专利名称：腺苷脱氨酶诊断试剂盒及腺苷脱氨酶活性测定方法
技术领域：
本发明涉及一种腺苷脱氨酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定腺苷脱氨酶活性的方法，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
医学研究表明，腺苷脱氨酶是一种与机体细胞免疫活性有重要关系的核酸代谢酶。因此，腺苷脱氨酶活性的测定被作为良恶性胸腹水，脑脊液鉴别诊断，重症联合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病鉴别的重要诊断标志。
腺苷脱氨酶的活性测定方法主要有放射核素法、物理方法和生化法。据申请人了解，目前国际上普遍采用紫外光法，其测定原理是腺苷(白色结晶粉末)+水(H2O)腺苷脱氨酶肌苷(Inosine)+氨离子(NH4+)，此反映过程生成的肌苷会在波长为265nm处显现，因此可以通过测定此波长处吸光度的大小直接反映腺苷脱氨酶活性的大小。然而，此方法无法用一般医院的可见光分析仪测定，而需要使用专门的紫外光分析仪，因此难以切实推广应用。
检索发现，申请号为03128092.7、申请日为2003.05.29、名称为《一种测定腺苷脱氨酶的试剂及其制法》的中国专利申请公开了应用酶反应产物氧化型烟酰氨辅酶配制的测定试剂。该发明所指的酶法测定试剂并不加入测定反应所需的还原型烟酰氨辅酶或其类似物，而加入其反应产物氧化型烟酰氨辅酶或其类似物，及其相应的生成还原型辅酶所需的酶和底物系统，通过在试剂内形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反应系统，将这类氧化型辅酶或其类似物缓慢循环还原为还原型烟酰氨辅酶或其类似物，当被还原的还原型烟酰氨辅酶或其类似物达到一定的浓度时，该发明所指的酶法试剂就可达到测定样本中腺苷脱氨酶及其同工酶活力的目的。该发明的特点在于为腺苷脱氨酶的测试提供一个内源合成腺苷脱氨酶反应所需要的还原型烟酰氨辅酶的腺苷脱氨酶试剂。其缺点之一为，这个系统在生成反应所需要的还原型烟酰氨辅酶的同时，也抵消了部分腺苷脱氨酶试剂(腺苷脱氨酶偶联谷氨酸脱氢酶反应必定将还原型烟酰氨辅酶氧化成氧化型烟酰氨辅酶)的活性，造成试剂测试的准确性大大降低。其缺点之二是，该试剂在正式测试前必须事先反应一段时间，以便能够产生足够的还原型烟酰氨辅酶，这样一来就造成了缓不济急的结果，给测试带来很大的不便。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种可以克服以上现有技术缺点的腺苷脱氨酶诊断试剂盒，采用该试剂盒中的试剂不仅可以在可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪上进行腺苷脱氨酶活性测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明的腺苷脱氨酶诊断试剂盒可以是单剂，包括缓冲液40——200mmol/l2-酮戊二酸酯 1——50mmol/l还原型辅酶0.15——0.3mmo/l谷氨酸脱氢酶 5000——500000U/l腺苷 0.5——50mmol/l通常腺苷为白色结晶粉末，还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH，2-酮戊二酸酯(即2-Ketoglutarate)，谷氨酸脱氢酶(即GLDH/Glutamate Dehydragenase)，缓冲剂可以是三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸(Tris-HCl)缓冲液或磷酸盐(Phosphate)缓冲液等。
也可以将以上单剂量分成如下双剂，更有利于消除内外源氨污染试剂I缓冲液 40——200mmol/l2-酮戊二酸酯 1——50mmol/l还原型辅酶 0.15——0.3mmo/l谷氨酸脱氢酶 5000——500000U/l试剂II缓冲液 40——200mmol/l腺苷 0.5——50mmol/l双剂也可以如下配制试剂I缓冲液 40——200mmol/l2-酮戊二酸酯 1——50mmol/l还原型辅酶 0.15——0.3mmo/l试剂II缓冲液 40——200mmol/l谷氨酸脱氢酶 5000——500000U/l腺苷 0.5-——50mmol/l此外，为了减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂或双剂的试剂I或试剂II中通常加入稳定剂10——50mmol/l，稳定剂可以是硫酸铵、甘油、腺苷二磷酸等中的一种或一种以上。
本发明测定腺苷脱氨酶活性的方法包括如下步骤
1)、将样品与试剂按体积1/10到1/250的比例混合，使之发生以下反应腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子氨离子+2-酮戊二酸酯+还原型辅酶或其衍生物谷氨酸脱氢酶谷氨酸+辅酶+水2)、将最终反应物置于可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出腺苷脱氨酶的活性大小。
以上过程的测定温度控制在常规的20℃到50℃范围，反应时间控制在常规的2-30分钟。这种方法应用腺苷脱氨酶偶联谷氨酸脱氢酶反应连续监测法。腺苷脱氨酶酶解腺苷反应产生氨离子，再通过偶联谷氨酸脱氢酶的作用，将还原型辅酶(NADH、NADPH或其它类似物——在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(NAD+、NADP+或其它类似物——在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算腺苷脱氨酶的活性大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方便综合考虑，无论是单剂还是双剂，如下成分关系的本发明腺苷脱氨酶诊断试剂盒较为理想缓冲夜 80——120mmol/l2-酮戊二酸酯3——10mmol/l还原型辅酶 0.2——0.3mmo/l谷氨酸脱氢酶100000——200000U/l腺苷1——5mmol/l由于本发明无需通过反应生成还原型辅酶，不会抵消腺苷脱氨酶试剂的活性，因此可以保证具有较高的测试准确性，同时显然可以缩短了测试时间，更便于推广应用。
此外，本发明的显著特色之一是可以消除内、外源氨的污染，消除内、外源氨的作用发生在整个反应时间段的前半部分，在后半段时间受污染的内、外源氨已经被消耗殆尽，而在后半段时间测试腺苷脱氨酶活性所需要的氨都是产生于腺苷脱氨酶的活性。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂盒包括试剂I磷酸盐缓冲液100mmol/l2-酮戊二酸酯10mmol/l还原型辅酶 0.2mmo/l谷氨酸脱氢酶200000U/l稳定剂 20mmol/l试剂II磷酸盐缓冲液100mmol/l腺苷2mmol/l在全自动生化分析仪1上设定温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度小于1.8，测试主波长340mn，测试副波长450mn，被测腺苷脱氨酶样品与双试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-4180。
加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子氨离子+2-酮戊二酸酯的+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+辅酶+水将最终反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性大小。
实施例二本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂有试剂I三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 180mmol/l2-酮戊二酸酯40mmol/l还原型辅酶 0.25mmo/l谷氨酸脱氢酶400000U/l稳定剂 20mmol/l试剂II三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 180mmol/l腺苷40mmol/l测定腺苷脱氨酶活性时，温度控制在37℃，反应时间10分钟，起始吸光度小于1.7，测试主波长340mn，测试副波长450mn，被测腺苷脱氨酶样品与试剂的比例约为4/50，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-2170。
具体测定步骤为1、腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子2、氨离子+2-酮戊二酸酯的+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+辅酶+水3，将最终反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性大小。
各反应步骤的反应时间控制在10分钟。
实施例三本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂为单试剂，有三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 50mmol/l2-酮戊二酸酯5mmol/l还原型辅酶 0.25mmo/l谷氨酸脱氢酶10000U/l腺苷3mmol/l稳定剂 20mmol/l测定腺苷脱氨酶活性时，温度控制在37℃，反应时间10分钟，起始吸光度小于1.7，测试主波长340mn，测试副波长450mn，被测腺苷脱氨酶样品与试剂的比例约为1/12.5，反应方向为负反应，延迟时间5分钟，检测时间2分钟，理论K值-2170。
具体测定步骤为1、腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子2、氨离子+2-酮戊二酸酯的+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+辅酶+水3，将最终反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性大小。
各反应步骤的反应时间控制在10分钟。
实施例四本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂有试剂I三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 120mmol/l2-酮戊二酸酯20mmol/l
还原型辅酶 0.25mmo/l试剂II三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 120mmol/l谷氨酸脱氢酶400000U/l腺苷25mmol/l稳定剂 20mmol/l在生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度小于1.8，测试主波长340mn，测试副波长450mn，被测腺苷脱氨酶样品与双试剂的体积比例为2/25，反应方向为负反应，延迟时间3.5分钟，检测时间1.5分钟，理论K值-2170。
加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子氨离子+2-酮戊二酸酯的+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+辅酶+水将最终反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性大小。
实验证明，采用技术方案范围中的其它配比关系均能达到所需的测定效果。并且，烟酰氨腺嘌呤二核苷酸磷酸(氧化型)-依赖型(NADP-依赖型)谷氨酸脱氢酶比烟酰氨腺嘌呤二核苷酸(氧化型)-依赖型谷氨酸脱氢酶(NAD-依赖型)在反应中的速度和稳定性都更好，采用还原型烟酰氨腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)偶联反应连续监测，会使得反应更稳定、可靠、灵敏，并且步骤简单，便于操作，也更易于推广应用。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。
权利要求
1.一种腺苷脱氨酶诊断试剂盒，包括缓冲液 40——200mmol/l2-酮戊二酸酯 1——50mmol/l还原型辅酶 0.15——0.3mmo/l谷氨酸脱氢酶 5000——500000U/l腺苷 0.5——50mmol/l
2.根据权利要求1所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、2-酮戊二酸酯、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶、腺苷组成单剂。
3.根据权利要求1所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、2-酮戊二酸酯、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶组成试剂I，由缓冲液、腺苷组成试剂II。
4.根据权利要求1所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、2-酮戊二酸酯、还原型辅酶组成试剂I，由缓冲液、谷氨酸脱氢酶、腺苷组成试剂II。
5.根据权利要求2、3或4所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于还包括稳定剂10——50mmol/l。
6.根据权利要求5所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于其中缓冲液 80——120mmol/l2-酮戊二酸酯3——10mmol/l还原型辅酶 0.2——0.3mmo/l谷氨酸脱氢酶100000——200000U/l腺苷 1——5mmol/l
7.根据权利要求5所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于所述缓冲剂为三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸、磷酸盐中的一种，所述稳定剂为硫酸铵、甘油、腺苷二磷酸中的至少一种。
8.根据权利要求1所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒测定腺苷脱氨酶活性的方法，包括如下步骤1)、将样品与试剂按体积1/10到1/250的比例混合，使之发生以下反应腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子氨离子+2-酮戊二酸酯+还原型烟酰氨辅酶或其衍生物谷氨酸脱氢酶谷氨酸+辅酶+水2)、将最终反应物置于可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出腺苷脱氨酶的活性大小。
9.根据权利要求8所述测定腺苷脱氨酶活性的方法，其特征在于温度控制在20℃到50℃范围，反应时间控制在2-30分钟。
全文摘要
本发明涉及一种腺苷脱氨酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定腺苷脱氨酶活性的方法，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒包括缓冲液、2－酮戊二酸酯、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶、腺苷，通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生还原型酶偶联反应，再将最终反应物置于可见光分析仪下，检测主波长或副波长吸光度下降的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性大小。采用本发明完全可以通过可见光分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。
文档编号C12Q1/25GK1641041SQ200410014929
公开日2005年7月20日 申请日期2004年5月18日 优先权日2004年5月18日
发明者王尔中 申请人:王尔中