一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 犬细小病毒病是危害我国养犬业的主要流行型传染病之一，是犬的一种具有高度 接触性的烈性传染病，具有发病急和死亡率高等特点，不同品种和年龄的犬都易感，幼犬在 16周龄左右感染率高达100%，死亡率达10% ~50%。中国宠物市场的发展和进步，是社 会经济发展、人们对宠物的态度以及人口老龄化和城市化进程综合促进的结果。犬作为一 种与人类接触最为亲密的、与人类相处时间最长的宠物之一，与人类的日常生活已经密不 可分，其健康状况往往与人类自身的健康状况息息相关，诸如犬是多少人畜共患的寄生虫、 病毒和细菌性病原的宿主和可能的传染源，因此，关注宠物犬的健康对于动物福利和人类 健康具有重要的公共卫生意义。犬除了作为宠物饲养之外，其在生命科学、军用犬已经试验 动物用途中越来越广泛。
[0003] 我国广泛存在并已分离多种毒株，对于其特异性抗体的检测方法主要有血凝抑制 试验（HI)，酶联免疫吸附法（ELISA)，胶体金法。其中血凝抑制试验（HI)，需要新鲜的猪、猴 的红细胞，材料来源不及时、批次制备原料不稳定、难以高通量检测，操作人为因素影响大， 而仅限于个别实验室内部使用，无法批量工业化生产，而不能推广到基层养殖场和宠物医 院临床一线检测之用。胶体金便于临床定性分析犬细小病毒抗体阳性与阴性问题，而无法 做到精确定量。ELISA是一项国内外通用的，目前在各个检测领域技术最为成熟的一种方 法，商品化的试剂盒也非常好用。然而，目前国内的技术力量没有达到相应的国际水平，迟 迟没有中国自己的犬细小病毒ELISA抗体检测试剂盒上市。而进口犬细小病毒ELISA抗体 检测试剂盒价格昂贵，临床应用成本高，在国内难以普遍推广使用。
[0004] 鉴于上述情况，开发一种能够适合工业化批量生产、质量可控、性能稳定、高通量、 特异性和敏感性好的犬细小病毒抗体检测试剂盒十分必要，更为重要的是，该试剂盒的成 本不能太高，否则，难以推广应用。基于以上种种背景，建立了本发明。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒，能够快速、准确的进 行检测。
[0006] 本发明为解决上述问题所采取的技术方案是：一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂 盒，该试剂盒内设有包被犬细小病毒抗原的96孔免疫检测反应板5块、120mL10倍浓缩洗涤 液1瓶、120mL样品稀释液1瓶、50 μ L阳性血清1管、50 μ L阴性血清1管、20 μ L辣根 过氧化物标记的SPA酶标抗体1管、60mL底物显色液A液1瓶、I. 5 mL每管的底物显色液 B液2管。
[0007] 所述包被犬细小病毒抗原96孔免疫检测反应板的制备方法，包括以下步骤： (1)、将培养瓶中单层猫肾细胞的培养基倒掉，然后向培养瓶中加入PBS洗涤液，每cm2 单层猫肾细胞对应的PBS洗涤液为0. 027mL，之后摇动培养瓶，使洗涤液覆盖单层猫肾细胞 面，以除去培养瓶中残留的培养基，倒掉PBS洗涤液后备用； (2) 、向步骤（1)处理过的培养瓶中加入质量浓度为0. 25%的胰酶-EDTA-Na2溶液，每 cm2单层猫肾细胞对应的胰酶-EDTA-Na2溶液为0. 013mL，摇动培养瓶，直至胰酶-EDTA-Na2 溶液覆盖单层猫肾细胞，室温下静置Imin后，倒掉瓶中的胰酶-EDTA-Na2溶液，再静置 2min，振动培养瓶直至单层猫肾细胞全部脱落，备用； (3) 、向步骤（2)处理过的培养瓶中加入MEM培养基，且MEM培养基中胎牛血清的质量 浓度为5%，用移液枪吹散猫肾细胞，直至猫肾细胞呈单个分布，即制得细胞悬液，备用； (4) 、将细胞悬液与胎牛血清质量浓度为5%的MEM培养基按1:5的体积比混合并搅拌 均匀，制得培养液，将基因型为2a型的犬细小病毒液加入到培养液中，使每孔病毒感染复 数为5TCID50,混合并搅拌均匀后制得包被液，备用； (5) 、用排枪吸取步骤（4)制备的包被液，并以每孔120 μ L加入到96孔免疫检测反应 板中，振动免疫检测反应板，使包被液在孔内均匀分布，之后放入温度为37°C、C02体积浓 度为5%的培养箱中培养48h，将96孔免疫检测反应板中的包被液倒掉，并用PBS洗涤溶液 清洗3-4次，在温度为30°C的真空干燥仪内干燥，直至孔边缘处出现白色圈； (6) 、向步骤（5)处理过的96孔免疫检测反应板中加入固定液，静置30min后弃去固定 液，放入温度为30°C的真空干燥仪内干燥，直至孔边缘出现白色圈，所述固定液是将丙酮与 PBS洗涤溶液按33:67的体积比混合并搅拌均匀后制得； (7) 、将步骤（6)制得的96孔免疫检测反应板抽真空后置于温度为-20°C下保存，即制 得包被犬细小病毒抗原的96孔免疫检测反应板。
[0008] 每升10倍浓缩洗涤液的制备方法是将NaCl 80 g、kcl 2 g、Na2HP04 14. 2 g、 KH2P04 2. 7g溶入到900mL去离子水中，并定容至1000mL，在温度为120°C下灭菌30分钟 后，转入温度为4°C下密闭保存即可。
[0009] 所述底物显色液A液的制备方法是将去离子无菌水、体积百分比浓度为30%的双 氧水和pH为5. 0、摩尔浓度为0.1 moL/L的乙酸盐缓冲液按1 :0. 03 :1的体积比混合并搅拌 均匀后制得。
[0010] 所述底物显色液B液的制备方法是在每毫升二甲基甲酰胺中加入4mg 3-氨 基-9-乙基咔唑，混合并搅拌均匀后即可。
[0011] 所述底物显色液的制备方法是将底物显色液A液和底物显色液B液按照20:1的 体积比混合并搅拌均匀后制得。
[0012] 有益效果 1、本发明所制备的试剂盒，在临床样品检测时操作流程简单，3. 5小时之内可完成检 测，结果判定只需要一台普通的倒置显微镜即可，不需要特殊的仪器，肉眼可见特异性染 色，非特异性染色十分容易区分，方便实验室和临床现场检测之用。
[0013] 2、相对于现有商品化的犬细小病毒ELISA抗体检测试剂盒制备所需要的高成本、 高技术制备工艺和生产条件，本发明所制备的试剂盒，不仅材料成本低廉、制备工艺简单， 而且稳定性强、灵敏度高、高通量的特性可与商品化的犬细小病毒ELISA抗体检测试剂盒 媲美。
[0014] 3、本发明所制备的试剂盒具有材料来源稳定、单一、可控的优点，本发明所采用的 F81细胞为传代细胞系，国际通用材料，背景清楚，可进行工业化生产。
【附图说明】
[0015] 图1为试验2中2只犬体内IgG抗体采用本试剂盒所测定的效价变化曲线。
【具体实施方式】
[0016] 一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒，该试剂盒内设有包被犬细小病毒抗原的96 孔免疫检测反应板5块、120mL 10倍浓缩洗涤液1瓶、120mL样品稀释液1瓶、50 μ L阳性血 清1管、50 μ L阴性血清1管、20 μ L辣根过氧化物标记的SPA酶标抗体1管、60mL底物显 色液A液1瓶、I. 5 mL每管的底物显色液B液2管。
[0017] 所述包被犬细小病毒抗原96孔免疫检测反应板的制备方法，包括以下步骤： (1) 、将培养瓶中单层猫肾细胞的培养基倒掉，然后向培养瓶中加入PBS洗涤液，每cm2 单层猫肾细胞对应的PBS洗涤液为0. 027mL，之后摇动培养瓶，使洗涤液覆盖单层猫肾细胞 面，以除去培养瓶中残留的培养基，倒掉PBS洗涤液后备用； (2) 、向步骤（1)处理过的培养瓶中加入质量浓度为0. 25%的胰酶-EDTA-Na2溶液，每 cm2单层猫肾细胞对应的胰酶-EDTA-Na 2溶液为0. 013mL，摇动培养瓶，直至胰酶-EDTA-Na 2 溶液覆盖单层猫肾细胞，室温下静置Imin后，倒掉瓶中的胰酶-EDTA-Na2溶液，再静置 2min，振动培养瓶直至单层猫肾细胞全部脱落，备用； (3) 、向步骤（2)处理过的培养瓶中加入MEM培养基，且MEM培养基中胎牛血清的质量 浓度为5%，用移液枪吹散猫肾细胞，直至猫肾细胞呈单个分布，即制得细胞悬液，备用； (4) 、将细胞悬液与胎牛血清质量浓