可用于检测糖尿病的标志物及其用图

可用于检测糖尿病的标志物及其用图
【专利摘要】本发明提供用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损或将发展2型糖尿病的标志物，其包括：葡萄糖、β?甘露糖甘油酸酯、D?塔罗糖中的一种或多种，诊断灵敏度可达96.3％，特异度为0％。
【专利说明】
可用于检测糖尿病的标志物及其用途
技术领域
[00011本发明涉及一种糖尿病标志物，特别地，进一步具体涉及G01N33/68。
【背景技术】
[0002] 发生葡萄糖代谢改变的病理生理学基础是多因素的，例如生活方式和遗传因素。 特别地，在遗传上易感2型糖尿病的人中，肥胖被认为是2型糖尿病的主要原因，并且在过去 50年间2型糖尿病的比率与肥胖平行地显著增加。相比1985年的大约0.3亿人，到2010年为 止，大约2.85亿人患有该疾病。
[0003] 从正常葡萄糖耐量(健康人)发展成2型糖尿病包括空腹葡萄糖受损（IFG)和葡萄 糖耐量受损(IGT)的中间阶段，称为前驱糖尿病。
[0004] 尽管例如年龄、体重指数(BMI)，与前驱糖尿病和2型糖尿病的发生相关，但这些因 素不足以准确预测从健康人发展成葡萄糖耐量受损的风险和/或从葡萄糖耐量受损发展成 2型糖尿病的风险，因为糖尿病的发展和进展经常是无症状的。此外，尽管用于确定受试者 是否具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的方法是已知的，但这样的方法要求过夜禁食和 在数小时内多次抽血，并且经常伴有副作用，例如恶心、呕吐、腹部气胀和/或头痛。
[0005] 因为对具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者和/或具有发展葡萄糖耐量 受损和/或2型糖尿病的风险的受试者和/或将对特定疗法有反应的那些受试者的早期鉴定 将降低与葡萄糖失调相关的短期和长期并发症，所以本领域需要确定哪些受试者具有或将 发展葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病和/或对某一疗法有反应的可靠和准确的方法，以允 许早期干预。

【发明内容】

[0006] 本发明至少部分地基于与葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的发展相关的和具有 葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者对治疗的反应相关的标志物的发现。因此，本发 明通过测量和鉴定特定的标志物或特定的标志物组合，提供用于预测受试者是否具有或将 发展葡萄糖耐量受损的灵敏和容易的方法和试剂盒，用于预测受试者是否具有或将发展糖 尿病的方法和试剂盒，以及用于鉴定可减缓葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的进展的化合 物的方法，监测某一疗法在减低受试者的葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的进展中的功效 的方法，和用于抑制在细胞或受试者中葡萄糖耐的量受损和/或2型糖尿病进展的方法。 [0007]因此，在一个方面，本发明提供用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受 损的标志物:葡萄糖、甘露糖甘油酸酯、D-塔罗糖。
[0008]所述标志物还进一步包括:胱氨酸、山梨糖、天冬酰胺、赖氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、 富马酸、羟基脲、木糖、酪氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、单硬脂酸甘油酯、亚油酸、甘油中的一种 或多种。
[0009]在一方面，本发明提供用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损和/或 将发展2型糖尿病和/或将发展2型糖尿病相关并发症的方法，所述方法包括：
[0010] 在受试者的样品中测定上述中一种或多种标志物的水平；
[0011] 将受试者样品中的一种或多种标志物的水平与对照样品中的一种或多种标志物 的水平相比较，其中与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比，受试者样品中的一种 或多种标志物的水平的差异指示所述受试者具有或将发展葡萄糖耐量受损。
[0012] 在另一方面，本发明提供用于确定具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者 是否将对疗法有反应的方法，所述方法包括：
[0013] 在受试者的样品中测定上述一种或多种标志物的水平；
[0014] 将受试者样品中的一种或多种标志物的水平与对照样品中的一种或多种标志物 的水平相比较，其中与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比，受试者样品中的一种 或多种标志物的水平的差异指示所述受试者将对所述疗法有反应。
[0015] 在另一方面，本发明提供用于抑制受试者的葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的发 展的方法。所述方法包括给予所述受试者有效量的试剂，所述试剂调节本发明的任何一种 或多种标志物的表达和/或活性，从而抑制受试者的葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的发 展。
[0016] 在一个实施方案中，受试者样品中的水平通过质谱法测定。在一个实施方案中，所 述质谱法是基质辅助的激光解吸/飞行时间(MALDI/T0F)质谱法、液相色谱四重离子捕获电 喷射(LCQ-MS)或表面增强激光解吸电离/飞行时间（SELDI/T0F)质谱法。
[0017] 在另一个实施方案中，受试者样品中的水平通过免疫测定法测定。
[0018] 受试者的样品可以是流体样品或组织样品。
[0019] 在一个实施方案中，所述标志物的水平是标志物的表达水平和/或活性。
[0020] 在一个实施方案中，所述受试者具有发展2型糖尿病的风险。
[0021] 在一个方面，本发明提供用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损或将 发展2型糖尿病或将发展2型糖尿病并发症的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中 权利要求1中的一种或多种标志物的水平的试剂和确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐 量受损或将发展2型糖尿病或将发展2型糖尿病并发症的试剂盒使用说明书。
[0022] 在另一方面，本发明提供用于确定具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者 是否将对治疗有反应的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定上述中的一种或 多种标志物的水平的试剂和确定受试者是否将对所述治疗有反应的试剂盒使用说明书。
[0023] 在又一方面，本发明提供在具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者中监测 治疗的功效的试剂盒。所述试剂盒包括用于测定受试者样品中的一种或多种标志物的水平 的试剂，和监测所述治疗的功效的试剂盒使用说明书。
[0024] 在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包括用于从受试者获得样品的试剂。
[0025] 在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包括对照样品。
[0026] 在一个方面，本发明提供用于鉴定2型糖尿病标志物的方法，所述方法包括：
[0027] 在稳定状态条件下，鉴定来自两个或更多物种的两种或更多种的血液，从而产生 标志物的临时列表；
[0028] 在功能障碍条件下鉴定临时列表中标志物；
[0029]在正常条件下鉴定临时列表中标志物；
[0030]测定试验样品和对照样品的样品中的标志物的水平，其中与试验样品中的水平相 比，对照样品中标志物的水平的差异鉴定所述标志物为2型糖尿病生物标志物；
[0031] 其中试验样品来自具有葡萄糖耐量受损的受试者或来自新诊断为2型糖尿病的受 试者或来自已确定为2型糖尿病的受试者；
[0032] 其中对照样品来自具有正常葡萄糖耐量的受试者或来自具有葡萄糖耐量受损的 受试者或来自新诊断为2型糖尿病的受试者。
[0033] 附图简述
[0034]图1:实施例1，以胱氨酸为标志物时的R0C图；
[0035]图2:实施例2,以葡萄糖为标志物时的R0C图；
[0036]图3:实施例10,以异亮氨酸为标志物时的R0C图；
[0037]图4:实施例20,以胱氨酸和甘油为标志物时的R0C图；
[0038]图5:实施例30,以葡萄糖和D-塔罗糖为标志物时的R0C图；
[0039]图6:实施例40,以胱氨酸、葡萄糖和甘油为标志物时的R0C图；
[0040]图7:实施例50,以天冬氨酸、葡萄糖和甘油为标志物时的R0C图；
[00411图8:实施例70,以胱氨酸、天冬氨酸、β-甘露糖甘油酸酯和甘油为标志物时的R0C 图；
[0042]图9:实施例55,以葡萄糖、β-甘露糖甘油酸酯和D-塔罗糖为标志物时的R0C图；
[0043] 图10:主成分分析图，其中圆形代表健康组，矩形代表糖尿病组。
【具体实施方式】
[0044] 本发明至少部分地基于与葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的发展、2型糖尿病的 进展和具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者对治疗有反应相关的标志物的发现。
[0045] 因此，本发明通过测量和鉴定特定的标志物或特定的标志物组合，提供用于预测 受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的方法和试剂盒、用于预测受试者是否具有或将 发展糖尿病的方法和试剂盒、以及用于鉴定可减慢葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的进展 的化合物的方法、监测疗法在降低受试者的葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的进展中的功 效的方法、和用于抑制在细胞或受试者中葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的进展的方法。
[0046] 本发明的各个方面更详细地描述于以下节段中：
[0047] 定义
[0048] 如本文所用，以下术语的每一个具有与其在本部分中相关的含义。
[0049] 冠词〃一个〃和〃一种〃在本文用于指该冠词的一个或超过一个（即至少一个）的语 法对象。例如，"要素"意指一个要素或超过一个要素。
[0050] "标志物"或"生物标志物"是与另一种表型状态(例如未患有疾病)相比，在取自一 种表型状态(例如患有疾病）的受试者的样品中差别存在的有机生物分子。如果在不同组中 生物标志物的平均或中位水平、例如表达水平经计算为统计学显著的，则生物标志物在不 同的表型状态中差别存在。统计学显著性的常见检验特别包括t-检验）漏￥六、&1^1?11-Wallis、Wilcoxon、Mann_Whitney和优势比。单独或组合的生物标志物提供受试者属于一种 表型状态或另一种表型状态的相对风险的度量。因此，它们用作标志物，例如，用于疾病(预 后和诊断）、药物的治疗功效(治疗诊断学)和药物毒性的标志物。
[0051 ]在一些实施方案中，用于本发明的组合物和方法的标志物的准确性可通过接收器 工作特征曲线（"ROC曲线"）来表征。ROC是对于诊断标志物的不同可能的割点的真阳性率相 对假阳性率的曲线。R0C曲线显示灵敏性和特异性之间的关系。即是说，灵敏性的增加将伴 随特异性的降低。曲线越靠近R0C空间的左轴，然后顶缘，标志物越准确。相反地，曲线越靠 近R0C图的45度对角线，标志物越不准确。R0C下的面积是标志物准确性的度量。标志物的准 确性取决于标志物如何适当地将待测试的组分成具有所述疾病的组和不具有所述疾病的 组。曲线下面积(称为"AUC"）为1表示完美的标志物，而面积为0.5表示有用性较差的标志 物。因此，在一些实施方案中，本发明的生物标志物和方法的AUC大于约0.50、大于约0.60或 大于约0.70。
[0052] "2型糖尿病"在本文中亦称为"糖尿病"，特征为外周胰岛素抵抗和胰脏β细胞的不 充分的胰岛素分泌的组合。如果受试者的空腹血糖(FPG)水平为约126mg/dL(约7.0mmol/L) 或更高；在75-g 口服葡萄糖耐量试验（0GTT)期间2-小时血糖（PG)水平为约200mg/dL(约 11. lmmol/L)或更尚；在具有尚血糖症或尚血糖危象的症状的受试者中随机血糖为约 20〇11^/北(约11.1111111〇1/1)或更高 ;和/或血红蛋白41(3(池41(3)水平为约6.5%或更高，则"受 试者具有糖尿病"。
[0053]具有"正常葡萄糖耐量"或"NGT"的受试者在75-g口服葡萄糖耐量试验(0GTT)期间 2-小时血糖(PG)水平为小于约140mg/dL(小于约7.8mmo 1 /L);空腹血糖(FPG)水平为小于约 110mg/dL(小于约6. lmmol/L);和/或血红蛋白Alc(HbAlc)水平为小于约6%。
[0054] "具有发展糖尿病的风险的受试者"是这样的受试者，其持续血压为约135/80mmHg 或更高；超重（例如体重指数（BMI)大于约30kg/m2);与糖尿病第一度相关;HDL水平为约 35mg/dL或更高和/或甘油三酯水平小于约250mg/dL;年龄为45岁或更大;是女性;具有妊娠 糖尿病史;具有多囊卵巢综合症;具有与代谢综合征相关的病况;是西班牙人;是非洲籍美 国人;和/或是土著美国人。此外，许多药物治疗和其它疾病可能使受试者具有发展糖尿病 的风险。例如，糖皮质激素类、噻嗪类、β阻滞剂、非典型抗精神病药物和他汀类药物可能使 受试者具有发展糖尿病的风险。之前已患有肢端肥大症、甲状腺功能亢进、嗜铬细胞瘤和某 些癌症例如胰高血糖素瘤和睾酮缺乏的受试者也具有发展2型糖尿病的风险。
[0055] 受试者，例如具有发展糖尿病风险的受试者，可能是"前驱糖尿病的"。如果受试者 具有葡萄糖耐量受损，则认为所述受试者是"前驱糖尿病的"。"葡萄糖耐量受损"是高血糖 症的一种状态，其与胰岛素抵抗和心血管病理风险增加有关。当2小时后受试者具有中间升 高的葡萄糖水平，但低于对于2型糖尿病所限定的水平，则受试者具有葡萄糖耐量受损。空 腹血糖可能是正常的或略微升高的。
[0056] 在75-g口服葡萄糖耐量试验(0GTT)期间，具有葡萄糖耐量受损的受试者的2-小时 血糖(PG)水平为约140mg/dL(约7.8mmol/L)或更高(例如在约7.8和llmmol/L之间）；空腹血 糖(FPG)水平为小于约126mg/dL(小于约7mmol/L)(例如在约95和约125mg/dL之间）；血红蛋 白Alc(HbAlc)水平为约6%或更高（例如在约6.0和6.4之间）；和/或BMI为约24kg/m 2或更 大。
[0057]受试者，例如具有发展糖尿病风险的受试者，可能具有"空腹糖血受损"。在75-g口 服葡萄糖耐量试验(0GTT)期间，具有空腹糖血受损的受试者的2-小时血糖(PG)水平为小于 约140mg/dL(小于约7 · 8mmο 1 /L);空腹血糖（FPG)水平为小于约126mg/dL(小于约7mmo 1/L) (例如在约110和约125mg/dL之间）；和/或血红蛋白Alc(HbAlc)水平为约6%或更高(例如在 约6.0和6.4之间）。
[0058]术语"糖尿病已发展"是指在受试者中，正常葡萄糖耐量发展为空腹糖血受损；正 常葡萄糖耐量发展为葡萄糖耐量受损;正常葡萄糖耐量发展为2型糖尿病;空腹糖血受损发 展为葡萄糖耐量受损;空腹糖血受损发展为2型糖尿病;和/或葡萄糖耐量受损发展为2型糖 尿病。
[0059] "标志物的水平"或"生物标志物的水平"是指在待测试的样品中存在的标志物的 量。标志物的水平可以是绝对水平或量(例如μg/ml)或相对水平或量(例如相对信号强度）。
[0060] 标志物的"更高水平"或"水平增加"是指大于用于评估标志物水平的测定法的标 准误差的试验样品中的标志物水平，和优选为对照样品中标志物水平(例如来自具有正常 葡萄糖耐量的受试者、具有空腹糖血受损的受试者、具有葡萄糖耐量受损的受试者、在过去 18个月内已经诊断为2型糖尿病的受试者的样品和/或几种对照样品中标志物的平均水平） 的至少1.5倍、和更优选3、4、5、6、7、8、9或10或更多倍。
[0061] 标志物的"更低水平"或"水平降低"是指小于用于评估标志物水平的测定法的标 准误差的试验样品中的标志物的水平，和优选为对照样品中标志物水平(例如来自具有正 常葡萄糖耐量的受试者、具有空腹糖血受损的受试者、具有葡萄糖耐量受损的受试者、在过 去18个月内已经诊断为2型糖尿病的受试者的样品和/或几种对照样品中标志物的平均水 平）的至多 1/2、和更优选 1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9或1/10或更低。
[0062] 术语"已知的标准水平"或"对照水平"是指标志物的公认的或预定的水平，其用于 比较来自受试者的样品中的标志物的水平。在一个实施方案中，标志物的对照水平基于来 自具有正常葡萄糖耐量的受试者的样品中的标志物的水平。在另一实施方案中，标志物的 对照水平基于来自具有空腹糖血受损的一个或多个受试者的样品中的标志物的水平。在另 一实施方案中，标志物的对照水平基于来自具有葡萄糖耐量受损的受试者的样品中的标志 物的水平。在另一实施方案中，标志物的对照水平基于来自在过去18个月内已经诊断为2型 糖尿病的受试者的样品中的标志物的水平。在一个实施方案中，来自受试者的样品中的标 志物的对照水平是之前在受试者的样品中已确定的标志物的水平。
[0063] 在又一个实施方案中，标志物的对照水平基于在给予对空腹糖血受损、葡萄糖耐 量受损和/或2型糖尿病的疗法之前来自受试者的样品中的标志物的水平。在另一实施方案 中，标志物的对照水平基于来自未与试验化合物接触的具有空腹糖血受损、葡萄糖耐量受 损和/或2型糖尿病的受试者的样品中的标志物的水平。在另一实施方案中，标志物的对照 水平基于来自与试验化合物接触的具有正常葡萄糖耐量的受试者的样品中的标志物的水 平。在一个实施方案中，标志物的对照水平基于来自空腹糖血受损、葡萄糖耐量受损和/或2 型糖尿病的动物模型的样品中的标志物的表达水平;源自空腹糖血受损、葡萄糖耐量受损 和/或2型糖尿病的动物模型的细胞或细胞系的样品中的标志物的表达水平。
[0064] 在其它实施方案中，标志物的"对照"水平可通过测定获自在受试者中怀疑空腹糖 血受损、葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病发作之前的受试者的受试者样品、获自存档的受 试者样品等的标志物的水平来确定。
[0065] 如本文所用的，术语〃患者〃或"受试者"是指人和非人动物，例如兽医学患者。术语 "非人动物"包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、小鼠、 兔、绵羊、狗、猫、马、奶牛、鸡、两栖动物和爬行动物。在一个实施方案中，所述受试者是人。
[0066] 在一些实施方案中，受试者的体重指数(BMI)为小于约40kg/m2(例如约40、39、38、 37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19或约181^/111 2)。在其它实 施方案中，受试者的体重指数(BMI)为大于约40kg/m2(例如约41、42、43、44、45、46、47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、 74、75、76、77、78、79或约801^/111 2)。
[0067] 本文所用的术语"样品"是指自受试者分离的类似细胞或组织的收集物，以及在受 试者内存在的组织、细胞和流体。术语"样品"包括来自受试者的任何体液(例如血液、淋巴、 妇科流体、囊液、尿液、眼泪和通过支气管灌洗和/或腹膜冲洗收集的流体)或细胞。在一个 实施方案中，从受试者取出所述组织或细胞。在另一实施方案中，所述或细胞存在于所述受 试者内。其它受试者样品包括泪滴、血清、脑脊液、粪便、痰和细胞提取物。在一个实施方案 中，生物学样品包含来自测试受试者的蛋白分子。在另一实施方案中，生物学样品可包含来 自测试受试者的mRNA分子或来自测试受试者的基因组DNA分子。
[0068] 术语〃测定〃意指包括检测样品中标志物的存在或不存在、定量测定样品中标志物 的量、和/或确定生物标志物的类型的方法。测量可通过本领域已知的方法和本文进一步描 述的那些方法实现。
[0069]试剂盒是包含特异性检测本发明的标志物的至少一种试剂例如探针、引物或抗体 的任何制品（例如包装或容器），所述制品作为用于进行本发明的方法的一个单位来推销、 分配或销售。在某些实施方案中，试剂盒可包括基质，例如包含本发明的一种或多种标志物 的捕获试剂和/或与本发明的一种或多种标志物结合的捕获试剂的基质。在一些实施方案 中，这样的试剂盒包含用于使用质谱测定标志物的水平的使用说明书。
[0070] 本发明的标志物
[0071] 本发明的一个方面，提供一种用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损 或将发展2型糖尿病的标志物，其包括:胱氨酸、葡萄糖、山梨糖、天冬酰胺、赖氨酸、异亮氨 酸、苏氨酸、富马酸、羟基脲、木糖、酪氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、单硬脂酸甘油酯、亚油酸、甘 油、甘露糖甘油酸酯、D-塔罗糖中的一种或多种。
[0072] 胱氨酸(cystine):别名双巯丙氨酸;3,3'_二硫代二丙氨酸。胱氨酸为氨基酸类药 物，能促进细胞氧化还原功能，使肝脏功能旺盛，并能中和毒素、促进白细胞增生、阻止病原 菌发育。
[0073] 葡萄糖(glucose):化学式C6H1206，又称为玉米葡糖、玉蜀黍糖，简称为葡糖。葡萄 糖在生物学领域具有重要地位，是活细胞的能量来源和新陈代谢中间产物，即生物的主要 供能物质。能促进肝脏的解毒功能，对肝脏有保护作用。
[0074]山梨糖（sorbose):分子式C6H12O,属于单糖中酮糖之一，白色晶体或结晶粉末，用 于动物和微生物的代谢研究。
[0075] 天冬酰胺(asparagine): L-天门冬酰胺，线性分子式H2NCOCH2CH(NH2)C00H。
[0076]赖氨酸（17以1^):(：此4他02，赖氨酸是人体必需氨基酸之一，能促进人体发育、增强 免疫功能，并有提高中枢神经组织功能的作用。赖氨酸在体内的功能有:参与体蛋白如骨骼 肌、酶和多肽激素的合成；是生酮氨基酸之一，当缺乏可利用的碳水化合物时，可参与生成 酮体和葡萄糖的代谢(在禁食情况下，是重要的能量来源之一）；维持体内酸碱平衡;作为合 成肉毒碱的前体物，参与脂肪代谢;另外，赖氨酸还可以提高机体抵抗应激的能力。
[0077]异亮氨酸（IS〇leuCine) :C6H13N02,异亮氨酸的作用包括与亮氨酸和缬氨酸一起合 作修复肌肉，控制血糖，并给身体组织提供能量。
[0078]苏氨酸（threonine ):C4H9N〇3,是一种必需的氨基酸，苏氨酸在机体内的代谢途径 和其他氨基酸不同，是唯一不经过脱氢酶作用和转氨基作用，而是通过苏氨酸脱水酶(TDH) 和苏氨酸脱酶(TDG)以及醛缩酶催化而转变为其他物质的氨基酸。途径主要有3条:通过醛 缩酶代谢为甘氨酸和乙醛;通过TDG代谢为氨基丙酸、甘氨酸、乙酰C0A;通过TDH代谢为丙酸 和氨基丁酸。
[0079] 富马酸(fumaric acid) :C4H4〇4,富马酸盐在清除炎症过程中释放自由基，从而保 护神经和胶质细胞。
[0080] 木糖(xylose):木糖是木聚糖的一个组分，木聚糖广泛存在于植物中。木糖也存在 于动物肝素、软骨素和糖蛋白中，它是某些糖蛋白中糖链与丝氨酸(或苏氨酸)的连接单位。
[0081] 酪氨酸（tyrosine) :C9HiiN〇3〇
[0082] 亮氨酸（leucine) :C6H13N02,亮氨酸的作用包括与异亮氨酸和缬氨酸一起合作修 复肌肉，控制血糖，并给身体组织提供能量。
[0083]天冬氨酸(aspartic acid):又称天门冬氨酸，是一种α-氨基酸，天冬氨酸普遍存 在于生物合成作用中。它是生物体内赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸等氨基酸及嘌呤、嘧 啶碱基的合成前体。
[0084] 亚油酸（linoleic acid) :Ci8H32〇2〇
[0085] 甘油（glycerol)、β_甘露糖甘油酸酯（beta-Mannosylglycerate)、D_塔罗糖（D_ Talose)〇
[0086] 在本发明的某些方面，单个标志物可用于本发明的方法和组合物。例如，在一个实 施方案中，用于本发明的方法和组合物的标志物是胱氨酸。在一个实施方案中，标志物是葡 萄糖。在一个实施方案中，标志物是山梨糖。在一个实施方案中，标志物是天冬酰胺。在一个 实施方案中，标志物是赖氨酸。在一个实施方案中，标志物是异亮氨酸。在一个实施方案中， 标志物是单硬脂酸甘油酯。在一个实施方案中，标志物是亚油酸。在一个实施方案中，标志 物是甘油。在一个实施方案中，标志物是甘露糖甘油酸酯。在一个实施方案中，标志物是 D-塔罗糖。
[0087] 在本发明的其它方面，超过一种标志物，例如多种标志物，例如2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11或更多种标志物，可用于本发明的方法和组合物。例如，在一个实施方案中，用于本发 明的方法和组合物的标志物包括胱氨酸和葡萄糖。在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸 和山梨糖。在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸和天冬酰胺。在一个实施方案中，标志物 包括胱氨酸和赖氨酸。在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸和异亮氨酸。在一个实施方案 中，标志物包括胱氨酸和苏氨酸。在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸和富马酸。在一个 实施方案中，标志物包括胱氨酸和羟基脲。在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸和木糖。 在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸和酪氨酸。在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸和 亮氨酸。在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸和天冬氨酸。在一个实施方案中，标志物包 括胱氨酸和单硬脂酸甘油酯。在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸和亚油酸。在一个实施 方案中，标志物包括胱氨酸和甘油。在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸和β-甘露糖甘油 酸酯。在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸和D-塔罗糖。在一个实施方案中，标志物包括 葡萄糖和山梨糖。在一个实施方案中，标志物包括葡萄糖和天冬酰胺。在一个实施方案中， 标志物包括葡萄糖和赖氨酸。在一个实施方案中，标志物包括葡萄糖和异亮氨酸。在一个实 施方案中，标志物包括葡萄糖和苏氨酸。在一个实施方案中，标志物包括葡萄糖和富马酸。 在一个实施方案中，标志物包括葡萄糖和羟基脲。在一个实施方案中，标志物包括葡萄糖和 木糖。在一个实施方案中，标志物包括葡萄糖和酪氨酸。在一个实施方案中，标志物包括葡 萄糖和亮氨酸。在一个实施方案中，标志物包括葡萄糖和天冬氨酸。在一个实施方案中，标 志物包括葡萄糖和单硬脂酸甘油酯。在一个实施方案中，标志物包括葡萄糖和亚油酸。在一 个实施方案中，标志物包括葡萄糖和甘油。在一个实施方案中，标志物包括葡萄糖和β-甘露 糖甘油酸酯。在一个实施方案中，标志物包括葡萄糖和D-塔罗糖。
[0088] 在一个实施方案中，标志物包括山梨糖和天冬酰胺。在一个实施方案中，标志物包 括山梨糖和赖氨酸。在一个实施方案中，标志物包括山梨糖和异亮氨酸。在一个实施方案 中，标志物包括山梨糖和苏氨酸。在一个实施方案中，标志物包括山梨糖和富马酸。在一个 实施方案中，标志物包括山梨糖和羟基脲。在一个实施方案中，标志物包括山梨糖和木糖。 在一个实施方案中，标志物包括山梨糖和酪氨酸。在一个实施方案中，标志物包括山梨糖和 亮氨酸。在一个实施方案中，标志物包括山梨糖和天冬氨酸。在一个实施方案中，标志物包 括山梨糖和单硬脂酸甘油酯。在一个实施方案中，标志物包括山梨糖和亚油酸。在一个实施 方案中，标志物包括山梨糖和甘油。在一个实施方案中，标志物包括山梨糖和甘露糖甘油 酸酯。在一个实施方案中，标志物包括山梨糖和D-塔罗糖。
[0089] 在一个实施方案中，标志物包括天冬酰胺和赖氨酸。在一个实施方案中，标志物包 括天冬酰胺和异亮氨酸。在一个实施方案中，标志物包括天冬酰胺和苏氨酸。在一个实施方 案中，标志物包括天冬酰胺和富马酸。在一个实施方案中，标志物包括天冬酰胺和羟基脲。 在一个实施方案中，标志物包括天冬酰胺和木糖。在一个实施方案中，标志物包括天冬酰胺 和酪氨酸。在一个实施方案中，标志物包括天冬酰胺和亮氨酸。在一个实施方案中，标志物 包括天冬酰胺和天冬氨酸。在一个实施方案中，标志物包括天冬酰胺和单硬脂酸甘油酯。在 一个实施方案中，标志物包括天冬酰胺和亚油酸。在一个实施方案中，标志物包括天冬酰胺 和甘油。在一个实施方案中，标志物包括天冬酰胺和甘露糖甘油酸酯。在一个实施方案 中，标志物包括天冬酰胺和D-塔罗糖。
[0090] 在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸、葡萄糖和山梨糖。在一个实施方案中，标 志物包括胱氨酸、葡萄糖和天冬酰胺。在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸、葡萄糖和赖 氨酸。在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸、葡萄糖和异亮氨酸。在一个实施方案中，标志 物包括胱氨酸、葡萄糖和富马酸。在一个实施方案中，标志物包括、D-塔罗糖、β-甘露糖甘油 酸酯和山梨糖。在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸、甘露糖甘油酸酯和亚油酸。在一 个实施方案中，标志物包括甘露糖甘油酸酯、单硬脂酸甘油酯和山梨糖。在一个实施方案 中，标志物包括β-甘露糖甘油酸酯、D-塔罗糖和单硬脂酸甘油酯。在一个实施方案中，标志 物包括甘露糖甘油酸酯、葡萄糖和亮氨酸。在一个实施方案中，标志物包括甘露糖甘油 酸酯、甘油和山梨糖。在一个实施方案中，标志物包括甘露糖甘油酸酯、D-塔罗糖和胱氨 酸。在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸、葡萄糖、山梨糖和天冬酰胺。在一个实施方案 中，标志物包括胱氨酸、葡萄糖、山梨糖和赖氨酸。在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸、 葡萄糖、山梨糖和异亮氨酸。在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸、葡萄糖、山梨糖和苏氨 酸。在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸、葡萄糖、山梨糖和富马酸。在一个实施方案中， 标志物包括胱氨酸、葡萄糖、山梨糖、天冬酰胺和赖氨酸。在一个实施方案中，标志物包括胱 氨酸、葡萄糖、山梨糖、天冬酰胺和异亮氨酸。在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸、葡萄 糖、山梨糖、天冬酰胺和苏氨酸。在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸、葡萄糖、山梨糖、天 冬酰胺、异亮氨酸和赖氨酸。在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸、葡萄糖、山梨糖、天冬 酰胺、异亮氨酸、苏氨酸和赖氨酸。在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸、葡萄糖、山梨糖、 天冬酰胺、异亮氨酸、苏氨酸、富马酸和赖氨酸。在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸、葡 萄糖、山梨糖、天冬酰胺、异亮氨酸、苏氨酸、富马酸、羟基脲和赖氨酸。在一个实施方案中， 标志物包括胱氨酸、葡萄糖、山梨糖、天冬酰胺、异亮氨酸、苏氨酸、富马酸、羟基脲、木糖和 赖氨酸。在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸、葡萄糖、山梨糖、天冬酰胺、异亮氨酸、苏氨 酸、富马酸、羟基脲、酪氨酸和赖氨酸。在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸、葡萄糖、山梨 糖、天冬酰胺、异亮氨酸、苏氨酸、富马酸、羟基脲、酪氨酸、亮氨酸和赖氨酸。在一个实施方 案中，标志物包括胱氨酸、葡萄糖、山梨糖、天冬酰胺、异亮氨酸、苏氨酸、富马酸、羟基脲、酪 氨酸、亮氨酸、天冬氨酸和赖氨酸。在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸、葡萄糖、山梨糖、 天冬酰胺、异亮氨酸、苏氨酸、富马酸、羟基脲、酪氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、单硬脂酸甘油酯 和赖氨酸。在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸、葡萄糖、山梨糖、天冬酰胺、异亮氨酸、苏 氨酸、富马酸、羟基脲、酪氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、单硬脂酸甘油酯、亚油酸和赖氨酸。在一 个实施方案中，标志物包括胱氨酸、葡萄糖、山梨糖、天冬酰胺、异亮氨酸、苏氨酸、富马酸、 羟基脲、酪氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、单硬脂酸甘油酯、亚油酸、甘油和赖氨酸。
[0091 ]在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸、葡萄糖、山梨糖、天冬酰胺、异亮氨酸、苏 氨酸、富马酸、羟基脲、酪氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、单硬脂酸甘油酯、亚油酸、甘油、甘露糖 甘油酸酯和赖氨酸。在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸、葡萄糖、山梨糖、异亮氨酸、苏 氨酸、富马酸、羟基脲、酪氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、单硬脂酸甘油酯、亚油酸、甘油、甘露糖 甘油酸酯、D-塔罗糖和赖氨酸。
[0092] 在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸、葡萄糖、山梨糖、天冬酰胺、异亮氨酸、苏 氨酸、富马酸、羟基脲、酪氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、单硬脂酸甘油酯、亚油酸、甘油、甘露糖 甘油酸酯和赖氨酸。在一个实施方案中，标志物包括胱氨酸、葡萄糖、山梨糖、天冬酰胺、异 亮氨酸、苏氨酸、富马酸、羟基脲、酪氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、单硬脂酸甘油酯、亚油酸、甘 油、β-甘露糖甘油酸酯、D-塔罗糖和赖氨酸。
[0093] 本发明的一个方面提供获取所述标志物的方法，其具体步骤在于：
[0094] 1、获取受试者样品，并进行前处理；
[0095] 2、将前处理过的受试者样品进行GC-MS或者LC-MS进行检测，收集数据；
[0096] 3、进行数据分析，获取可行的标志物。
[0097] 上述步骤中，所述受试者样品可以是固体、液体，也可以是细胞、微生物等。
[0098] 作为一种实施方式，当所述受试者样品为固体时，所述具体前处理的方法为：将 100mg固体溶于400yL提取试剂，加入钢珠进行研磨，所述研磨的条件为30Hz，5分钟;然后进 行离心，取上清。
[0099] 若要进行GC-MS测试，可进行浓缩干燥。所述浓缩干燥的步骤为将上清中加入 20mg/ml的甲氧胺，在80 °C下干燥20min，然后加入试剂BSTFA下进行衍生化处理1小时后，进 行测试。
[0100] 若要进行LC-MS测试，则只需将上清液进行浓缩干燥，加入100yL乙腈进行复溶，经 过滤塞，可直接进行LC-MS测试。
[0101] 作为一种实施方式，所述受试者样品为液体时，例如血清、尿液等。所述具体前处 理的方法为：100yL液体加入350yL甲醇中，进行斡旋混匀，高速离心，取上清液，进行测试。
[0102] 若要进行GC-MS测试，可进行浓缩干燥。所述浓缩干燥的步骤为将上清中加入 20mg/ml的甲氧胺，在80 °C下干燥20min，然后加入试剂BSTFA下进行衍生化处理1小时后，进 行测试。
[0103] 若要进行LC-MS测试，则只需将上清液进行浓缩干燥，加入100yL乙腈进行复溶，经 过滤塞，可直接进行LC-MS测试。
[0104] 作为一种实施方式，所述受试者样品为微生物时，所述处理方式与细胞的处理方 式一样。
[0105] 本发明的方法
[0106] 在某些方面，本发明提供诊断方法。例如，在一个方面，本发明提供用于确定受试 者是否具有葡萄糖耐量受损的方法。所述方法包括测定在受试者样品中的本发明的一种或 多种标志物的水平与在对照样品中的所述一种或多种标志物的水平。与对照样品中一种或 多种标志物的水平相比，受试者样品中的一种或多种标志物的水平差异(例如更高或更低） 指示所述受试者具有葡萄糖耐量受损。
[0107] 在另一方面，本发明提供用于确定受试者是否具有2型糖尿病的方法。所述方法包 括测定在受试者样品中的本发明的一种或多种标志物的水平与在对照样品中的所述一种 或多种标志物的水平。与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比，受试者样品中的一 种或多种标志物的水平差异(例如更高或更低)指示所述受试者具有2型糖尿病。
[0108] 本发明还提供预后方法。例如，在一个方面，本发明提供用于确定受试者是否将发 展葡萄糖耐量受损的方法。所述方法包括测定在受试者样品中的本发明的一种或多种标志 物的水平与在对照样品中的所述一种或多种标志物的水平。与对照样品中的一种或多种标 志物的水平相比，受试者样品中的一种或多种标志物的水平差异(例如更高或更低)指示所 述受试者将发展葡萄糖耐量受损。
[0109] 在另一方面，本发明提供用于确定受试者是否将发展2型糖尿病的方法。所述方法 包括测定在受试者样品中的本发明的一种或多种标志物的水平与在对照样品中的所述一 种或多种标志物的水平。与对照样品中一种或多种标志物的水平相比，受试者样品中的一 种或多种标志物的水平差异(例如更高或更低)指示所述受试者将发展2型糖尿病。
[0110] 多种并发症与葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病相关，尤其是与长期的葡萄糖耐量 受损和/或2型糖尿病相关。例如，这样的受试者具有2-4倍风险的心血管疾病(包括缺血性 心脏病和中风）、下肢截肢增加20倍和住院率增加。2型糖尿病也是非创伤性致盲和肾病(包 括肾衰竭)的最主要原因，并与认知功能障碍和痴呆(通过疾病过程例如阿尔茨海默病和血 管性痴呆）的风险增加相关。其它并发症包括例如神经病、黑棘皮病、性功能障碍和经常感 染。
[0111] 因为本发明的标志物已显示在新诊断为2型糖尿病的受试者和已确定为2型糖尿 病的那些受试者(例如具有长期葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的那些受试者）中差异表 达，因此本发明还提供用于确定受试者是否将发展2型糖尿病相关并发症的方法。所述方法 包括测定在受试者样品中的本发明的一种或多种标志物的水平与在对照样品中的所述一 种或多种标志物的水平。与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比，受试者样品中的 一种或多种标志物的水平差异(例如更高或更低)指示所述受试者将对糖尿病疗法有反应。
[0112]在另一方面，本发明提供用于确定具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者 是否将对治疗方案有反应的方法。所述方法包括测定在受试者样品中的本发明的一种或多 种标志物的水平与在对照样品中的所述一种或多种标志物的水平。与对照样品中的一种或 多种标志物的水平相比，受试者样品中的一种或多种标志物的水平差异(例如更高或更低） 指示所述受试者将对治疗有反应。
[0113]本领域已知多种糖尿病疗法，包括例如胰岛素致敏剂，例如双胍类（例如二甲双 胍)和噻唑烷二酮类(例如罗格列酮、啦格列酮、曲格列酮）；促分泌剂，例如磺脲类(例如格 列本脲、格列吡嗪、格列美脲、甲苯磺丁脲、醋酸己脲、妥拉磺脲、氯磺丙脲、格列齐特、格列 喹酮）、非磺脲类促分泌剂例如氯茴苯酸衍生物(例如瑞格列奈、那格列奈）；二肽基肽酶IV 抑制剂(例如西他列汀、沙格列汀、利拉利汀、维达列汀、阿格列汀）；α-糖苷酶抑制剂(例如 阿卡波糖、米格列醇、伏格列波糖）；胰岛淀粉样多肽模拟物(例如醋酸普兰林肽）；肠降血糖 素模拟物(例如艾塞那肽、利拉鲁肽、他司鲁肽）；胰岛素和其类似物(例如快速起效、缓慢起 效和中等起效）；胆汁酸多价螯合剂(例如考来维仑）；和多巴胺激动剂(例如溴隐亭），单独 或组合使用。
[0114] 在本发明的某些实施方案中，所述治疗包括胰岛素致敏剂。在另一实施方案中，所 述治疗包括胰岛素致敏剂和促分泌剂。在又一个实施方案中，所述治疗包括胰岛素致敏剂、 促分泌剂和胰岛素。
[0115] 本发明的方法可与技术人员用于诊断、预测和/或监测受试者的葡萄糖耐量受损 和/或2型糖尿病和/或2型糖尿病并发症和/或对治疗的反应的任何其它方法一起实施。例 如，本发明的方法可与本领域已知的葡萄糖耐量、肥胖和/或糖尿病的任何临床测量一起进 行，所述测量包括其它分子标志物的血清学、细胞学和/或检测(和定量，如果合适的话）。
[0116] 在本发明的任何方法(和试剂盒）中，获自受试者的样品中本发明的标志物的水平 可通过各种众所周知的技术和方法中的任一种来测定，其将样品中的本发明的标志物转化 成可检测和定量的部分。这样的方法的非限制性实例包括使用用于检测蛋白质的免疫学方 法、蛋白质纯化方法、蛋白质功能或活性测定法、核酸杂交方法、核酸逆转录方法和核酸扩 增方法、免疫印迹法、蛋白质印迹法、RNA印迹法、电子显微术、质谱法（例如MALDI -T0F和 SELDI-T0F)、免疫沉淀、免疫荧光、免疫组织化学、酶联免疫吸附测定法(ELISA)(例如扩增 ELISA)、基于血液的定量测定法（例如血清ELISA)、基于尿液的定量测定法、流式细胞术、 DNA杂交、阵列分析等和其组合或亚组合分析样品。
[0117]普通技术人员将容易理解的是，本领域已建立用于在核酸或蛋白水平上检测本发 明的标志物的水平的任何技术手段基本上都可用于测定本文所述的本发明的标志物的水 平。
[0118]在一个实施方案中，本发明的标志物的水平使用核酸探针来测定。本文所用的术 语"探针"是指能够选择性结合本发明的特定标志物的任何分子。探针可由本领域技术人员 合成，或来源于合适的生物制备物。探针可经特别设计为标记的。可用作探针的分子的实例 包括但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。
[0119] 在本发明的一个实施方案中，使用微阵列来检测本发明的标志物的水平。因为不 同实验之间的可再现性，微阵列特别地非常适合用于此目的。DNA微阵列提供一种用于同时 测量大量基因的水平的方法。各阵列由附着至固体支持物的可重现形式的捕获探针组成。 标记的RNA或DNA与阵列上的互补探针杂交，然后通过激光扫描检测。阵列上的各探针的杂 交强度经测定并转化成表示相对基因表达水平的定量值。
[0120] 用于在蛋白水平上检测本发明的标志物的其它已知方法包括以下方法，例如电 泳、毛细管电泳、高效液相色谱、薄层色谱、超扩散色谱等，或各种免疫学方法例如流体或凝 胶沉淀反应、免疫扩散、免疫电泳、放射免疫测定法、酶联免疫吸附测定法、免疫荧光测定法 和蛋白质印迹法。
[0121] 在本发明的一个实施方案中，使用蛋白质组方法，例如质谱法。质谱法是一种分析 技术，包括将化合物电离以产生带电分子(或其片段)和测量其质量-电荷比。在典型的质谱 程序中，自受试者获得样品，加载到质谱上，和其组分(例如本发明的标志物)通过不同的方 法电离(例如通过用电子束轰击它们），导致形成带电颗粒(离子）。然后当离子穿越电磁场 时，根据离子的运动计算颗粒的质量-电荷比。
[0122] 例如，基质辅助的激光解吸/电离飞行时间质谱法或表面增强激光解吸/电离飞行 时间质谱法，其包括应用生物样品例如血清至蛋白结合芯片可用于测定本发明的标志物的 水平。
[0123] 此外，用于测定本发明标志物的水平的体内技术包括将针对本发明标志物的标记 抗体引入到受试者中，所述抗体结合本发明的标志物并将其转化成可检测的分子。如上所 述，在受试者中本发明的可检测标志物的存在、水平或甚至位置可通过标准成像技术检测 而测定。
[0124] 总的来说，优选受试者样品中的本发明标志物的水平与对照样品中的本发明标志 物的量之间的差异尽可能的大。尽管该差异可能与用于测定标志物水平的方法的检测限度 一样小，但优选所述差异至少大于评估方法的标准误差，优选差异为评估方法的标准误差 的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、100、500、1000倍或更大。
[0125] 用于监测治疗功效的方法
[0126] 本发明还提供用于监测可用于在受试者中抑制葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病 的发展;降低或减慢正常葡萄糖耐量至空腹糖血受损、至葡萄糖耐量受损和/或至糖尿病的 进展;和/或降低或抑制与所述疾病相关的并发症的发展的疗法或治疗方案或任何其它治 疗方法的功效的方法。在这些方法中，评估在一对样品（不经过治疗方案的第一样品和经过 治疗方案的至少一部分的第二样品）中的本发明的一种或多种标志物的水平。相对于第二 样品，第一样品中一种或多种标志物的表达水平的调节表明所述疗法有效在受试者中抑制 葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的发展；降低或减慢正常葡萄糖耐量至空腹糖血受损、至 葡萄糖耐量受损和/或至糖尿病的进展；和/或降低或抑制与所述疾病相关的并发症的发 展。
[0127] 鉴定2型糖尿病生物标志物的方法
[0128] 本发明进一步提供用于鉴定2型糖尿病生物标志物的方法，所述生物标志物用作 例如疾病(预后和诊断）、药物的治疗功效（治疗诊断）和药物毒性的标志物。例如，如上所 述，本文所述的标志物和使用生物标志物发现的方法鉴定的标志物可用于例如确定受试者 是否具有或将发展葡萄糖耐量受损;确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病;确定具有2 型糖尿病的受试者是否将对糖尿病疗法有反应;监测用于在受试者中抑制葡萄糖耐量受损 和/或2型糖尿病的发展、降低或减慢正常葡萄糖耐量至空腹糖血受损、至葡萄糖耐量受损 和/或至糖尿病的进展和/或降低或抑制与所述疾病相关的并发症的发展的疗法的功效;鉴 定调节(例如降低或增加)用作例如疗法的本发明的标志物的表达和/或活性的分子的筛选 测定法中。
[0129] 2型糖尿病标志物还可通过以下来鉴定：测定提供至少一部分疗法给受试者之前 获自具有2型糖尿病的受试者的第一样品中的蛋白水平，和测定提供所述疗法的至少一部 分后获自所述受试者的第二样品中的蛋白水平。相对于第一样品，第二样品中蛋白表达水 平的差异，例如统计学显著水平，鉴定所述蛋白为2型糖尿病标志物。
[0130] 本发明的试剂盒
[0131]本发明还提供用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损和/或受试者是 否具有或将发展2型糖尿病的试剂盒。还提供确定受试者是否将发展2型糖尿病并发症、确 定疗法是否将有效治疗具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者的试剂盒和用于监 测疗法的功效的试剂盒。
[0132] 这些试剂盒包括测定本发明的一种或多种标志物的水平的工具和试剂盒使用说 明书。
[0133] 本发明的试剂盒可任选包含用于进行本发明方法的另外组分。例如，试剂盒可包 含用于从受试者获得生物样品的试剂、对照样品、一个或多个样品区室、糖尿病治疗剂、描 述进行本发明方法的指导材料和组织特异性对照/标准品。
[0134] 用于测定一种或多种标志物的水平的试剂可包括例如缓冲液或用于评价一种或 多种标志物的水平的测定法的其它试剂。说明书可以是例如用于进行评价本发明的一种或 多种标志物的水平的测定法的印刷的说明书。
[0135] 用于自受试者分离生物样品的试剂可包括可用于从受试者获得流体或组织的一 种或多种试剂，例如用于获得唾液或血液的工具。
[0136] 本发明的试剂盒可进一步包括用于培养获自受试者的样品的试剂。
[0137]优选，试剂盒经设计用于人类受试者。
[0138] 本发明通过以下实施例作进一步说明，实施例不应解释为进一步限制。本申请全 文所引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容，以及附图，明确地通过引用以其 整体结合到本文中。
[0139] 等效物
[0140] 在描述实例性实施方案中，为澄清的原因使用特定的术语。为描述的目的，各特定 的术语意指至少包括所有技术和功能等效物，其以类似的方式操作来实现类似的目的。此 外，在其中具体的实例性实施方案包括多个系统要素或方法步骤的一些实例中，那些要素 或步骤可替换为单一要素或步骤。同样，单一要素或步骤可替换为用于相同目的的多个要 素或步骤。此外，在本文指定实例性实施方案的各种性质的参数的情况下，那些参数可向上 或向下调整1/20、1/10、1/5、1/3等，或通过其四舍五入近似值调整，除非另有说明。此外，尽 管实例性实施方案已经参考其具体的实施方案进行显示和描述，但本领域普通技术人员将 理解，在不背离本发明的范围的情况下，可对其进行形式和细节上的各种替换和改变。还另 外，其它方面、功能和优点也在本发明的范围内。
[0141] 本文提供了实例性的流程图用于说明的目的，并且是非限制性的方法实例。本领 域普通技术人员将认识到，实例性的方法可包括比实例性流程图中说明的那些更多或更少 的步骤，并且实例性流程图中的步骤可以与所示不同的顺序进行。
[0142] 分组:分为正常组、2型糖尿病组、前驱糖尿病组、2型糖尿病相关的并发症组。
[0143] 选取1250个受试者，其中正常健康人320人;2型糖尿病300人;前驱糖尿病330人;2 型糖尿病相关的并发症300人。
[0144] 一、获取标志物
[0145] 步骤：1、获取受试者血清，并进行前处理：100yL液体加入350yL甲醇中，进行斡旋 混匀，高速离心，取上清液，进行浓缩干燥，加入lOOyL乙腈进行复溶，经过滤塞，可直接进行 GC-MS测试;收集GC-MS数据，进行主成份分析的方式统计出合适的标志物。主成分分析图如 图10所示。
[0146] 由图10的主成分分析图所示可知，正常组与糖尿病组样品基本可以明显区分，通 过后续的判别分析进一步研究其差异。
[0147] 采用GC-MS定量验证后发现2型糖尿病组、前驱糖尿病组、2型糖尿病相关的并发症 组，与正常人组相比，特异有差异的表达物质有:胱氨酸、葡萄糖、山梨糖、天冬酰胺、赖氨 酸、异亮氨酸、苏氨酸、富马酸、羟基脲、木糖、酪氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、单硬脂酸甘油酯、 亚油酸、甘油、甘露糖甘油酸酯、D-塔罗糖，结果如表1所示：
[0148] 表1糖尿病组对比正常组特异有差异的表达物质
[0150] 其中，倍数变化值是指糖尿病组某物质含量的均值除以正常人组该物质含量的均 值；
[0151] 组间变量重要性(VIP):某物质在两组之间的差异对组间差异的贡献度，一般认为 VIP>1的物质贡献度显著，VIP越大贡献度越大；
[0152] 相似度:在物质定性时，实检质谱图与标准谱库中的质谱图进行比对后的打分值， 满分1000分，越接近1000分说明实检质谱图与标准质谱图越类似，相当于定性越准确，一般 认为s imi lar i ty>800为定性准确。
[0153] 实施例如表2所示：
[0154] 表2【具体实施方式】




[0160] 其中，编号"2-3"代表以编号为2的标志物和编号为3的标志物组合联合诊断2型糖 尿病组和正常人组，也就是以葡萄糖和甘油为标志物组合联合诊断。其余编号以此类推。
[0161] 对比例1:去泛素化酶和神经束蛋白
[0162] 以去泛素化酶和神经束蛋白联合诊断2型糖尿病组和正常人组。
[0163] 结果如图1 R0C曲线(受试者工作特征曲线)所示，可知AUC(R0C曲线下的面积)为 0.7436，诊断灵敏度为49.81 %，特异度为15.4%。
[0164] 以上数据可以看出，标志物组合使用时，诊断灵敏度为96.3%，特异度为0%。本发 明所选择的标志物具有很强的使用前景，因此提供了本发明的有益技术效果。
[0165] 前述的实例仅是说明性的，用于解释本公开的特征的一些特征。所附的权利要求 旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例 的组合的选择的实施方式的说明。因此，
【申请人】的用意是所附的权利要求不被说明本发明 的特征的示例的选择限制。而且在科技上的进步将形成由于语言表达的不准确的原因而未 被目前考虑的可能的等同物或子替换，且这些变化也应在可能的情况下被解释为被所附的 权利要求覆盖。
【主权项】
1. 用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损或将发展2型糖尿病的标志物， 其包括:葡萄糖、β-甘露糖甘油酸酯、D-塔罗糖中的一种或多种。2. 用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损或将发展2型糖尿病或将发展2 型糖尿病相关并发症的方法，所述方法包括： 在受试者的样品中测定权利要求1中一种或多种标志物的水平； 将受试者样品中的一种或多种标志物的水平与对照样品中的一种或多种标志物的水 平相比较，其中与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比，受试者样品中的一种或多 种标志物的水平的差异指示所述受试者具有或将发展葡萄糖耐量受损。3. 用于确定具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者是否将对疗法有反应的方 法，所述方法包括 在受试者的样品中测定权利要求1中一种或多种标志物的水平； 将受试者样品中的一种或多种标志物的水平与对照样品中的一种或多种标志物的水 平相比较，其中与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比，受试者样品中的一种或多 种标志物的水平的差异指示所述受试者将对所述疗法有反应。4. 用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损或将发展2型糖尿病或将发展2 型糖尿病并发症的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中权利要求1中的一种或多 种标志物的水平的试剂和确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损或将发展2型糖尿 病或将发展2型糖尿病并发症的试剂盒使用说明书。5. 用于确定具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者是否将对治疗有反应的试 剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定权利要求1中的一种或多种标志物的水平 的试剂和确定受试者是否将对所述治疗有反应的试剂盒使用说明书。6. 用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损或将发展2型糖尿病或将发展2 型糖尿病相关并发症的方法，所述方法包括 测定在受试者样品中的所述胱氨酸的水平； 将受试者样品中的胱氨酸的水平与对照样品中的胱氨酸的水平相比较，其中受试者样 品中的胱氨酸的水平高于对照样品中的胱氨酸的水平，指示所述受试者具有或将发展葡萄 糖耐量受损。7. 用于确定具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者是否将对治疗有反应的方 法，所述方法包括 测定在受试者样品中的胱氨酸的水平； 将受试者样品中的胱氨酸的水平与对照样品中胱氨酸的水平相比较，其中受试者样品 中的胱氨酸的水平高于对照样品中的胱氨酸的水平，指示所述受试者将对所述治疗有反 应。8. 在具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者中监测治疗的功效的方法，所述方 法包括： 在给予受试者所述治疗的至少一部分之前和之后，测定在受试者样品中的胱氨酸的水 平;和 将在给予所述治疗之前来自受试者样品中的胱氨酸的水平与在给予所述治疗的至少 一部分之后来自受试者样品中的胱氨酸的水平相比较，其中与在给予所述治疗之前的样品 中的胱氨酸的水平相比，在给予所述治疗的至少一部分之后的样品中的胱氨酸的水平降低 表明所述受试者对所述治疗有反应，从而监测所述治疗的功效。9. 权利要求6-8中任一项的方法，进一步包括测定在受试者样品中的权利要求1中的一 种或多种另外的标志物的水平。10. 权利要求1所述的方法，所述标志物还包括:胱氨酸、山梨糖、天冬酰胺、赖氨酸、异 亮氨酸、苏氨酸、富马酸、羟基脲、木糖、酪氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、单硬脂酸甘油酯、亚油 酸、甘油中的一种或多种。
【文档编号】G01N33/68GK106093430SQ201610393254
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月6日 公开号201610393254.3, CN 106093430 A, CN 106093430A, CN 201610393254, CN-A-106093430, CN106093430 A, CN106093430A, CN201610393254, CN201610393254.3
【发明人】楼格尔, 邓军亮, 吴洪强
【申请人】上海阿趣生物科技有限公司