抑制STAT3信号与诸如血癌、乳癌、头癌和颈癌等癌症的很多细胞株有关系(Bromberg and Darnell，Oncogene(2000)19，2468-2473)。
为解决上述问题进行的广泛研究的结果是，本发明的发明人发现了环己烯酮长链醇具有抑制STAT3磷酸化和抑制Notch1表达的活性，从而实现了本发明。
也就是说，本发明涉及(1)抑制STAT3磷酸化和抑制Notch1表达的试剂，其含有下式(1)代表的化合物作为活性成分
其中R1、R2和R3彼此独立地代表氢原子或甲基；并且X代表具有10至28个碳原子的直链或支链烷基、亚烷基或亚烯基，；(2)抗肿瘤剂，含有上述化合物(1)作为活性成分；和(3)改善STAT信号和Notch信号转导系统功能异常的试剂，包含上述化合物(1)作为活性成分。
发明的效果式(1)代表的化合物展示出极好的抑制STAT3磷酸化的效果和抑制Notch1表达的效果，适合用作改善STAT信号和Notch信号转导系统功能异常的试剂。此外，由于已揭示出STAT信号和Notch信号转导系统功能异常导致疾病如各种肿瘤、癌症、和神经变性疾病如阿尔茨海默症，式(1)代表的化合物也适合用作各种肿瘤和癌症以及各种神经变性疾病的预防或治疗剂。
附图简述
图1是显示取决于是否添加了本发明的环己烯酮长链醇的基因表达增加或减少的图。
图2是显示通过添加本发明的环己烯酮长链醇，抑制STAT3磷酸化活性的图。
图3是显示实验结果的图，表明本发明的环己烯酮长链醇的体外抗肿瘤活性。
图4是显示实验结果的图，表明本发明的环己烯酮长链醇离体(exvivo)的抗肿瘤活性。
发明的最佳实施方式在上式(1)中，X是具有10至28个碳原子、直链或支链烷基、亚烷基或亚烯基，并提到在支链亚烷基或亚烯基的情况下，具有1-10个碳原子的烷基作为侧链。侧链烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、己基、异己基、庚基、辛基、壬基、癸基等。其中，优选甲基。另外，在直链亚烷基或亚烯基(这表示至少有一个碳-碳双键的烯烃结构)上的侧链取代优选在3-和/或7-位进行。在这些X中，更优选具有10-28个碳原子的直链烷基，并特别优选具有10-18个碳原子的直链烷基。此外，R1、R2和R3各自代表氢原子或甲基，更优选它们中至少一个为甲基的情况。
另外，式(1)代表的化合物可以是其可药用的盐、溶剂化物或水合物的形式。作为由式(1)表示的化合物，可能存在各种异构体，这些异构体也包括在本发明中。
式(1)代表的化合物可通过任何已知的方法制备，例如，它可以依照JP-A-2000-297034中叙述的生产方法产生。
式(1)代表的化合物可以通过口服给药方式或通过非胃肠给药方式(肌内、皮下、静脉内、栓剂等)给药。
就口服制剂而言，它们可以在加入赋形剂以及需要的话，加入粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、矫味剂后，以常规方式配制成片剂、包衣片、颗粒、胶囊、溶液、糖浆、酏剂、油剂或水基悬液。赋形基的实例包括乳糖、玉米淀粉、蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、结晶纤维素等。粘合剂的实例包括聚乙烯醇、聚乙烯醚、乙基纤维素、甲基纤维素、阿拉伯胶、黄芪胶、明胶、虫漆、羟丙基纤维素、羟丙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮等。
崩解剂的实例包括淀粉、琼脂、明胶粉、结晶纤维素、碳酸钙、碳酸氢钠、柠檬酸钙、右旋糖苷、果胶等。润滑剂的实例包括硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇、二氧化硅、硬化植物油等。作为着色剂，药学可接受作为药用添加剂者均可用。矫味剂的实例包括可可粉、薄荷醇、芳香酸、薄荷油、冰片、肉桂粉等。需要的话，这些片剂和胶囊可以用糖、明胶等包衣。
作为非胃肠给药的实例，在制备注射剂的情况下，皮下、肌内或静脉内注射剂以常规方法通过添加pH调节剂、缓冲剂、稳定剂和/或防腐剂(需要的话)来制备。通过将注射液放置在小瓶中，随后冻干溶液等，注射剂可以配制成固体制剂，用前复溶。可以是一剂放在一瓶中，或者选择多剂放在一瓶中。
就人类而言，本发明化合物作为药物对于每个成年人的剂量通常在0.01-1000mg/天的范围内，优选在0.1-500mg/天的范围内，日剂量可以每天一次给药或者分成2-4部分给药。
实施例虽然下文将参考实施例解释本发明，但本发明不受这些实施例的限制。
实施例1基因表达实验用2，4，4-三甲基-3-(15-羟十五基)-2-环己烯-1-酮处理在乙醇中溶解用JP-A-2000-297034描述的方法合成的2，4，4-三甲基-3-(15-羟十五基)-2-环己烯-1-酮，得到10-2M的浓度。溶液按需要的浓度加入到培养溶液中，最终稀释为1μl/ml。在细胞培养的不同时间和不同阶段，加入2，4，4-三甲基-3-(15-羟十五基)-2-环己烯-1-酮。使用1μl/ml的乙醇作为对照(在稀释的浓度下，乙醇一点也不影响培养溶液的分化)。每个实验至少重复三次。
神经球的形成、保持和分化规程取自Grandbarbe等，Development(2003)130，1393-1402。按照Tropepe等，Dev.Biol.(1999)208，166-188的描述简要说明，原代神经球从野生型胚胎(E14.5)的端脑制备，并在含有10ng/ml EGF的无血清培养基中(Reynolds and Weiss，Science(1992)255，1707-1770)，通过持续传代培养，保持成为二代神经球。在增殖不同时间后，将50-100个神经球在有2ng/ml EGF和0.5％FBS的条件下，接种到涂有聚鸟氨酸(Sigma)的盖玻片上，进行分化。
RT-PCR分析神经球在含有10ng/ml EGF的“神经球培养基”中培养，在不同条件下培养不同时间(如文中所述，在RNA提取前3小时、12小时或24小时)。神经细胞(来自鼠科动物13-14天的胚胎脑)、星形细胞(来自新生Wistar大鼠的脑)、和少突胶质细胞(来自新生Wistar大鼠的脑)，在有2，4，4-三甲基-3-(15-羟十五基)-2-环己烯-1-酮(或乙醇)的条件下培养24小时。从培养细胞中提纯RNA并转录。对各个实验制备三份独立的RNA样品。从神经球的3μg总RNA 、星形细胞和少突细胞的2μg总RNA、以及神经细胞的1.5μg总RNA，用20μl含有200U M-MLV转录酶(Invitrogen)、0.5mM dNTP(Qbiogen)、5mM DTT(Invitrogen)、0.01μg/μl六碱基随机序列(randon hexmer)(Invitrogen)和20U RnaseOUT(注册商标)(Invitrogen)的反应混合液，在37℃下1小时合成cDNA。用含有1.25U Taq DNA聚合酶(Invitrogen)、0.5mM dNTP(Qbiogen)和0.5μg每种引物的反应混合物溶液扩增总cDNA的十分之一。研究中对各种引物和靶向的细胞调整PCR条件。引物设计如下，以兼匹配大鼠和小鼠样本。
Notch1 F5’-TGCCAAATGCCTGCCAGAAT-3’(SEQ ID NO1)Notch1 R5’-CATGGATCTTGTCCATGCAG-3’(SEQ ID NO2)Notch2 F5’-GAGGCGACTCTTCTGCTGTTGAAGA-3’(SEQ IDNO3)Notch2 R5’-ATAGAGTCACTGAGCTCTCGGACAG-3’(SEQID NO4)Notch3 F5’-ACACTGGGAGTTCTCTGTGAG-3’(SEQ ID NO5)Notch3 R5’-GCTGTCTGCTGGCATGGGATA-3’(SEQ ID NO6)Notch4 F5’-CTTCTCGTCCTCCAGCTCAT-3’(SEQ ID NO7)Notch4 R5’-GCTGACATCAGGGGTGTCAC-3’(SEQ ID NO8)典型的循环条件是94℃下30秒、55℃下30秒和72℃下30秒，除了对于HES-5的程序是94℃下30秒、63℃下30秒和72℃下2分钟。重复PCR两次。结果表示为已用2，4，4-三甲基-3-(15-羟十五基)-2-环己烯-1-酮处理的细胞的基因表达相对于未处理细胞的百分比(在对于GAPDH标准化后，对照的条件调整为100％)。mRNA的相对量依照BabyImager分析和NIHimage 1.36定量测定。
以RT-PCR进行Notch通路的关键基因表达的分子分析的结果是，发现其它Notch受体(Notch2-4)的表达水平不因为通过2，4，4-三甲基-3-(15-羟十五基)-2-环己烯-1-酮处理而改变，而Notch1和然后HES5的mRNA水平却总是降低。
实施例2制备2，4，4-三甲基-3-(15-羟十五基)-2-环己烯-1-酮溶液(10-8M)后，用STAT3和磷酸化的STAT3抗体(STAT3抗体来自兔子，Cell Signaling制造)进行Western点杂交，以证实2，4，4-三甲基-3-(15-羟十五基)-2-环己烯-1-酮对STAT3磷酸化的作用。
如图2所示，结果表明，在2，4，4-三甲基-3-(15-羟十五基)-2-环己烯-1-酮存在的条件下，与对照相比(不加入该化合物)，STAT3磷酸化产物(P-STAT3)的条带很细。因此，这说明STAT3的磷酸化受到抑制。
实施例3体外实验3T3Ras转化的成纤维细胞的实验规程当3T3Ras转化的成纤维细胞在含有10％FBS的DMEM培养基中培养3天后，与未转化的细胞株比较，观察到“病灶”的出现。
每个3T3Ras转化的成纤维细胞(来自小鼠)或3T3成纤维细胞(来自小鼠)，都以10,000细胞/ml的浓度在含有10％FBS的DMEM培养基中培养1天。
之后，每个细胞用10-5M的2，4，4-三甲基-3-(15-羟十五基)-2-环己烯-1-酮处理6天。
软琼脂分析3T3Ras转化的成纤维细胞或3T3成纤维细胞，以10,000细胞/ml的浓度，在含5％FBS的DMEM培养基中培养，所述培养基含有0.625％琼脂(DIFCO)和10-6M的2，4，4-三甲基-3-(15-羟十五基)-2-环己烯-1-酮。
最近，已经表明Notch1的活性是维持Ras转化的细胞株的瘤灶所必需的。该观察结果确定了Notch信号转导作为致瘤Ras的关键的下游效应器，并进一步证实了Notch可以是新的治疗靶标(Weijzen等，Nature Med.(2002)8，979-986)。
Ras转化的成纤维细胞用2，4，4-三甲基-3-(15-羟十五基)-2-环己烯-1-酮(10-6M)处理，然后与未处理的细胞比较。未转化的细胞株(处理和未处理的)用作对照。
从图3揭示，2，4，4-三甲基-3-(15-羟十五基)-2-环己烯-1-酮减少了Ras转化的细胞株的瘤灶。该发现还伴随着Notch表达的分子减少。
实施例4离体实验在试管中，3T3Ras转化的成纤维细胞(来自小鼠)或3T3成纤维细胞(来自小鼠)以50μl(10-3M)2，4，4-三甲基-3-(15-羟十五基)-2-环己烯-1-酮处理3天。细胞(2×107细胞)再次悬浮在400μl DMEM培养基中，其200μl对称地注射到7周龄Swiss Nu/Nu小鼠(雄性)中。在注射后的第二、第八和第十五天，小鼠腹膜内给药2，4，4-三甲基-3-(15-羟十五基)-2-环己烯-1-酮。
图4揭示了，通过给药环己烯酮长链醇，肿瘤大小减小了。
虽然本发明被详细地并参考其具体实施例进行描述，但对于本领域技术人员显而易见的是，可以在其中进行各种改变和修改而不背离其内涵和外延。
本申请建立在2004年10月13日提交的日本专利申请2004-299415的基础上，其内容在此合并作为参考。
工业实用性式(1)代表的化合物表现出了优异的抑制STAT3磷酸化的效果和抑制Notch1表达的效果，适合用作改善STAT信号和Notch信号转导系统功能异常的试剂。此外，该化合物也适合用作各种肿瘤和癌症以及各种神经变性疾病的预防或治疗剂。
序列表<110>明治乳业株式会社(Meiji Dairies Corporation)<120>STAT3磷酸化抑制剂NoNotch1表达抑制剂(STAT 3 Phosporylation and Notch 1 ExpressionInhibitor)<130>SCT071738-47<160>8<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>primer<400>1tgccaaatgc ctgccagaat20<210>2<211>21<212>DNA<213>Artificial<220>
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<223>primer<400>7cttctcgtcc tccagctcat20<210>8<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>primer<400>8gctgacatca ggggtgtcac20
权利要求
1.一种抑制STAT3磷酸化和抑制Notch1表达的试剂，包含下式(1)代表的化合物作为活性成分 其中R1、R2和R3各自独立地代表氢原子或甲基；并且X代表具有10至28个碳原子的直链或支链烷基、亚烷基或亚烯基。
2.一种抗肿瘤剂，包含权利要求1所述的化合物作为活性成分。
3.一种改善STAT信号和Notch信号转导系统功能异常的试剂，其包含权利要求1所述的化合物作为活性成分。
全文摘要
本发明涉及抑制STAT3磷酸化和抑制Notch1表达的试剂，包含下式(1)代表的化合物作为活性成分其中R
文档编号A61P35/00GK101039663SQ20058003510
公开日2007年9月19日 申请日期2005年10月13日 优先权日2004年10月13日
发明者邦·卢, 埃兰·莫希尔, 山田昌司, 铃木启仁 申请人:明治乳业株式会社