一种恩拉霉素的提纯方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于抗生素纯化领域，主要涉及一种恩拉霉素的提纯方法。
【背景技术】
[0002] 恩拉霉素（enramycin)又名恩来霉素、恩霉素、安来霉素、持久霉素，是由包括13 个不同种类的17个氨基酸分子和脂肪酸分子所组成的多肽类抗生素，其中氨基酸分子构 成环状多肽结构，脂肪酸位于多肽结构末端。根据其末端脂肪酸种类不同，分为恩拉霉素 A和恩拉霉素B，恩拉霉素主要是由这两种成分组成。恩拉霉素对革兰氏阳性菌有显著抑 菌作用，不易产生抗药性，能够改变肠道内的细菌菌落分布，有利于饲料营养成分的消化吸 收，具有很好的促生长效果。恩拉霉素盐酸盐为白色结晶粉末，易溶于二甲基亚砜、可溶于 甲醇、含水乙醇，难溶于丙酮，不溶于苯、氯仿。恩拉霉素盐酸盐对热、光照和潮湿有极好的 稳定性。
[0003] 中国专利CN101597578A公布了一种利用大孔树脂分离纯化恩拉霉素的方法，该 方法所获得的产品含量较低。中国专利CN102391363A公布的提纯方法其含量也低于90%。 为了提高恩拉霉素的含量，也出现多种方法联合使用纯化恩拉霉素的方法，利用大孔树脂 与反相制备色谱联合使用制备高含量恩拉霉素的方法（《大孔树脂吸附与反相色谱纯化恩 拉霉素》，《生物工程学报》，2014, 30 (11) : 1701-1708)，但该方法的缺陷在于成本高昂，步骤 繁琐，难于操作。
[0004] 因此，目前本领域需要提供一种成本低廉、操作简便、恩拉霉素含量高的恩拉霉素 的提纯方法。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种利用硅胶柱层析纯化获得恩拉 霉素的新方法，以克服现有恩拉霉素提纯工艺存在的一系列问题。
[0006]本发明的目的是通过如下技术解决方案实现的。
[0007]本发明提供了一种恩拉霉素的提纯方法，所述提纯方法包括：
[0008]利用盐酸调整甲醇与恩拉霉素闪蒸粉混合物的pH值至酸性获得恩拉霉素提取 液，再调整所述恩拉霉素提取液的pH值至中性，以柱层层析硅胶为分离介质，以石油醚、乙 酸乙酯、乙酸丁酯、甲醇、作为洗脱液依次洗脱去除杂质，再使用盐酸的甲醇溶液将恩拉霉 素洗脱获得含有恩拉霉素的洗脱液，将所述含有恩拉霉素的洗脱液的pH调整至中性后，旋 转蒸发干燥得到恩拉霉素。
[0009] 可选的，所述提纯方法包括以下步骤：
[0010] (1)将恩拉霉素与甲醇进行第一接触后获得混合物1，用盐酸的甲醇溶液调节混 合物1的pH至1. 0-4. 0后离心收集上清获得恩拉霉素提取液，调节所述恩拉霉素提取液的 pH至6. 5-8. 5后与柱层层析硅胶进行第二接触获得混合物2,将混合物2旋转蒸发干燥后 干法上柱获得娃I父柱；
[0011] (2)依次利用石油醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲醇作为洗脱液对步骤（1)获得的硅 胶柱进行洗脱，获得去除杂质后的硅胶柱；
[0012] (3)利用盐酸的甲醇溶液对去除杂质后的硅胶柱进行洗脱，收集获得含有恩拉霉 素的洗脱液；
[0013] (4)将所述含有恩拉霉素的洗脱液的pH值调节至6. 5-8. 5后进行旋转蒸发干燥。
[0014] 可选的，在所述步骤（1)中：调节混合物1的pH值至2-3. 5,调节所述恩拉霉素提 取液的pH至7-7. 5。
[0015] 可选的，所述盐酸的甲醇溶液中盐酸的浓度为0. 1-lmol/L。
[0016] 可选的，在步骤（1)和步骤（4)中，利用浓度为0. 1-lmol/L的氢氧化钠的甲醇溶 液或浓度为〇. 1-lmol/L的氢氧化钾的甲醇溶液对所述恩拉霉素提取液和所述含有恩拉霉 素的洗脱液的pH值进行调整。
[0017]可选的，在所述步骤（1)中，恩拉霉素提取液与柱层层析硅胶的混合比例为：以恩 拉霉素提取液中干物质的质量为基准，加入3-6倍质量的柱层层析硅胶。
[0018] 可选的，旋转蒸发干燥的温度控制在35-50°C。
[0019] 可选的，在步骤（2)中：在洗脱开始时采用石油醚作为第一杂质洗脱液，洗脱1-3 个柱体积；然后使用乙酸乙酯作为第二杂质洗脱液，洗脱1-3个柱体积；随后使用乙酸丁酯 作为第三杂质洗脱液，洗脱1-3个柱体积；最后使用甲醇作为第四杂质洗脱液，洗脱5-15个 柱体积。
[0020] 可选的，所述第一接触中，相对于100g的所述恩拉霉素闪蒸粉，甲醇的用量为 0.3-lL〇
[0021] 可选的，在步骤（3)中以盐酸的甲醇溶液对去除杂质后的硅胶柱进行洗脱，洗脱 3-10个柱体积。
[0022] 本发明根据恩拉霉素的理化性质及杂质情况，寻找到了适合恩拉霉素提纯的方 法。本发明所提供的方法可以有效去除杂质，克服现有恩拉霉素提纯方法的缺陷，实验证 明，应用本发明提供的方法制备恩拉霉素，其含量可以达到98%以上。
【具体实施方式】
[0023] 本发明提供了一种恩拉霉素的提纯方法，所述提纯方法包括：
[0024] 利用盐酸调整甲醇与恩拉霉素闪蒸粉混合物的pH值至酸性获得恩拉霉素提取 液，再调整所述恩拉霉素提取液的pH值至中性，以柱层层析硅胶为分离介质，以石油醚、乙 酸乙酯、乙酸丁酯、甲醇、作为洗脱液依次洗脱去除杂质，再使用盐酸的甲醇溶液将恩拉霉 素洗脱获得含有恩拉霉素的洗脱液，将所述含有恩拉霉素的洗脱液的pH调整至中性后， 旋转蒸发干燥得到恩拉霉素。
[0025] 其中，所述恩拉霉素闪蒸粉是将恩拉霉素发酵液直接进行闪蒸所得固体。闪蒸粉 中恩拉霉素的含量约为7-8% (质量）。
[0026] 在本发明所提供的方法中，本发明的提纯方法可以包括以下步骤：
[0027] (1)将恩拉霉素与甲醇进行第一接触后获得混合物1，用盐酸的甲醇溶液调节混 合物1的pH至1. 0-4. 0后离心收集上清获得恩拉霉素提取液，调节所述恩拉霉素提取液的 pH值至6.5-8. 5后与柱层层析硅胶进行第二接触获得混合物2,将混合物2旋转蒸发干燥 后干法上柱获得娃I父柱；
[0028] (2)依次利用石油醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲醇作为洗脱液对步骤⑴获得的硅 胶柱进行洗脱，获得去除杂质后的硅胶柱；
[0029] (3)利用盐酸的甲醇溶液对去除杂质后的硅胶柱进行洗脱，收集获得含有恩拉霉 素的洗脱液；
[0030] (4)将所述含有恩拉霉素的洗脱液的pH值调节至6. 5-8. 5后进行旋转蒸发干燥。
[0031] 可选的，在步骤（1)中：调节混合物1的pH值至2-3. 5,调节所述恩拉霉素提取液 的pH至 7-7. 5。
[0032] 在本发明所提供的方法中，所述盐酸的甲醇溶液中盐酸的浓度为0. 1-lmol/L。
[0033] 其中，在第一接触中，相对于100g的所述恩拉霉素闪蒸粉，甲醇的用量为0. 3-1L。
[0034] 在步骤⑴和步骤⑷中，利用浓度为0. 1-lmol/L的氢氧化钠的甲醇溶液或浓度 为0. 1-lmol/L的氢氧化钾的甲醇溶液对所述恩拉霉素提取液和所述含有恩拉霉素的洗脱 液的pH值进行调整。
[0035] 其中，所述步骤（1)中，恩拉霉素提取液与柱层层析硅胶的混合比例为：以恩拉霉 素提取液中干物质的质量为基准，加入3-6倍质量的柱层层析硅胶。
[0036] 其中，所述干物质的质量是通过以下方式测量得到的：先称量旋蒸瓶的质量，随后 利用该旋蒸瓶旋蒸中性恩拉霉素提取液，待不再有液体被蒸出时，称量此时旋蒸瓶的质量， 两个质量相减所得质量即为干物质质量。干物质呈粘稠状液体，含有恩拉霉素及大量杂质。
[0037] 在生产中，可以将所述干物质用适量甲醇复溶，超声振荡充分溶解，再加入层析硅 胶旋转蒸发干燥。
[0038] 可选的，所述柱层层析硅胶的规格为100目-300目。
[0039] 其中，在上柱时，与恩拉霉素提取液混合的柱层层析硅胶与硅胶柱中填充的柱层 层析硅胶之间的质量比为5:1-3:1。
[0040] 其中，所述旋转蒸发的温度为35-50°C。
[0041] 可选的，在步骤⑵中：
[0042] 包括利用极性大小不同的洗脱液依次洗脱以去除恩拉霉素提取液中的杂质。
[0043] 其中，在步骤（2)中，还包括在洗脱前利用石油醚对装填后的硅胶层析柱进行润 洗。
[0044] 所述洗脱液依次为石油醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲醇。
[0045] 在洗脱开始时采用石油醚作为第一杂质洗脱液，洗脱1-3个柱体积；然后使用乙 酸乙酯作为第二杂质洗脱液，洗脱1-3个柱体积；随后使用乙酸丁酯作为第三杂质洗脱液， 洗脱1-3个柱体积；最后使用甲醇作为第四杂质洗脱液，洗脱5-15个柱体积。优选地，在洗 脱过程中以高效液相色谱监测洗脱液中的恩拉霉素。
[0046] 在步骤（3)中以盐酸的甲醇溶液对去除杂质后的硅胶柱进行洗脱，洗脱3-10个柱 体积。优选地，在洗脱过程中以高效液相色谱监测洗脱液中的恩拉霉素。
[0047] 步骤（4)后收集到的含有恩拉霉素的洗脱液经调节pH值至中性后进行旋转蒸发， 得到固体恩拉霉素，随后将固体恩拉霉素水洗打浆，抽滤后将滤饼烘干得到高含量恩拉霉 素。
[0048] 可选的，所述步骤（4)中：将恩拉霉素洗脱液1的pH值调节至6. 5-8. 5,优选 为7-7. 5后进行旋转蒸发，旋转蒸发的温度为35-50°C。调节pH值使用的溶液为浓度为0. 1-lmol/L的氢氧化钠的甲醇溶液或者浓度为0.1-lmol/L的氢氧化钾的甲醇溶液。
[0049] 本发明所提供的方法中，对于接触的方式没有特别的限制，只要能够使得各组分 混合均匀即可。
[0050] 另一方面，本发明还提供通过上述提纯方法得到的恩拉霉素。所得到的恩拉霉素 含量达到98%以上。
[0051] 以下参照具体的实施例来说明本实验。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅 用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0052] 下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中的药材原 料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0053] 以下实施例中闪蒸粉由山东胜利生物工程有限公司提供，恩拉霉素含量为7-8%。
[0054] 实施例1
[0055] 将500g恩拉霉素闪蒸粉与1. 5L甲醇充分混合获得混合物，利用0.lmol/L盐酸的 甲醇溶液将混合物的pH至调节至1. 0,充分振荡，在3000rpm离心30min取得上清液制成恩 拉霉素提取液，利用0.lmol/L的氢氧化钠的甲醇溶液将提取液的pH调节至6. 5,其干物质 的质量约为50g(先称量旋蒸瓶的质量，随后利