lII双酶切得到片段7'。将质粒 PUC18/S用BsmI-Bglll进行双酶切得到两个片段，一个大片段为片段8,是质粒pUC18/Sac 的骨架部分，一个小片段是切下来的F基因。
[0056] 将三个片段6'、7'和8进行连接，最后得到质粒pUC18/S Λ F。此质粒相比质粒 pUC18/Sac缺少一段长度为1698bp的序列，这段缺失的序列正是F基因。
[0057] 以质粒pUC18/S Λ F中的Dra III片段替换质粒pSeV18中的Dra III片段，得到质粒 pSeV18 Δ F〇
[0058] 至此得到F基因缺失的仙台病毒cDNA克隆，将质粒pSeV18 Λ F进行包装，得到的 病毒就不能表达F蛋白，也不具有感染能力。
[0059] 实施例2
[0060] HIV gag基因克隆、改造及引入F基因缺失的仙台病毒载体 [0061] 1.采集河南艾滋病流行区HIV抗体阳性患者静脉血；
[0062] 2.采用Qiagen公司的QiaAmp Blood试剂盒从上述静脉血中提取细胞总DNA ;
[0063] 3.根据gag基因的共有序列，设计引物，以步骤2中的总DNA为模板，扩增gag基 因并连接pMD18_Teasy载体（购自Promega)，得到质粒pMD18-T_gag，转化DH5 α感受态细 胞（Promega)，涂平板，培养，挑取单克隆培养，提取质粒进行酶切鉴定；
[0064] 4.将步骤3中酶切鉴定正确的质粒测序，并将测序结果与B亚型标准株gag基因 进行序列比对，结果显示该基因具有B亚型的序列特征；
[0065] 5.根据密码子优化原则，在不改变氨基酸序列的前提下，对扩增的gag基因进行 序列改造，因为哺乳动物密码子第三位碱基为G/C含量高，所以，通过增加以G或C结尾的 密码子含量，使其在真核细胞中高效表达的可能性增加，对优化后的gag基因序列进行全 基因合成，获得改造后的gag基因，m. gag,并插入载体PUC57载体，得到质粒PUC57-m. gag, 测序；
[0066] 6.选择测序正确的质粒PUC57-m. gag,用限制性内切酶分别酶切重组仙台病毒 载体和PUC57-m. gag，连接获得缺失了 F基因的、表达HIV gag基因的重组仙台病毒载体， pSev-HIV-gag/ Λ F，其质粒图谱如图1所示。
[0067] 实施例3
[0068] 表达仙台病毒辅助蛋白质粒的构建
[0069] 3. 1表达仙台病毒ΝΡ蛋白的质粒pGEM-NP的构建：
[0070] 1.用限制性内切酶Notl/Xhol分别双酶切pSeV-TDK(来自DNADEC)和 pGEMl lZf (+)(购自Promega)，并连接含有编码NP蛋白的核苷酸序列到酶切后的 pGEMllZf(+)上；
[0071] 2.设计以下引物，以1步骤中得到的产物为模板，扩增编码NP蛋白的核苷酸序 列：
[0072] forward primer, 5' -CCGGAATTCAACAAATGGCCGGGTTGTTGAGCACCTTCGA-3' ；
[0073] reverse primer, 5' -CCGGAATTCCTAGATTCCTCCTATCCCAGCTACTGCTGCTCG-3' ；
[0074] 3.将PCR产物用EcoR I酶切，连接到载体pGEMl lZf (+)上，得到pGEM-NP质粒。
[0075] 3. 2表达仙台病毒P蛋白的质粒pGEM-P的构建：
[0076] 1.以SeVcDNA为模板，扩增编码P蛋白的基因，引物序列如下：
[0077] forward
[0078] primer, 5' -CTACTCGAGATGGATCAAGATGCCTTCATTCTAAAAGAAATTCTGAAGTAGAG-3' ；
[0079] reverse primer, 5' -CTAGCGGCCGCCTAGTTGGTCAGTGACTCTATGTCCTCTTCTACG-3' ；
[0080] 2.将步骤1的PCR产物用Xhol/Notl酶切，连接到pGEMllZf (+)上得到pGEM-P。 3. 3表达仙台病毒L蛋白的质粒pGEM-L的构建：
[0081] 1.使用 Quick Change TMSite-Directed Mutagenesis kit (购自 Τ0Υ0Β0),将 pGEMllZf (+)载体中的Apal酶切位点突变为Fsel酶切位点；
[0082] 2.分别用Fsel/Kpnl双酶切pSeV-TDK质粒和步骤1中的突变后的pGEMllZf(+) 载体，连接包含L蛋白的片段到突变后的pGEMllZf (+)载体上；
[0083] 3.为获得与SeV Z strain的L蛋白编码基因完全相同的序列，利用 TMSite-Directed突变试剂盒再次增加两处突变，得到pGEM-L。
[0084] 实施例4
[0085] 表达HIV Gag的重组仙台病毒的获得
[0086] 1.接种LLC-MK2/F (来自DNADEC)细胞到100mm培养皿中，5 X 106细胞/孔；
[0087] 2.培养24h后，室温下用表达T7 RNA聚合酶的辅助病毒VTF7-3病毒感染 LLC-MK2/F细胞，感染复数Μ0Ι为5，lh后，用无血清的DMEM(购自Promega)洗涤细胞2次；
[0088] 3.将已构建好的质粒pSeV-Gag/dF和构建好的其它3个质粒pGEM-NP、pGEM-P、 pGEM-L(可分别表达病毒NP、P、L蛋白）共转染LLC-MK2/F细胞；
[0089] 4.培养3h后，用无血清的DMEM洗涤细胞2次；
[0090] 5.换液后，继续培养24h后，去除上清液，用无血清的DMEM洗涤细胞2次；
[0091] 6.培养48h后，收集细胞，冻融3次；
[0092] 7.从冻融细胞提取物中提取RNP ;
[0093] 8.用步骤7中的RNP转染LLC-MK2/F细胞，106细胞/孔；
[0094] 9.培养5天后，从该细胞培养上清中收集重组病毒。
[0095] 实施例5
[0096] 5. 1反转录聚合酶链式反应（RT-PCR)验证重组仙台载体疫苗中gag基因
[0097] 1.接种LLC-MK2 (来自ATCC)细胞到六孔板中，2X 105细胞/孔，37°C，5% C02条 件下培养72h，细胞汇合度达到100% ;
[0098] 2. PBS液洗涤细胞3次，加入Μ0Ι = 5的重组仙台病毒，另一孔中加入Μ0Ι = 5的 仙台病毒作为负对照，37°C，5% C02条件下培养lh ;
[0099] 3.弃含病毒的上清液，PBS液洗涤细胞3次；
[0100] 4.重新加入DMEM细胞培养液到六孔板中，37°C，5% C02条件下培养48h ;
[0101] 5.采用Trizol (购自Promega)法提取感染细胞的总RNA ;
[0102] 6.用一步RT-PCR法验证重组仙台载体疫苗中gag基因。
[0103] 结果如图2所示，可看出，用重组仙台病毒感染LLC-MK2细胞后，提取总RNA，进行 RT-PCR，可扩增到800bp左右的DNA片段，而负对照中扩增不到此片段，说明HIV gag基因 正确构建到仙台病毒载体上。
[0104] 5. 2免疫印迹法（Western Blot)验证重组仙台载体疫苗中Gag蛋白的表达
[0105] 1.接种LLC-MK2 (来自ATCC)细胞到六孔板中，2X 105细胞/孔，37°C，5% C02条 件下培养72h，细胞汇合度达到100% ;
[0106] 2. PBS液洗涤细胞3次，加入Μ0Ι = 5的重组仙台病毒，另一孔中加入Μ0Ι = 5的 仙台病毒作为负对照，37°C，5% C02条件下培养lh ;
[0107] 3.弃含病毒的上清液，PBS液洗涤细胞3次；
[0108] 4.重新加入DMEM细胞培养液到六孔板中，37°C，5% C02条件下培养48h ;
[0109] 5.收集细胞，用细胞裂解液裂解，经SDS-PAGE，转膜。然后用抗HIV P24蛋白（此蛋 白为Gag蛋白中的保守区域）兔血清（购自Promega)作为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG (购 自Promega)作为二抗，检测Gag蛋白的表达。
[0110] 实验结果如图2所示，可见：用重组仙台病毒感染LLC-MK2细胞后，裂解细胞，进行 Western Blot，可检测到55KDa大小的条带，即Gag蛋白；而负对照仙台病毒感染细胞检测 不到55KDa大小的条带