，因此，重组仙台载体疫苗中的gag基因可正确表达。
[0111] 实施例6
[0112] 重组仙台病毒疫苗免疫效果实验
[0113] 6. 1.细胞内细胞因子染色法（ICS)检测免疫小鼠中HIV gag特异性细胞免疫反应
[0114] 6. 1.1小鼠免疫实验：
[0115] 取20只雌性BALB/c小鼠，4-6周龄，体重约18-25克，随机分为4组，每组5只。 以不同剂量的重组仙台病毒疫苗进行单独免疫。将重组仙台病毒疫苗稀释至l〇 7PFU/ml、 10sPFU/ml和109PFU/ml/，单侧胫前肌注射，每次100μ 1，对照组注射相同体积的无菌PBS。
[0116] 6. 1. 2细胞内细胞因子染色法（ICS)
[0117] 初次免疫后6周，处死免疫后的小鼠，分离小鼠脾淋巴细胞，用ICS检测CD8和 IFN- γ双阳性的T淋巴细胞，具体步骤如下：
[0118] 1.各取2X 106小鼠脾淋巴细胞重悬于1ml含10% FBS的1640培养液。
[0119] 2.每个实验孔加入终浓度为10 μ g/ml的3条Gag特异性多肽（PI :AMQMLKETI，P2 : TTSTLQEQI，P3 :EPFRDYVDRF)，于培养箱中刺激培养。其中，阴性对照为不加 Gag特异性多 肽，阳性对照不加多肽，加入终浓度为25ng/ml的佛波酯（PMA)和终浓度为1 μ g/ml的离子 霉素（lonomycin) 〇
[0120] 3.培养3h后，加入终浓度为5ng/ml的蛋白质运输抑制物布雷菲尔德菌素 A(Brefeldin A)
[0121] 4.收集细胞，离心，弃上清，以lml含1%FCS的PBS洗涤细胞，离心，弃上清，沉淀 以20 μ 1含1 % FCS的PBS重悬，各加5 μ 1 PE标记的大鼠抗小鼠 CD8a (Ly-2)单抗，室温避 光染色lh ;
[0122] 5.以lml含1%FCS的PBS洗涤细胞，离心，细胞沉淀中各加500 μ 1 0.15%皂素 室温穿膜15min ;
[0123] 6.以lml含1%FCS的PBS洗涤细胞，离心，弃上清，各加 ΙμL FITC标记的大鼠 抗小鼠 IFN-γ单抗，室温避光染色lh ;
[0124] 7.以lml含1%FCS的PBS洗涤细胞，离心，弃上清，各加入800μ1含1%FCS的 PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测。
[0125] 经重组仙台载体疫苗免疫后的小鼠的检测结果如图4所示。
[0126] 从图4看出：106 PFU的重组仙台载体疫苗单独免疫小鼠后，即可检测到较高水平 的HIV Gag特异性、分泌IFN-γ的⑶8+T细胞。这表明：本发明的重组仙台载体疫苗能激 发很强的细胞免疫反应，并且呈剂量依赖性。
[0127] 6. 2体外细胞实验检测
[0128] 用重组仙台载体疫苗刺激艾滋病人的外周血单个核细胞（PBMC)，疫苗感染后的 PBMC表达递呈HIV抗原作为刺激细胞实验，抗原激活艾滋病人的PBMC中的HIV特异性T细 胞分泌IFN-γ等细胞因子。本研究通过使用酶联免疫斑点法（ELISPOT)技术检测针对重 组仙台载体疫苗特异性反应的Τ细胞频数定量。
[0129] 6. 2. 1 HIV 感染者 PBMC 分离：
[0130] 1.采集新鲜抗凝血；
[0131] 2.转移新鲜抗凝血于离心管中，离心，吸取血浆分装冻存；
[0132] 3.剩余血液转移至离心管中，用Hans液稀释全血，混匀；
[0133] 4.在另一个新离心管中加入15ml淋巴细胞分离液，在分离液上加入30ml稀释全 血,离心；
[0134] 5.弃上层液体，保留PBMC层，吸出PBMC ;
[0135] 6. Hanks液洗涤PBMC，混匀，离心；
[0136] 7.弃上清，再加入Hanks液洗涤细胞，离心；
[0137] 8.弃上清，加入10ml新鲜培养液，混匀细胞，并吸取100 μ 1细胞悬液进行细胞计 数。
[0138] 6. 22. 2 ELISP0T 实验
[0139] 用重组仙台载体疫苗以无血清方式感染2X105PBMC，设置Sev、Gag肽库为对照，检 测27个HIV感染者的PBMC中的HIV特异性T细胞分泌IFN- γ的能力。
[0140] 1.在ELISP0T平板中加入包被抗体，置于4°C冰箱中封闭过夜；
[0141] 2.弃包被抗体，每孔加入10%胎牛血清的RPMI 1640(购自Gibco)培养基清洗，放 置 2min ;
[0142] 3.弃培养基，用PBS清洗1次；
[0143] 4.每孔中加入4 X 105PBMC细胞悬液，并设置1-7个孔，1号孔不加外源刺激，作为 负对照，2号和3号孔均加入20CIU Sev，4号和5号孔均加入20CIU重组仙台载体疫苗，6 号孔加入Gag肽库1 (终浓度4 μ g/ml，上海市公共卫生临床中心提供），7号孔加入Gag肽 库2 (终浓度4 μ g/ml，上海市公共卫生临床中心提供），然后置于37°C，5% C02培养28h ;
[0144] 5.每孔用 200 μ 1PBST 清洗 3 次；
[0145] 6.弃PBST，加入检测抗体，室温放置2h ;
[0146] 7.弃抗体液，加入PBST清洗3次
[0147] 8.弃PBST，加入亲和素-HRP，室温放置lh ;
[0148] 9.弃亲和素-HRP，用PBST清洗3次；弃PBST，用PBS清洗3次；
[0149] 10.弃PBS，加入显色液显色，室温避光放置10_30min，观察斑点形成；
[0150] 11.斑点形成后，加去离子水冲洗终止酶联反应；
[0151] 12.室温干燥过夜；
[0152] 13.用ELISP0T读数仪，读取数据。
[0153] 表1不同病毒和肽库的ELI SPOT反应强度
[0154]
[0155]
[0156] Sev、重组仙台载体疫苗、Gag肽库1和Gag肽库2的ELI SPOT的反应强度中位数 分别为2. 5、172. 5、145和185,用Wilcoxon Signed Ranks Test检验比较重组仙台载体疫 苗和Sev、重组载体疫苗和Gag肽库1、重组载体疫苗和Gag肽库2反应强度的差异，P值分 别为P < 0. 001，P = 0. 487, P = 0333。重组载体疫苗和Sev的反应强度差异具有统计学 意义。重组载体疫苗激活本实验中27份样本PBMC的IFN- γ分泌强度高于对照Sev的反 应强度。
[0157] 因此，体外检测重组仙台载体疫苗能够激活现有艾滋病PBMC中的HIV特异性T细 胞分泌INF- γ，可较好地活化HIV特异性CTL。
【主权项】
1. 一种表达HIV抗原的重组载体疫苗，其包含改造后的仙台病毒作为载体。2. 权利要求1所述的重组载体疫苗，所述改造后的仙台病毒为F基因缺陷型仙台病毒。3. 权利要求1或2所述的重组载体疫苗，所述HIV抗原为HIVGag。4. 权利要求3所述的重组载体疫苗，其中编码HIVGag的多核苷酸来源于中国河南 HIV-1流行区感染者。5. 权利要求4所述的重组载体疫苗，其中编码HIVGag的多核苷酸来源于B亚型毒株。6. 权利要求5所述的重组载体疫苗，其中编码HIVGag的多核苷酸为改造后的HIVgag 基因。7. 权利要求6所述的重组载体疫苗，其中改造后的HIVgag基因能够不依赖于调节蛋 白Rev在真核细胞中有效表达。8. -种重组载体疫苗构建方法，其特征在于，包括：提供F基因缺陷型仙台病毒载体、 HIVgag基因，连接获得重组仙台病毒载体；重组仙台病毒载体与表达仙台病毒辅助蛋白的 质粒共转染LLC-MK2/F获得重组载体疫苗。9. 权利要求1所述重组载体疫苗在治疗艾滋病中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种表达HIVGag的重组仙台载体疫苗及其构建方法和用途。所述疫苗是基于F基因缺陷型仙台病毒载体而构建。表达HIVGag的多核苷酸经过适当的修饰和改造，使其可以在真核细胞中高表达且不依赖于调节蛋白Rev。试验结果显示：该重组载体疫苗能够正确表达HIVGag，且可有效地诱导体内和体外细胞免疫。
【IPC分类】A61P31/18, A61K48/00, C12N15/86, A61K39/21
【公开号】CN105441482
【申请号】CN201410508505
【发明人】张锋, 杨延新, 王明晓
【申请人】石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2014年9月28日