用于植物的抗微生物环肽组合物的制作方法

用于植物的抗微生物环肽组合物的制作方法
【专利摘要】本发明描述了用于预防或控制抗微生物病原体在植物、植物材料或植物生长培养基上的生长的、包含一种或多种短杆菌酪肽、短杆菌色肽、短杆菌苯丙肽或短杆菌肽S或其衍生物或其类似物的组合物，本发明还描述了用于控制或预防微生物病原体、尤其是真菌病原体在植物、植物材料或植物生长介质上的生长的方法。用于控制这些病原体的活性剂为短杆菌酪肽、短杆菌色肽、短杆菌苯丙肽和/或短杆菌肽S或其衍生物、类似物或改性物。所述短杆菌酪肽、短杆菌色肽、短杆菌苯丙肽和/或短杆菌肽S是具有通用氨基酸序列cyc/o(缬氨酸-X1-亮氨酸-D-苯丙氨酸-脯氨酸-X2-X3-X4-X5-X6)(SEQ ID NO:1)的环十肽或其衍生物或其类似物，其中X1是鸟氨酸或赖氨酸，X2是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸；X3是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、鸟氨酸或赖氨酸的左旋体；X4是天冬酰胺、谷氨酰胺或亮氨酸；X5是谷氨酰胺，或缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的左旋体；以及X6是酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸。
【专利说明】用于植物的抗微生物环肽组合物

【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于预防或控制在植物、植物部分或植物材料上的微生物生长的抗微 生物的组合物。

【背景技术】
[0002] 由于微生物感染（尤其是真菌病原体感染）所导致的产量和质量的下降是对新 鲜农产品市场的最大威胁。每年由微生物病原体引起的收获前感染导致全球食品产量大 约16%的损失，还伴随着由收获后感染导致的高达50%的进一步损失，尤其是在发展中国 家。这潜在威胁到全球食品安全（Chakraborty and Newton，2011，Plant Path. 60,2_14， Montesinos and Bardaji, 2008, Chem.Biodivers. 5,1225-1237)〇
[0003] 收获后感染（例如由青霉菌属（Penicillium ssp)(青霉）、链核盘菌属 (Monilinia spp)(褐腐病）以及尤其是灰霉菌（Botrytis cinerea)(灰霉）在葡萄、草 莓、车厘子以及如梨和苹果的木本果中引起的那些收获后感染）是造成可市售水果的重大 损失的主要原因 （Lennox et al. 2003. Plant Dis. 87, 639-644 ;Wilson et al.,1991Crop Protection 10, 172-177 ;Romanazzi, 2010, Fresh produce 4,111-115)。在储存期间限制 损失的措施包括低温储存、生物防治和用天然化合物处理以及用化学物质处理（Zheng et al.2008. Food Control,19,470-474 ；Romanazzi,2010, Fresh Produce 4,111-115)〇
[0004] 农业中的另一个主要关注点是主要由因感染所导致的植物健康衰退而导致的收 获前损失。土壤传播的镰刀菌属（或称为镰孢属，Fusarium spp.)与葡萄树枯萎和根腐 病相关，并且影响许多植物物种（Di Peitro et al. 2003, Mol. Plant Path 4, 315-325; Berrocal-Lobo and Molina,2008, Trends Plant Sci. 13,145-150, Highet and Nair, 1995，Aus.J. Grape Wine Res, 148-50)。真菌孢子可以在土壤中坚持多年，用于种植的 插条或脱落叶子可以通过维管伤口来促进感染，尽管在许多植物中，感染通过根部发生 (Berrocal-Lobo and Molina,2008Trends Plant Sci. 13,145-150, Highet and Nair, 1995，Aus.J. Grape Wine Res, 148-50)。然而，与葡萄树衰败相关的两种最具破坏性的 疾病是由柱孢霉属（Cylindrocarpon spp.)引起的乌脚病（black foot disease)以 及由Phaeomoniella spp.和Phaeoacremonium spp.引起的葡萄幼苗衰败或佩特里病 (Petri disease)(Fourie and Halleen. 2001, ffinelands,12,19 - 23 ；2002.Aus. Plant Path. 31:425 - 426.)。乌脚病和佩特里病主要感染葡萄繁殖材料和新种植的葡萄树，并 且要么单独地要么共同地对葡萄幼苗衰败、产量减少或损失以及葡萄幼苗死亡负有责 任。已被感染这些疾病的老葡萄树显示了发育不良表型和低的甚至无结果潜能。因此， 葡萄种植者被迫以巨大成本和生产损失来重新种植初期的、感染的葡萄园。但是，这样的 问题经常发生在供应繁殖材料的苗圃中。研究已经表明感染材料的主要来源是母块材 料和苗圃，低于50%的繁殖材料能生产出健康的、可出售的植物（Fourie and Halleen, 2004, Aus. Plant Path. 33:313-315 ;Halleen et al. 2003. Aus. Plant Path. 32:47 - 52)。 Halleen等人（2007，Plant Path. 56,637 - 645)评估了 13种杀真菌剂，代表用于柱孢属和 Campylocarpon spp (乌脚病的病原）的体外菌丝抑制的10种不同化学品种类。只有咪鲜 胺二氯化锰、抑霉唑和苯来特能在所有被测试的真菌菌株中有效地减少菌丝生长，但是未 能在现场条件下保护繁殖免患乌脚病。该研究表明大部分的化学品治疗是无效的，并且与 保护葡萄树免患乌脚病是不一致的。
[0005] 植物组织培养是葡萄树和水果产业中用于供应建立新的葡萄园和果园的无病毒 和无病原体的种植材料的重要技术。第二组织培养技术（也就是胚胎挽救）在新品种尤其 是无核葡萄品种培育中发挥了重要作用。尽管这些技术已经在供应高品质的种植材料方面 已经非常成熟，但是仍然有许多方面影响将现场材料在体外环境中建立的成功率。最重要 的因素之一是外植体的质量，其可以受到存在于现场植物材料中的微生物种群（真菌、细 菌和酵母）的很大影响（Cassells，2001，Proc. IV IS on In Vitro Cult. &Hort. Breeding， Eds. S. Sorvari et al.，353-350)。用于在体外建立外植体材料的富培养基也是这些微生 物生长的理想培养基，使得所采用的灭菌策略成为在成功建立外植体材料从户外回到体 外培养中的关键步骤（Cassells，2001，Proc.IV IS on In Vitro Cult. &Hort. Breeding， Eds. S. Sorvari et al.，353-350)。外植体材料的灭菌通常涉及热水处理、乙醇和NaOCl2 处理的结合（Cassells，2000，Plant Cell Biology (Ed. Spier，R.E·)，Wiley，Chichester， 577-586)，但是这样仅除去了部分表面微生物，而内生细菌和真菌存活下来，当外植体被置 于培养基时就导致了污染。组织培养试验室依靠抗生素来控制真菌和细菌感染两者，但是 出现在外植体材料上的单一微生物需要使用抗生素的组合的情况是很少见的，其可以导致 危害植物的毒性（Estopc5,2001，Plant Cell，Tissue&Organ Culture 65,211-220)。包含 甲基氯异噻唑啉酮/甲基异噻唑啉酮作为活性成分的PPMTM是当前市场上唯一声称抑制细 菌和真菌病原体两者的生长的化学产品，但是其已被报道会干扰植物发育，尤其是在葡萄 树的组织培养中（Compton and Koch 2001，In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 37,259-261)。
[0006] 化学杀微生物剂的替代品（例如生物控制剂）给予生产者保护其产品的对环境友 好的方式，但是伴随着不断的环境，生物控制的效力不可预知并且不能保证抗微生物病原 体的保护。
[0007] 随着现有的抗微生物剂（主要为化学杀微生物剂）由于抗性而失去对很多病原体 的效力、增多的全球性反对采用化学控制和倾向于更天然和有机农业实践的运动，需要具 有确保能建立高质量的种植材料并且还可以保护收获后储存期间的农产品的广谱活性的 天然的生物控制剂。


【发明内容】

[0008] 根据本发明的第一个【具体实施方式】，提供了 一种用于预防或处理在植物、植 物部分或植物材料上的微生物生长的植物抗微生物组合物，所述组合物包括作为活性 组分的环十肽，所述环十肽为短杆菌酪肽、短杆菌色肽（tryptocidine)、短杆菌苯丙肽 (phenycidine)或短杆菌肽S或其衍生物或其类似物，所述环十肽包括环（缬氨酸-X 1-亮 氨酸-D-苯丙氨酸-脯氨酸-X2-X3-X4-X 5-X6MSEQ ID NO: 1)或其衍生物或其类似物的氨基 酸序列，其中，其中X1是鸟氨酸或赖氨酸。
[0009] X2可以是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸；
[0010] X3可以是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、鸟氨酸或赖氨酸 的左旋体； toon] X4可以是天冬酰胺、谷酰胺或亮氨酸；
[0012] X5可以是谷氨酰胺，或缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的左旋体；以及
[0013] X6可以是酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸。
[0014] 所述环十肽可以是具有序列VX1LfPX7X8NQX 9(SEQ ID NO:2)的短杆菌酪肽或其类似 物或衍生物，其中：
[0015] X1 = O*!^
[0016] X7 = W 或 F ;
[0017] X8 = w 或 f;以及
[0018] X9 = Y、W*F。
[0019] 所述环十肽可以是具有环（缬氨酸-X1-亮氨酸-D-苯丙氨酸-脯氨酸-缬氨 酸-X 1-亮氨酸-D-苯丙氨酸-脯氨酸）的氨基酸序列的短杆菌肽S，或其衍生物或类似物。
[0020] 所述环十肽可以是短杆菌酪肽、短杆菌色肽、短杆菌苯丙肽或短杆菌肽S的衍生 物或类似物，并且具有一个或多个下列氨基酸被替换：
[0021] 缬氨酸残基可被亮氨酸或异亮氨酸残基替换；
[0022] 亮氨酸残基可被异亮氨酸或缬氨酸残基替换；
[0023] 脯氨酸残基可被羟脯氨酸残基替换；
[0024] 苯丙氨酸残基被色氨酸或酪氨酸残基替换；或者
[0025] 鸟氨酸残基可被赖氨酸或阳离子氨基酸替换；或类似物/衍生物。
[0026] 所述环十肽可以具有选自 SEQ ID NOS:6-21、SEQ ID NOS:22-37 或 SEQ ID N0S:38-59 中的任一个、SEQ ID N0S:60-75、SEQ ID N0S:76-91 或 SEQ ID N0S:92-113 中 的任一个、SEQ ID NOS: 114-129、SEQ ID NOS: 130-145、SEQ ID NOS: 146-161 或 SEQ ID NOS: 162-167中的任一个，或SEQ ID NOS: 168-177中的任一个的氨基酸。
[0027] 所述组合物可以包含两种或多种上述的环十肽。
[0028] 所述组合物还可以包含天然地生产所述环十肽的生物体。
[0029] 所述组合物可以是用于控制一种或多种以下真菌的生长的抗真菌组合物： Phaeoacremonium spp.(例如 Phaeoacremonium aleophilum)、拟莖点菌(Phomopsis viticola)、镰刀菌属（Fusarium spp.)(例如腐皮镰刀菌（Fusarium solani)、尖孢镰刀 菌（F.oxysporum)、拟轮生镰孢菌（F.verticilliodes))、柱孢霉属（例如 Cilidocarpon Iiriodendra)、灰霉菌（Botrytis cinerea)、踩节菌属（Talaromyces spp·)、曲霉菌属 (Aspergillus spp·)、青霉菌属（Penicillium spp·)、链核盘菌属（Monilinia spp·)、木霉 属(Trichoderma spp.)或Phaeomoniella spp. 〇
[0030] 所述组合物可以是抗细菌组合物。
[0031] 所述组合物可以能够治疗或预防青霉、褐腐病、绿霉、葡萄树枯萎和根腐病、乌脚 病、幼期葡萄树衰败或佩特里病。
[0032] 根据本发明的第二个【具体实施方式】，提供了用于预防或控制在植物、植物材料、植 物部分或在用于维持植物或植物材料的介质中的微生物生长的方法，所述方法包括向上述 植物、植物材料、植物部分或介质施用上述组合物的步骤。
[0033] 所述环十肽或环多肽的混合物或其类似物/衍生物可被化学改性从而改善溶解 性、生物有效性和/或生物活性和/或限制毒性。改性方法可以包括有机部分的氧化、羟基 化、酰化、酰胺化、偶联，羟基、羰基、羧基、氨基、甲基或糖/糖衍生物基团取代以及生物合 成改性。
[0034] 所述组合物可以被适当配制以提高活性、稳定性和/或生物有效性和/或限制毒 性。配方可以包含生物盐、脂类或脂类衍生物、多糖或多糖衍生物、糖类或糖类衍生物、生物 友好的或认可的GRAS添加剂。
[0035] 所述组合物还可以包括一种或多种其他的抗微生物或抗真菌化合物，其包括来自 动物、微生物或植物来源的天然多肽、脂肽类或抗生素，或以化学方法生产的杀生物剂或抗 生素。
[0036] 所述组合物可以包括一个或多个短杆菌酪肽和短杆菌肽S或其衍生物的组合。
[0037] 所述植物可以是胚胎的、幼期或成熟植物，并且可以是产水果的植物、产蔬菜的植 物、行栽作物、蔬菜作物、装饰植物、草或树。例如，所述植物可以是葡萄树、草莓植物、核果 类果树（例如李子、樱桃、桃、油桃、杏和扁桃）、苹果树、梨树、例如小麦等的谷物。
[0038] 所述植物材料或植物部分可以是植物插条、根、用于细胞培养的植物材料、外植 体、花、果实、蔬菜、种子或谷物。所述植物材料可以是干燥的植物材料，例如在干燥的动物 饲料中发现的。所述水果可以是易受灰霉菌和其它腐坏病原体影响、感染和腐坏的水果，例 如葡萄和草莓、多种浆果或樱桃以及无花果、梨、苹果、桃、杏或李子等木本果。所述蔬菜包 括地上和地下生长的所有种类的蔬菜。
[0039] 根据本发明的第三个【具体实施方式】，提供了一种改善植物生长或植物活力或延长 切花的寿命的方法，所述方法包括以下步骤：向植物、植物材料或生长介质或者向切花的花 瓶的水中施用上述组合物。

【专利附图】

【附图说明】
[0040] 图1 :在短杆菌肽S不存在（对照，左侧）以及当短杆菌肽S与A柱孢属（20mg/L 短杆菌肽 3)、13拟莖点霉（Phomopsis) (10mg/L 短杆菌肽 S)、C Phaeoacremonium(20mg/L 短 杆菌肽S)存在时（处理，右侧），孵育5天后的真菌生长发育。
[0041] 图2 :15mg/L的短杆菌肽S (GS)和短杆菌酪肽（Trc)混合物对挑选的葡萄树组织 培养植物的发育的作用。
[0042] 图3 :用于葡萄扦插灭菌的30mg/L的短杆菌肽S (GS)、短杆菌酪肽混合物（Tyr)以 及短杆菌酪肽/短杆菌肽S混合物对葡萄树植物发育的作用。
[0043] 图4 :在15天内花瓶水处理对迷你非洲雏菊（Gerbera ssp.)的水吸收（A)以及 花条件（B)的作用。对照仅包含自来水，那些具有如供应商所指定的剂量接收的商品，试验 花接收到35mg/L的短杆菌酪肽混合物、35mg/L短杆菌肽S (GS)或短杆菌肽S和短杆菌酪肽 混合物（每种包含35mg/L)。
[0044] 图5 :在5天内花瓶水处理对飞燕草花（Delphinium flowers)的瓶插寿命的影响， 4或5的花条件视为可用的花。对照仅包含自来水，那些具有如供应商所指定的剂量接收的 商品，肽试验包含25mg/L短杆菌酪肽混合物、25mg/L短杆菌肽S(GS)或短杆菌肽S和短杆 菌酪肽混合物（各包含25mg/L)。

【具体实施方式】
[0045] 本文描述了用于控制或预防微生物病原体（特别是真菌病原体）在植物、植物体 和植物材料上生长的组合物和方法。用于控制这些病原体的活性剂为短杆菌酪肽、短杆菌 色肽、短杆菌苯丙肽和/或短杆菌肽S，或其衍生物、类似物或改性物。
[0046] 采取相似的骨架构象/分子拓扑的所述短杆菌酪肽、短杆菌色肽、短杆菌苯丙肽 和短杆菌肽S是天然β_折叠环十肽的家族高度保守，并且具有高的序列一致性。它们是 由芽孢杆菌属和短芽孢杆菌属产生的。
[0047] Tyrocidines 和短杆菌肤 S 包含五肤序列 Val-Orn-Leu-D-Phe-Pro (SEQ ID Ν0:4)。该五肽部分在其阳离子残基上可以不同，对于短杆菌酪肽和短杆菌肽S两者来说， 其鸟氨酸残基都可被赖氨酸替代，对于短杆菌酪肽，其缬氨酸或亮氨酸残基也可被亮氨酸、 异亮氨酸或缬氨酸替代。
[0048] 短杆菌肽S具有高度保守序列，其为上述五肽单元的重复，即环（Val-Orn/ Lys-Leu-D-Phe-Pro) 2(SEQ ID NO: 3)。短杆菌酪肽包括其中3个芳香残基独立地可被色氨 酸、苯丙氨酸或酪氨酸取代的Phe-D-Phe-Asn-Gln-Tyr(SEQ ID N0:5)或其衍生物的可变化 的五肽部分，而不是重复五肽单元。
[0049] 短杆菌肽S和短杆菌酪肽之一（短杆菌酪肽A)的基本化学结构如下所示：
[0050]

【权利要求】
1. 一种用于预防或处理在植物、植物部分或植物材料上的微生物生长的植物抗微生 物组合物，所述组合物包括作为活性剂的环十肽，所述环十肽为短杆菌酪肽、短杆菌色肽、 短杆菌苯丙肽或短杆菌肽s或其衍生物或类似物，所述环十肽包括环（缬氨酸-Xr亮氨 酸-D-苯丙氨酸-脯氨酸-X 2-X3-X4-X5-X6)(SEQ ID N0:1)或其衍生物或类似物的氨基酸序 列，其中， Xi是鸟氨酸或赖氨酸。
2. 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于， χ2是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸； χ3是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、鸟氨酸或赖氨酸的左旋体； χ4是天冬酰胺、谷氨酰胺或亮氨酸； χ5是谷氨酰胺、或缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的左旋体；以及 χ6是酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸。
3. 根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述环十肽是短杆菌酪肽，并且具 有序列VXiLfPXANQXjSEQ ID N0:2)或其类似物或衍生物，其中： Xi = 0 或 K ; X7 = W 或 F ; X8 = w或f ;以及 X9 = Y、W 或 F。
4. 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述环十肽是短杆菌肽S，并且具有环 (缬氨酸-x「亮氨酸-D-苯丙氨酸-脯氨酸-缬氨酸-x「亮氨酸-D-苯丙氨酸-脯氨酸） (SEQ ID NO:3)的氨基酸序列。
5. 根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述环十肽是短杆菌酪肽、 短杆菌色肽、短杆菌苯丙肽或短杆菌肽S的衍生物或类似物，并且具有一个或多个下列氨 基酸替换： 缬氨酸残基被亮氨酸残基或异亮氨酸残基替换； 亮氨酸残基被异亮氨酸残基或缬氨酸残基替换； 脯氨酸残基被羟脯氨酸残基替换； 苯丙氨酸残基被色氨酸残基或酪氨酸残基替换；或者 鸟氨酸残基被赖氨酸或阳离子氨基酸替换；或类似物/衍生物。
6. 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述环十肽具有选自SEQ ID NOS:6-21、SEQ ID NOS:22-37 或 SEQ ID NOS:38-59 的任意一项的氨基酸。
7. 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述环十肽具有选自SEQ ID N0S:60-75、SEQ ID N0S:76-91 或 SEQ ID N0S:92-113 的任意一项的氨基酸。
8. 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述环十肽具有选自SEQ ID NOS: 114-129、SEQ ID NOS: 130-145、SEQ ID NOS: 146-161 或 SEQ ID NOS: 162-167 的任意 一项的氨基酸。
9. 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述环十肽具有选自SEQ ID NOS: 168-177的任意一项的氨基酸。
10. 根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其特征在于，其包含两种或多种所述环 十肽。
11. 根据权利要求1-10中任一项所述的组合物，其特征在于，其包含天然生产所述环 十肽的生物体。
12. 根据权利要求1-11中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物是抗真菌组 合物。
13. 根据权利要求1-12中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物能够控制 一种或多种选自由下列各项所组成的组中的真菌的生长：Phaeoacremonium spp.、拟莖 点菌、镰刀菌属、柱孢霉属、灰霉菌、踝节菌属、曲霉菌属、青霉菌属、链核盘菌属、木霉属和 Phaeomoniella spp. 〇
14. 根据权利要求1-11中任一项所述的组合物，其特征在于，所述的组合物是抗细菌 组合物。
15. 根据权利要求1-14中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物能够治疗或 预防青霉、褐腐病、绿霉、葡萄树枯萎和根腐病、乌脚病、幼期葡萄树衰败或佩特里病。
16. 根据权利要求1-15中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括一个或 多个短杆菌酪肽和短杆菌肽S或其衍生物的组合。
17. -种预防或控制在植物、植物材料、植物部分或在用于维持植物或植物材料的培养 基中的微生物生长的方法，所述方法包括向植物、植物材料、植物部分或培养基施用根据权 利要求1-16中任一项所述的组合物的步骤。
18. -种改善植物生长或植物活力或延长切花的寿命的方法，所述方法包括以下步骤： 向植物、植物材料、植物部分或生长培养基或者向用于切花的花瓶的水中施用根据权利要 求1-16中任一项所述的组合物。
【文档编号】C07K7/64GK104271592SQ201380021144
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2013年2月22日 优先权日:2012年2月22日
【发明者】玛丽娜·劳登巴赫, 阿布雷·德·比尔, 安斯查·马里·特洛斯凯, 约翰·阿诺德·沃斯卢 申请人:斯泰伦博什大学