环状缩肽合成酶及其基因、以及环状缩肽的大规模生产系统的制作方法

专利名称：环状缩肽合成酶及其基因、以及环状缩肽的大规模生产系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及环状缩肽合成酶及其基因、以及环状缩肽的大规模生产系统，更具体地说，本发明涉及具有驱虫活性的PF1022物质的合成酶及其基因、以及PF1022物质的大规模生产系统。
背景技术：
PF1022物质[环(D-乳酰基-L-N-甲基亮氨酰基-D-3-苯基乳酰基-L-N-甲基亮氨酰基-D-乳酰基-L-N-甲基亮氨酰基-D-3-苯基乳酰基-L-N-甲基亮氨酰基)]是由无孢目(Agonomycetales)的丝状真菌PF1022菌株(无孢菌类(Mycelia sterilia)，FERM BP-2671)产生的环状缩肽，该物质对动物寄生性线虫类有极强的驱虫活性(特开平3-35796号，Sasaki，T.，et al.J.Antibiotics.，45，692，(1992))。因此，该物质不仅可用作动物用的驱虫剂，还可作为原材料用于合成活性更高的该物质的衍生物。
通常，由天然分离的微生物所产生的次级代谢产物的量是微量的。因此，要将其用于生产，必须要提高次级代谢产物的产量。为了提高产量，进行了培养方法的研究、培养基成分的研究、添加前体物质的发酵条件的改良、以及利用紫外线照射或诱变剂进行诱变的菌株的改良。最近，除了以上方法以外，还有采用基因重组的手段来提高生产性能的方法。
作为采用基因重组的手段来提高生产性能的方法，例如增强生物合成途径中酶基因的表达、增强生物合成中调控基因的表达、阻断不必要的生物合成途径等(Khetan，A.and Hu，W.-S.Manual ofIndustrial Mocrobiology and Biotechnology 2nd edition，p.717，(1999))。此外，作为特殊的例子，以提高氧的利用能力为目的，已知有将血红蛋白基因在细菌中表达并提高生产性能的方法(Minas，W.et al，Biotechnol.Prog.，14，561，(1998))。
用基因重组的方法来提高生产性能时，最常用的方法是提高生物合成途径中酶基因的表达水平。为了适应这种方法，必须建立对象微生物的转化方法、存在可提高表达水平的启动子和终止子，还必须搞清楚其生物合成的途径、以及要分离出这些基因。对于PF1022物质生产菌，己成功地通过转化导入了外源基因(WO 97/00944号)，但其生物合成途径的基因尚未分离出来。
PF1022物质包括L-N-甲基亮氨酸、D-乳酸、以及D-苯基乳酸通过酯键或酰胺键结合的结构，在生产菌中由4个分子的L-亮氨酸、2个分子的D-乳酸、2个分子的D-苯基乳酸通过某种肽合成酶的作用合成。肽合成酶是以氨基酸或羟基酸为底物，合成肽、缩肽、脂肽、肽内酯等微生物次级代谢产物的生物合成酶，现已明确几种肽合成酶的序列(Marahiel，M.A.，et al.Chem.Rev.，97，2651，(1997))。由这种酶所催化的反应，与以mRNA为模板、由核糖体合成蛋白质的系统完全不同。其催化机理可能是，肽合成酶对于每种底物有1个结构域，每种底物在该结构域中由ATP活化，并通过结构域中的磷酸泛酸的介导而结合，最后，这些底物通过各个结构域间的区域的催化作用形成酰胺键或脂键。
发明的概述本发明的目的在于，提供合成环状缩肽、特别是PF1022物质的酶(以下，称为“环状缩肽合成酶”)。
本发明的第二个目的在于，提供编码环状缩肽合成酶的基因(以下，称为“环状缩肽合成酶基因”)。
本发明的第三个目的在于，提供表达环状缩肽合成酶的重组载体和转化体、以及环状缩肽的大规模生产系统及其制造方法。
本发明的第四个目的在于，提供环状缩肽合成酶的制造方法。
本发明的环状缩肽合成酶是含有选自下列序列构成的组的氨基酸序列的蛋白质。(a)序列号2的氨基酸序列，以及(b)序列号2的氨基酸序列的修饰氨基酸序列，该修饰序列具有1个以上选自置换、缺失、添加和插入的修饰，并具有环状缩肽合成酶活性。
本发明的环状缩肽合成酶基因包括编码环状缩肽合成酶的核苷酸序列。
并且，本发明的环状缩肽合成酶基因由选自下列序列构成的组的核苷酸序列构成。(c)序列号1的DNA序列，(d)与序列号1的DNA序列至少有70％的同源性，并编码具有环状缩肽合成酶活性的蛋白质的核苷酸序列，(e)序列号1的DNA序列的修饰DNA序列，该修饰序列具有1个以上选自置换、缺失、添加和插入的修饰，并编码具有环状缩肽合成酶活性的蛋白质，以及(f)在严格条件下与序列号1的DNA序列杂交，并编码具有环状缩肽合成酶活性的蛋白质的核苷酸序列。
本发明的重组载体是含有本发明的环状缩肽合成酶基因的载体。
本发明的转化体和环状缩肽的大规模生产系统是含有本发明的重组载体的宿主。
本发明的环状缩肽的制造方法包括培养本发明的转化体，并从培养物中提取环状缩肽的步骤。
本发明的环状缩肽合成酶的制造方法包括培养本发明的转化体，并从培养物中提取环状缩肽合成酶的步骤。
按照本发明，可在PF1022物质生产菌株中过表达环状缩肽合成酶，同时可大规模生产PF1022物质。
附图的简单说明


图1表示质粒pABP/PFsyn的构建方法。
图2表示含Abp1基因的6kb Hind III片段的限制性酶图谱。
图3表示pABPd的结构和限制性酶图谱。
图4表示由亲本株和导入pABP/PFsyn的基因导入株提取的蛋白质的电泳结果。
图5表示由亲本株和导入pABP/PFsynN的基因导入株提取的蛋白质的电泳结果。
发明详述微生物的保藏实施例1的1中所述的PF1022菌株委托通商产业省工业技术院生命工程工业技术研究所(日本国茨城县筑波市东1丁目1-3号)保藏，保藏日期为1989年1月24日，保藏编号为FERM BP-2671。
实施例2的1.(1)中所述的用质粒pPFsyn转化的大肠杆菌(DH5α)委托通商产业省工业技术院生命工程工业技术研究所(日本国茨城县筑波市东1丁目1-3号)保藏，保藏日期为1999年9月1日，保藏编号为FERM BP-7253。
实施例2的1.(1)中所述的用质粒pPFsynN转化的大肠杆菌(DH5α)委托通商产业省工业技术院生命工程工业技术研究所(日本国茨城县筑波市东1丁目1-3号)保藏，保藏日期为1999年9月1日，保藏编号为FERM BP-7254。基因和蛋白质本发明提供环状缩肽合成酶，优选提供PF1022物质合成酶及其基因。
本发明的酶可作用于4个分子的L-亮氨酸、2个分子的D-乳酸、以及2个分子的D-苯基乳酸，并合成PF1022物质。在本发明中，通过预先对D-乳酸、L-亮氨酸、以及D-苯基乳酸进行修饰，可制造PF1022物质的衍生物。
作为PF1022物质的衍生物，例如PF1022物中两个苯基的对位被氨基取代的物质。此时，作为PF1022物质的衍生物的合成底物，例如可用D-对氨基苯基乳酸替代D-苯基乳酸。
序列(b)中修饰的数目，例如可以是1～数个，更具体是1～6个。
序列(e)中修饰的数目，例如可以是1～数十个。
序列(b)和(e)中存在多个突变时，导入的突变种类可以相同，也可以不同。
序列(d)与序列号1的DNA序列的同源性可以优选至少为80％，更优选至少为90％，最优选至少为95％。
序列(f)中“严格条件”是指杂交后膜的洗涤操作在高温、低盐浓度中进行，例如洗涤条件为在0.2×SSC浓度(1×SSC15mM柠檬酸三钠、150mM氯化钠)、0.1％SDS溶液中，60℃洗涤15分钟。
就序列(b)是否“具有环状缩肽合成酶活性”，例如可用以下方法确认，即，将被测蛋白作用于环状缩肽的底物，然后用色谱法确认环状缩肽的生成。
就序列(d)、(e)和(f)是否“编码具有环状缩肽合成酶活性的蛋白质”，例如可用下述方法作出评价，如实施例2所述，在宿主中表达被测核苷酸序列，将所得的蛋白质作用于环状缩肽的底物，然后用色谱法确认环状缩肽的生成。
如果给出本发明合成酶的氨基酸序列，则很容易确定编码该氨基酸序列的核苷酸序列，序列号2中所示的氨基酸序列的各种编码核苷酸序列都可以选择。因此，编码本发明合成酶的核苷酸序列，除了序列号1所示的DNA序列的一部分或全部以外，也指有简并密码子的、编码同一氨基酸的DNA序列，还包括与这些DNA对应的RNA序列。
本发明的基因，例如可由以下方法获得。
从PF1022物质生产菌提取基因组DNA，用适当的限制性酶切断后，用噬菌体载体构建PF1022物质生产菌的基因组文库。以肽合成酶的氨基酸序列保守区，或以由PF1022物质生产菌提取并纯化的环状缩肽合成酶的部分氨基酸序列为基础，合成适当的引物，用此引物，以PF1022物质生产菌的基因组DNA为模板，通过PCR法扩增环状缩肽合成酶基因的DNA片段。用此片段作为探针，对基因组文库进行筛选。由此，可分离出环状缩肽合成酶的全长基因。测定该DNA片段的碱基序列后，在翻译起始密码子的上游和翻译终止密码子的下游通过PCR等方法导入适合的限制性酶切位点，即可得到只含环状缩肽合成酶基因的基因片段。重组载体本发明提供含有环状缩肽合成酶的编码核苷酸序列的重组载体。
本发明的重组载体可以采用基因工程领域中常用的程序和方法构建。
作为本发明中可以使用的载体，例如整合到宿主染色体DNA中的载体，或具有可自主复制的自主复制序列并以质粒的形式存在于宿主细胞内的载体，例如pUC系列(pUC18或pUC118等)、pBluescript系列(pBluescript II KS+等)、以及pBR322等质粒。宿主细胞内存在的基因拷贝数可以是1个拷贝，也可以是多个拷贝。
本发明的重组载体可通过下述方法构建，例如在编码环状缩肽合成酶的核苷酸序列上游或下分别按可操纵的方式连接启动子或终止子，并根据需要将基因筛选标记和/或其他的调控序列按可操纵的方式连接。
启动子和终止子与本发明的基因的连接，以及在作为表达单位的载体中的插入，均可按公知的方法进行。
对本发明所用的启动子和终止子无特殊的限制，例如3-磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、烯醇化酶等糖酵解系统酶基因的调控序列，鸟氨酸氨甲酰基转移酶、色氨酸合成酶等氨基酸合成系统酶基因的调控序列，淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、乙酰胺酶等水解酶基因的调控序列，硝酸盐还原酶、乳清酸核苷-5｀-磷酸脱氢酶、乙醇脱氢酶等氧化还原酶基因的调控序列，以及在PF1022物质生产菌株中高表达的来源于PF1022物质生产菌的Abp1等基因的调控序列。
本发明的基因也可与编码其他蛋白质翻译区的外源基因连接，以融合蛋白形式表达。
基因筛选标记的导入方法如下，例如通过PCR法将适当的限制性酶切位点导入调控序列，将该调控序列插入质粒载体后，再连接抗药性基因或营养缺陷型基因等筛选标记基因。
基因筛选标记可根据转化体的筛选方法适当地进行选择。例如可选用抗药性基因和营养缺陷型基因。作为抗药性基因，例如越霉素、苯菌灵、寡霉素、潮霉素、G418、博莱霉素、bialaphos、杀稻瘟菌素S、腐草霉素、phosphinothricin、氨苄青霉素、卡那霉素等药物的抗药性基因。作为营养缺陷型基因，例如amdS、pyrG、argB、trpC、niaD、TRP1、LEU2、URA3等基因。转化体和环状缩肽的制造本发明提供由上述载体转化的宿主。
本发明中所使用的宿主只要是能用于基因重组宿主的微生物，则无其他特殊的限制。作为可使用的宿主，例如任一细菌类或真菌类微生物，优选大肠杆菌、杆菌属细菌、放线菌、酵母、丝状真菌，更优选生产PF1022物质的丝状真菌，最优选PF1022菌株(无孢菌类，FERMBP-2671)。
将基因表达用重组载体导入宿主时，可以采用常规的方法。作为导入方法，例如电穿孔法、聚乙二醇法、土壤杆菌法、锂盐法或氯化钙法等，可根据宿主细胞选择有效的方法。使用PF1022物质生产菌作为宿主时，优选使用聚乙二醇法转化体的培养可选择合适的培养基和培养条件，并按常规方法进行。作为培养基使用惯用的成分，例如作为碳源可以使用葡萄糖、蔗糖、纤维素、麦芽糖、糊精、淀粉、甘油、糖蜜、动植物油等。另外，作为氮源可以使用大豆粉、小麦胚芽、药物介质(pharma media)、玉米浸渍液、棉子渣、牛肉汤、蛋白胨、聚胨、麦芽提取物、酵母提取物、硫酸铵、硝酸钠、尿素等。根据需要还可添加能够生成钠、钾、钙、镁、钴、氯、磷酸根、磷酸根以及其它离子的无机盐类，例如可添加氯化钾、碳酸钙、磷酸氢二钾、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸锌、硫酸锰、硫酸铜。另外，根据需要也可以添加硫胺素(硫胺素盐酸盐等)等各种维生素，谷氨酸(谷氨酸钠等)、天冬酰胺(DL-天冬酰胺等)等氨基酸，核苷酸等微量营养素，抗生素等筛选药物。另外，可以适当添加有助于菌体发育、促进环状缩肽生产的有机物和无机物。
培养方法可以采用需氧条件下的振荡培养法、通气搅拌培养法或深部需氧培养法，特别是深部需氧培养法最为适合。培养基的pH例如为pH6～pH8左右。培养的合适温度为15℃～40℃，但大多数场合是在26℃～37℃附近进行培养。环状缩肽合成酶和环状缩肽的生产根据培养基、培养条件或所用的宿主而异，但所有培养方法通常都是在2天～25天期间其蓄积量达到最高峰。
培养过程中，在环状缩肽合成酶或环状缩肽的蓄积量达到最高峰时停止培养，并从培养物中分离并纯化环状缩肽合成酶或环状缩肽。
从培养物中提取环状缩肽合成酶或环状缩肽时，可以根据其性质用常规的分离手段，例如溶剂萃取法、离子交换树脂法、吸附或分配柱色谱法、凝胶过滤法、透析法、沉淀法、结晶化法等，这些方法可以单独使用，或以适当的组合方式进行提取和纯化。
环状缩肽合成酶例如可以通过丁基琼脂糖等疏水性色谱有效地提取和纯化。
环状缩肽例如可以用丙酮、甲醇、丁醇、醋酸乙酯、醋酸丁酯等从培养物中萃取。环状缩肽也可通过硅胶、氧化铝等吸附剂，SephadexLH-20(Pharmacia公司)或者Toyopearl HW-40(Toso公司)等色谱进一步纯化。由上述方法，或将上述方法适当组合可得到纯净的环状缩肽。
本发明提供环状缩肽的大规模生产系统。作为环状缩肽的生产系统、特别是PF1022物质生产系统的宿主，优选生产PF1022物质的丝状真菌、最优选PF1022菌株(无孢菌类，FERM BP-2671)。作为转化所用的重组载体，优选的是将PF1022物质生产菌的功能调控序列(启动子、终止子等)按可操纵的方式与环状缩肽合成酶基因连接的表达载体，最优选的是将PF1022菌株(无孢菌类，FERM BP-2671)的功能调控序列按可操纵的方式与环状缩肽合成酶基因连接的表达载体。环状缩肽、特别是PF1022物质，优选通过以下方法制造。即，将PF1022物质生产菌的功能调控序列按可操纵的方式与环状缩肽合成酶基因连接，构建表达载体，培养由该表达载体转化的PF1022物质生产菌，并从培养物中分离出环状缩肽。
对于不能合成PF1022物质的底物L-亮氨酸、D-乳酸或D-苯基乳酸的宿主，通过添加缺乏的底物或底物的衍生物进行培养，则有可能生产出PF1022物质或PF1022物质的衍生物。
实施例以下结合实施例对本发明进行详细说明，但本发明不受这些实施例的限制。实施例1从PF1022物质生产菌克隆环状缩肽合成酶基因1.基因组DNA的分离及基因组文库的构建用UV照射或NTG处理PF1022菌株(无孢菌类，FERM BP-2671)，诱发其突变，从提高了PF1022生产性能的PF1022物质生产菌432-26株中提取基因组DNA。将PE1022物质生产菌432-26株在50ml种子培养基[1％酵母提取物、1％麦芽提取物、2％聚胨、2.5％葡萄糖、0.1％磷酸氢二钾、0.05％硫酸镁(pH7.0)]中，于26℃培养2天，然后通过离心分离回收菌体。将得到的菌体用液氮冷冻后，用研钵和研杵磨碎。用ISOPLANT(日本基因公司)，按生产商所提供的方案，由此磨碎的菌体分离基因组DNA。用Sau3AI将分离的基因组DNA部分酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳回收15kb-20kb的DNA片段，然后用碱性磷酸酶处理，使DNA片段末端脱磷酸化。将此DNA片段插入噬菌体载体的LambdaDASH II(Stratagene公司)。用Gigapack III Gold PackagingExtract(Stratagene公司)，按照生产商所提供的方案，对由此得到的重组噬菌体载体进行体外包装。然后，用此重组噬菌体载体感染大肠杆菌XL1-Blue MRA(P2)株，并在平板上培养，使其形成噬菌斑。2.环状缩肽合成酶基因部分DNA片段的分离对已知的肽合成酶进行多重序列比较，找出保守性较好的区域WTSMYDE(序列号3)和VVQYFPT(序列号4)。根据此序列，合成5′-TGGACIWSNATGTAYGAYGG-3′(序列号5)和5′-GTIGGRAARTAYTGIACNAC-3′(序列号6)的引物。用该引物对，以从PF1022物质生产菌分离的基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR的50μl反应液中有50ng的基因组DNA作为模板，有1.25U的ExTaq DNA聚合酶(宝酒造社)，随酶提供的缓冲液和dNTP混合物，以及10μM的引物。PCR反应条件反应为94℃ 3分钟，[94℃ 1分钟、65℃(每个循环下降0.5℃) 1分钟、72℃ 1分钟]×30次，72℃ 3分钟。由此反应扩增出约350bp的DNA片段，用Original TA克隆试剂盒(Invitrogen公司)，按照生产商所提供的方案，将扩增的DNA片段插入到pCR2.1质粒载体中。
用DNA Sequencing Kit dRhodamine Terminator CycleSequencing Ready Reaction(Applied Biosystems公司)和ABI PRISM310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems公司)，按生产商所提供的方案，测定按上述方法克隆的DNA片段的碱基序列。结果表明，分离的DNA的碱基序列与肽合成酶基因有同源性，明确了该片段是目的环状缩肽合成酶基因的一部分。3.环状缩肽合成酶全长基因的克隆通过PCR将荧光素标记的dUTP加入到DNA片段中，制备筛选基因组文库所用的探针。在50μl的PCR反应液中，以100ng插入环状缩肽合成酶基因DNA片段的pCR2.1质粒载体为模板，加入1.25U的ExTaqDNA聚合酶(宝酒造社)和随酶提供的缓冲液、0.2mM dATP、0.2mMdCTP、0.2mM dGTP、0.02mM dTTP、0.18mM荧光素标记的dUTP(FluoroGreen，Amersham Pharmacia Biotech公司)，以及10μM引物(序列号5和序列号6)。PCR反应条件为94℃ 2分钟，(94℃ 30秒、55℃ 1分钟、72℃ 1分钟)×25次，72℃ 3分钟。由此反应制备出约350bp荧光素标记的探针。
将Hybond-N+膜(Amersham Pharmacia Biotech公司)置于实施例1的1中制成的生成噬菌斑的平板上，使噬菌斑印迹在膜上。用碱处理该膜，使膜上的重组噬菌体DNA变性成为单链，并吸附在膜上。将吸附噬菌体DNA的膜放入用Hybridization Buffer Tablets(Amersham Pharmacia Biotech公司)调制的缓冲液中，60℃保温1小时。然后，将上述荧光素标记的探针热变性后加入到其中，60℃下杂交过夜。随后，将膜放入1×SSC(SSC15mM柠檬酸三钠、150mM氯化钠)-0.1％SDS溶液中，60℃下洗涤15分钟，再在0.2×SSC-0.1％SDS溶液中，于60℃洗涤15分钟。用DIG洗涤及封闭缓冲液(Boehringermannheim公司)、碱性磷酸酶标记的抗荧光素抗体(Anti-fluorescein-AP，Fab fragment，Boehringer mannheim公司)、生色底物氮蓝四唑氯(Boehringer mannheim公司)以及X-磷酸盐(Boehringer mannheim公司)，按照生产商提供的方案显象荧光素结合的噬菌斑。由此，筛选出含有与探针相同区域的5′上游区和3′下游区的阳性克隆。4.碱基序列的测定用噬菌体载体的序列5′-GCGGAATTAACCCTCACTAAAGGGAACGAA-3′(序列号7)和5′-GCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAAGAA-3′(序列号8)为引物，用PCR扩增上述分离的阳性克隆中的DNA片段。PCR的50μl的反应液中，以100ng阳性克隆DNA为模板，加入2.5U的LA Taq DNA聚合酶(宝酒造社)、随酶提供的缓冲液、dNTP混合物、2.5mM氯化镁以及0.2μM引物。PCR反应条件为94℃ 1分钟， (98℃ 10秒钟，68℃ 15分钟)×25次，72℃ 15分钟。纯化所得的PCR产物后，经喷雾处理，使其随机分解为0.5kb～2.0kb的片段。用T4 DNA聚合酶补平这些片段的末端，用T4多核苷酸激酶磷酸化后，插入到pT7Blue(Novagen公司)的EcoRV位点，然后导入大肠杆菌JM109株中。将所得的168个菌落用M13引物M4(宝酒造社)和M13引物RV(宝酒造社)直接进行PCR，产物纯化后，用M13引物M4(宝酒造社)为引物进行测序。PCR的50μl反应液中，加入1.25U的ExTaq DNA聚合酶(宝酒造社)、随酶提供的缓冲液、dNTP混合物以及0.5μM的引物。PCR反应条件为94℃ 4分钟，(94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 2分钟)×30次，72℃ 3分钟。此外，用DNA Sequencing Kit dRhodamineTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction(AppliedBiosystems公司)和ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(AppliedBiosystems公司)，按生产商所提供的方案进行测序。
对于所得的结果中解析不够充分的区域，以已解析的碱基序列为基础，重新设计引物进行PCR扩增，产物纯化后，用PCR所用的引物进行测序。由此，确定阳性克隆中DNA片段15606bp的碱基序列。
该序列的解析结果表明，序列中存在包括9633bp的开放阅读框架(ORF)，由此序列预测的蛋白质具有3210个氨基酸残基，分子量为354kDa，并与肽合成酶有同源性。此外，表现出最高同源性的蛋白质是恩镰孢素合成酶(S39842)，其同源性为56％。序列表的序列号1中示出由此分离的本发明环状缩肽合成酶基因ORF的碱基序列。另外，序列号2中示出其氨基酸序列。实施例2通过环状缩肽合成酶基因的过表达提高PF1022的生产性能1.基因表达用重组载体的构建(
图1)(1)环状缩肽合成酶基因区的克隆用NotI从实施例1的3中所得的阳性克隆中切出插入的DNA片段，插入到pBluescript II KS+(Stratagene公司)中的NotI位点，构建成质粒pPF7。用BanIII和SmaI消化pPF7，然后进行琼脂糖凝胶电泳，并从琼脂糖凝胶中回收约8250bp的DNA片段。将此片段插入pBluescript II KS+中，构建质粒pPF7-1。
以pPF7为模板，用5｀-AGCATCGGATCCTAACAATGGGCGTTGAGCAGCAAGCCCTA-3′(序列号9，按从ORF的N末端起第10位的Met开始翻译而设计)或5′-AGCATCGGATCCTAACAATGTCAAACATGGCACCACTCCCTA-3′(序列号11，按从ORF的N末端第1位的Met开始翻译而设计)和5′-TTTGCTTCGTACTCGGGTCCT-3′(序列号10)作为引物，通过PCR扩增从N末端附近至BanIII位点的约440bp(用序列号9和序列号10)或约470bp(用序列号11和序列号10)的片段。另外，用引物5′-GCATCGCGATACTAGAGAAG-3′(序列号12)和5′-AGCATCGAATTCGGATCCCTAAACCAACGCCAAAGCCCGAAT-3′(序列号13)扩增从SmaI位点至C末端的约920bp的片段。此时，上述PCR引物是按照在本发明的环状缩肽合成酶基因的5′端和3′端导入BamHI位点而设计的。PCR的50μl的反应液中，以150ng的质粒DNA为模板，加入2.5U的KOD DNA聚合酶(东洋纺织社)、随酶提供的缓冲液、dNTP混合物、1mM氯化镁以及0.5μM的引物。PCR反应条件为98℃ 30秒，(98℃ 15秒、65℃ 2秒、74℃ 30秒)×10次，74℃ 1分钟。用乙醇沉淀由各种引物所得的PCR反应液，回收PCR产物。用BmaHI和BanIII消化N末端区，用SmaI和BmaHI消化C末端区，然后进行琼脂糖凝胶电泳，并从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。
在pPF7-1的SmaI和BmaHI位点间插入上述C末端区的PCR片段，构建质粒pPF7-2。用BanIII和BmaHI消化该质粒后，进行琼脂糖凝胶电泳，并从琼脂糖凝胶中回收约9170bp的DNA片段。将此DNA片段、以及用序列号9和序列号10扩增的N末端区同时插入到pBluescriptII KS+的BmaHI位点，由此重构建本发明的环状缩肽合成酶基因，进而构建质粒pPFsyn(从ORF的N末端起第10位的Met开始翻译)。
另-方面，将从pPF7-2切出的约9170bp的DNA片段、以及用序列号9和序列号11扩增的N末端区同时插入到PHSG299(宝酒造社)的BamHI位点，由此重构建本发明的环状缩肽合成酶基因，进而构建质粒pPFsynN(从ORF的N末端起第1位的Met开始翻译)。由此，制备两端都有BamHI位点的环状缩肽合成酶基因。
用BamHI消化pPFsyn和pPFsynN后，分别从凝胶中回收环状缩肽合成酶基因区。(2)用Abp1基因的表达调控序列构建表达载体PF1022物质生产菌的基因组DNA分离PF1022物质生产菌(FERM BP-2671)的基因组DNA分离，按照文献(H.Horiuchi et al.，J.Bacteriol.，170，272-278，(1988))所述方法进行。具体方法是，首先将PF1022菌株(FERM BP-2671)在种子培养基(可溶性淀粉2.0％、葡萄糖1.0％、聚胨0.5％、小麦胚芽0.6％、酵母提取物0.3％、大豆饼0.2％以及碳酸钙0.2％，灭菌前pH为7.0；参照WO 97/00944号的实施例1)中培养2天，通过离心分离(3500rpm、10分钟)回收菌体。随后，将所得的菌体冷冻干燥后，悬浮于TE中，在3％SDS溶液中60℃处理30分钟后，用TE饱和酚萃取，除去菌体残渣。萃取液用乙醇沉淀后，用核糖核酸酶A(Sigma公司制)和蛋白酶K(和光纯药社制)处理，再用12％的聚乙二醇6000使核酸沉淀。将此沉淀用TE饱和酚萃取，用乙醇沉淀，将该沉淀溶于TE中，即得到基因组DNA。PF1022物质生产菌的基因组文库的构建将上述由PF1022物质生产菌制备的基因组DNA用Sau3AI部分消化。用T4连接酶(宝酒造社制连接试剂盒Ver.2)将此消化产物与噬菌体载体、λEMBL3克隆试剂盒(Stratagene公司)的BamHI臂连接。将此连接物用乙醇沉淀后，溶于TE中。用Gigapack III PlusPackaging试剂盒(Stratagene公司)将全部连接混合物感染大肠杆菌LE392株，形成噬菌体噬菌斑。由此方法得到的1.3×104个(2.6×104PFU/ml)噬菌体文库进行Abp1基因的克隆。由PF1022物质生产菌的基因组DNA克隆Abp1基因用PCR法扩增Abp1基因的翻译区，用作探针。以由上述PF1022物质生产菌制备的基因组DNA为模板，用由8-73U和8-73R组成的合成引物，用LETS GO PCR试剂盒(SAWADY Technology公司)进行PCR反应。PCR反应的条件为，以94℃30秒、50℃30秒、72℃90秒为一个循环，共反复操作25次进行扩增。8-73U和8-73R的DNA序列如下所示。8-73UCTCAAACCAGGAACTCTTTC(序列号14)8-73RGACATGTGGAAACCACATTTTG(序列号15)用ECL Direct System(Amersham Pharmacia Biotech公司制)标记上述所得的PCR产物。将上述制备的噬菌体噬菌斑印迹到HybondN+尼龙转移膜(Amersham PharmaciaBiotech公司制)上，碱变性后，用5倍浓度的SSC(SSC15mM柠檬酸三钠、150mM氯化钠)洗涤、干燥并固定DNA。按试剂盒附带方案所述的方法，预杂交1小时(42℃)后，加入预先标记的探针，杂交16小时(42℃)。按上述试剂盒附带方案所述的方法洗涤探针。将已洗涤探针的膜在检测溶液中浸渍1分钟后，置于医用X光片上感光，得到1个阳性克隆。该克隆的Southern分析结果表明，至少6kb的HindIII片段与基因组DNA的限制性酶切片段长度一致。该HindIII片段的限制性酶图谱如图2所示。将HindIII片段亚克隆到pUC119中(pRQHin/119)，供以后实验之用。表达载体的构建以pRQHin/119为模板，通过PCR法扩增Abp1基因的启动子区和终止子区。启动子的扩增用ABP-Neco和ABP-Nbam组成的引物，终止子的扩增用ABP-Cbam和ABP-Cxba组成的引物，用PCR Super Mix HighFidelity(Lifetech Oriental公司制)进行PCR反应。PCR反应的条件以94℃30秒、50℃30秒、72℃90秒为一个循环，反复操作25次进行扩增。ABP-Neco、ABP-Nbam、ABP-Cbam以及ABP-Cxba的DNA序列如下所示。ABP-NecoGGGGAATTCGTGGGTGGTGATATCATGGC(序列号16)ABP-NbamGGGGGATCCTTGATGGGTTTTGGG(序列号17)ABP-CbamGGGGGATCCTAAACTCCCATCTATAGC(序列号18)ABP-CxbaGGGTCTAGACGACTCATTGCAGTGAGTGG(序列号19)用Microspin S-400柱(Amersham Pharmacia Biotech公司制)将各种PCR产物纯化，用乙醇沉淀后，启动子用EcoRI和BamHI消化，终止子用BamHI和XbaI消化，并与用同样的酶消化的pBluescript IIKS+依次连接。将其用XbaI消化后，插入来源于pMKD01(WO 98/03667号)的越霉素抗性组件，构建pABPd(图3)。pABPd中具有Abp1基因的启动子和终止子。
将上述从凝胶中回收的环状缩肽合成酶基因区插入到pABPd中的BamHI位点，构建可使环状缩肽合成酶基因表达的表达载体pABP/PFsyn(从ORF的N末端起第10位的Met开始翻译)以及pABP/PFsynN(从ORF的N末端起第1位的Met开始翻译)。2.PF1022物质生产菌中环状缩肽合成酶基因的导入和表达按照WO 97/00944号的实施例1中所述方法，将表达载体导入PF1022菌株(无孢菌类，FERM BP-2671)中，之后筛选潮霉素B抗性高的菌株。确认这些菌株中是否导入了目的基因，可根据Abp1启动子设计引物5′-TGATATGCTGGAGCTTCCCT-3′(序列号20)和根据环状缩肽合成酶基因的序列设计引物5′-GCACAACCTCTTTCCAGGCT-3′(序列号21)，进行PCR反应来确认。由此，筛选潮霉素B抗性高的、导入了本发明环状缩肽合成酶基因的基因导入株。
将基因导入株和亲本株(无孢菌类，FERM BP-2671)分别在50ml的种子培养基中26℃培养2天后，每种培养液取1ml分别接种于50ml的生产培养基[6％麦芽糖、2.6％淀粉、2％小麦胚芽、1％药物介质(Pharmamedia)、0.2％硫酸镁7水合物、0.2％碳酸钙、0.3％氯化钠(pH7.5)]中，26℃下培养4天。培养液在4500rpm下离心5分钟，收集菌体，所得的每种菌体用0.3M氯化钾洗涤。用液氮将每种菌体分别冷冻后，进行冷冻干燥。
以下所述的抽提操作是在冰上或在4℃低温室内进行。将10mg冷冻干燥的菌体和1.0ml的玻璃珠(直径0.5mm)加入2ml的微型离心管内，然后添加1.0ml抽提缓冲液[50mM Tris-HCl(pH8.0)、0.3M氯化钾、60％甘油、10mM乙二胺四乙酸钠、5mM二硫苏糖醇、10μM亮肽素、1mM甲苯磺酸、60μg/ml糜蛋白酶]。将此微型离心管置于Mini-Bead-Beater-8(Biospeck公司)中，以最高速度转3分钟进行抽提。将此管在15000rpm离心5分钟后，将100μl的上清液加到100μl的三氯乙酸溶液中，并混合。放置15分钟以后，在15000rpm离心10分钟，将所得的沉淀溶于15μl的碱溶液(2％碳酸钠、0.4％氢氧化钠)中，并加入60μl的样品缓冲液(125mM Tris-HCl(pH6.8)、20％甘油、4％十二烷基硫酸钠、10％2-巯基乙醇、50mg/l溴酚蓝)。将其在沸水中加热5分钟后，通过电泳系统(Difco公司)，用4％～20％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳[十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)]。电泳后的聚丙烯酰胺凝胶用Quick-CBB(和光纯药社)，按生产商所提供的方案染色。由亲本株和导入pABP/PFsyn的基因导入株提取的蛋白质的电泳结果如图4所示。此外，由亲本株和导入pABP/PFsynN的基因导入株提取的蛋白质的电泳结果如图5所示。
由此可见，基因导入株的环状缩肽合成酶的表达量明显高于亲本株。3.PF1022物质的提取和定量将基因导入株和亲本株分别在50ml的种子培养基中，26℃培养2天后，每种培养液取1ml分别接种于50ml生产培养基中，于26℃培养6天。每种培养液取10ml，分别在3000rpm离心10分钟，分别收集菌体。在每种菌体中加入10ml甲醇，激烈振荡后静置30分钟。然后，再进行振荡，3000rpm离心10分钟后，将每种菌体提取液上清中的PF1022物质通过液相色谱分别进行定量。所用的柱为LiChrospher100 RP-18(e)(关东化学社)，柱的温度为40℃，流动相为80％的乙腈，流速为1.0ml/分钟，根据其在210nm的吸收检测PF1022物质。在此条件下，PF1022物质的保留时间为5分钟～6分钟。实验反复进行两次，由亲本株和导入pABP/PFsyn的基因导入株提取的PF1022物质定量结果的平均值如表1所示。
表1PF1022物质(μg/ml)亲本株 88基因导入株 222基因导入株的PF1022生产性能为亲本株的约2.5倍。这表明通过过表达本发明的环状缩肽合成酶，提高了PF1022物质的生产性能。
由亲本株和导入pABP/PFsynN的基因导入株提取的PF1022物质定量结果的平均值如表2所示。
表2PF1022物质(μg/ml)亲本株 29基因导入株1 123基因导入株2 136基因导入株3 172表2的结果表明，基因导入株的PF1022生产性能为亲本株的4.3～6.0倍。这表明通过过表达本发明的环状缩肽合成酶，提高了PF1022物质的生产性能。
序列表<110>明治制果株式会社(Meiji Seika Kaisha，Ltd)<120>环状缩肽合成酶及其基因、以及环状缩肽的大规模生产系统<130>127184<150>JP 253040/1999<151>1999-09-07<150>JP 104291/2000<151>2000-04-06<160>21<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>9633<212>DNA<213>无孢菌类(Mycelia sterilia)<220><221>CDS<222>(1)..(9633)<223>PF1022肽合成酶<220><221>成熟肽<222>(13)..(9630)<400>1atg tca aac atg gca cca ctc cct acg atg ggc gtt gag cag caa gcc 48Met Ser Asn Met Ala Pro Leu Pro Thr Met Gly Val Glu Gln Gln Ala-1 1 5 10cta tca ctt tca tgc ccc tta ctc cct cat gac gat gag aaa cac tca 96Leu Ser Leu Ser Cys Pro Leu Leu Pro His Asp Asp Glu Lys His Ser15 20 25gac aac ctt tac gag caa gca act cgg cac ttc ggc ttg agc cga gac 144Asp Asn Leu Tyr Glu Gln Ala Thr Arg His Phe Gly Leu Ser Arg Asp30 35 40aag atc gaa aat gtc tta cca tgt act tcc ttt caa tgt gat gtc ata 192Lys Ile Glu Asn Val Leu Pro Cys Thr Ser Phe Gln Cys Asp Val Ile45 50 55 60gat tgc gcc gtc gac gat cgg cgg cat gct atc ggt cac gtc gtc tat 240Asp Cys Ala Val Asp Asp Arg Arg His Ala Ile Gly His Val Val Tyr65 70 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权利要求
1.一种蛋白质，它含有选自下列序列构成的组的氨基酸序列，(a)序列号2的氨基酸序列，以及(b)序列号2的氨基酸序列的修饰氨基酸序列，该修饰序列具有1个以上选自置换、缺失、添加和插入的修饰，而且具有环状缩肽合成酶活性。
2.一种多核苷酸，它编码权利要求1所述的蛋白质。
3.权利要求2所述的多核苷酸，它包括序列号1的DNA序列。
4.一种多核苷酸，它选自下列序列构成的组，(c)序列号1的DNA序列，(d)与序列号1的DNA序列至少具有70％的同源性，而且编码具有环状缩肽合成酶活性的蛋白质的核苷酸序列，(e)序列号1的DNA序列的修饰DNA序列，该修饰序列具有1个以上选自置换、缺失、添加和插入的修饰，而且编码具有环状缩肽合成酶活性的蛋白质，(f)与序列号1的DNA序列在严格条件下杂交，而且编码具有环状缩肽合成酶活性的蛋白质的核苷酸序列。
5.权利要求4所述的多核苷酸，其中，(d)是与序列号1的DNA序列至少具有80％同源性的核苷酸序列。
6.权利要求4所述的多核苷酸，其中，(d)是与序列号1的DNA序列至少具有90％同源性的核苷酸序列。
7.一种重组载体，它含有权利要求2～6任一项所述的多核苷酸。
8.一种宿主，它含有权利要求7所述的重组载体。
9.权利要求8所述的宿主，它可表达环状缩肽合成酶。
10.权利要求8或9所述的宿主，该宿主为PF1022物质生产菌。
11.一种制造环状缩肽的方法，该方法包括培养权利要求8～10任一项所述的宿主，然后从培养物中提取环状缩肽的步骤。
12.权利要求11所述的制造方法，其中，环状缩肽是PF1022物质及其衍生物。
13.一种制造环状缩肽合成酶的方法，该方法包括培养 8～10任一项所述的宿主，然后从培养物中提取环状缩肽合成酶的步骤。
14.权利要求13所述的制造方法，其中，环状缩肽是PF1022物质及其衍生物。
全文摘要
本发明提供合成环状缩肽、特别是合成PF1022物质的酶及其基因。这种环状缩肽合成酶含有(a)序列号2的氨基酸序列;或(b)由上述氨基酸序列衍生的氨基酸序列,该序列经过了1个以上选自替换、缺失、添加和插入的修饰,并且具有环状缩肽合成酶活性。本发明的环状缩肽合成酶基因包括编码上述环状缩肽合成酶的核苷酸序列。进而,本发明还提供环状缩肽的大规模生产系统,以及制造环状缩肽合成酶的方法等。
文档编号C12P21/00GK1387566SQ00815301
公开日2002年12月25日 申请日期2000年9月7日 优先权日1999年9月7日
发明者御堂直树, 冈仓薰, 宫本功一, 渡边学, 矢内耕二, 安武哲也, 相原智, 二村孝文, 村上健, H·克莱恩考夫 申请人:明治制果株式会社