专利名称：一段人乳头状瘤病毒58亚型dna序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一段人乳头状瘤病毒58亚型DNA序列及其应用，属于生物医学技术领域。
背景技术：
人类乳突病毒(Human Papillomavirus，简称HPV)是一种嗜上皮性病毒，有高度的特异性。在1%4年，HPV便被证实是性传播疾病的病原之一，与泌尿生殖系尖锐湿疣有关，并具有传染性。研究表明，HPV还是诱发宫颈癌的元凶。国际癌症研究协会IARC资料表明，13种低危型HPV主要引起生殖道、肛门周围皮肤等湿疣类病和低度子宫颈上皮内瘤变； 15种高危型HPV，尤其是16和18型，主要导致高度子宫颈上皮内瘤变和宫颈癌的发生。在各国、各地区致癌HPV有不同，在中国是16、18、58亚型，并且58亚型有一种比 18亚型还要多的趋势。因此，准确的诊断，特别是准确的分型诊断，对于HPV感染的治疗， 以及宫颈癌的预防有着非常重要的意义。PCR和基因芯片诊断是一种快速而准确的检测方法。而这一类的诊断方法依赖于获得特异的核酸序列。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之不足，而提供一段人乳头状瘤病毒58亚型DNA 序列及其应用。本发明的技术方案如下1. 一段乳头状瘤病毒58亚型(HPV58)特异DNA的克隆通过生物信息学分析和PCR扩增，获得了一段HPV58亚型的特异DNA片段，该片段共227bp，其序列如下caaatgcagg caaagattca cgatggccat atttgcacag tagactaaca gtatttgaat 60ttaacaatcc atttccattt gatgcaaatg gtaatccagt gtataaaata aatgatgaaa 120attggaaatc ctttttctca aggacgtggt gcaaattagg cttaatagag gaagaggaca 180aggaaaacga tggaggaaat atcagcacgt ttaagtgcag tgcagga2272.在PCR中的应用用 5，-caaatgcaggcaaagattca-3，作上游弓丨物，5，_tcctgcactgcacttaaacg_3，作下游引物，进行HPV58的特异片段的PCR扩增。3.在基因芯片中的应用用如下序列gatggccata tttgcacagt agactaacag tatttgaatt taacaatcca tttccatttg 60atgcaaatgg taatccagtg tataaaataa atgatgaaaa ttggaaatcc tttttctcaa 120ggacgtggtg caaattaggc ttaatagagg aagaggacaa ggaaaacgat ggaggaa177作为基因芯片上的检测探针，制作基因芯片。用 5，-caaatgcaggcaaagattca-3，作上游弓丨物，用 5，-tcctgcactgcacttaaacg-3‘作下游引物对样品进行PCR扩增，扩增产物能够与芯片上的探针序列进行杂交检测。本发明通过基因数据库资料的搜索和分析，确定了一段人乳头状瘤病毒58亚型的特异性，通过PCR扩增克隆了该序列。该序列长度为227bp，作为乳头状瘤病毒检测的靶序列。用该序列建立PCR和基因芯片检测方法诊断乳头状瘤病毒58亚型。本发明与现有技术相比，优点在于本发明涉及的序列与PCR检测和基因芯片技术相结合，应用于临床样品的核酸检测，实现在人乳头状瘤病毒感染的分型检测中HPV58 亚型的准确分型和定位。特别是在基因芯片的应用中，配合基因芯片高通量的特点，实现了一次取样、单次操作完成多项检测。极大的提高了检测的准确性和效率。
图1为临床标本的PCR扩增图谱，左边道为DNA分子量Marker，大小为100_600bp ； 右边道为特异性PCR扩增产物，大小在200与300之间。图2、为该序列的测序图。图3为基因芯片杂交结果。
具体实施例方式1. 一段乳头状瘤病毒58亚型(HPV58)特异DNA的克隆在基因数据库GenBank中搜索HPV58亚型DNA序列，将搜索到的HPV58亚型DNA 序列用Blast进行序列比对，找出HPV58特有而其它亚型不具有的特异DNA序列。针对每一段HPV58亚型特异序列设计多对PCR引物，进行PCR扩增，挑选PCR扩增产物效率高，特异性好的PCR引物。比较多对PCR引物的扩增产物，挑出其中一对引物，其扩增产物如图1。 该PCR引物符合挑选标准。将该引物扩增产物克隆到T-vector载体上，并进行测序，测序结果见图2。将测序结果进行blast搜索，发现所有与克隆序列完全匹配的序列全是HPV58亚型的病毒序列，而其它亚型病毒序列与之差异很大，PCR引物不能很好的扩增。2. PCR 扩增用常规临床样本采集方法，如棉拭子等，采集生殖道分泌物，按常规方法提取DNA。用本发明提供的引物上游弓丨物 5，-caaatgcaggcaaagattca-3，下游弓I物 5，-tcctgcactgcacttaaacg-3，按常规PCR方法扩增，即获得特异PCR扩增产物，产物大小与分子量Marker比较， 大小为227bp，表明该样本扩增为阳性，如图1，否则为阴性。该序列用于荧光定量PCR扩增，只要用荧光探针检测，按常规荧光定量PCR扩增即可。如图2显示，PCR扩增产物特异性高，扩增产率高，适合进行PCR检测。3.基因芯片应用(1)用下列引物5， -gatggccatatttgcacagt-3，5， -ttcctccatcgttttccttg-3，扩增本发明获得的克隆DNA，得到DNA探针，按常规方法打印到支持介质，如包被处理过的玻璃片或者尼龙膜上，作为探针。 (2)用上述PCR扩增方法扩增临床样本，扩增时按基因芯片检测方法进行标记，包括扩增标记或末端标记方法，扩增的标记产物按常规基因芯片方法进行杂交检测，如图3。 图3所示基因芯片检测图中，包含其它14种HPV亚型的探针位点，基因芯片检测结果只有本发明所指序列能有效的杂交，信号很强，而其它序列均无杂交信号，显示其在基因芯片检测方法中应用时特异性很好。
权利要求
1.一段人乳头状瘤病毒58亚型DNA序列，其特征在于a.采用生物信息学分析和PCR扩增，获得一段HPV58亚型的特异DNA片段，该片段共 227bp，其序列如下caaatgcagg caaagattca cgatggccat atttgcacag tagactaaca gtatttgaat 60 ttaacaatcc atttccattt gatgcaaatg gtaatccagt gtataaaata aatgatgaaa 120 attggaaatc ctttttctca aggacgtggt gcaaattagg cttaatagag gaagaggaca 180 aggaaaacga tggaggaaat atcagcacgt ttaagtgcag tgcagga227 ；b.该序列的检测引物序列为检测上游弓丨物 5，-caaatgcaggcaaagattca-3， 检测下游弓I物 5，-tcctgcactgcacttaaacg-3，；c.探针制备引物序列为探针制备上游引物 5，-gatggccatatttgcacagt-3， 探针制备下游引物 5’ -ttcctccatcgttttccttg-3’。
2.权利要求1所述的一段人乳头状瘤病毒58亚型DNA序列，其特征在于该序列克隆 DNA在临床样本的PCR法和基因芯片方法检测中，用于确定乳头状瘤病毒58亚型的存在。
全文摘要
本发明涉及一段人乳头状瘤病毒58亚型DNA序列及其应用，属于生物医学技术领域。本发明采用生物信息学手段和PCR方法，通过基因数据库资料的搜索和分析，确定了一段人乳头状瘤病毒58亚型的特异性，通过PCR扩增克隆了该序列。该序列长度为227bp，作为乳头状瘤病毒检测的靶序列。用该序列建立PCR和基因芯片检测方法诊断乳头状瘤病毒58亚型。本发明与现有技术相比，优点在于本发明涉及的序列与PCR检测和基因芯片技术相结合，应用于临床样品的核酸检测，实现在人乳头状瘤病毒感染的分型检测中HPV58亚型的准确分型和定位。特别是在基因芯片的应用中，配合基因芯片高通量的特点，实现了一次取样、单次操作完成多项检测。极大的提高了检测的准确性和效率。
文档编号C12N15/37GK102533794SQ20101058036
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者杜凌琳, 谭德勇 申请人:昆明云大生化科技有限责任公司