C分子参与多肽呈递。 ⑶1家族分子呈递非多肽抗原，如脂质和糖类。⑶1家族可以分为三类：第I类包括⑶la， ⑶Ib和⑶lc，第II类是⑶ld，第III类⑶le，兔子可以表达这三类，老鼠只能表达第II类。 第I类分子主要根据脂质抗原的变化来表达不同的T细胞进行免疫反应，相比较而言，第II 类则根据脂质抗原而产生自然杀伤性T细胞，兔和鼠针对脂质或糖脂类抗原的决定簇的不 同，因此针对多糖类分子免疫兔产生抗体优于鼠产生的抗体。
[0057] 在兔体内抗体产生的初期和第二期具有几个特征：与人和鼠不同，兔B细胞不断 的在肠相关的淋巴组织产生，由富含B细胞的淋巴组织和血液中的游离的B细胞产生抗 体，通过进行非特异性免疫原的抗体扩增而形成大的抗体库；相对鼠和人，兔的免疫更加 简单，兔的IgG没有亚基，而且很少会产生IgM。兔抗体仅有C γ基因，而且轻链的大部分 (90-95% )来自同型的Ck 1，IgG的全部轻链仅5% -10%来自同型的λ，兔IgG的这些特 点使得基因克隆比鼠和人的更容易。
[0058] 本发明所述的不同区域的PCT抗原的多克隆抗体的制备方法，步骤如下：
[0059] 1.用制备好的各个区域的PCT抗原免疫动物。
[0060] 2.测定免疫后动物的血清效价，从免疫后的动物体内取血。
[0061] 3.用饱和硫酸铵盐析法和亲和层析法对血清进行纯化，得到纯化的多克隆抗体。
[0062] 上述步骤2中免疫的方法是多种多样的，如：脾内注射法，腹腔注射法等。免疫剂 量可视具体动物种类而定。用于制备PCT多克隆抗体的动物可以是鼠、兔、鸡、羊、马、猪、驴 等可用于免疫的动物。
[0063] 上述步骤3中免疫后的动物可处死后采血，也可以不处死，饲养过程中每次采一 定量的血。
[0064] 上述步骤4中用于抗体纯化的方法可以是饱和硫酸铵盐析沉淀法和亲和层析法 等。
[0065] 亲和层析法步骤如下：
[0066] (A)取2份抗血清样本，加等体积的生理盐水，再加入4份饱和硫酸铵溶液，于4°C 沉淀过夜；
[0067] (B) 1000 Og低温离心10分钟，弃上清，将沉淀用2份PBS溶解，缓慢滴加 1份饱和 硫酸铵溶液，在4°C静置1小时；
[0068] (C) 1000 Og低温离心10分钟，弃上清，将沉淀用1份PBS溶解，用PBS溶液4°C透 析过夜；
[0069] (D)用亲和层析的方法进一步纯化：
[0070] I用5-10倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱；
[0071] II用5_10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；
[0072] III将用饱和硫酸铵盐析法初步纯化过的样品上样；
[0073] IV用5_10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；
[0074] V用2-5倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱，得到抗PCT抗原的多克隆抗体。
[0075] 用上述方法制备得到的多克隆抗体及其他种属来源的多克隆抗体是需要本发明 保护的。
[0076] 本发明提供了抗PCT抗原的多克隆抗体和单克隆抗体，及抗PCT抗原的多克隆抗 体和单克隆抗体的制备方法。实验证明，用本发明所属方法制得的多克隆抗体具有效价高， 特异性好的特点，有很强的应用前景。
[0077] 通过上述试剂盒，可利用多个PCT标准品建立标准曲线，即可得到待测样品的PCT 浓度。
[0078] 为了保证检测过程的顺利进行，本领域技术人员可以理解上述检测试剂盒还需要 使用必要的缓冲液、终止液等，因此试剂盒内还包括洗液试剂瓶，其中装有用于洗涤酶标版 的洗液；底液试剂瓶，其中装有受酶催化显色的底物溶液；终止液试剂瓶，其中装有终止显 色反应的终止液。
[0079] 对于上述应作广泛理解，即可以将这些缓冲液等成分的试剂瓶装在一个单独的盒 子中与本发明的试剂盒组成配套试剂盒使用，以便避免材料浪费；也可以是这些试剂瓶均 装在本发明的试剂盒中，以便于快速操作，分类方便。这两种试剂盒形式均涵盖于本发明的 保护范围。
[0080] 尽管只要使用两个标准品即可建立标准曲线，为了提高检测的准确度，所述PCT 标准品试剂瓶为5个，所述PCT标准品浓度范围为0. 05ng-100ng/mL，在此范围内的任意五 个不同浓度。可以理解，更多的不同浓度的标准品可以进一步提高检测准确度，其它任意数 目均涵盖于本发明。
[0081] 在本发明中，优选的，用于标记抗PCT的单克隆多抗的酶为辣根过氧化物酶或或 碱性磷酸酶。
[0082] 其中，所述的浓缩洗液，样本稀释液、底物溶液和终止液的组分及配比如下：
[0083] 浓缩洗液：按重量份数计，氯化钠96. 0份，氯化钾2. 40份，十二水合磷酸氢二钠 42. 96份，磷酸二氢钾2. 88份，吐温-20 0. 05份，超纯水1000份；
[0084] 样本稀释液：人工血清；
[0085] 底物溶液：TMB溶液或PNPP溶液；
[0086] 终止液：2mol/L硫酸溶液或3mol/L氢氧化钠溶液。
[0087] 为了保证检测结果的可靠性，防止污染等导致的失真，试剂盒内还包括阳性质控 试剂瓶和/或阴性质控试剂瓶。
[0088] 在此基础上，本发明相应的提供了所述试剂盒的制备方法，包括下述步骤：
[0089] (1)制备PCT单克隆多抗包被的酶标板
[0090] (a) PCT单克隆多抗包被液的配制：采用以下任一缓冲溶液将GM稀释至 25ng/100 μ L ~2 μ g/100 μ L : 0· 01mol/L ~0· 2mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS)，其 pH7. 0 ~ pH8. 0 ;0. 05~0. 2mol/L碳酸盐缓冲液（CBS)，其pH9. 0~ρΗ9. 6 ;0. 05mol/L三羟甲基氨基 甲烷（Tris)缓冲液，其ρΗ10· 0~ρΗ10· 6 ;
[0091] (b)封闭液的配制：将3%~5%的脱脂奶粉或者1 %~4% BSA加入下述缓冲溶 液中，配制成封闭液：缓冲溶液，0.0 lmol/L~0. 2mol/L PBS，其pH7. 0~pH8. 0 ;
[0092] (c)包被酶标板：
[0093] ①将配制的PCT单克隆多抗包被液加入酶标板孔中，每孔分别加入60μ L~ 200 μ L包被液；
[0094] ②酶标板置于2_8°C环境下包被8~16h ;
[0095] ③将配制的封闭液加入酶标板孔中，每孔分别加入60 μ L~200 μ L封闭液，置于 37 °C温箱，30~90分钟；
[0096] ④从温箱取出酶标板后弃去封闭液，37°C恒温30~90分钟，即得；
[0097] (2)标准品的制备
[0098] 标准品的制备是将PCT抗原用含稳定剂的磷酸盐缓冲液稀释而成；
[0099] (3)酶标记的抗PCT的单克隆多抗溶液的配制
[0100] 酶标记的抗PCT的单克隆多抗溶液的配制是将HRP或AP标记的抗PCT的单克隆 多抗用偶联物稳定剂以1 : 2000~1 : 20000的比例稀释而成。
[0101] 本发明的试剂盒对于检测PCT的浓度具有非常好的效果，不仅快速准确，而且灵 敏性高，因此本发明还公开了所述试剂盒在检测人降钙素原浓度中的应用，具体操作步骤 如下所示：
[0102] 1)将PCT标准品、待测样品加入到PCT单克隆多抗包被的酶标板的孔中，同时加 入酶标记的抗PCT的单克隆多抗，孵育5-60min ;2)甩掉反应液，采用洗液洗涤酶标板的孔； 2)洗涤结束后在孔中加入底物溶液孵育15min，然后加入终止液混匀后，在0D450nm处读 数；3)根据PCT标准品和待测样品的吸光度测定值，绘制标准曲线和方程，计算出待测样品 中PCT的浓度。
[0103] 本发明的试剂盒，通过将针对特异片段PCT的单克隆多抗包被在固相载体上，制 成固相抗体，然后将待检样本与酶标的抗PCT的单克隆多抗分别加入所得固相上，恒温反 应并经过彻底洗涤后使待检抗原与单克隆多抗结合形成免疫复合物；由于酶的反应底物 TMB显色，颜色的深浅和待检样本中PCT浓度呈正相关，因此用酶标仪在一定波长下测定吸 光度（0D值），通过标准曲线实现对抗原的定量检测分析，快速准确的检测PCT抗原，有利于 相关疾病的早期诊断；同时，本发明的试剂盒敏感性和特异性好，能提供更准确可靠的检验 结果；具体到检测操作，本发明的试剂盒采用一步式操作，实验操作简便易行，检测快速敏 感，不需要精密的仪器设备，是一种面向不同级别医院及临床检验机构进行PCT检测的有 效方法。
【附图说明】
[0104] 图1为本发明试剂盒实际应用生成的标准曲线图；
[0105] 图2为对应于检测结果的ROC曲线图。
[0106] 图3显示了兔IgG型多克隆抗体的SDS-PAGE检测的结果，其中，pAb泳道为多抗， M泳道为蛋白Marker。
[0107] 图4显示了兔IgG型多克隆抗体的效价测定的结果。
【具体实施方式】
[0108] 在下述实施例中，本发明提供了所述试剂盒的优选实现方式，通常本发明的PCT 诊断试剂盒在盒体内放置海绵托架和单克隆多抗包被的酶标板R1，在海绵托架上防治符 合要求的试剂瓶，例如R2a试剂瓶（PCT标准品a)、R2b试剂瓶（PCT标准品b)、R2c试剂瓶 (PCT标准品c)、R2d试剂瓶（PCT标准品d)、R2e试剂瓶（PCT标准品e)、R3试剂瓶（辣根 过氧化物酶标记的抗PCT的单克隆多抗）、R4试剂瓶（浓缩洗液）、R5试剂瓶（TMB溶液）、 R6试剂瓶（终止液）、R7试剂瓶（阳性质控）、R8试剂瓶（阴性质控）、封板膜和海绵托架 组成。
[0109] 其中，所用的洗液为了尽可能减少体积占用，采用浓缩洗液，所用的浓缩洗液、底 物溶液和终止液的组分及配比如下：
[0110] 浓缩洗液：氯化钠96. 0份，氯化钾2. 40份，十二水合磷酸氢二钠42. 96份，磷酸二 氢钾2. 88份，吐温-200. 05份，超纯水1000份；
[0111] 底物溶液：TMB或PNPP ;
[0112] 终止液：2mol/L硫酸溶液或3mol/L氢氧化钠溶液。
[0113] 上述所公开的组成以及浓度均为免疫学领域最常用的，根据需要，可以对其进行 合理调整。
[0114] 实施例1 :PCT抗原的制备
[0115] (1)取 Img PCT 全长抗原；
[0116] (2)配置2ml酶解液：激素原转化酶（Prohormone Convertase，PC)、羧肽 酶（Carboxypeptidase，CP)、氨肽酶（Aminopeptidase，AP)、肽酰甘氨酸轻单氧化酶 (Pepeitdyl Glycine Amidating Mono_oxygenase，PAM)各3〇IU/g溶解于2〇mM Tris，5〇OmM NaCl，pH7. 4缓冲液中。
[0117] (3)加入酶解液，37°C水浴酶解2h ;
[0118] (4)将分别针对N端（N-proCT)、降钙素（Calcitonin，CT)以及下钙素 (Katacalcin，KAT)抗原的三种单克隆抗体单独偶联到层析柱上，将酶解液依次过滤进行亲 和纯化，从而获得N端（N-proCT)、降钙素（Calcitonin, CT)以及抗降钙素原（Katacalcin， KAT)三种抗原，具体步骤如下：
[0119] a将上述抗体分别结合到蛋白A微珠上。2mg的单克隆抗体结合ImL湿的微珠。将 抗体和蛋白A微珠混合制成稀薄的匀浆，在总量为IOmL的溶液中加入ImL微珠，室温孵育 Ih,混匀。
[0120] b用10倍体积的0· 2mol/L硼酸钠（ρΗ9· 0)洗涤微珠2次，每次以3000g离心2min。
[0121] c用10倍体积的0. 2mol/L硼酸钠（pH9. 0)重悬微珠，留样。加入二甲基庚二酸酯 (固体）至微珠匀浆中，使终浓度为20mmol/L。
[0122] d室温孵育30min，并混匀，留样。
[0123] e用0· 2mol/L乙醇胺（ρΗ8· 0)洗涤微珠1次以终止反应。然后重悬于0· 2mol/L 乙醇胺，室温孵育2h，混匀。
[0124] f将抗体包被的微珠转入层析柱中，用PBS缓冲液（pH7. 4)冲洗容器。
[0125] g用20倍柱床体积的20mM Tris，500mM NaCl，pH7. 4缓冲液洗柱。
[0126] h将抗原液加到柱上，按每毫升柱体积大约lml/h的速度使抗原溶液流过层析柱。
[0127] i用20倍柱床体积的结合缓冲液（PBS，pH7. 4)洗柱。
[0128] k采用分段洗脱法，连续以0. 5倍柱床体积的洗脱缓冲液（0.1 M