现配。
[0036] 4.底物显色液：显色前，将底物A液和底物B液按照20 :1的比例混匀即可，注意 现用现配。
[0037] 二、操作步骤 1.预温：在使用前，根据检测血清样本数量，取免疫检测反应板(根据样品数量，将未用 孔用塑料膜封闭)、洗涤液及稀释液恢复至室温，轻轻均匀。
[0038] 2.浸板：每孔注入200 μ L的洗涤液，置室温浸洗一次，轻轻甩出洗液，吸水纸上 轻叩。
[0039] 3.样品稀释：用样品稀释液将待检样品、阴性血清对照品和阳性血清对照品作1 : 100倍稀释。例如：分别将待检和对照血清样品3 μ L加入300 μ L样品稀释液，混匀。如 果要测定样品中IgG的滴度可以按照10倍的梯度稀释法稀释。
[0040] 4.与血清样品反应：取上述稀释的血清样品分别加入到对应孔，每孔100 μ L，依 次注入反应板孔中，记录每个样品位置，将反应板置入湿盒内，于37°C温箱中孵育I h。
[0041] 5.洗板：每孔注入200 μ L洗涤液，立即排除洗液，吸水纸上轻叩，重复3次。
[0042] 6.与酶标抗体反应：每孔注入100 μ L稀释的辣根过氧化物酶标记的抗体，将反 应板置入湿盒内，于37°C温箱中孵育I h。
[0043] 7.洗板：按步骤5进行。
[0044] 8.底物显色：每孔注入100 μ L底物显色液(现用现配)，避光，于37°C温箱中反 应 15 min〇
[0045] 9.终止反应：甩出反应液，每孔注入200 μ L蒸馏水洗一次，每孔加入100 μ L ddH20观察结果。
[0046] 10.在显微镜下观察各孔显色情况，进行样品结果判定。
[0047] 三、结果判定 免疫检测反应板内细胞质内或细胞核周围呈棕红色，细胞核无着色，判为阳性；细胞质 内或细胞核周围无着色反应判定为阴性。以检测血清阳性终点时最高稀释度的倒数表示抗 体效价。
[0048] 本发明试剂盒质量标准及检定： 特异性：30份阴性血清、30份阳性血清，分别采用血凝抑制试验和本试剂盒进行检测， 符合率不低于95%。
[0049] 灵敏性：犬细小病毒阳性血清12800倍稀释能检出（g卩1 μ L血清加到12800 μ L 样品稀释液中，取其中100 μ L加入样品检测孔）能检出。
[0050] 稳定性：将试剂盒置于37°C不少于2天与4°C存放的试剂盒同步检测10份样品， 其符合率为100%。
[0051] 试验 1 犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒检测未接种犬细小病毒疫苗的健康幼犬抗细小病毒 IgG抗体：从广州某养狗场采集30份未接种犬细小病毒疫苗的健康幼犬（60日龄）血清样 本，按照犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒检测程序进行检测。
[0052] 试验结果 未接种犬细小病毒疫苗的健康幼犬抗细小病毒IgG抗体检测结果：从广州某养狗场 采集30份未接种犬细小病毒疫苗的健康幼犬血清样本进行犬细小病毒IgG抗体检测，结果 表明（表1) :12份为阳性，18份为阴性。其中阳性血清中最高的效价为400倍（400X)，最 低效价为10倍（10X)。所有阴性血清样品均已原倍检测为阴性结果。这些结果表明，幼犬 中存在犬细小病毒母源抗体。
[0053] 表1犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒检测30份健康犬血清
【主权项】
1. 一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒内设有包被犬细小病 毒抗原的96孔免疫检测反应板5块、120mL10倍浓缩洗涤液1瓶、120mL样品稀释液1瓶、 50yL阳性血清1管、50yL阴性血清1管、20yL辣根过氧化物标记的SPA酶标抗体1 管、60mL底物显色液A液1瓶、I. 5mL每管的底物显色液B液2管。
2. 根据权利要求1所述的一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒，其特征在于：所述包 被犬细小病毒抗原96孔免疫检测反应板的制备方法，包括以下步骤： (1 )、将培养瓶中单层猫肾细胞的培养基倒掉，然后向培养瓶中加入PBS洗涤液，每cm2 单层猫肾细胞对应的PBS洗涤液为0. 027mL，之后摇动培养瓶，使洗涤液覆盖单层猫肾细胞 面，以除去培养瓶中残留的培养基，倒掉PBS洗涤液后备用； (2) 、向步骤（1)处理过的培养瓶中加入质量浓度为0. 25%的胰酶-EDTA-Na2溶液，每 cm2单层猫肾细胞对应的胰酶-EDTA-Na2溶液为0. 013mL，摇动培养瓶，直至胰酶-EDTA-Na2 溶液覆盖单层猫肾细胞，室温下静置Imin后，倒掉瓶中的胰酶-EDTA-Na2溶液，再静置 2min，振动培养瓶直至单层猫肾细胞全部脱落，备用； (3) 、向步骤（2)处理过的培养瓶中加入MEM培养基，且MEM培养基中胎牛血清的质量 浓度为5%，用移液枪吹散猫肾细胞，直至猫肾细胞呈单个分布，即制得细胞悬液，备用； (4) 、将细胞悬液与胎牛血清质量浓度为5%的MEM培养基按1:5的体积比混合并搅拌 均匀，制得培养液，将基因型为2a型的犬细小病毒液加入到培养液中，使每孔病毒感染复 数为5TCID5(I，混合并搅拌均匀后制得包被液，备用； (5) 、用排枪吸取步骤（4)制备的包被液，并以每孔120yL加入到96孔免疫检测反应板 中，振动免疫检测反应板，使包被液在孔内均匀分布，之后放入温度为37°C、CO2体积浓度为 5%的培养箱中培养48h，倒掉免疫检测反应板中的包被液，并用PBS洗涤溶液清洗3-4次， 在温度为30°C的真空干燥仪内干燥，直至孔边缘处出现白色圈； (6) 、向步骤（5)处理过的96孔免疫检测反应板中加入固定液，静置30min后弃去固定 液，放入温度为30°C的真空干燥仪内干燥，直至孔边缘出现白色圈，所述固定液是将丙酮与 PBS洗涤溶液按33:67的体积比混合并搅拌均匀后制得； (7) 、将步骤（6)制得的96孔免疫检测反应板抽真空后置于温度为-20°C下保存，即制 得包被犬细小病毒抗原的96孔免疫检测反应板。
3. 根据权利要求1所述的一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒，其特征在于：每升10 倍浓缩洗涤液的制备方法是将NaCl80g、kcl2g、Na2HPO4 14. 2g、KH2PO4 2. 7g溶入到 900mL去离子水中，并定容至1000mL，在温度为120°C下灭菌30分钟后，转入温度为4°C下 密闭保存即可。
4. 根据权利要求1所述的一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒，其特征在于：所述底 物显色液A液的制备方法是将去离子无菌水、体积百分比浓度为30%的双氧水和pH为5. 0、 摩尔浓度为〇.ImoL/L的乙酸盐缓冲液按1 :0. 03 :1的体积比混合并搅拌均匀后制得。
5. 根据权利要求1所述的一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒，其特征在于：所述底 物显色液B液的制备方法是在每毫升二甲基甲酰胺中加入4mg3-氨基-9-乙基咔唑，混合 并搅拌均匀后即可。
6. 根据权利要求1所述的一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒，其特征在于：所述底 物显色液的制备方法是将底物显色液A液和底物显色液B液按照20:1的体积比混合并搅 拌均匀后制得。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体涉及一种犬细小病毒IgG抗体检测试剂盒。本发明所制备的试剂盒，在临床样品检测时操作流程简单，3.5小时之内可完成检测，结果判定只需要一台普通的倒置显微镜即可，不需要特殊的仪器，肉眼可见特异性染色，非特异性染色十分容易区分，方便实验室和临床现场检测之用。相对于现有商品化的犬细小病毒ELISA抗体检测试剂盒制备所需要的高成本、高技术制备工艺和生产条件，本发明所制备的试剂盒，不仅材料成本低廉、制备工艺简单，而且稳定性强、灵敏度高、高通量的特性可与商品化的犬细小病毒ELISA抗体检测试剂盒媲美。
【IPC分类】G01N33-569
【公开号】CN104792984
【申请号】CN201410830855
【发明人】唐青海, 阚云超, 姚伦广, 唐存多, 毛倩倩, 焦铸锦, 史鸿飞, 冷超粮, 刘宗才, 刘飞
【申请人】南阳师范学院
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2014年12月26日