一种用于宫颈上皮内瘤变分级辅助诊断的双染试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于免疫组织化学领域，具体涉及一种用于宫颈上皮内瘤变分级辅助诊断的双染试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002]宫颈癌是常见的女性恶性肿瘤，又是目前已知惟一可以预防的癌症，国际上宫颈癌预防性疫苗，已经上市，若在癌变前或早期发现，宫颈癌治愈率高。宫颈癌的发生发展是一个漫长的渐变过程，存在一个较长、可逆的癌前病变期，从宫颈上皮内瘤变(cervicalintraepithelial neoplasia，CIN)发展到癌大约需要十年时间。宫颈易于直接观察和取材，只要能及时发现和正确治疗癌前病变，就可以预防宫颈癌。
[0003]及时发现和正确治疗宫颈癌癌前病变能够提高宫颈癌实际发病率、降低死亡率。目前宫颈癌早期筛查方法已形成了 “三阶梯”模式，即细胞学筛查和HPV检测-阴道镜检查-宫颈活检/颈管诊刮的结合方法，使宫颈癌的发病率和死亡率大幅度下降，但目前的筛查程序仍存在一定的局限性。对于年轻女性来说，轻度细胞学异常很常见，且大多数会自然转归；HPV感染可能只是短暂的，有可能自然转阴。更为重要的是，宫颈细胞学筛查不能很好地区分宫颈上皮内瘤变(CIN)级别和预测其是否进展。CIN发展为宫颈癌是一个长期的过程，早期诊断和恰当的治疗完全可能将其阻断在CIN或早期癌阶段，并彻底治愈。而且并非所有的CIN病变都进展为高度病变，目前采用的基于形态学诊断的方法有时很难将CIN与非瘤病变、不同级别的CIN准确地鉴别出来，从而导致过度治疗或治疗不足。
[0004]用于判断宫颈上皮内瘤变级别的免疫组化标记物众多，应用最广泛的当属pl6和k1-67。在致癌性人乳头瘤病毒(HPV)相关的鳞状上皮内瘤变(SILs)中，pl6标记物检测的敏感性达到89 %?98 %，但由于致癌性HPV广泛出现在各级别的SILs中，所以P16的特异性不高，例如P16在一小部分阴性和反应性宫颈活检上皮组织中也呈阳性，干扰对CIN的分级进而影响了治疗方案的选择和预后。
【发明内容】
[0005]为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于宫颈上皮内瘤变分级辅助诊断的双染试剂盒；利用两种免疫组化标记物作为混合抗体，提高对CIN分级的灵敏度和特异性，能够更加精确鉴别CIN分级；增加阅片的可读性和精确度，并减少检测费用，操作步骤。
[0006]本发明的另一目的在于提供用于本发明的双染试剂盒分级辅助诊断宫颈上皮内瘤变的方法。
[0007]为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下:
[0008]一种用于宫颈上皮内瘤变分级辅助诊断的双染试剂盒，该双染试剂盒包括免疫组化标记物一抗，该免疫组化标记物一抗为Stathmin抗体与MCM2抗体组成的混合抗体试剂。
[0009]具体地，本发明中所述的Stathmin抗体与MCM2抗体的滴度均为90-120，即稀释比例为 1:90-120。
[0010]进一步的，本发明中所述的该双染试剂盒还包括AP标记羊抗鼠二抗和HRP标记羊抗兔二抗混合二抗。
[0011]优选的，本发明所述AP标记羊抗鼠二抗和HRP标记羊抗兔二抗的体积比为1:1。
[0012]进一步的，本发明该双染试剂盒还包括显色剂，所述显色剂为AP-Red染色液和DAB染色液。
[0013]本发明所述的双染试剂盒在宫颈上皮内瘤变分级辅助诊断中的应用。
[0014]一种宫颈上皮内瘤变分级非诊断性的辅助鉴定方法，该辅助鉴定方法采用本发明所述的双染试剂盒，并包括以下步骤:
[0015]I)脱蜡和水化:福尔马林固定-石蜡包埋的正常宫颈上皮组织，脱蜡前将正常宫颈上皮组织切片放在烤片机上烤片，然后依次经过二甲苯中浸泡、无水乙醇浸泡、95%乙醇中浸泡、蒸馏水中浸泡；
[0016]2)抗原修复:切片在EDTA抗原修复液中煮沸修复，冷却，自来水冲洗，蒸馏水浸泡；
[0017]3)封闭:用过氧化氢室温孵育，蒸馏水冲洗，TBS清洗并浸泡；
[0018]4)双染:滴加Stathmin抗体与MCM2抗体的混合抗体，室温孵育后TBS清洗，然后滴加混合二抗，孵育后TBS清洗，再分别DAB显色，AP-Red显色，终止反应；
[0019]5)复染1-3分钟，TBS返蓝；
[0020]6)脱水:依次95%乙醇中浸泡、无水乙醇中浸泡；
[0021]7)透明:二甲苯中浸泡；
[0022]8)封片。
[0023]具体地，步骤I)中二甲苯中浸泡2次，每次1分钟；无水乙醇浸泡2次，每次5分钟、95%乙醇中浸泡5分钟、蒸馏水中浸泡I分钟。
[0024]具体地，步骤2)中EDTA抗原修复液的pH值为8.8-9.2。
[0025]具体地，步骤4)室温孵育的时间为55-65分钟。
[0026]相比现有技术，本发明的有益效果在于:
[0027]1.本发明所述的双染试剂盒用于宫颈上皮内瘤变分级鉴定，采用免疫组化标记物混合物(Stathmin抗体与MCM2抗体)，对宫颈上皮内瘤变分级，两个抗体混合应用，提高了灵敏度和特异性，增加了一张切片的信息量，增加了阅片的可读性和精确度，并减少检测费用，操作步骤；
[0028]2.本发明所述的双染试剂盒可以在同一组织片子中可以观察到两种不同抗原的表达情况，Stathmin蛋白和MCM2蛋白分别在胞浆、胞核表达，在宫颈癌上皮瘤样病变的分级中阳性表达率具有高度相似性，联合使用可以更加明确诊断CIN分级；
[0029]3.本发明所述的辅助鉴定方法中标记物提供的信息准确，有利于规范对宫颈上皮内瘤变抗体的应用及选择，使得CIN分级鉴别更加精确。
[0030]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
【附图说明】
[0031]图1为本发明实施例1的鉴定结果图；
[0032]图2为本发明实施例2中CINI的鉴定结果图；
[0033]图3为本发明实施例2中CINII的鉴定结果图；
[0034]图4为本发明实施例3的鉴定结果图；
[0035]图5为本发明实施例4的鉴定结果图。
【具体实施方式】
[0036]Stathmin蛋白，又名原癌基因蛋白18抗体，是一种广泛存在的微管去稳定蛋白，在有丝分裂、细胞运动及迀移中起作用。在本发明的研宄中发现Stathmin在正常和良性子宫颈仅在基底层细胞出现阳性染色，在不同级别宫颈上皮内瘤样变组织中可出现不同程度的阳性表达；在低级别宫颈上皮瘤样变(CINI)，仅有9%的表达；在宫颈上皮内高度瘤样变(CIN III)组织，有93%的表达；并且发现Stathmin蛋白用于宫颈上皮内瘤样变的分级诊断的敏感性与pl6相似，但特异性比pl6高(分别为44%、39%);因此，Stathmin蛋白可作为一个潜在的诊断CIN分级的标记物，且优于P16。
[0037]微染色体维持蛋白2 (MCM2蛋白)属于调节哺乳动物DNA复制的MCM家族；可用于标记正常细胞和肿瘤细胞的增殖，MCM家族蛋白含量在细胞周期中从GO到G1/S期逐渐提高；其中MCM2在分裂间期时集中在胞核，是进入S期和细胞分裂期的必要条件；MCM2作为细胞增殖标记物，在结肠癌、肺癌和其他上皮组织癌前病变鉴别诊断中优于K1-67 ;MCM2在正常的宫颈上皮中，仅少数呈弱阳性表达，且局限于上皮的基底层；在高级别鳞状上皮内瘤变(HSIL)组织中其阳性表达率明显升高，阳性表达分布从基底层向表层推移，直至整个上皮。在本发明研宄过程中发现MCM2在组织学确诊的CIN II及以上病变中的阳性表达率为85.3% -98.8%，而在CINI中仅为14.3% -30% ;在宫颈鳞癌组织中95%的样本呈现MCM2阳性表达，其表达范围广泛，染色强度强。
[0038]免疫组化利用抗原和抗体特异性结合的原理，通过化学反应使显色剂显色来检测组织标本中抗原的存在情况。本发明利用免疫组织化学双染检测在同一组织中的两个抗原表达情况和相互的关系，可以在同一组织片子中可以观察到两种不同抗原的表达情况，Stathmin蛋白和MCM2蛋白分别在胞浆、胞核表达，在宫颈癌上皮瘤样病变的分级中阳性表达率具有高度相似性，联合使用可以更加明确诊断CIN分级。
[0039]一种用于宫颈上皮内瘤变分级辅助诊断的双染试剂盒，该双染试剂盒包括免疫组化标记物一抗，该免疫组化标记物一抗为Stathmin与MCM2组成的混合抗体试剂。
[0040]具体地，本发明中所述的Stathmin抗体与MCM2抗体的滴度均为90-120，即稀释比例为1:90-120。优选的，两者的滴度均为100。
[0041]进一步大的，本发明中所述的该双染试剂盒还包括AP标记羊抗鼠二抗和HRP标记羊抗兔二抗的混合二抗。优选的，本发明所述AP标记羊抗鼠二抗和HRP标记羊抗兔二抗的体积比为1:1。羊抗鼠二抗具体可选羊抗鼠IgG，羊抗兔二抗具体可选羊抗兔IgG。
[0042]进一步的，本发明该双染试剂盒还包括显色剂，所述显色剂为AP-Red染色液和DAB染色液。
[0043]本发明所述的双染试剂盒在宫颈上皮内瘤变分级辅助诊断中的应用。
[0044]一种宫颈上皮内瘤变分级非诊断性的辅助鉴定方法，该辅助鉴定方法采用本发明所述的双染试剂盒，并包括以下步骤:
[0045]I)脱蜡和水化:福尔马林固定-石蜡包埋的正常宫颈上皮组织，脱蜡前将正常宫颈上皮组织切片放在烤片机上烤片，然后依次经过二甲苯中浸泡、无水乙醇浸泡、95%乙醇中浸泡、蒸馏水中浸泡；
[0046]2)抗原修复:切片在EDTA抗原修复液中煮沸修复，冷却，自来水冲洗，蒸馏水浸泡；
[0047]3)封闭:用过氧化氢室温孵育，蒸馏水冲洗，TBS清洗并浸泡；
[0048]4)双染:滴加Stathmin蛋白与MCM2蛋白的混合抗体，室温孵育后TBS清洗，然后滴加混合二抗，孵育后TBS清洗，再分别DAB显色，AP-Red显色