专利名称：截短胰高血糖素样肽1(sGLP－1)、制法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及促胰岛素分泌的胰高血糖素样肽1(glucagon-likepeptide-1，GLP-1)的类似物，另外还涉及其制法及其应用。
背景技术：
近年来对促胰岛素分泌肽GLP-1和Exendin 4的研究进展很快，两者具有很高的同源性，应用于治疗II型糖尿病取得较好的效果。GLP-1是人肠道中分离纯化得到的多肽，Exendin 4是从墨西哥巨蜥蜴的毒液中分离得到的一种短肽。两者在很低浓度下即可促进胰脏合成和分泌胰岛素，从而能帮助糖尿病人控制血糖。
GLP-1是人体分泌的一种肠道激素，由胰高血糖素原(Proglucagon)分子经肠道蛋白水解酶作用而产生，因而称为胰高血糖素类多肽。当血糖浓度高于6mmol/L时，GLP-1能显著促进胰岛素分泌；而一旦血糖浓度恢复至正常值则不再继续作用，这一点对II型糖尿病的治疗十分有用。人体内的GLP-1有两种形式，一种为GLP-1(7-36)NH2，是由30个氨基酸残基组成的多肽，即由胰高血糖素原中第7位至第36位氨基酸组成，其C端是酰胺化了的；另一种为GLP-1(7-37)，是由31个氨基酸残基组成的多肽，即胰高血糖素原中第7位至第37位氨基酸，GLP-1(7-36)NH2和GLP-1(7-37)有相同的促胰岛素分泌作用，实验证明，在1×10-10-1×10-111mol/L浓度下，GLP-1与离体胰岛细胞作用时，可促进其分泌胰岛素，故又称它们为促胰岛素分泌肽。美国专利USP 05424286公开了Exendin4和GLP-1促胰岛素分泌的对比实验。与GLP-1相比，产生胰岛素分泌作用所需的Exendin 4浓度更低，而且Exendin 4在人体内的半衰期更长。这些研究表明，GLP-1或Exendin 4可能成为一种较为理想的II型糖尿病治疗药物。
一个治疗II型糖尿病的理想药物应该是既能降低空腹血糖，也能降低餐后血糖，又不会导致低血糖，还能减少心血管系统的并发症，并且没有其它的副反应。GLP-1是由30个氨基酸组成的肽，其序列His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg。虽然该序列用于治疗糖尿病优点是该序列为人体产生的天然序列，具有上述的多种特性，副反应少，比如它能象糖原那样抑制糖原的分泌，减慢胃肠排空，抑制食欲等；此外，GLP-1受体的刺激还可以促进细胞增殖及更新，从而使胰岛素分泌增多，对糖的耐受性提高。但缺点是，头两个氨基酸His-Ala很快就被体内的二肽基肽酶降解而丧失活性，在体内的半衰期太短，只有90至120秒，几乎没有太大的临床实用价值。目前国内外进行GLP-1序列改构的研究和专利均有很多，但没有在GLP-1序列改构同时进行序列长度缩减的。
Exendin 4在人体内的半衰期长，降血糖作用明显，但化学合成的Exendin 4是39个氨基酸组成的肽，成本高，而且作为异源多肽，长期使用有诱发人体产生对应抗体而失效的可能。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足问题，提供一种截短胰高血糖素样肽1(sGLP-1)，与胰岛细胞受体结合力更强，刺激胰岛素分泌作用更强；半衰期延长，另外还提供其制法，合成成本低，最后还提供其应用。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是截短胰高血糖素样肽1(sGLP-1)，其由26个氨基酸组成，其序列如下His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu式中英文缩写表示His(缩写为H，以下相同。)组氨酸、Gly(G)甘氨酸、Glu(E)谷氨酸、Thr(T)苏氨酸、Phe(F)苯丙氨酸、Ser(S)丝氨酸、Asp(D)天冬氨酸、Val(V)缬氨酸、Tyr(Y)酪氨酸、Leu(L)亮氨酸、Gln(Q)谷氨酰胺、Lys(K)赖氨酸、Ile(I)异亮氨酸、Trp(W)色氨酸。
其中所述的X1为Gly或Ser。
本发明所述截短胰高血糖素样肽1(sGLP-1)的制法第一步sGLP-1肽树脂的合成称取0.5克的多肽合成树脂倒入合成反应柱中，加入二甲基甲酰胺溶剂溶胀，按照sGLP-1氨基酸序列依次称取0.1克的9芘甲氧羰基进行氨基酸N端(FMOC)保护的氨基酸于反应器的容器中，采用Merrifield发明的固相化学合成方法合成，sGLP-1的氨基酸序列从C端开始依次进行，在合成反应柱中，加入用二甲基甲酰胺溶解的N，N二异丙级碳二亚胺(DIC)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)，C端第一个氨基酸(FMOC-Leu)，反应2-3小时中止，减压抽干反应液，洗树脂，分别用异丙醇洗3次，二氯甲烷洗3次，二甲基甲酰胺洗3次，加入含20％(V/V)6-氢吡啶的二甲基甲酰胺脱保护溶液，反应30分钟，抽干反应液，分别用异丙醇洗3次，二氯甲烷洗3次，二甲基甲酰胺3次，随后加入的第二个FMOC保护的氨基酸，和无水羟基苯丙三氮唑(HOBT)，2-苯骈三氮唑-1，1，3，3，-四甲基脲四氟硼酸酯(HBTU)，N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)，溶解活化5分钟，立即加入反应器中反应2小时，按上法洗树脂，脱保护，随后依照序列结构偶连反应直到序列完全，偶连完成后，用二甲基甲酰胺充分洗去残余的未偶连试剂，用惰性气体N2吹干肽树脂，备用。
第二步sGLP-1树脂的裂解取上述肽树脂于容器中，加入裂解液9.5ml三氟乙酸，0.4ml硫代苯甲醚，0.4ml苯甲醚，0.2ml-1，2-乙二硫醇，于室温避光反应2小时，过滤，滤液于室温浓缩后加入预先冷冻的无水乙醚中，冰冻过夜，离心，弃上清液，沉淀用水或冰醋酸溶解后，冷冻后置冷冻干燥机中干燥，得粗肽。第三步sGLP-1肽纯化取上述粗肽，加入无热源水溶解，得到样品溶液，过滤并收集样品滤液；将乙腈及无热源水用0.45u滤膜过滤，分别加入0.1％三氟乙酸，混匀，用C18反向柱分离纯化，分离条件采用流动相A0.1％三氟乙酸+100％H2O；流动相B0.1％三氟乙酸+100％乙腈；0→90分钟梯度洗脱纯化制备，收集纯化的sGLP-1洗脱液，冷冻后置冷冻干燥机中干燥，得到sGLP-1多肽纯品。
本发明所述截短胰高血糖素样肽1(sGLP-1)在治疗II型糖尿病药物中的应用。如在治疗II型糖尿病注射针剂、口服片剂或胶囊、喷雾剂中的应用。
所述中成分除sGLP-1外，注射针剂包含sGLP-1及人体可接受的稀释液体，如注射用水、生理盐水和磷酸盐缓冲液等；口服片剂或胶囊包括sGLP-1及医药可接受的稳定剂、固型剂等。
本发明所述的截短胰高血糖素样肽1(sGLP-1)与目前GLP-1及其类似物相比，具有突出的特点1.截短肽链改构后与胰岛细胞受体结合力更强，刺激更强的胰岛素分泌作用；2.通过第二位氨基酸序列的改变，由Ala改为Gly或Ser使改构的模拟序列可抵抗二肽基肽酶降解作用，从而使半衰期延长，药效增强；3.通过截短肽链，降低合成成本。多肽的制备一般可采用化学合成和基因工程技术两种方法生产。但生产的成本很高，这成为其进入药品市场的障碍。本发明提供的合成方法，通过改变肽链中的少数若干个氨基酸可得到多肽的类似物，同时又可以大规模、低成本地进行生产。通过用II型糖尿病大鼠模型试验，进行II型糖尿病降血糖治疗试验，结果表明本发明sGLP-1降血糖作用优于GLP-1及其改构序列，动物试验表明降糖效果明显提高。用改构的缩短序列与胰岛细胞受体结合，具有更佳的刺激胰岛素分泌作用，具有较好的用于II型糖尿病病人的治疗药物的应用前景。
图1为本发明sGLP-1液相色谱纯度鉴定图。
图2为本发明sGLP-1分子量质谱鉴定图。
具体实施例方式实施例1按下述方法合成sGLP-1，其序列如下His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu第一步sGLP-1肽树脂的合成称取0.5克的Wang树脂(或其他多肽合成树脂)倒入合成反应柱中，加入二甲基甲酰胺溶剂溶胀，按照本发明的降血糖肽的氨基酸序列依次称取0.1克的FMOC(9芘甲氧羰基进行氨基酸N端保护的)氨基酸于反应器的容器中，按照Merrifield发明的固相化学合成方法(具体方法如下)依照本发明的sGLP-1的氨基酸序列从C端开始依次进行，在合成反应柱中，加入用10ml的二甲基甲酰胺溶解的4ml N，N二异丙级碳二亚胺(DIC)，0.012克4-二甲氨基吡啶的C端第一个氨基酸(FMOC-氨基酸)，反应2-3小时中止，减压抽干反应液，洗树脂，分别用异丙醇洗3次，二氯甲烷洗3次，二甲基甲酰胺3次，加入含20％(V/V)6-氢吡啶的二甲基甲酰胺脱保护溶液，反应30分钟，抽干反应液，分别用异丙醇洗3次，二氯甲烷洗3次，二甲基甲酰胺3次，随后加入的第二个FMOC保护的氨基酸，和0.22克无水羟基苯丙三氮唑，0.6克2-苯骈三氮唑-1，1，3，3，-四甲基脲四氟硼酸酯(HBTU)，0.35mlN，N-二异丙基乙胺，溶解活化5分钟，立即加入反应器中反应2小时，按上法洗树脂，脱保护，随后依照序列结构偶连反应直到序列完全，偶连完成后，用二甲基甲酰胺充分洗去残余的未偶连试剂，用惰性气体N2吹干肽树脂，备用。
第二步sGLP-1树脂的裂解取上述肽树脂于容器中，加入裂解液9.5ml三氟乙酸，0.4ml硫代苯甲醚，0.4ml苯甲醚，0.2ml-1，2-乙二硫醇，于室温避光反应2小时，过滤，滤液与室温浓缩后加入预先冷冻的无水乙醚中，冰冻过夜，离心，弃上清液，沉淀用200ml水或冰醋酸溶解后，冷冻后置冷冻干燥机中干燥，得粗肽。
第三步sGLP-1肽纯化取粗肽，加入200ml无热源水溶解，得到样品溶液，过滤并收集样品滤液；将乙腈及无热源水用0.45u滤膜过滤，分别加入0.1％三氟乙酸，混匀，用C18反向柱分离纯化，分离条件采用流动相A0.1％三氟乙酸+100％H2O；流动相B0.1％三氟乙酸+100％乙腈；0→90分钟梯度洗脱纯化制备，收集纯化的sGLP-1洗脱液，冷冻后置冷冻干燥机中干燥，得到sGLP-1多肽纯品。
实施例2按照实施例1所述方法合成sGLP-1，其序列如下His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu。
动物实验1、降血糖效果实验材料和方法GK糖尿病大鼠(中国科学院上海动物中心提供)sGLP-1序列如下No1HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRNo2HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLNo3HSEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLNo4HSEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFINo5HGEGTFTSDVSSYLEGQAVRLFINo6HGEGTFTSDVSSYMEEEAVRNo7HGE GTFTSDVSSYMNo8HGEGTFTSDVSS上述8种序列多肽用0.9％NaCl溶液配置成1mg/ml溶液，备用。
大鼠随机分组，禁食过夜后，用刻度毛细管(注射前以肝素处理)从眼窦取血20微升，置入300微升生理盐水中混匀，3000转/分离心除去红血球，血清用于空腹血糖浓度测定。然后各组分别注射不同多肽，用生理盐水作阴性对照，每只大鼠每天注射两次，每次0.1mg，连续注射两周，禁食过夜后，再次按上法取血，测定空腹血糖。
结果见附表1，No1～No5均有降血糖作用，其中No1序列是第2位氨基酸由A改为G的全长GLP-1序列作为阳性对照；No2～No5为不同截短长度的改构序列，而且No2和No3组降血糖作用明显高于No1组，为最终确定的本发明sGLP-1序列。
2、对NOD小鼠的降血糖作用实验材料与方法
NOD小鼠禁食过夜(中国科学院上海动物中心提供)40％葡萄糖、0.9％NaCl溶液、sGLP-1纯品(实施例1所得产品)、GLP-1纯品、血糖测定试剂盒(中国卫生部上海生物制品所出品)NOD小鼠禁食过夜，分为三组。第一组腹腔注射200微升40％葡萄糖和10微克sGLP-1，第二组腹腔注射200微升40％葡萄糖和10微克GLP-1，第三组为对照组，只注射葡萄糖。立刻用刻度毛细管(注射前以肝素处理)从眼窦取血20微升，置入300微升生理盐水中混匀，3000转/分离心除去红血球，血清用于血糖浓度测定。分别于30，60，120分钟按同样操作取血，分离血清。三组血清均按照试剂盒所述方法测定血糖浓度，以检验各组的降血糖作用。
结果如表1所示。
对照组血糖浓度大幅度升高后，逐渐回落到正常水平；而给药组血糖浓度未出现显著升高，一直保持在正常水平附近。这是由于给药后促进了胰岛素分泌，从而避免了血糖浓度的大幅波动。由此可证明sGLP-1和GLP-1的降血糖作用。
表1.sGLP-1对NOD小鼠的降血糖作用
注表中血糖浓度值为mmol/L3、sGLP-1的促胰岛素分泌作用实验材料与方法NOD小鼠(中国科学院上海动物中心提供)0.9％NaCl溶液、sGLP-1纯品(实施例1所得产品)、GLP-1纯品放射免疫胰岛素测定试剂盒(中国卫生部上海生物制品所出品)NOD小鼠分成三组。首先用刻度毛细管(先以1mg/mL肝素润洗毛细管内壁并晾干)从眼窦取血50微升，然后三组小鼠分别腹腔注射10微克sGLP-1、10微克GLP-1和200微升生理盐水，并记此时为零时刻。然后分别于5，10，20，30分钟按同样操作取血。取血后各血样立刻加入盛有50微升生理盐水的离心管中，混匀，3000转/分离心除去红血球，按放射免疫试剂盒使用方法测定血清中胰岛素浓度，以检验sGLP-1的促胰岛素分泌作用。
实验结果如表2所示。该结果表明，腹腔注射sGLP-1能显著促进胰岛素的分泌，短时间刺激产生胰岛素能力与GLP-1相当，中长时间刺激产生胰岛素能力超过GLP-1。
表2.sGLP-1的促胰岛素分泌作用
注表中胰岛素值为10-6国际单位4.sGLP-1的促C肽分泌作用实验材料与方法健康C57/BL小鼠(中国科学院上海动物中心提供)0.9％NaCl溶液、sGLP-1纯品(实施例1所得产品)、GLP-1纯品。放射免疫C-肽测定试剂盒(中国卫生部上海生物制品所出品)健康C57/BL小鼠分成三组。首先用刻度毛细管(先以1mg/mL肝素润洗毛细管内壁并晾干)从眼窦取血50微升，然后两组小鼠分别腹腔注射10微克sGLP-1、10微克GLP-1和200微升生理盐水，并记此时为零时刻。然后分别于5，10，20，30分钟按同样操作取血。取血后各血样立刻加入盛有50微升生理盐水的离心管中，混匀，3000转/分离心除去红血球，按放射免疫试剂盒使用方法测定血清中C肽浓度，以检验sGLP-1的促C肽分泌作用。
实验结果如表3所示。该结果表明，腹腔注射sGLP-1能显著促进c肽的分泌，而且促进c肽的分泌能力高于GLP-1。
表3.sGLP-1的促胰岛素分泌作用
注表中c肽浓度为pmol/mL
附表1 降血糖效果实验
权利要求
1.截短胰高血糖素样肽1(sGLP-1)，其特征在于其由26个氨基酸组成，其序列如下His-Xl-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu。
2.根据权利要求1所述的截短胰高血糖素样肽1(sGLP-1)，其特征在于其中Xl为Gly或Ser。
3.根据权利要求1所述的截短胰高血糖素样肽1(sGLP-1)的制法，其特征在于第一步sGLP-1肽树脂的合成称取0.5克的多肽合成树脂倒入合成反应柱中，加入二甲基甲酰胺溶剂溶胀，按照sGLP-1氨基酸序列依次称取0.1克的9芘甲氧羰基进行氨基酸N端(FMOC)保护的氨基酸于反应器的容器中，采用Merrifield发明的固相化学合成方法合成，sGLP-1的氨基酸序列从C端开始依次进行，在合成反应柱中，加入用二甲基甲酰胺溶解的N，N二异丙级碳二亚胺(DIC)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)，C端第一个氨基酸(FMOC-Leu)，反应2-3小时中止，减压抽干反应液，洗树脂，分别用异丙醇洗3次，二氯甲烷洗3次，二甲基甲酰胺洗3次，加入含20％(V/V)6-氢吡啶的二甲基甲酰胺脱保护溶液，反应30分钟，抽干反应液，分别用异丙醇洗3次，二氯甲烷洗3次，二甲基甲酰胺3次，随后加入的第二个FMOC保护的氨基酸，和无水羟基苯丙三氮唑(HOBT)，2-苯骈三氮唑-1，1，3，3，-四甲基脲四氟硼酸酯(HBTU)，N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)，溶解活化5分钟，立即加入反应器中反应2小时，按上法洗树脂，脱保护，随后依照序列结构偶连反应直到序列完全，偶连完成后，用二甲基甲酰胺充分洗去残余的未偶连试剂，用惰性气体N2吹干肽树脂，备用；第二步sGLP-1树脂的裂解取上述肽树脂于容器中，加入裂解液9.5ml三氟乙酸，0.4ml硫代苯甲醚，0.4ml苯甲醚，0.2ml-1，2-乙二硫醇，于室温避光反应2小时，过滤，滤液于室温浓缩后加入预先冷冻的无水乙醚中，冰冻过夜，离心，弃上清液，沉淀用水或冰醋酸溶解后，冷冻后置冷冻干燥机中干燥，得粗肽；第三步sGLP-1肽纯化取上述粗肽，加入无热源水溶解，得到样品溶液，过滤并收集样品滤液；将乙腈及无热源水用0.45u滤膜过滤，分别加入0.1％三氟乙酸，混匀，用C18反向柱分离纯化，分离条件采用流动相A0.1％三氟乙酸+100％H2O；流动相B0.1％三氟乙酸+100％乙腈；0→90分钟梯度洗脱纯化制备，收集纯化的sGLP-1洗脱液，冷冻后置冷冻干燥机中干燥，得到sGLP-1多肽纯品。
4.根据权利要求1所述的截短胰高血糖素样肽1(sGLP-1)在治疗II型糖尿病药物中的应用。
5.根据权利要求1所述的截短胰高血糖素样肽1(sGLP-1)在治疗II型糖尿病注射针剂、口服片剂或胶囊、喷雾剂中的应用。
6.根据权利要求4所述的截短胰高血糖素样肽1(sGLP-1)在治疗II型糖尿病药物中的应用，其特征在于注射针剂包含sGLP-1及人体可接受的稀释液体，如注射用水、生理盐水和磷酸盐缓冲液。
7.根据权利要求4所述的截短胰高血糖素样肽1(sGLP-1)在治疗II型糖尿病药物中的应用，其特征在于口服片剂或胶囊包括sGLP-1及医药可接受的稳定剂、固型剂。
全文摘要
本发明涉及促胰岛素分泌的胰高血糖素样肽1(glucagon－likepeptide－1，GLP－1)的类似物，截短胰高血糖素样肽1(sGLP－1)，其由26个氨基酸组成，其序列如下His－X1－Glu－Gly－Thr－Phe－Thr－Ser－Asp－Val－Ser－Ser－Tyr－Leu－Glu－Gly－Gln－Ala－Ala－Lys－Glu－Phe－Ile－Ala－Trp－Leu。发明所述的截短胰高血糖素样肽1(sGLP－1)与目前GLP－1及其类似物相比，具有突出的特点1.截短肽链改构后与胰岛细胞受体结合力更强，刺激更强的胰岛素分泌作用；2.通过第二位氨基酸序列的改变，由Ala改为Gly或Ser使改构的模拟序列可抵抗二肽基肽酶降解作用，从而使半衰期延长，药效增强；3.通过截短肽链，降低合成成本。
文档编号A61P3/10GK1817904SQ20051004780
公开日2006年8月16日 申请日期2005年11月21日 优先权日2005年11月21日
发明者李元, 黄庆生, 李别虎, 张虎明, 张明杰, 薛小平, 王延竹, 韩文君, 张卫华, 张胜军 申请人:大连帝恩生物工程有限公司